Sunteți pe pagina 1din 6

Curs 4 de Imunologie

Azi vom discuta despre limfocit.Despre limfocit si inainte sa


discutam despre fiecare in parte => s vedem cateva notiuni de
laborator.
Exista mai multe metode de separare si identificare a populaiilor
limfocitare => se lucreaza cu suspenisii de celule si printre metodele de
purificare => tehnicii care folosesc markeri mb specifici grupurilor
celulare(se bazeaz pe citometria in flux) si e metoda cu cele mai bune
rezultate din ultimii ani.
Mai avem metode care se bazeaz pe proprietile biologice a
acestor celule cum e functia fagocitar- separ monocitele i macrofagele
punandu-le in contact cu Fe coloiodal => aceste celule l absorb si pot fi
separate cu ajutorul campului magnetic.
O alta particularitate este aderarea la diverse suprafete.Unele
populaii de limfocite B (LB) si limfocite T (LT) => prezint unele molecule
de adeziune => ader la suprafaa sticlei si asa le putem separa.
O alt metod => cromatografie de afinitate => se bazeaz pe
faptul c celulele au receptori de recunoatere a diferitilor liganzi si atunci
punnd celulele in contact cu anumite tipuri de liganzi, celulele care
exprim receptorii => vor lega ligandul respectiv si astfel devin mai grele
=> se separ prin diverse tehnici.
Alte metode => pe baza vitezei de sedimentare diferit a celulelor ,
fiind data de marimea si continutul celular . Sedimentarea se poate realiza
liber intr-un gradient de densitatea sau prin centrifugeare tot in gradient
de densitate.
Centrifugarea in gradient de densitate este explicat prin desenul
1
Sngele simplu la centrifugare => plasma + straturi de celule,dar
aceasta solutie cu densitate intre grupul de celule care ne intereseaza si
grupul celor care nu ne intereseaz=> se interpune => le separa pentru
analiz.
Tehnica rozetrii - diversele grupuri de limfocite= > exprim pe mb
anumiti receptori care pot interact cu liganzi de pe alte celule - in mare
parte sunt receptori de adeziune.
Daca am putut separa stratul => il putem pune la incubator cu
eritrocite de oaie.
Desen2
Limfocitele T exprim pe membrana lor receptori CD2 => va lega
un ligand E (de la eritrocit ) de pe eritrocitele de oaie ,iar LB nu exprim
CD2 => separ cele 2 clase.
LT =2/3 din totalul Limfocitelor => LB reprezint doar 1/3 din totalul
limfocitelor.
Putem realiza diverse variante => separare mai avansat (de ex. in
fct de afinitatea diferit ptr eritrocitele de oaie).
Daca punem o suspensie de eritrocite de oaie la incubaie o ora la
29 grade Celsius => separam LTH cu o mare afinitate ptr eritrocitele de
oaie .

O alt variant e s folosim o suspensie cu eritrocite de oaie ,iar prin


incubaie o ora la 45 grade Celsius , cutm limfocite rezistente la aceasta
temperatur - LT Supresor - care sunt termostabile.
De la aceasta tehnica de rozetare=> si alte variante , dar putem
separa si LB chiar daca nu expr CD2 - exprim fc gama R si receptori
pentru complement.
Daca expun la eritrocite cu Ig G => se vor fixa pe eritrocitele de
bou (s-a trecut acum la astea) => prin interm fc gama R => se
rozeateaza LB prin alta tehnica.
Ca sa folosesc Cp => hematiile de bou sunt incubate cu Ig M in
prealabil si se adaug si o sursa de Cp ( de la o rozatoare). Ig M activeaz
Cp din plasma (eventual de soarece) si componenta C3B se va atasa si va
fi recunoscut de LB prin intermediul receptorilor ptr Cp => rozeteaz
indirect LB .
Cea mai interesanta si cea mai folosit in ultimii anii =>
imunoferotiparea prin citometrie in flux => stabileste proportiile de seturi
si subseturi limfocitare din sg => si limfocitele in stare de activare prin
intermediul Ag membranare HLA DR 3.
Prin citometria in flux , putem stabili simultan mai multi parametri
precum marime , granularitate, fluorescenta, etc. CiF ( citometria n flux)
=> datorit productiei de Ac monoclonali , deoarece ei sunt specifici strict
anumitor Ag membranare de pe S limfocitelor.
Acesti Ac monoclonali => vor fi fluorocromati si astfel pot fi
detectati .
Citometrul => are o camera de curs ca sa curga celulele una cate una in
fata unei raze laser si are si un computer atasat => grafice de tip DOT
PLOT.
Sistemul computerizat analizeaz rezultatele si datele obtinute ,iar
din complexitatea celulei, (semnalizeaza daca s-a legat Ac monoclonal)
=> se pot separa celulele si caracteriza.
Rezultatele pot fi inregistrate ca grafic. De obicei se folosesc 2
fluorocromi => se pot obtine 2 populaii de celule distincte in functie de
acest marcaj.
Avem nevoie de un martor sau o proba de control care s conin Ig G .
Unele Ig G sunt marcate cu un fluorocrom si altele cu cellalt fluorocrom .
Acestea se vor fixa nespecific prin fc gama R .
Desen 3
Daca folosim un grup de limfocite T care in cadrul lor , unele s fie
cd4 + (LTH care leag domeniul monomorf al MHC II) si cd8+ (limfocitele
care leaga domeniul monomorf al MHC I - LTC si LTS) .
Legam cu Ac monoclonali specifici ptr acesti cd 4/cd 8 marcati cu
fluorocromi diferii => tabel 2 din desen 3
Exista si un sistem de filtre => dupa ce a fost identificat celula si
marcata cu flurorocromul 1 => ea intra in casuta 1 , iar daca urmtoarea
celula => fllurocromul 2 => intra in casuta 2 .
Aceasta tehnica are multe aplicatii => spre exemplu e foarte util in
diagnosticarea si monitorizarea terapiei hemopatiilor maligne (leucemii,
limfoame) ptr c celulele modificate malign ale liniilor hematologice sunt /

exprim pe S lor diversi markeri anormali=> se pot identifica cu Ac


monoclonali deja produsi sau in curs de productie.
Deci identificm celulele pentru diagnostic ,iar pe de alt parte
putem urmri dinamica acestor celule modificate malign in functie de
terapie.
Putem urmari raportul cd4/cd8 in monitorizarea transplantului de
maduva osoasa, fiind indicator al instalarii reactiei de respingere a
grefei.Am vazut ca mhc 1 au acel ALFA 3 - domeniu monomorf care iat c particip la reaciile de
respingere a grefei.
Dinamica cd4/cd8 ofer date despre agresivitatea propriului sistem
imun impotriva grefei care s-a instalat.
Pe urm,aceeasi metoda se poate folosi si pentru aprecierea
statusului imunodepresiv in diverse neoplazii pentru ca vedem ce
populaii de celule limfocitare scad sau cresc pe de-o parte ,datorita
neoplaziei dar si terapiei .
Apoi , determinarea Ag HLA b 27 prezint iar o importan clinic
pentru c purttorii de HLA b 27 sunt mai predispui la anumite tipuri de
boli autoimune.
Apoi putem urmari scaderea numarului de celule CD4+ in SIDA si
putem urmari si stadiul de agresiune si corelatia cu bolile autoimune.
Putem urmri si evolutia sarcinii pentru c ftul e un fel de gref =>
organismul se adapteaz a.i. LTs devin hiperstenice si Limfocitele NK - au
rol inhibitor => va fi tolerat si protejat grefa.
Aceast urmrire a acestor populatii in cursul sarcinii => este
important pentru supravegherea sarcinilor atat normal cat si patologice .
Limfocitele reprezint cam 25-40% din totalul leucocitelor, deci sunt
cam 2500-4000/ mm^3. Din punct de vedere morfologic ( ce vedem la
MO), avem 2 grupe (limfocite mari si limfocite mici ).
Cele mici au 6-9 microni si am vzut ca sunt LB SI LT - le putem
obine prin tehnica rozetrii.
Limfocitele mari reprezint cam 15-20 % sin totalul limfocitelor din
sngele periferic . Ele au dimensiuni de 10-16 m, citoplasm abundent
cu granulocite , fiind reprezentate de celule NK - fac parte din celulele
efectorii in RIC ,dar sunt o punte legatura cu imunitatea innascut ptr ca
sunt foarte implicate in inflamatia acut.
Deci le putem separa - ceea mai interesant separare fiind cu CiF
=> avem LTH, LTC, LTS si LT contrasupresor.
Deci Ac monoclonali s-au creat prin tehnici de hibridizare=> sunt
inalt specifici ptr un singur Ag. Si denumirile CD(clasa de diferentiere) =>
e vorba de markerul care lega specific Ac monoclonal respectiv.
LT sunt majoritare (2/3) , au perioada de viata - foarte lunga - pn
la cateva zeci de ani si sunt intens recirculante => cauta mereu Ag ptr
care au fost preprogramate.Deci sunt tinere si nelinistite.
Markerii lor de suprafa : desen4
- receptori de recunoastere Ag => 2 varietati de receptori complexul TCR CD3 (in recunoasterea epitopilor prezentati prin moleculele
MHC de ctre APC) si CD4 ( MHC I) /CD8 ( MHC II)- recunosc moleculele
care prezint epitopi.

Receptorii de recunoatere Ag recunosc simultan


epitopul si molecula de prezentare a lui - foarte important ptr c asta
nseamn ca acesti receptori au 2 functii importante:
- recunoterea imunologica care e asociativ ( recunosc si
epitop si molecula MHC) si odat ce recunosc => vor fi principala cale de
activare metabolic a limfocitului.
- receptorii cu rol accesor in activarea LT ( doar primii nu
sunt suficienti ptr activare => deci avem un fel de activare suplimentar
=> realizeaza un soi de control intrinsec => trb s mai existe ceva ca sa
se activeze) - prin CD 28 si CD 45 (acetia sunt cei mai importanti)
- receptori de adeziune intercelular - avem CD 2 pe
membrana limfocitar - care recunosc ligandul de pe eritrocit - recunosc
CD 58 si mai e LFA1 ( Ag asociat funciei limfocitare)(pe lng cd2) - acesti
receptori aduc celulele in contact c altfel nu poate avea loc
recunoaterea ( sunt primii in acest proces de recunoatere).
LT recunoate structurile Ag ( epitopii) dup structura lor primar - e
vorba de niste determinani Ag liniari - din secvene de aa si TCR recunosc secvenele hidrofile - determinani sunt prezentai de MHC prin
secvenele lor hidrofobe.
O alt caracteristic - evident LT recunoate doar Ag prezentat in
raport cu molecula MHC si expuse pe mb APC in cadrul cooperri celulare
LT-APC.
A treia caracteristic e asociativitatea.

Structura favorizeaz functia - TCR e un complex heterodimeric ( o


molecul Ig -like) format din 2 lanturi transmembranare asociate prin
punti bisulfurice. Aceste lanturi sunt alfa si beta .
Alfa are =45 kDa ,e elaborat dup gene de pe cr 14 , iar beta are
=40 kDa si e elaborat dupa gene de pe cr 7 . Avem de-a face cu lanturi
dispuse transmb cu captul
aminoterminal la exterior si cel carboxiterminal la interior , avand
conformatie de Ig like.
La exterior aceast structur se dispune in 2 bucle - 1 bucl (cea
aminoter-minal) e domeniul variabil si cealalt va fi domeniul constant.
Domeniul variabil are 100-110 aa - e variabil de la o celul la alta .
Sunt pozitionate fata in fata a.i. alctuiesc o cavitate in interiorul careia se
poate fixa i lega Ag - deci aceasta cavitate va fi situsul combinativ ptr
recunoaterea Ag .
Aceste 2 domenii sunt cele mai importante deoarece prin interm lor
e recunoscut epitopul.
Domeniile constante( C alfa si C beta) contin niste secvene de aa
regsite la majoritatea limfocitelor .
Domeniile variabile (V alfa si V beta) nu angajeaza legturi cu
epitopul prin toat lungimea lor ,ci contactele cu epitopii se realizeaz prin
scurte secvente aa care vin in contact cu acesta prin plicaturarea

domeniilor acestora, iar plicaturarea are la baz stabilirea de punti


bisulfurice.
Deci am 3 plicaturi ptr lantul alfa si inca 3 pentru lantul beta.
Varfurile acestor plicaturi au secvente scurte de aa (8-15) direct in contact
cu epitopul si cu molecula MHC. Deci aceste zone vor recunoaste aceste
structuri prin complementaritate , prin potrivire ,deci se numesc regiuni
determinante ale complementarittii (CDR ) si avem 3 astfel de CDR
pentru lantul V alfa si inca 3 pentru V beta . Toate sunt numerotate CDR 1,
CDR 2 si CDR 3 pentru V alfa si la fel pentru V beta. Deci in total vor fi 6
regiuni CDR.
Epitopul este exprimat , legat la molecula MHC care se exprim pe
APC.
Se realizeaza contacte selective si acest lucru se realizeaza in timpul
colaborarii celulare dintre LT si APC.
CDR1 si CDR2- leag si recunosc domeniile polimorfe ale
moleculelor MHC
(alfa 1 si alfa 2 ptr MHC I / alfa 1 si beta 1 pentru MHC II) in timp ce doar
CDR3 recunosc direct determinantul Ag.
Prin TCR=> recunoatere asociativ intrareceptorial.
Cele 6 CDR => alctuiesc o substructura a situsului combinativ ptr
Ag care se numeste PARATOP.
Dup aceasta zona variabil =>avem zon balama si apoi domeniul
constant.
Zona balama - e o portiune cu o mare flexibilitate a.i. favorizeaz
contactul regiunii variabile cu complexul MHC-epitop .
Segmentele transmembranare au cam 20 aa , iar segmentele
intracito-plasmatice - au 5-12 aa ( sunt foarte scurte).
In concluzie , functiile TCR sunt recunoasterea Ag , dar si generarea
de semnale activatoare si cum segmentele intracitoplasmatice sunt foarte
scurte=> aceste semnale activatoare nu se vor putea transmite mai
departe in citoplasm => CD R trebuie s asocieze CD 3 - e un complex
pentameric alctuit din 3 lanturi scurte ( gama , delta , epsilon) cu mase
moleculare foarte mici , elaborate dup gene de pe cr 11 , legate prin
punti disulfurice intre ele si cu TCR si inc 2 lanturi lungi (identice intre
ele)- lanturi zeta- foarte lungi si foarte fine, elaborate dupa gene de pe cr
1 si sunt asociate prin punti bisulfurice intre ele si cu celelalte lanturi =>
alctuiesc un complex heptameric .
Daca am asociat aceste lanturi lungi - au rol in transmiterea
semanlului generat in momentul recunoasterii Ag . In portiunea
intracitoplasmatic adnc => exist niste secvente ( au 3 ITAM pe
fiecare lant- secv aa identice bogate in Tyr ,imuno receptor tyrozisine baze
motivation = motive activatoare tyr imunoreglatoare) . Aceste motive au
rol de fixare a unor PK - zap 70 (= protein kinaza asociat lanturilor zeta)
Semnalul activator generat prin recunoasterea Ag se va transmite
din lan in lan, in cele din urma prin lanturi beta si e stabilit accesul la
sistemele enzimatice citoplasmatice.
CD4:
- sintetizat dupa gene de pe cr 12 , =60 kDa , distribuit pe suprafata LTH

- e o GP transmb , captul aminoterminal extern si carboxiterminal intern ,


segmentul intracitoplasmatic e foarte lung ,iar cel extern =>4 domenii 1,2,3,4.
-domeniul 1 recunoaste domeniul constant alfa 2 al moleculei MHC II si il
leag
-domeniul intracitoplasmatic - are rol in activarea metabolic a limfocitului
TH pentru ca vine in contact direct cu PK -p56 LCK- kinaza caracteristic
leucocitelor .
-D1 recunoaste domeniul monomorf al moleculei MHC II - e foarte
important ptr ca moleculele MHC II nu sunt ori sunt vide si chiar daca au
epitop - exista sanse sa nu fie cel ptr TH => in acest caz- aceste semnale
se blocheaza limfocitul - activat doar cand poart epitop si acesta la
rndul lui e recunoscut de CD3 (deci cand aceste semanle converg si
activeaz celula).
CD8 :
-e o GP transmembranar cu =70 kDa , elaborat de gene de pe cr 2
-e un complex heterodimeric, Ig -like ,avand 2 lanturi - alfa si beta , iar
fiecare lant => cate un domeniu extern (captul amino e ext , iar carboxi
e int) care angajeaz legturi cu domeniul monomorf al MHC I( alfa 3)
-se gsete pe Tc/Ts , fiind un marker definitoriu pentru aceste celule .
- CD 8 particip la cooperarea cu APC , prin legturi cu domeniul
monomorf alfa 3 al molec MHC I.
- segmentul intracitoplasmatic este in contact cu Pk P56 LCK
- acesti receptori TCR si cd3 + cd4/cd8 => recunoatere antigenic
asociativ dubl
-TCR si CD3 prezint recunoatere asociativ intrareceptorial ,iar prin
intermediul cd4 / cd8 care se asociaz la TCR => se va recunoate
molecula MHC inter-receptorial => Prin intermediul TCR, CD 3 si CD 4/8
=> recunoatere Ag dubl intra- si inter- receptorial.
Limfocitul T are contact in acelasi moment cu moleculele
prezentatoare de Ag si cu epitopul (prin CD3).
Putem sa intelegem ca LT poate recunoate doar Ag membranare ,
dar nu orice fel , ci doar cele expuse prin intermediul moleculelor MHC
pentru c asa mai exist Ag mb constitutive sau atasate mb , ele fiind
haptene sau Ac .
LT - nu recunosc decat Ag membranare prezentate prin MHC => deci
recunoaterea e MHC restrictiv.