UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA

PCR Y RT-PCR

GARCA FRANCO MIRIAM IXCHEL

Diferencias

A pesar de que RT-PCR y la PCR tradicional tanto producen mltiples copias de

determinados aislados de ADN a travs de la amplificacin, las aplicaciones de las
dos tcnicas son fundamentalmente diferentes. La PCR tradicional se utiliza
simplemente para amplificar exponencialmente las secuencias de ADN dadas. RTPCR se utiliza para clonar los genes expresados por la transcripcin inversa del
ARN de inters en su complemento de ADN a travs del uso de la transcriptasa
inversa. Posteriormente, el ADNc recin sintetizado se amplifica mediante PCR
tradicional.

PCR
Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicacin del ADN. Est basado en
la accin de la polimerasa, que como se sabe es la enzima que dirige la sntesis
de ADN, y desde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. Para ello
necesita al menos una pequea fraccin de cadena doble de ADN para iniciar la
sntesis. Esto hace posible, si de forma voluntaria le proponemos una pequea
fraccin de oligonucletidos que sean complementarios de una porcin, se unir
despus de la desnaturalizacin de la doble cadena y mediante el crecimiento
hacia el extremo 3 del DNA por aposicin de los nucletidos correspondientes
suministrados y, a travs de la accin de la polimerasa, se hace la amplificacin
del fragmento deseado.
La PCR es un proceso que consta de tres pasos;
Desnaturalizacin: La primera reaccin consiste en la desnaturalizacin del DNA,
separndose las dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrgeno.
La desnaturalizacin incompleta permite el apareamiento de las hebras de DNA y
por lo tanto se reduce el rendimiento el producto. En contraste, los pasos de

desnaturalizacin a altas temperaturas o por mucho tiempo provocan perdida de la

actividad de la enzima.
Alineamiento.: La segunda reaccin consiste en la hibridacin de los primers.
Para ello se baja la temperatura y las condiciones sern tales que se facilitar la
unin de los primers a las cadenas. El rango de actividad de las enzimas varia en
dos ordenes de magnitud entre 20 y 85C. Las temperaturas de alineamiento en el
rango de 55 a 72C generan buenos resultados.
Extensin: La tercera reaccin se efecta a 72 C, temperatura a la cual, la
polimerasa lleva a cabo su accin, insertando los diferentes nucletidos
complementarios en el orden que le va indicando la cadena que acta como
molde.
Un modelo estndar para realizar PCR es el siguiente:

Desnaturalizacin inicial: 95C por 5 a 10 mn

30 ciclos con desnaturalizacin a 95C por 30 s, alineamiento a 50C por
30s y extensin a 72C por tiempo variable
Extensin final a 72C por 10 mn (aunque no es estrictamente necesario
este ltimo paso, es slo para asegurar que los fragmentos incompletos se
terminen de sintetizar)
Al final se programa la mquina para que conserve los tubos a 4C

RT-PCR
En la RT-PCR, la plantilla de ARN se convierte primero en un ADN
complementario usando una transcriptasa inversa. El ADNc se utiliza a
continuacin como plantilla para la amplificacin exponencial mediante PCR. RTPCR es actualmente el mtodo ms sensible de deteccin de ARN disponible. Se
utiliza para la deteccin y amplificacin de ARN, permite estudiar la expresin de
determinados genes (su traduccin a protenas).

Normalmente se utiliza la rTth ADN polimerasa de Thermus thermophilus, que es

una enzima recombinante y termoestable que acta como transcriptasa inversa y
como ADN polimerasa. Para saber si se ha amplificado la cadena de ADN de
inters se suele utilizar la electroforesis en un gel teido con bromuro de etidio.
Este compuesto se intercala en las bases del ADN provocando una alta densidad
electrnica. Al exponer el gel a luz ultravioleta los electrones del bromuro de etidio
se estimulan produciendo fluorescencia, pudindose as visualizar el ADN. Las
bandas gruesas que observamos en el gel son las secuencias de ADN que hemos
amplificado. Segn la altura a la que haya migrado el ADN amplificado tendr un
tamao u otro.

Un paso de RT-PCR es tomar mRNA objetivo y someterlo a transcripcin inversa y

amplificacin por PCR a continuacin, en un solo tubo de ensayo. Utilice slo ARN
de alta calidad para obtener los mejores resultados. Asegrese de utilizar un
cebador especfico de secuencia.
Mtodo:

Seleccionar un solo paso kit de RT-PCR, que debe incluir una mezcla
con transcriptasa inversa y el sistema de PCR tales como Taq ADN
polimerasa y una polimerasa de correccin de pruebas.
Preparar una mezcla de la reaccin, que incluir dNTP, cebadores, ADN
plantilla, enzimas necesarias y una solucin tampn.
Aadir la mezcla a un tubo de PCR para cada reaccin. A continuacin,
aadir el ARN de plantilla.
Colocar los tubos de PCR en el termociclador para comenzar el
ciclismo. El primer ciclo es la transcripcin inversa para sintetizar ADNc.
El segundo ciclo de desnaturalizacin. Durante este ciclo se inactiva la
transcriptasa inversa. Los prximos 40 a 50 ciclos de amplificacin son
el programa, que consta de tres pasos: desnaturalizacin, hibridacin,
elongacin.
Los productos de RT-PCR a continuacin, pueden ser analizados con
electroforesis en gel.

Componentes de la reaccin
Nucletidos
Los nucletidos se diluyen en agua, la solucin debe ser protegida (por ejemplo
con el 10mM Tris pH 7,7-8,0, concentracin final) . Si no, un pH cido promover
la hidrlisis del dNTP en dNDP y dNMP y los har intiles para las reacciones de
polimerizacin de la DNA enzimtica. Concentraciones entre 20 y 200 M resultan
en un balance ptimo entre rendimiento, especificidad y fidelidad. Los cuatro dNTP
deben ser usados en concentraciones equivalentes para minimizar errores de
incorporacin de bases.
Primers
Los oligonucletidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios que
se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN. La
composicin base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La
secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de
poliG o de poliC que pueden promover el reconocimiento no especfico. Las
regiones poliA y poliT deben tambin ser evitados ya que interfieren con el
complejo del primer-templado. Esto puede bajar la eficacia de la amplificacin.
La composicin base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La
secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de
poliG o de poliC que pueden promover el reconocimiento no especfico. Las

regiones poliA y poliT deben tambin ser evitados ya que interfieren con el
complejo del primer-templado. Esto puede bajar la eficacia de la amplificacin. El
primer tendr un contenido de G/C del 50% y 20 bases de largo. Esto pondr la
Tm en la gama de 56C - 62C.
Temperatura de Asociacin
La temperatura de asociacin de los primers es uno de los factores ms
determinantes de la reaccin. Se recomienda que se emplee como temperatura de
asociacin la temperatura de fusin -5C, aproximadamente. Existen muchos
mtodos para calcular la temperatura de fusin, pero siempre, despus de
efectuado el clculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes
temperaturas de asociacin cercanas a la temperatura de fusin para determinar
la temperatura ptima para cada reaccin.
Clculo de la temperatura de fusin (Tm)
Existen muchos mtodos para estimar el valor de la temperatura de fusin.
Para secuencias de 20 bp o menos, existe la siguiente aproximacin:
Tm = 2C (A + T) + 4C (G + C)
donde se asume una concentracin de sal de 0.9M, tpica de "dot blot" y otros
ensayos de hibridizacin
La polimerasa
Un rango de concentracin recomendado para Taq polimerasa (Perkin-Elmer
CETUR) es entre 1 y 2.5 unidades (SA = 20 unidades/pmol) por 100 l de reaccin
cuando los otros parmetros son ptimos. Sin embargo, los requerimientos de
enzima pueden variar con respecto a la secuencia blanco o los primers. Cuando
se optimiza un PCR, se recomienda probar rangos de concentracin de enzima de
0.5 a 5 unidades/100 l. Si la concentracin de la enzima es muy alta se acumulan
productos no especficos, y si es muy baja se formara una cantidad insuficiente del
producto deseado.
Templado
El criterio esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA
intacta que abarque la regin que va a ser amplificada y que las impurezas sean
suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerizacin.
Concentracin de Magnesio
Es benfico optimizar la concentracin del in magnesio, ya que afecta: el
alineamiento de los primers, la temperatura de disociacin de las cadenas, tanto
del templado como del producto de PCR, la especificidad del producto, la
formacin de dmeros de primer y la actividad y fidelidad de la enzima. La Taq
polimerasa requiere magnesio libre en la unin con el templado, los primers y los
dNTPs.
Otros componentes de la reaccin
Un buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl (pH entre 8.3 -8.8).

Tris es un buffer inico bipolar que tiene un pKa de 8.3 a 20C y un _ pKa de
-0.021/C sin embargo el verdadero pH de una buffer 20mM de Tris (pH 8.3 a
20C) varia entre 7.8 y 6.8 durante las condiciones tpicas del termociclador.
Hasta 50 mM de KCl puede ser incluido en la mezcla de reaccin para facilitar el
alineamiento de los primers. NaCl a 50 mM o KCl arriba de 50 mM inhibe la
actividad de la Taq polimerasa.
Nmero de ciclos
Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. La repeticin de este ciclo unas 40
veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de
amplificacin, millones de copias del fragmento de inters.
El nmero ptimo de ciclos depender principalmente de la concentracin inicial
del templado cuando los otros parmetros son optimizados. Un error comn es el
de ejecutar demasiados ciclos, ya que esto puede incrementar la cantidad y
complejidad de productos no especficos. Pocos ciclos dan como resultado un bajo
rendimiento del producto.

Electroforesis de cidos nucleicos

El trmino electroforesis se usa para describir la migracin de una partcula
cargada bajo la influencia de un campo elctrico. Muchas molculas importantes
biolgicamente (aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos, cidos
nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solucin como especies
cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se
van a separar en funcin de su carga cuando se aplica un voltaje a travs de los
electrodos.
La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar molculas o
fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para
separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la
agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un
tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA
sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores
a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y
permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As,
molculas de DNA de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel
de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser
inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la
utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los
pesos moleculares de las muestras de DNA problema.

En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que

se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz
ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y
se vern las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los
marcadores de peso molecular.
Ratones knockhout
Los knockout son ratones a los que se ha inactivado o eliminado
experimentalmente uno o ms genes. Estos knockout son valiosos aliados para
averiguar la funcin del gen que les falta. Sin embargo, cuando el investigador
"toca" un gen especialmente importante para el desarrollo o el metabolismo del
organismo, a veces acaba consiguiendo ratones que mueren antes de nacer o tras
unos pocos das de vida. Para el investigador esto es bueno a priori, ya que este
resultado le indica que el gen es esencial, uno de esos que se encuentran una vez
en la vida pero al mismo tiempo, su modelo animal no le permite ir mucho ms
all, ya que se queda sin material con el que seguir estudiando los efectos del gen
que acaba de descubrir.
Gen MIF
Los macrfagos son atrados y activados en el foco de infeccin debido a la accin
de IFN-g y del factor quimiotctico y activador de los monocitos (MCAF). Otro
factor secretado llamado MIF (inhibidor de la migracin de macrfagos) evita que
el macrfago "pase de largo" el foco infectivo, afinando su quimiotaxis.