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CINTICA ENZIMTICA I:
ACCIN CATALTICA-ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN
ACTIVIDADES TERICO-PRCTICAS
El alumno deber conocer los temas de Cintica Enzimtica desarrollados en Qumica
Biolgica General.
Objetivos
Estudiar los efectos de un catalizador sobre el equilibrio y velocidad de una reaccin qumica.
Estudiar la ecuacin de Michaelis-Menten: concepto de velocidad inicial y estado estacionario.
Interpretacin fsica de la ecuacin de Michaelis-Menten y de los parmetros cinticos.
Determinacin prctica de la actividad enzimtica
1-Introduccin
Las enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas especficas. El mecanismo
propuesto para este tipo de catlisis es que la enzima E se asocia con la molcula sobre la que
acta (llamada sustrato S) formando un complejo enzima-sustrato (ES) a partir del cual se forma el
producto P y se libera nuevamente la enzima sin modificaciones:
E+S
ES
E+P
2-Catlisis
Problema 1
k1
La reaccin S
k -1
en ambas direcciones.
48
Vida k1 S
Vvuelta k 1 P
a) Cmo son estas dos velocidades en el equilibrio? Encuentre la relacin existente entre las
constantes cinticas y la Keq.
b) Grafique cualitativamente cmo vara la [S] y la [P] en el tiempo.
c) Cmo obtiene la velocidad de la reaccin a cualquier tiempo a partir de este grfico?
Si esta reaccin ocurre en presencia de un catalizador:
d) Qu pasar con el G y la Keq?
e) Qu ocurrir con la energa del estado de transicin?
f) Como se modificarn las velocidades de la reaccin de ida y de vuelta?
g) Cmo se ver modificado el grfico de variacin de [S] y [P] en el tiempo?
h) Si el catalizador fuese una enzima, sus respuestas anteriores seguiran siendo vlidas?
i) Nombre algunas caractersticas de la catlisis enzimtica dada la naturaleza proteica de la
enzima.
3-Ecuacin de Michaelis-Menten
Problema 2
La reaccin qumica de S que da P, catalizada por E se puede describir como:
k1
E+S
k2
E+P
ES
k-2
k-1
E+S
K2
E+P
ES
k-1
Vo
d P
k 2 ES
dt
d ES dt 0
49
d ES dt k1 E S
d ES dt k 1 ES k 2 ES
E E t ES
Cuando hay un exceso de S disponible, podemos aproximar que toda la enzima est
formando el complejo ES, es decir: E t ES . En estas condiciones, la velocidad de la
reaccin enzimtica se aproxima a la velocidad mxima (Vmax). Podemos decir entonces que:
Vo k 2 ES
Condiciones saturantes de S
V max k 2 E t
Problema 3
El siguiente grfico representa la variacin de concentracin de producto en el tiempo para
una reaccin del tipo S
P
[P] mM
a
tiempo
50
5-Ejercicios de aplicacin
Problema 5
Ud. esta poniendo a punto una tcnica para estimar la concentracin de una determinada
enzima en una muestra biolgica compleja.
a) Qu medira para detectar su actividad biolgica?
b) Supongamos que Ud. conoce las condiciones de temperatura, pH, iones y cofactores que la
enzima necesita para su funcionamiento; cmo determinara las condiciones de velocidad
inicial? Grafique [P] vs. tiempo para dos experimentos con distinta cantidad de Et, ([E]t1 =
2[E]t2).
c) Segn la ecuacin de Michaelis-Menten, cul es la dependencia de Vo con [E]t? Grafique Vo
vs. [E]t para una concentracin de S constante.
d) A altas [E]t, se seguirn cumpliendo las predicciones de la ecuacin de Michaelis-Menten?
e) Conociendo el grfico anterior Ud. ya puede estimar la [E]t de una muestra desconocida
midiendo Vo?
Problema 6
Ud. esta investigando las diferencias de afinidad por el sustrato de dos enzimas de distinto
origen biolgico (bovina y humana) que catalizan la misma reaccin. Suponga que ya conoce las
condiciones ptimas para el funcionamiento de ambas enzimas, incluso las condiciones de Vo.
a) Qu mediciones hara para realizar dicha comparacin?
b) Sus resultados fueron KM(h) = 0.03 M, y KM(b) = 0.5 M. Grafique ambas curvas Vo vs [S] y
explique cul enzima tiene mayor afinidad por S. Suponga que ambas enzimas llegan a igual
Vmax.
c) Qu pasara si hubiera elegido poner el doble de [E]t en el sistema de reaccin?. Los
resultados de KM hubieran sido los mismos? Grafique ambas situaciones.
d) Grafique [P] vs tiempo para distintos experimentos con [E]t(h)= cte. y [S] = KM, KM, 10KM y
20KM. Qu sucede con las ltimas dos curvas? Estas condiciones se llaman saturantes de
S o condiciones de orden cero. Qu sucede con las primeras dos curvas? Ellas estn en
condiciones de primer orden para S.
Problema 7
Segn el siguiente grfico diga V/F respecto de la concentracin de sustrato:
Vo
A
B
[S]
51
Problema 8
Segn el siguiente grfico diga V/F:
a
[P]
tiempo
a) Ambos experimentos se realizaron con la misma [S] pero con distinta [E] t.
b) Ambos experimentos se realizaron con la misma [E] t y en condiciones de primer orden para el
S, siendo [S]a=2[S]b.
c) Ambos experimentos se realizaron en condiciones saturantes de S e igual [E] t.
d) El experimento a alcanza mayor [P] debido a que se realiz con mayor [S] que el experimento
b.
Problema 9 (ATENCION: el siguiente problema deber llevarse realizado al Terico-practico
de Cinetica Enzimatica I ya que ser discutido en clase. Para resolverlo, tome el valor de
absortividad molar del producto de reaccin que figura en la parte prctica.
Se desarroll la reaccin de defosforilacin del sustrato p-nitrofenilfosfato catalizada por la
enzima fosfatasa alcalina de cerebro de rata. Para ello se incubaron a 37C en sendos tubos 50 l
de una solucin 25 mM del sustrato, iniciando la reaccin con el agregado de 150 l de un
homogeneizado de cerebro de rata conteniendo la enzima, en presencia de magnesio (cofactores)
y el buffer adecuado. La reaccin se dej evolucionar y se detuvo por agregado de 1 ml de NaOH
0.2 M segn el esquema siguiente:
Tubo
N
1
2
3
4
Bco.*
(l)
(l)
Sustrato
25 mM
(l)
50
50
50
50
50
200
200
200
200
200
50
50
50
50
50
Cofactores
Buffer
MgCl2 y ZnSO4
Abs.
(410 nm)
(l)
Tiempo de
incubacin
(minutos)
150
150
150
150
150*
10
20
30
40
10
0.051
0.098
0.144
0.172
0
Enzima
Producto
formado
(M)
52
Problema 10
A fin de analizar la dependencia de la actividad Glucosa oxidasa con la [E]t se desarroll el
siguiente experimento. Se incub a 37 C, 1 mL de solucin 1 mM de glucosa con diferentes
cantidades de enzima, deteniendo la reaccin a distintos tiempos y midiendo la aparicin de un
producto coloreado (= 3140 M-1cm-1).
Tiempo
(min)
1
2
3
4
5
0.5 g enzima
A
[P]
0.044
0.091
0.134
0.178
0.227
1 g enzima
A
[P]
0.090
0.179
0.271
0.310
0.363
2 g enzima
A
[P]
0.180
0.374
0.547
0.600
0.684
5 g enzima
A
[P]
0.395
0.788
1.030
1.250
1.321
53
Actividades Prcticas
En este y en el prximo trabajo prctico se realizarn estudios cinticos acerca de la enzima
de Escherichia coli.
El prctico estar dividido en dos etapas:
FOSFATASA ALCALINA
Fosfatasa alcalina
-
O P O- + O2N
O P O
Op-nitrofenilfosfato
O-
MgCl2, pH=10,
H2O
Ofosfato
p-nitrofenxido
54
Primera semana
1]
Curvas de Tiempo:
Para estudiar cmo cambian las curvas de formacin de producto en funcin del tiempo de la
reaccin cuando se cambian las condiciones de [E] y [S], realizaremos tres curvas de tiempo
siguiendo el siguiente esquema.
Tabla1:Curvadetiempo1
Tubo N Cofactores
Buffer
Enzima
(L)
Sustrato
3 mM
(L)
(L)
Tiempo de
incubacin
(minutos)
MgCl2 10 mM
Tris 10 mM pH 8
ZnSO4 1 mM
Abs.
Producto
(410 nm) formado
(M)
(L)
1
65
540
25
30
65
540
25
30
10
65
540
25
30
15
65
540
25
30
20
Bco.*
65
540
25
30* (alfinal)
55
Cofactores
MgCl2 10 mM
ZnSO4 1 mM
(L)
Buffer
Tris 10
mM pH 8
(L)
Sustrato
3 mM
(L)
Enzima
(L)
Tiempo de
incubacin
(minutos)
65
465
100
30
65
465
100
30
10
65
465
100
30
15
65
465
100
30
20
Bco.*
65
465
100
30* (al
final)
Tubo
N
Abs.
Product
(410 nm) o
formad
o
(M)
Tabla3:Curvadetiempo3conDisminucin deEnzima
Tubo N Cofactores
Buffer
Enzima
(L)
Sustrato
3 mM
(L)
(L)
Tiempo de
incubacin
(minutos)
MgCl2 10 mM
Tris 10 mM pH 8
ZnSO4 1 mM
Abs.
Producto
(410 nm) formado
(M)
(L)
1
65
558
25
12
65
558
25
12
10
65
558
25
12
15
65
558
25
12
20
Bco.*
65
558
25
12 (alfinal)
Para asegurarnos de que en las condiciones de trabajo elegidas nuestro sistema se comporta
segn el modelo de Michaelis-Menten, necesitamos cerciorarnos de trabajar en un rango de [E]
en el cual la dependencia de Vo con [E] sea lineal. Para ello graficamos los resultados de las
velocidades de reaccin (Vo) obtenidas de las curvas 1 y 3 (adems del punto 0,0) en funcin
de la cantidad de enzima agregada y discutimos su dependencia.
56
Segunda semana
Velocidad de reaccin en funcin de la concentracin de sustrato. Determinacin de KM y Vmax
3]
En los experimentos anteriores usted observ que a tiempos cortos la [P] es lineal con el
tiempo y eligi detener la reaccin en un determinado tiempo en el cual la reaccin se encuentra
en condiciones de velocidad inicial. Adems Ud. se asegur que la velocidad de la reaccin
depende linealmente de la concentracin de enzima en el intervalo de tiempo usado. En este
Trabajo Practico realizaremos una Curva de Sustrato para poder obtener los parmetros
cinticos KM y Vmax de la Fosfatasa Alcalina.
Realizaremos el siguiente protocolo:
Cofactores Sustrato
MgCl 10 mM
3 mM
Tubo ZnSO2 1 mM
4
N
(l)
(l)
Buffer
Tris 10 mM
pH 8
Enzima
(l)
(l)
65
560
30
65
10
555
30
65
15
550
30
65
25
540
30
65
100
465
30
65
300
265
30
65
550
15
30
Bco*
65
25
540
30*(alfinal)
Abs.
(410 nm)
Sustrato
(M)
Producto
formado
(M)
Vo
(M/min)
Incubar todos los tubos a 37 oC durante el tiempo elegido en el prctico anterior como condiciones
de Vo. Para detener la reaccin agregar a cada tubo 1 ml de NaOH 0,1 M.
* La enzima para el blanco se agrega despus del NaOH.
Calcule la concentracin de sustrato (M) en el volumen de reaccin y las velocidades de
reaccin (en M/min) a partir de los datos de absorbancia. Grafique Vo vs. [S] utilizando el
programa de anlisis grafico Origin o similar y obtenga los datos de KM y Vmax mediante un ajuste
no-lineal con la frmula de Michaelis-Menten. Adems, utilice un mtodo de linealizacion de la
ecuacion de Michaelis-Menten a su eleccin (Lineaweaver-Burk o Eadie-Hofstee) y realice una
regresin lineal de sus datos utilizando Origin o Excel. A partir de los valores de la pendiente y
ordenada al origen, calcule KM y Vmax. Obtiene los mismos valores con los dos mtodos? Cual
de ellos le da errores menores?
57
U6 - ACTIVIDAD N 6
Cintica Enzimtica II
Determinacin de parmetros cinticos - Inhibidores Enzimticos
Objetivos:
Determinacin grfica y analtica de KM y Vmax de una reaccin catalizada enzimticamente.
Linearizacin de la ecuacin de Michaelis-Menten: transformaciones de Lineweaver-Burk y de
Eadie-Hofstee.
Identificacin de distintos tipos de inhibidores y sus efectos en los parmetros cinticos.
1- Introduccin
Cuando se disea y ejecuta un experimento, el anlisis se realiza generalmente ajustando
un modelo terico a los datos obtenidos. Para ello, necesitamos conocer las ecuaciones que
describen el comportamiento del sistema y el significado fsico de cada uno de sus parmetros.
En nuestro caso, el modelo es el de Michaelis-Menten de una reaccin enzimtica.
En el terico-prctico anterior, discutimos el marco terico de este modelo. Por lo tanto,
para una buena comprensin de este terico-prctico, es fundamental que tenga presente los
conceptos aprendidos en Cintica I.
(Tambin sugerimos repasar los conceptos ya conocidos de equilibrio qumico y
funciones lineales.)
2-Determinacin de KM y Vmax.
El modelo de MichaelisMenten para una reaccin catalizada por una enzima nos dice que
la variacin de la velocidad inicial (Vo) de la reaccin con la concentracin de sustrato ([S])
responde a la siguiente ecuacin:
Vo
Vmax S
K M S
(1)
58
10
9
8
7
Vo
(mg/min)
6
5
4
Model: Hyperbl
Chi^2 = 0.04976
Valor
Vmax 9.90757
3.50931
KM
3
2
1
Std
0.36235
0.31899
0
0
10
[S] (mM)
Figura 1
2.1) Es posible obtener grficamente los valores de KM y Vmax a partir de los datos de la
figura 1?
Por lo general no es posible obtener grficamente los datos de KM y Vmax ya que el rango
de [S] trabajado normalmente es a concentraciones bajas y el error en la determinacin grfica es
muy alto. El mejor mtodo para obtener KM y Vmax es el ajuste mediante una regresin no lineal de
los datos experimentales con la ecuacin de Michaelis-Menten. En este Terico-Practico, as como
en el Trabajo Prctico correspondiente, obtendremos los valores de KM y Vmax utilizando el
programa de anlisis de datos Origin, el cual nos permite ajustar los datos de los problemas de
aplicacin.
En el caso de que no se disponga de un programa capaz de realizar una regresin no
lineal, la transformacin lineal de la ecuacin de Michaelis-Menten nos facilita la tarea de hacer el
clculo a mano o en un programa que sea capaz de hacer slo regresiones lineales, como el
Excel. Los dos mtodos de linealizacin ms empleados son los de dobles inversas o de
Lineaweaver-Burk y de Eadie-Hofstee, los cuales se muestran en la figura 2. La linealidad en estos
grficos asegura el cumplimento de la ecuacin de Michaelis-Menten (y por tanto los supuestos
que esta implica).
59
Ecuacin de
Michaelis-Menten
Vo
Vmax S
K M S
Vo
Vmax
KM
[S]
Ecuacin de
Lineweaver-Burk
1 KM 1
1
Vo Vmax S Vmax
Ecuacin de
Eadie-Hofstee
Vo K M
(2)
1/Vo
Vo
V
S max
(3)
Vo
Vmax
1/Vmax
Pendiente: -KM
Pendiente: KM/Vmax
-1/KM
1/[S]
Vmax/KM
Vo/[S]
Figura 2
Cuando un conjunto de datos no tiene error experimental, los mtodos de linealizacin son
adecuados para determinar los parmetros cinticos. Sin embargo, para un conjunto de datos
reales (que presentan error) estos mtodos pueden inducir a una incorrecta determinacin. Por
ejemplo, la linealizacin por Lineweaver-Burk a bajas concentraciones de sustrato amplifica los
errores, generando una dispersin de datos que dificulta realizar un buen ajuste. El mtodo de
Eadie-Hofstee tambin produce una amplificacin de los errores, pero este no es tan severo y esta
tcnica se considera ms adecuada. Un problema adicional con Eadie-Hofstee es que la variable
independiente no es realmente independiente y por lo tanto los errores experimentales estn
presentes en ambos ejes.
El siguiente ejemplo ilustra lo anterior. En el grfico de Michaelis-Menten (1) se muestran en
crculos llenos los datos sin error, mientras que en smbolos vacos se representan dos conjuntos
60
Vo
1/Vo
de datos con error experimental. En los grficos de Lineweaver-Burk (2) y de Eadie Hofstee (3) se
representan los mismos datos y sus respectivos ajustes lineales.
1/[S]
[S]
Vo
Vo/S
3- Inhibicin
Los inhibidores son compuestos que perturban la cintica de la reaccin, haciendo variar
KM, Vmax o ambos en forma APARENTE.
Vo
Vmax S
K M S
Vo
Vmax, ap S
K M , ap S
(3)
E + S
+
I
KI
EI
ES
P + E
61
En esta ecuacin, Vmax y KM son los parmetros correspondientes al sustrato sin inhibidor.
Vmax, ap Vmax
I
K M , ap K M 1
K I
(4,5)
3.1.2) Verifique si las ecuaciones 4 y 5 coinciden con lo esperado segn el punto anterior.
3.1.3) Encuentre las races de la transformacin de Eadie Hofstee y Lineweaver-Burk.
Las representaciones grficas de la ecuacin linealizada a medida que aumenta la [I] son:
[I]1
1/Vo
[I]2
Vo
SIN I
[I]2>[I]1
Vmax
[I]2>[I]1
1/Vmax
Pendiente: -KM(1+[I]/KI)
[I]1
Pendiente: (1+[I]/KI)KM/Vmax
[I]2
-(1/(KM(1+[I]/KI ))
1/[S]
Vmax/KM (1+[I]/KI)
SIN I
Vo/[S]
Figura 3
3.1.4) Dibuje el grfico de Michaelis-Menten para las situaciones con y sin inhibidor.
3.2- Inhibicin no competitiva
Vmax, ap
Vmax
1 [ I ]
K I
K M ,ap K M
(6,7)
62
La representacin grfica de las ecuaciones linealizadas a medida que aumenta la [I] son:
[I]1
1/Vo
[I]2>[I]1
[I]2
Vo
SIN I
Pendiente: -KM
Vmax/(1+[I]/KI)
(1+[I]/KI)/Vmax
[I]1
Pendiente: (1+[I]/KI)KM/Vmax
-(1/KM )
SIN I
[I]2
1/[S]
Vmax/KM (1+[I]/KI)
Vo/[S]
Figura 4
3.2.2) Dibuje el grfico de Michaelis-Menten para las situaciones con y sin inhibidor.
Vmax, ap
Vmax
1 [ I ]
K I
K M ,ap
KM
1 [ I ]
K I
(8,9)
Las representaciones grficas de la ecuacin linealizada a medida que aumenta la [I] son:
[I]1
1/Vo
[I]2
SIN I
Vo
[I]2>[I]1
Vmax/(1+[I]/KI)
(1+[I]/KI)/Vmax
Pendiente: -KM/(1+[I]/KI)
[I]2>[I]1
[I]1
Pendiente: KM/Vmax
-((1+[I]/KI)/KM )
SIN I
[I]2
1/[S]
Vmax/KM
Vo/[S]
Figura 5
3.3.2) Dibuje el grfico de Michaelis-Menten para las situaciones con y sin inhibidor.
Como podemos ver en estos ejemplos, debemos realizar los experimentos en ausencia y
presencia de inhibidor para identificar el tipo de inhibicin.
63
4-Problemas de aplicacin
1) Se midi la variacin de la velocidad inicial en funcin de la concentracin de sustrato para una
reaccin catalizada enzimticamente. Se realizaron dos experimentos y slo en uno de ellos la
concentracin de enzima era conocida. Los valores obtenidos se muestran en la tabla.
[S] (M)
0.1
0.2
0.5
0.8
1.0
2.0
[E]1=1x10-6 M
Vo (mmol /mL min)
3.33
5.00
7.14
8.00
8.33
9.09
[E]1
Vo/[S]
[E]2=?
Vo (mmol /mL min)
7.67
11.50
16.43
18.40
19.17
20.91
[E]2
Vo/[S]
a) Calcule Vo/[S] para ambos experimentos y realice un grafico de Eadie Hofstee para ambas
curvas.
b) Obtenga la ecuacin lineal que mejor describe los datos de cada experimento y obtenga los
valores para KM y Vmax para ambos casos.
c) Calcule el valor de la kcat.
d) Qu concentracin de enzima se utiliz en el segundo experimento?
2) Suponga que los datos que se muestran en la tabla fueron obtenidos de una reaccin
enzimtica en presencia y ausencia de un inhibidor.
[S] (mM)
0.2
0.4
0.8
1.0
2.0
4.0
a)
b)
c)
d)
Vo (mmol/ mL min)
Sin I
Con I
5.0
3.0
7.5
5.0
10.0
7.5
10.7
8.3
12.5
10.7
13.6
12.5
Velocidad (mg/min)
sin salicilato
con salicilato
0.21
0.08
0.25
0.10
0.28
0.12
0.33
0.13
0.44
0.16
0.40
0.18
64
Problema 1: Completar:
Dado que se asume que la velocidad de la reaccin enzimtica esta dada por la ecuacin
de M.M., necesariamente debemos tener en cuenta lo asumido en el modelo de M.M. Por lo que el
KM obtenido representa la constante de disociacin de............, y representa una medida de la
....................de E por S.
A pesar de que esto no ha sido demostrado fehacientemente hasta hoy, meramente definimos KM
como una constante que representa la concentracin de sustrato a la cual se
produce..........................................................
Problema 2
Suponga que la glucosa puede convertirse en otra sustancia por la accin de una cierta
enzima. La tabla siguiente muestra para este caso hipottico las diferentes velocidades a diversas
concentraciones de glucosa:
[glucosa](M)
Vo (M min-1 )
1/ [S].
1/ Vo
Vo/[S]
1x10-5
150
2x10-5
256
1x10-4
600
3x10-4
770
5x10-4
818
a) Graficar Vo vs. [S].
b) Calcular las inversas de concentracin y velocidad y graficar 1/Vo vs. 1/[S].
c) I-El primer propsito del grfico de Lineweaver-Burk, es estudiando la linealidad, chequear cuan
bien la reaccin responde a la ecuacin. Esta correspondencia indica que el complejo enzimasustrato:
( ) permanece a una concentracin relativamente constante durante el perodo de las
observaciones.
( ) es formado apreciablemente a partir de la unin de la enzima con el sustrato y tambin del
producto son el sustrato.
II-El segundo propsito del grfico L-B, una vez que estamos satisfechos con la linealidad, es
evaluar Vmax y KM.
La interseccin de la recta en el eje y corresponde al valor algebraico de..................que en
este caso es de ............. Cuando 1/[S] = 0, la velocidad es (infinita - mxima - mnima). Si
extrapolamos la recta hasta cortar el eje x, donde 1/Vo = 0, el valor de la interseccin con el eje de
las abscisa es igual a -1/KM que en este caso es de.................
d) Analizando el mismo grfico, existe otro modo que nos permita calcular el valor de KM?
e) Otro modo de analizar la cintica de una reaccin enzimtica esta representado por los grficos
de Hofstee, el cual grfica............................................
Calcular con los datos anteriores Vo/[S] y grafique. Determinar Vmax y KM
Problema 3
En un experimento de Vo en funcin de [S], se obtuvo como resultado KM y Vmax para una
dada enzima con su sustrato, expresado en una grfica de Vo vs [S] y 1/Vo vs 1/[S] (Fig 1.
Experimento 1).
Luego se realizaron otros dos experimentos, cada uno con una "pequea" variante pero
manteniendo constante temperatura, pH y tiempo de reaccin, obteniendo los siguientes
resultados comparados con el experimento 1.
65
66
MgCl2
Tubo
Sustrato
Buffer
0,026 M
Suero de paciente
(Enzima)
Paciente1
25 L
100 L
300 L
200 L
Paciente 2
25 L
100 L
300 L
200 L
Blanco
25 L
100 L
300 L
200 L*
p-nitrofenol + PO44-
Enzima
A(paciente 2)=0,154
A(blanco)=0,021
E+S
V3
ES
E+P
V4
V2
a) En que condiciones se considera la velocidad igual a la velocidad inicial:
I) V1 V2
II) V1=V2
III) V3 V4
IV) V3=V4
V) Ninguno es correcto.
Problema 7
Un estudiante decide comparar dos sustratos (A y B), con una enzima (E) que es especfica
para ambos. Los productos de reaccin de ambos sustratos son diferentes pero pueden ser
detectados espectroscpicamente a 450 nm (PA) y 550 nm (PB).
Se realiz un experimento de Vo vs [S] para A y para B. En todos los casos se mantuvo
constante la temperatura, pH, [E] y tiempo de reaccin (los cuales fueron determinados con
anterioridad). Las reacciones se mantuvieron a 37 C durante 20 minutos (condiciones de Vo
preestablecidas) y siendo el volumen final igual a 5 mL, se obtuvieron los siguientes resultados
para ambos sustratos.
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[Sustrato]
mM
A (PA)
A (PB)
0.082
0.039
5
10
20
30
50
0.301
0.460
0.640
0.740
0.820
0.167
0.271
0.416
0.498
0.593
Si
E+A
[EA]
PA + E
E+B
[EB]
PB + E
A(PA)= PA d [PA]
d=1 cm.
(a 450 nm).
A(PB)= PB d [PB]
d=1 cm.
(a 550 nm).
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