UNIVERSIDAD LAICA ELOY ALFARO

DE MANAB
TEMA:
DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE AMINOCIDOS PPTIDOS Y PROTENAS

Fecha:
09/08/2016
AO 2016- PERODO 1

INTRODUCCION

Los aminocidos son la base de todo proceso vital ya que son absolutamente necesarios en
todos los procesos metablicos.
Los aminocidos son las unidades qumicas o elementos constitutivos de las protenas que a
diferencia de los dems nutrientes contienen nitrgeno.
Para entender la importancia de los aminocidos se debe conocer cul es las protenas en
nuestro organismo. Las protenas proporcionan la estructura a todos los seres vivos.
Despus del agua, las protenas constituyen la porcin ms grande de nuestro peso, ya que
forman los msculos, ligamentos, tendones, rganos, glndulas, uas, cabellos, fludos
corporales y son indispensables para la formacin del hueso.
Las protenas estn compuestas por cadenas de aminocidos unidos por enlaces ppticos.
Tanto los aminocidos que las componen, como la secuencia en que stos estn
organizados, es lo que otorga a cada protena sus caractersticas y funciones individuales.

DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE AMINOCIDOS PPTIDOS Y

PROTENAS
Los grupos amino, carboxilo de los aminocidos libres y los sulfhidrilo, fenlico, hidroxilo,
tioter, imidazol y guanidino de los grupos R, en las protenas son capaces de reaccionar
qumicamente con otras molculas orgnicas. La inestabilidad qumica de pptidos y
protenas ha sido revisada exhaustivamente. Algunas de estas reacciones se utilizan en la
industria alimentaria para modificar las propiedades de hidrofobicidad e hidrofilicidad, y
por consiguiente, las propiedades funcionales de las protenas y pptidos.
Por ejemplo las reacciones de los aminocidos con la ninhidrina, el o-ftalaldehdo, o con
fluorescamina son utilizados regularmente en la cuantificacin de aminocidos.
Reacciones qumicas de los grupos funcionales de las protenas
Reaccin con ninhidrina.

Se utiliza a menudo para cuantificar aminocidos libres,

pptidos y protenas. El aminocido reacciona con un exceso de ninhidrina, que le causa

una desaminacin oxidativa y la produccin de amoniaco, el aldehdo correspondiente, que
tiene un tomo menos de carbono que el aminocido original, CO2 e hidrindantina que
proviene de la reduccin simultnea de la ninhidrina. El amoniaco liberado
subsecuentemente reacciona con una molcula de hidrindantina, formando un producto
color prpura conocido como morado de Ruhemanns, que tiene una absorbancia mxima a
570 nm. La prolina y la hidroxiprolina dan un producto amarillo que tiene una absorbancia
mxima a 440 nm.

Reaccin con fluorescamina

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Los aminocidos, pptidos y protenas que contienen aminas primarias producen, con
fluorescamina, un derivado altamente fluorescente con una mxima emisin a 475 nm
cuando la excitacin se hace a 390 nm. Este mtodo se puede utilizar para cuantificar
aminocidos, protenas y pptidos. Es mucho ms sensible y no tiene las desventajas de la
ninhidrina. El grupo amino que ha reaccionado puede ser recuperado con alto rendimiento
por hidrlisis cida y puede ser identificado por anlisis subsecuentes. El exceso de
fluorescamina es inestable en presencia de agua, se hidroliza a productos no fluorescentes y
no reactivos, lo que permite que los pptidos detectados con fluorescamina puedan ser
analizados directamente.

Reaccin con orto-ftalaldehdo: La reaccin de aminocidos con O-ftalaldehdo (1,2benzeno dicarbonal) en la presencia de 2-mercaptoetanol produce un derivado fluorescente
que tiene una excitacin mxima a 380 nm y una emisin de fluorescencia mxima a 450
nm [Ec. 8]. Es tan sensible que es posible cuantificar aminocidos a niveles de picomoles
(10-12 mol). La ninhidrina, fluorescamina y O-ftalaldehdo no son especficos para
protenas porque estos reaccionan con otros grupos amino

Anlisis de los aminocidos de las protenas

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Este anlisis se efecta por mtodos de cromatografa de intercambio inico con dos
resinas, una catinica y otra aninica, con capacidad de separar las molculas del
aminocido por su afinidad. El paso previo es la hidrlisis de la protena a sus aminocidos
constituyentes, en condiciones muy drsticas, tanto cidas como alcalinas. En el primer
caso se somete la protena a una temperatura de 120C, con HCl 6N durante 10-24 horas.
En estas condiciones, los enlaces peptdicos se hidrolizan totalmente.
La hidrlisis en medio alcalino se lleva a cabo con NaOH a temperatura de ebullicin. La
principal ventaja de este mtodo es que el Trp no se destruye, pero se produce una fuerte
racemizacin de la mayora de los aminocidos y la destruccin de un porcentaje de Cys,
cistina, Ser, Thr Asn, Gln y Lys. Este mtodo se emplea ms bien cuando se desea
determinar Trp.
Cuantificacin de protenas
Existen diversos mtodos para la cuantificacin de las protenas, todos ellos basados en
alguna de sus propiedades tpicas, como puede ser la absorbancia de los grupos aromticos
a 280 nm, la reactividad del enlace peptdico o el contenido de nitrgeno total.

Absorbancia a 280 nm
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Las protenas purificadas son fcilmente detectadas y cuantificadas por sus propiedades de
absorbancia en UV a 280 nm, la que depende del nmero y posicin de sus residuos de
aminocidos aromticos Phe, Tyr, y Trp as como de puentes disulfuro entre los residuos de
Cys; se debe conocer el coeficiente de absorcin molar para poder calcular su
concentracin. Se debe considerar que todos los aminocidos, por su estructura qumica,
absorben a 210 nm y se encontrarn interferencias si en la solucin existen otras especies
qumicas que posean absorbancia en UV. Este mtodo tiene una ventaja adicional porque la
absorbancia de una protena puede aumentar cuando se depliega, expone sitios aromticos
que en condiciones normales no absorberan a 280 nm. El desplegamiento hace posible
calcular el coeficiente de absorcin molar si se conoce el nmero de puentes disulfuro y el
contenido de aminocidos aromticos.
La reaccin de biuret
Es especfica para la medicin del enlace peptdico, por lo que slo se recomienda para la
cuantificacin de protenas, mas no de hidrolizados, a menos que se conozcan los tamaos
moleculares y se adapte la protena estndar de la curva. Se utiliza una solucin diluida de
sulfato cprico en tartrato fuertemente alcalino, sta se adiciona a la solucin de protena,
resultando un compuesto de color entre prpura y violeta que absorbe a 540 nm, obtenido
probablemente por el acomplejamiento del Cu12 con dos enlaces peptdidos adyacentes.

El mtodo de Kjeldahl

Para la determinacin de N total es el ms utilizado, e incluso se toma como referencia

cuando se usan otras tcnicas. El mtodo no hace distincin entre el N que proviene de
protenas (de grupos amino y amida) y el no protenico (urea, aminocidos), lo que da lugar
a errores en clculo. El mtodo consiste en la digestin de la muestra con H2SO4 y la
formacin de NH4OH que es recibido en cido para ser titulado con un lcali de
concentracin conocida.

Mtodos de tincin de protenas

Un reactivo que se utiliza comnmente para teir protenas es el azul brillante de
Coomassie, en sus formas R250 y G250. Estos colorantes no reaccionan qumicamente con
las protenas pero forman complejos no covalentes. Se considera que la interaccin es
principalmente inica, involucrando los grupos bsicos de las protenas, por lo que el
colorante no se unir de la misma manera a todas las protenas. Ambos colorantes son
similares en estructura, pero tienen diferencias fsicas y de procedimiento de tincin. El
azul de Coomassie G250 se utiliza para cuantificar protenas en solucin ya que el
complejo cambia sus propiedades de absorbancia: en condiciones cidas su absorbancia
mxima va de 465 a 595 nm. El azul de Comassie R250 se utiliza principalmente para la
tincin de protenas en geles, esto hace que las protenas queden fijas e insolubles en el gel.
Es posible detectar aproximadamente 0.1 mg de protena en geles de poliacrilamida.

Tincin con nitrato de plata

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El ms sensible de los reactivos para teir protenas fijadas en un gel o en un blot es la

tincin de plata, el cual puede detectar menos que un nanogramo (1029 g) de protena. Se
utiliza nitrato de plata en condiciones cidas y la reaccin est basada en los procesos
fotogrficos, donde al parecer se involucra a las cadenas laterales bsicas de la protena.
Determinacin de amino y carboxilo terminales
Existen diversos mtodos que requieren que ninguno de estos grupos se encuentre
bloqueado. La determinacin de grupo amino terminal involucra el marcaje qumico de
todos los grupos amino de la protena, incluyendo los de Lys, para posteriormente someter a
hidrlisis cida a la protena, a una separacin por electroforesis o cromatografa en papel,
para identificar a los aminocidos que tienen marcado el grupo a-amino. Los dos reactivos
ms usados son el fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNF) o reactivo de Sanger y el cloruro de
dansilo. La a-amino derivado con DNF se colorea de amarillo vivo. El derivado del cloruro
de dansilo, tambin llamado cloruro de dimetilaminonaftilsulfonilo, se obtiene en
condiciones fuertemente alcalinas, con la ventaja de ser altamente fluorescente.
Electroforesis
Las protenas, como ya se discuti son anfolitos debido a las cargas de algunas de sus
cadenas laterales. Cuando las protenas se someten a un campo elctrico pueden migrar
hacia el polo de carga contraria a su carga neta a un pH determinado, por un fenmeno
conocido como electroforesis. La protena se desplaza hacia el ctodo o el nodo,
dependiendo del balance global de grupos positivos y negativos a un pH determinado. La
velocidad de migracin est dada en funcin de la carga neta, y est influenciada por la
forma de la protena, sus dimensiones moleculares, la intensidad de la corriente aplicada y
el material utilizado como soporte, que puede ser poliacrilamida o papel. ste es el mtodo
analtico ms ampliamente usado para la separacin de protenas y es muy til para el
anlisis de proteomas.

BIBLIOGRAFIA
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