Direccin General de Pregrado

Vicerrectora Acadmica

Gua de Trabajos Prcticos

Bioqumica General
CDIGO: DBIO1038
2016

INDICE

Calendarizacin General de los laboratorios

Indicaciones Generales para el Trabajo de Laboratorio

Sesin 1: Bioseguridad en el Laboratorio, Normas APA y Preparacin de Soluciones

Sesin 2: Construccin de una Curva de Calibracin y Cuantificacin de Protenas

11

Sesin 3: Determinacin de Actividad Enzimtica

15

Sesin 4: Metabolismo de Glcidos :Determinacin de Glicemia

18

Sesin 5: Metabolismo de lpidos: Determinacin de Colesterol, Colesterol-HDL yTriglicridos

20

Sesin 6: Metabolismo Nitrogenado: Determinacin de GOT y GGT

26

CALENDARIZACIN GENERAL DE LOS LABORATORIOS ( LAS FECHAS SON PROPIAS DE CADA

SECCIN)

Fecha de
realizacin

N
Sesin

Tema

Tipo

Bioseguridad, Normas APA y Soluciones

Laboratorio

Construccin de Curva de Calibracin y Determinacin

de Protenas

Laboratorio

Determinacin de Actividad Enzimtica

Laboratorio

Metabolismo de Glcidos: determinacin de Glicemia

Laboratorio

5
6
7

Metabolismo de Lpidos: Determinacin de Colesterol,

Colesterol-HDL y Triglicridos
Metabolismo Nitrogenado: Determinacin de
aminotransferasa y gammaglutamiltransferasa
SEMINARIO CLNICO
Examen

Laboratorio
Laboratorio
Presentacin

INDICACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO

Del trabajo en laboratorio:

Los Laboratorios se desarrollan en dos mdulos y segn las fechas calendarizadas para cada
seccin.
Se exige un 100% de asistencia a las actividades prcticas, la ausencia a estas actividades implica
no cumplir con los requisitos de aprobacin para la asignatura ( ver Programa de la Asignatura)
Se exige puntualidad, el retraso en el horario de entrada implica el no ingreso al laboratorio y, por lo
tanto, la ausencia a ste y el no cumplimiento de los requisitos de aprobacin.
Es requisito para el ingreso y permanencia en el laboratorio el uso del delantal blanco cerrado de
mangas largas. El estudiante que no cumpla con esta condicin no puede ingresar al laboratorio,
quedando ausente de la actividad prctica.
Es requisito para el ingreso y permanencia al laboratorio la tenencia de un cuaderno de laboratorio
personal y los implementos necesarios para el registro de las anotaciones y resultados
correspondientes a cada prctico.
Cada estudiante es responsable del material entregado para que desarrolle cada prctico. Al finalizar
la actividad deber entregar los materiales en buenas condiciones, as como el lugar de trabajo limpio
y ordenado.
Se exige un comportamiento acorde al trabajo en laboratorio, por lo que aquellos estudiantes que no
presenten una conducta responsable y realicen desorden sern expulsados del laboratorio, quedando
ausentes de la actividad.
No se permite durante el desarrollo de las actividades prcticas el uso de celular y gorros, ingerir
cualquier tipo de alimento o bebida, masticar chicle, fumar, el uso de cualquier implemento ajeno al
trabajo de laboratorio que genere distraccin de los estudiantes. Las mochilas y/o bolsos deben ser
dejados ordenadamente en los estantes dispuestos para ello; no se permite la entrada y salida libre
del estudiante del laboratorio, la salida sin autorizacin implica que el estudiante no puede volver a
ingresar al laboratorio quedando ausente de la actividad.
Las actividades sern realizadas en grupos de cuatro estudiantes o segn las indicaciones del
profesor encargado.
En lo posible traer un notebook, ya que se necesitar buscar informacin o realizar clculos.
El estudiante debe llegar con la materia relacionada al prctico estudiada, con dominio y
conocimiento de las actividades a desarrollar durante cada laboratorio.En el aula virtual se
encuentran disponibles la Gua de Laboratorios, adems de los informes y Trabajo Previo para cada
Laboratorio (excepto el Laboratorio 1 que no tiene Trabajo Previo).
El Trabajo Previo, tal como lo dice su nombre, debe traerse REALIZADO en forma individual y su
cumplimiento o no, contribuir a la nota de Evaluacin de Desempeo.
Al comienzo de cada Laboratorio se realizar un test corto de carcter individual de la materia
correspondiente a cada actividad prctica.
Los estudiantes debern entregar al TRMINO DE LA SESIN, un INFORME GRUPAL, que incluye
el TRABAJO PREVIO (ste deber consolidarse entre los trabajos previos individuales).
El informe se realizar en una hoja cuadriculada de cuadernillo, de ACUERDO AL FORMATO y el
Trabajo Previo y el Informe sern evaluados en conjunto.Recuerde revisar que en su trabajo estn
escritos los nombres de todos los integrantes del grupo.

De las Calificaciones:

Las actividades prcticas se calificarn con tres notas que equivalen al Solemne 1, Solemne 2 y
Solemne 3 y cada una de ellas contempla las notas de los controles, Informes ( que incluyen los
Trabajos Previos) y la nota de Evaluacin de desempeo, adems de una nota correspondiente a un
Seminario.
Estas notas se ponderarn de acuerdo a lo establecido en el programa de la asignatura.

SESIN N1: BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO, NORMAS APA Y PREPARACION DE

SOLUCIONES
INTRODUCCIN:
La Bibliografa utilizada en cualquier trabajo de investigacin acadmica juega un rol muy importante. En
los Trabajos Previos para preparar los Laboratorios, as como en los Informes, los alumnos debern
consultar y citar las fuentes bibliogrficas fidedignas.
Estas fuentes bibliogrficas para que se consideren vlidas, deben corresponder a libros o revistas
cientficas, no recomendndose citar textos encontrados en Internet que no correspondan a publicaciones
acadmicas.
Toda informacin obtenida de un trabajo, debe ser citada como perteneciente al o los autores del artculo,
constituyendo un plagio si no se efecta este procedimiento. (La accin de copiar y pegar constituye un
plagio). La idea, es recabar informacin, comprenderla y expresarla con las palabras propias, citando la
fuente bibliogrfica de donde se obtuvo la informacin.
Las citas bibliogrficas tienen un formato definido, el cual puede realizarse de acuerdo a distintas normas,
por ejemplo:estilo AMA, estilo Vancouver, estilo APA, entre otras.
Una de las ms usadas son las Normas APA de la Asociacin Estadounidense de Psicologa (American
PsychologicalAssociation,. A.P.A.) y son las que aprenderemos a usar y sern exigidas en todos los
trabajos.

En la actualidad la utilizacin de soluciones se ha masificado en diversas reas de la ciencia, de tal forma

que su preparacin constituye una prctica rutinaria de la cual la medicina no queda exenta. Se entiende
por disolucin a la dispersin homognea del soluto en un solvente. Este proceso generalmente requiere
de una fuente de energa para que ocurra, que puede ser calor y/o una fuerza mecnica como la agitacin.
Las soluciones ms comnmente utilizadas son aquellas en las que el soluto es un slido o un lquido y el
solvente es un lquido, normalmente agua.La concentracin de la solucin nos da informacin acerca de
la cantidad de soluto incorporado en el solvente, expresado en unidades de concentracin. Existen
diversas formas de expresar la concentracin, pero slo se analizarn aquellas unidades de mayor
aceptacin internacional. Las unidades de concentracin ms utilizadas son p/p, p/v, Molaridad,
Normalidad. En muchas ocasiones es fundamental preparar ciertas soluciones a concentraciones muy
bajas y en forma precisa. Las soluciones son ms estables a mayor concentracin, por lo que stas se
almacenan lo ms concentradas posibles. Cuando se trata de un producto de alto costo, se prepara slo la
cantidad necesaria del producto deseado para optimizar recursos, por lo que es til entender el concepto
dilucin seriada.
Dilucin Seriada: El objetivo de las diluciones seriadas es obtener una solucin diluida a partir de otra
solucin concentrada, a travs de diluciones sucesivas de volumen y concentracin establecidos por el
usuario. La magnitud de las diluciones y el volumen final de soluciones son establecidos por el usuario de
acuerdo a la disponibilidad de material para realizarlo y sus objetivos, ya que una de las finalidades de esta
tcnica es facilitar en la prctica la dilucin de una solucin concentrada para su cuantificacin. El clculo
6

de concentraciones y alcuotas se determina mediante la relacin: C1xV1=C2xV2, teniendo siempre claro la

concentracin de la solucin inicial y la de la solucin final, y el volumen de la solucin final. La siguiente
Figura muestra un ejemplo de una dilucin de una solucin de albmina.
Si se conoce la concentracin de la solucin original, y se efectaun nmero determinado de diluciones
seriadas, es factible obtener distintas concentraciones de una solucin final segn lo que se necesite.
200 L
200 L
200 L
Solucin
de
albmina

200 L
200 L
H2O
A

200 L
200 L
H2O
B

200 L
200 L
H2O
C

Se eliminan
200 L
H2O
D

200 L
H2O
E

Micropipetas: son instrumentos volumtricos bastante precisos, que permiten medir volmenes pequeos.
Poseen un dial que permite variar la cantidad de volumen a pipetear. Este volumen est medido en micro
litros (L).Existen distintasmicropipetassegn su capacidad : de 1-20 L, de 20-100 L, de 100-1000 L
Equivalencia de unidades
Recuerde que:
1 ml=1000 L
Por lo tanto, para transformar mL a L, debe multiplicar por unfactor unitario. Por ejemplo, si desea tomar
0,45 mL,el clculo de equivalencia es :
,

1000
=
1

Para el uso correcto de las micropipetas, considere que se trata de material volumtrico delicado, por lo
que deben tratarse con cuidado y no forzarlas. Para medir adecuadamente un volumen, debe seguir los
siguientes pasos:
1)
2)
3)
4)

Marcar en el dial el volumen deseado.

Apretar el mbolo hasta el primer tope. ( con el pulgar, segn imagen)
Con la pipeta bien recta, introducir la punta en el material a pipetear.

Aspirar el contenido previamente ajustado, cuidando de no generar burbuja.

5) Para verter el volumen aspi

aspirado, apretar el mbolo, hasta el segundo tope para vaciar el
volumen completamente.
6) Se desecha la punta en el recipiente correspondiente despus de terminar
terminar.

Soluciones de uso en el rea de la S

Salud.
1.- Suero fisiolgico: El suero fisiolgico es una solucin de agua destilada con cloruro de sodio en una
concentracin determinada que corresponde a 0,9 g de NaCl (s) puro en 100 ml de solucin ( 0.9 %
p/v),la
la que se puede expresar tambin como: 9 g/litro. Es una solucin isotnica, ya que tiene la misma
osmolaridad que la sangre.Por
Por la importancia y frecuencia de utilizacin en Clnica, Ud. deber recordar la
forma de prepararlo.
2.- Sueros glucosados: Son soluciones de suero fisiolgico con glucosa (C6H12O6), en diferente
concentracin. En la farmacia se encuentran al 5 % p/v; 10 % p/v y 20 % p/v. Por lo tanto revise los
conceptos de soluciones y los clculos involucrados para prepararlos, para comprender el significado de
cada concentracin.
Para ser suministrados a un ser vivo
vivo, tanto el suero fisiolgico como los glucosados, deben estar estriles.
3.-Tintura de Yodo: Es una solucin alcohlica que contiene 6,5 % p/v de yodo puro; 2,5 % p/v de yoduro
de potasio, etanol y agua destilada. Se utiliza como desinfectante. Si quisiramos preparar 1000 g de
Tintura de yodo se requiere:
I2 (s)
=
65 g
KI (s)
=
25 g
C2H5OH (l)
=
846 g
H2O (l)
=
64 g
4.- Solucin de Hipoclorito de Sodio: El hipoclorito de sodio se expende en el comercio bajo distintos
nombres (Clorinda, cloro lquido, etc.) y la concentracin del hipoclorito de sodio nos permite liberar cloro
gaseoso segn la siguiente ecuacin qumica:
2H2O(l) + 2ClO-(ac)

Cl2(g) +

4OH- (ac)

Se ha determinado que esas soluciones comerciales contienen cloro al 4 % p/v

Ud. deber calcular la cantidad en volumen de esa solucin comercial para obtener distintos volmenes de
solucin al 0,5 % p/v.

MATERIALES:
Balanza digital.
Pipetas y micropipetas.
Propipetas.
Probetas
Vasos de precipitados.
Tubos de ensayos.
Matraz aforado.
NaCl(s); C6H12O6(s); I2(s); KI(s); C2H5OH (l), Solucin de hipoclorito de sodio comercial.
Pisetas con Agua destilada

ESTRATEGIA
Aprendizaje colaborativo,se trabajar en grupos de 3-4 alumnos o segn lo indique el profesor. El grupo
deber organizarse para llevar a cabo todas las actividades.
ACTIVIDADES:
1) Preparacin de soluciones de suero fisiolgico, de suero glucosado al 5 % y clculo de sus
densidades.
a) Preparacin de solucin de suero fisiolgico y clculo de su densidad.
a) Realice los clculos correspondientes para determinar la cantidad deNaCl (s) puro necesario para
preparar 10,0 ml de suero fisiolgico.
b) Pese en la balanza esa cantidad de NaCl (s) puro y vacelo cuidadosamente a un matraz aforado de
10,0 ml. Vaya agregando agua y agitando. Afore, coloque la tapa del matraz y mezcle cuidadosamente.
c) Clculo de la densidad del suero fisiolgico: Pese un vaso precipitado limpio y seco (con capacidad
para recibir los 10,0 ml de suero fisiolgico) y anote el valor de su masa.
d) Trasvasijecon mucho cuidado, el suero fisiolgico que Ud. prepar, desde el matraz aforado al vaso de
precipitado recin pesado. Vuelva a pesar y por diferencia de pesada, determine el peso de los 10,0 ml de
suero fisiolgico y calcule la densidad de la solucin preparada.

b) Preparacin de solucin de suero glucosado al 5% y clculo de su densidad.

a) Realice los clculos para determinar la glucosa necesaria para preparar 10 ml de suero glucosado al
5%.
b) Pese sobre papel, la cantidad de glucosa necesaria para preparar esa cantidad de suero glucosado al
5%.
c) Agregue la glucosa pesadaal vaso de precipitado que contiene el suero fisiolgico y agite hasta obtener
homogenizacin. La solucin as obtenida corresponde asuero glucosado al 5%.

d) Clculo de la densidad del suero glucosado al 5 %: Pese el vaso de precipitado que contiene el suero
glucosado al 5%, posteriormente vacelo a una probeta y mida su volumen. Con los datos
experimentales obtenidos determine su densidad.

2) Preparacin de solucin de hipoclorito de Sodio

a) Calcule el volumen de solucin comercial de Hipoclorito de Sodio, que se requiere para preparar 10
ml de solucin que contenga 0,5 % p/v de Cl2 (g) (Cloro activo).
b) Vace aproximadamente unos 5 ml , desde el frasco de reactivo que contiene solucin de hipoclorito
de sodio comercial a un tubo de ensayo con capacidad de 10 mL
c) Utilice pipeta parcial y succione con propipeta la cantidad de solucin comercial de hipoclorito de sodio,
calculada, vacela al matraz aforado y complete con agua hasta el aforo.

RESULTADOS :
En base a las experiencias efectuadas en este laboratorio, deber contestar las preguntas del Informe
respectivo.

10

SESIN N 2 CONSTRUCCCION DE CURVA DE CALIBRACIN Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS

INTRODUCCIN:
Absorcin colorimtrica.
Fundamentos:
Algunos compuestos qumicos y bioqumicos (protenas, carotenos, cidos nucleicos e hidratos de
carbono, por ej.), absorben una cierta intensidad de luz en el rango visible o UV del espectro. Los
compuestos que presentan esta propiedad se denominan cromforos.
Dependiendo del tipo de compuesto, ser diferente la longitud de onda a la cual absorben. La longitud de
onda de la luz se expresa generalmente en nanmetros (nm = 1 x 10-9 m) y nos da cuenta de la regin del
espectro que se est utilizando.
Las protenas y los cidos nucleicos,pueden absorber luz en la regin UV y/o visible. Dependiendo de la
concentracin y del tipo de protena o cido nucleico que se trate, se observar una mayor o menor
capacidad de absorcin de la luz
Los grupos funcionales aromticos confieren la propiedad de absorber la luz en el espectro UV.
La mayora de las biomolculas no absorben luz visible, excepto las que son coloreadas (ejemplo:
hemoglobina y mioglobina).
Algunasbiomolcula, al reaccionar con determinados compuestos qumicos forman productos coloreados
que absorben en el espectro visible.
Absorciometra
Si a una energa radiante que tiene una intensidad inicial denominada Iose le hace atravesar una cubeta
que contiene una solucin de unasustancia que absorbeesa energa radiante, la intensidad de la luz que
sale de la solucin (It )luego de atravesarla ser menor que Io.Ver las figuras.
La sustancia en solucin puede absorber a una cierta longitud de onda del espectro de luz UV(200-340 nm)
o visible (340-750 nm),

La Absorbancia se define como la cantidad de luz que es absorbida por una solucin a una longitud de
onda fija. Esta Absorbancia es directamente proporcional a la concentracin de la solucin.
La Ley de Lambert-Beer, define la relacin directamente proporcional entre la absorbancia y la
concentracin de una solucin y se precisa segn la siguiente frmula:

11

Donde:
A = Absorbancia
= Coeficiente de extincin molar, que es una constante caracterstica para cada sustancia.
l = Longitud que debe atravesar la luz, es tambin una constante que depende del equipo y generalmente
es igual a 1 cm.
c = Concentracin de la solucin.
Otro trmino asociado es la transmitancia, que se define como el porcentaje de la luz que atraves la
solucin en relacin con la intensidad de luz inicial Io y que tiene una relacin logartmica con la
Absorbancia.

Cuando una solucin de protenas se alcaliniza fuertemente con Hidrxido de sodio o de Potasio y se
agrega una solucin diluida de sulfato de cobre, se produce un color violeta, cuya intensidad es
proporcional a la concentracin de la protena de la solucin.
Esta reaccin, llamada reaccin de Biuret, es propia de las sustancias que contienen dos grupos
carbamilos (-CONH) unidos directamente o por medio de un tomo de carbono o de nitrgeno. Las
protenas y los pptidos (a partir de los tripptidos) presentan dicha estructura y por lo tanto, dan positiva
esta reaccin.
El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino), reacciona con compuestos que tienen dos o ms
enlaces peptdicos dando coloracin caracterstica. El color desarrollado se debe a la formacin de un
complejo de coordinacin entre el Cu++ y cuatro tomos de nitrgeno que provienen de dos cadenas
peptdicas.este color se puede medir por absorciometra.
Curva de calibracin: Fundamento:
Una curva de calibracin es la representacin grfica de una seal que se mide en funcin de la
concentracin de un analito. En este caso, la seal es el color desarrollado por la reaccin de Biuret, y el
analito corresponde a las protenas que queremos medir.
El color desarrollado se mide en un espectrofotmetro, a una longitud de onda tal, que permite medir el
color azul violeta (546 nm).
La etapa de calibracin analtica se realiza mediante un modelo de lnea recta que consiste en encontrar la
recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de n puntos experimentales, donde cada punto se
encuentra definido por una variable x (variable independiente, generalmente concentracin del analito de
inters) y una variable y (variable dependiente, generalmente respuesta instrumental, en este caso la
Absorbancia).
La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante
la ecuacin
y = mx + b .

12

MATERIALES
Espectrofotmetro ajustado a 546 nm.
Cubetas de plstico de 1,5 ml
Material volumtrico (micropipetas de 100 ul y de 1000 ul, tubos de ensayo)
Muestras de suero normal y patolgico,
Estndar de protenas totales.
Reactivo Biuret
Timer o cronmetro.
Agua destilada
MUESTRAS
Suero N
Suero P

ESTRATEGIA
Aprendizaje colaborativo,se trabajar en grupos de 3-4 alumnos o segn lo indique el profesor. El grupo
deber organizarse para construir una curva de calibracin para la determinacin de protenas plasmticas
por el mtodo de Biuret , luego hacer una determinacin de protenas en dos muestras desconocidasy
discutir sus resultados para realizar un informe grupal.

ACTIVIDADES
Construccin de la curva de calibracin: En nuestro caso, los puntos experimentales, son 5 y estn
dados por las coordenadas x e y correspondientes alos tubos 1,2,3,4, y 5, en que xes la concentracin de
protenas en g/dL e y es la Absorbancia a 546 nm.El tubo 1 corresponde al tubo blanco. La medida de la
Absorbancia del blanco puede realizarse de dos maneras: a) ajustando a cero la absorbancia del blanco o
b) restar la absorbancia del tubo blanco a la absorbancia de los tubos con distintas concentraciones del
analito (Absorbancia medida- Absorbancia del tubo blanco).
Cuantificacin de protenas en dos muestras desconocidas:
En razn de que se usar la curva de calibracin para obtener las concentraciones de las muestras
desconocidas, las muestras deben ser tratadas exactamente igual a los tubos de la curva y correspondern
a los tubos 6 y 7.

13

Preparacin tubos Curva de CalibracinPreparacin tubos muestras

N tubo
Estndar de protenas
8g/dL(mL)
H2O destilada (L)

1
0

2
20

3
30

4
40

5
50

50

30

20

10

0
Muestra N (L)
Muestra P(L)

Reactivo de Biuret (L)

2000

2000

2000

2000

2000

6
0

7
0

0
50
0
2000

0
0
50
2000

Concentracin de Protenas
(g/dL)

Mezclar por agitacin, incubar 10 minutos a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 546 nm.
Para poder realizar la curva de calibracin, usted deber calcular previamente, la concentracin de
protenas en cada punto. Realice los clculos y complete la tabla superior.Considere que el estndar de
protenas tiene una concentracin de 8.0 g/dl

RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.

14

SESIN 3: DETERMINACION DEACTIVIDAD ENZIMTICA

INTRODUCCIN: La catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos animales y
vegetales. La funcin de esta enzima en los tejidos es necesaria, porque durante el metabolismo celular, se
forma una molcula txica que es el perxido de hidrgeno H2O2 (agua oxigenada), que es necesario
eliminar. La catalasa esuna protena y podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al
desnaturalizarse, perder tambin la funcin y como consecuencia su funcin cataltica, por lo que no
podr descomponer al agua oxigenada.
Por otro lado, otra enzima, la amilasa o ptialina, presente en la saliva, acta sobre el polisacrido almidn,
hidrolizando el enlace O-glicosdico, por lo que el almidn se terminar por transformar en unidades de
glucosa. La presencia de almidn puede ser puesta de manifiesto mediante Lugol (solucin yodoyodurada), mientras que la glucosa (azcar reductor), puede ser puesta de manifiesto mediante la reaccin
de Fehling.
MATERIALES
Tubos de ensayo.
Mechero
Bao de agua termorregulado
Micropipetas de 1 mL.
Cuentagotas.
Esptula.
Placa calefactora.
Centrifugadora.
Puntas azules
REACTIVOS:
Fehling A: 7 g de sulfato cprico monohidrato en 100 ml de agua destilada.
Fehling B: 35 g de tartrato de sodio y 10 g de hidrxido de sodio en 100 ml de agua destilada.
Lugol: solucin de I2 al 1% en equilibrio con KI, al 2% en agua destilada
Solucin de almidn al 0,5%
Perxido de hidrgeno 10 volmenes.
MUESTRAS
Hgado de pollo
Saliva
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos, los que detectarn la accin de enzimas
provenientes de dos diferentes fuentes, utilizando reacciones apropiadas y discutirn sus resultados para
realizar un informe grupal.

15

ACTIVIDADES
1.-AMILASA

a)
b)
c)
d)
e)

a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)

Obtencin:
Preparar un tubo de ensayo limpio y colocarle encima un embudo con un filtro de papel.
Humedecer con suero fisiolgico este filtro hasta que aparezca alguna gota de filtrado en el tubo de
ensayo de recogida.
Activar en lo posible la secrecin de saliva y depositar sobre el embudo un poco de saliva escupiendo
suavemente.
Aadir 12 ml de suero fisiolgico en el embudo, para facilitar la filtracin y fluidificacin de dicha saliva.
Esperar que el volumen de filtrado en el tubo de ensayo, sea de unos 10 mL.
Deteccin
Colocaren una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1 al 4.
Aadir en cada tubo 5 mL de una solucin diluida de almidn (0,5 %).
A los tubos 3 y 4 aadir 1 ml de la solucin de amilasa obtenida de la saliva.
En el tubo 1, realizarla reaccin de Fehling.
En el tubo 2, realizar la Reaccin de Lugol.
Los tubos 3 y 4 que contienen el almidn, al que le hemos agregadola saliva, incubar a al bao Mara,
a 37 C, durante 15 min.
A continuacin, en el tubo nmero 3, realizar la Reaccin de Fehling y en el tubo nmero 4 realizar la
Prueba del Lugol.
Anotar los resultados obtenidos

16

Reaccin de Fehling: A 5 ml de unasolucin de azcar agregar 10 gotas de reactivo de Fehling A y 10

gotas de Fehling B calentar a ebullicin por 1 minuto.Si se forma un precipitado naranja a rojo, la
reaccin es positiva.
Prueba de Lugol:A 5 ml de solucin del glcido a investigar, aadir unas gotas de Lugol.Si la disolucin
del tubo se torna de color azul-violeta, la reaccin es positiva.

2. CATALASA:

a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)

Deteccin de catalasa en hgado

Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hgado de pollo.
Aadir 5 mL de agua oxigenada de 10 volmenes recin preparada.
Observar y anotar el resultado
Colocar en otro tubo de ensayo varios trocitos de hgado.
Aadir 5 mL de agua y hervir durante unos 2 minutos.
Despus de este tiempo, retirar el sobrenadante.
Aadir el agua oxigenada (2-3ml aprox.) al hgado hervido.
Observar y anotar el resultado.

RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.

17

SESIN N4: METABOLISMO DE GLCIDOS: DETERMINACIN DE GLICEMIA

INTRODUCCIN: Los carbohidratos son uno de los principales componentes de la dieta en los seres
humanos. La glucosa es el monosacrido ms importante que se utiliza para extraer energa. Cualquier
alteracin en su metabolismo da origen a patologas, como la diabetes.El metabolismo de la glucosa
incluye, entre otros, los procesos degluclisis,glucgenolisis, gluconeognesis, los cuales son regulables
por hormonas tales como la insulina ,glucagn y adrenalina.
Las determinaciones de glucosa pueden realizarse en diferentes fluidos biolgicos, siendo el ms comn la
determinacin en sangre (glicemia).
Esta determinacin se realiza en estado de ayuno.
VALORES DE REFERENCIA GLICEMIA EN AYUNAS: 70 a 100 mg/dL

Hipoglicemia : valores por debajo de 70 mg/dL

Hiperglicemia : valores por encima de 100 mg/dL
Mtodo de determinacin:
Fundamento:Serealizamediante un ensayo enzimtico-colorimtricoque consiste en dos reacciones
enzimticas acopladas.
En la primera reaccin (reaccin especfica), catalizada por la enzima glucosa oxidasa (GOD), se oxida la
glucosa y se genera H2O2. En la segunda reaccin (reaccin indicadora), la enzima peroxidasa (POD)
cataliza la descomposicin del H2O2 lo que provoca oxidacin de un cromgeno que pasa de su forma
reducida(4-aminoantipirina, incolora) a su forma oxidada (quinoneimina,coloreada). La aparicin del
cromgeno oxidado (coloreado) se mide mediante un espectrofotmetro,siendo la coloracin producida
directamente proporcional a la concentracin de glucosa en la muestra. La coloracin se lee a
546nm.
Glucosa + O2

cido glucnico + H2O2

Glucosa-oxidasa

H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol

Quinoneimina + HCl + H2O

Peroxidasa

Se usa una solucin de glucosa de concentracin conocida con la que se hace la comparacin de
Absorbancia.

MATERIALES
Tubos de ensayo.
Bao de agua termorregulado
Espectrofotmetro
Micropipetas de 10Ly de 1 mL y sus respectivas puntillas.
Reactivo para determinacin de Glucosa
18

Estndar de Glucosa 100 mg/dL

MUESTRAS
Suero N
Suero P
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos los que cuantificarn la glicemia de dos
muestras distintas y discutirn sus resultados para realizar un informe grupal.
Determinacin de la Glicemia :
a)Prepare una serie de 4 tubos, de acuerdo a la tabla siguiente:
Tubo 1 (Blanco)

Tubo 2 (Estndar)

Tubo 3 (muestra N)

Tubo 4 (muestra P)

H2O (L)

10

Estndar de
Glucosa
(100 mg/dL) (L)
Suero Normal
(L)
Suero Patolgico
(L)
Reactivo GOD-PAP
(L)

10

10

10

1000

1000

1000

1000

Tubo 3 (muestra N)

Tubo 4 (Muestra P)

b)Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

c)Lea la absorbancia en espectrofotmetro a 546nm.
Tubo 1 (Blanco)

Tubo 2 (Estndar)

A 546 nm

d)Obtenga la concentracin de glucosa de ambas muestras.

Absorbancia de la muestra X 100 (mg/dL)
Glicemia (mg/dL)=
Absorbancia del Estndar
RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.
19

SESIN N5: METABOLISMO DE LPIDOS: DETERMINACIN DE COLESTEROL,COLESTEROL-HDL

Y TRIGLICERIDOS
INTRODUCCIN: Los lpidos se clasifican generalmente como sustancias orgnicas insolubles en agua,
pero solubles en solventes orgnicos. Los principales lpidos del plasma humano son colesterol,
triglicridos, fosfolpidos y cidos grasos. Estos lpidos son transportados en el plasma formando las
lipoprotenas.Las lipoprotenas se dividen en varias clases dependiendo de su densidad, lo que determina
su nomenclatura: Quilomicrones, VLDL (lipoprotenas de muy baja densidad), IDL (lipoprotenas de
densidad intermedia), LDL (lipoprotenas de baja densidad) y HDL (Lipoprotenas de alta densidad).
Los lpidos plasmticos de mximo inters para diagnstico y monitorear los tratamiento de las
dislipidemias son el colesterol y los triglicridos. Los mtodos rutinarios de Laboratorio determinan a estos
lpidos como parte de las lipoprotenas. Dentro de las lipoprotenas las de mayor inters clnico son las HDL
y las LDL, porque se correlacionan con el riesgo de enfermedades cardiovasculares.
En este laboratorio, determinaremos: Colesterol Total, Trigliceridos y lipoprotenas HDLen dos
muestras distintas.Por otra parte, calcularemos las lipoprotenas LDL, de tal forma de obtener un Perfil
Lipdico de ambas muestras.
Mtodos de determinacin.
Fundamentos.
Mtodo para determinar colesterol total:
Se realiza mediante un ensayo enzimtico-colorimtricoque consiste entresreacciones enzimticas
acopladas.
En la primera reaccin,los steres de colesterol contenidos en las lipoprotenas son hidrolizados por la
enzima colesterol hidrolasa,, en la segunda reaccin, la colesterol oxidasa , oxidael grupo 3-OH del
colesterol y se forma perxido de hidrgeno, y en la tercera reaccin la enzima peroxidasa cataliza la
descomposicin del H2O2 lo que provoca oxidacin de un cromgeno que pasa de su forma reducida(4aminoantipirina, incolora) a su forma oxidada (quinoneimina,coloreada). La aparicin del cromgeno
oxidado (coloreado) se mide mediante un espectrofotmetro,siendo la absorbancia del producto
coloreado ser directamente proporcional a la concentracin de colesterol en la muestra. La
coloracin se lee a 546nm.

Ester de Colesterol + H2O

Colesterol hidrolasa

Colesterol + c. Graso

Colesterol + O2Colest-4-en-3-ona + H2O2

Colesterol Oxidasa
H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol

Quinoneimina + HCl + H2O

Peroxidasa

VALORES DE REFERENCIA:ColesterolTotal Menor que 200 mg/dL

20

Mtodo para la determinacin de lipoprotenas:Las lipoprotenas plasmticas son complejos

macromoleculares esfricos encargados de transportar los lpidos de forma soluble en la sangre. En su
ncleo se ubican los lpidos y en la superficie se encuentran las apolipoprotenas. Las distintas
lipoprotenas tienen diferente cantidad y tipo de apoprotenas y ello se usa para determinar algunas de
ellas.
La HDL es la nica lipoprotena que no posee apolipoprotenaapo-B en su estructura y los mtodos de
laboratorio utilizan esta propiedad para separarla de las otras lipoprotenas y cuantificarla en forma
separada.
Mtodo de Determinacin de Colesterol-HDL:Se utiliza un reactivo precipitante que contiene ciertas
sales que reaccionan con las apo B precipitando a las lipoprotenas que la contengan. Como las HDL no
tienen esta apoprotena no precipitan, y quedan en el sobrenadante. Al determinar el colesterol que est
en el sobrenadante, se estar determinando slo a las HDL.
VALOR DE REFERENCIA: HDL mayor a 35 mg/dL

Mtodo de determinacin de Triglicridos:

Se realiza mediante un anlisis enzimtico-colorimtricoque consiste encuatroreacciones enzimticas
acopladas.
En la primera reaccin,los triglicridos son hidrolizados por la enzima lipasa, en la segunda reaccin, el
glicerol es fosforilado con ATP por la glicerol quinasa para producir glicerol-3-fosfato.En la reaccin
siguiente, el glicerol-3-fosfato en presencia de O2 es oxidado a dihidroxicetona fosfato, con liberacin de
H2O2. Finalmente, el H2O2 formado reacciona con 4-aminoantipirina, en presencia de peroxidasa, formando
quinoneimina, que absorbe a 546 nm, siendo su formacin directamente proporcional a la cantidad de
triglicridos presente en la muestra.

Triglicridos

Glicerol + cidos grasos

Lipasas

Glicerol + ATP Glicerol- 3-Fosfato + ADP

Gliceroquinasa
Glicerol- 3-Fosfato + O2

Dihidroxiacetonafosfato + H2O2
Glicerol 3 fosfato oxidasa

H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol

Peroxidasa

Quinoneimina + HCl + H2O

VALOR DE REFERENCIA: Trigliceridemiamenor que 150 mg/dL

21

MATERIALES

Tubos de ensayo.
Bao de agua termorregulado
Espectrofotmetro
Centrfuga
Micropipetas de 10 L, 100Ly de 1 mL y sus respectivas puntillas.
Reactivo para determinacin de Colesterol
Reactivo precipitante
Reactivo para determinacin de Triglicridos
Estndar de colesterol total
Estndar de Colesterol-HDL
Estndar de Trigliceridos

MUESTRAS
Suero N
Suero P
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos los que cuantificarn el colesterol total ,
Colesterol-HDL y Triglicridos de dos muestras distintas y discutirn sus resultados para realizar un
informe grupal.

PROCEDIMIENTOS:
Determinacin de Colesterol : Se cuantificar la cantidad de colesterol total y colesterol HDL presente
en dos muestras sricas. El trabajo se realizar en dos fases:
Fase 1: Separacin de lipoprotenas HDL del resto de las lipoprotenas.
Fase 2:Cuantificacin del colesterol total (de todas las lipoprotenas, sin separar) y cuantificacin de
colesterol HDL ( el colesterol que est en el sobrenadante de la precipitacin)
Fase 1: Separacin de HDL
1) En dos tubos de ensayos colocar 0.1 ml de suero N y 0.1 ml de suero P, respectivamente.
Agregar a ambos tubos ,1 ml de reactivo precipitante .El reactivo precipitante reacciona con
apolipoprotenas B, por lo tanto quedar sin precipitar la HDL solamente, ya que es la nica que no
posee apo B.
2) Incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente y posteriormente centrifugar a 5.000
rpm por 5 minutos.
3) Luego de centrifugar no mueva el tubo para no mezclar y dejarlo hasta la determinacin.

22

Fase 2: Cuantificacin de Colesterol Total y Colesterol-HDL

Cuantificacin de Colesterol Total:
Preparar cuatro tubos, segn lo indicado a continuacin:

Tubo 1 (Blanco)

Tubo 2 (Estndar)

Tubo 3 (muestra N)

Tubo 4 (muestra P)

H2O (L)

100

Estndar de
Colesterol
(200 mg/dL) (L)
Suero Normal
(L)
Suero Patolgico
(L)
Reactivo para
determinacin de
Colesterol
(L)

100

100

100

1000

1000

1000

1000

Tubo 3 (muestra N)

Tubo 4 (Muestra P)

b) Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

c) Lea la absorbancia en espectrofotmetro a 546nm.

Tubo 1 (Blanco)

Tubo 2 (Estndar)

A 546 nm

d) Obtenga la concentracin de colesterol de ambas muestras.

Absorbancia de la muestra X 200 (mg/dL)
Colesterolemia (mg/dL)=
Absorbancia del Estndar

23

Cuantificacin de Colesterol-HDL :
Preparar cuatro tubos, segn lo indicado a continuacin. Tenga precaucin al aspirar los sobrenadantes
para que no se contaminen con el precipitado.
Tubo 1 (Blanco)

Tubo 2 (Estndar)

Tubo3
(sobrenadante
muestra N)

Tubo4
(sobrenadante
muestra P)

H2O (L)

100

Estndar de HDL
Colesterol
(150 mg/dL) (L)
Sobrenadante
muestra N
(L)
Sobrenadante
muestra P
(L)
Reactivo para
determinacin de
Colesterol
(L)

100

100

100

1000

1000

1000

1000

b) Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

c) Lea la absorbancia en espectrofotmetro a 546nm.
Tubo 1 (Blanco)

Tubo 2 (Estndar)

Tubo3
(sobrenadante
muestra N)

A 546 nm

d) Obtenga la concentracin de colesterol-HDL de ambas muestras.

Absorbancia de la muestra X 150 (mg/dL)
Concentracin de colesterol-HDL (mg/dL)=
Absorbancia del Estndar

24

Tubo4
(sobrenadante
muestra N)

Cuantificacin de Triglicridos
Preparar cuatro tubos, segn lo indicado a continuacin:

Tubo 1 (Blanco)

Tubo 2 (Estndar)

Tubo 3 (muestra N)

Tubo 4 (muestra P)

H2O (L)

10

Estndar de
Triglicridos
(200 mg/dL) (L)
Suero Normal
(L)
Suero Patolgico
(L)
Reactivo para
determinacin de
Triglicridos
(L)

10

10

10

1000

1000

1000

1000

Tubo 3 (muestra N)

Tubo 4 (Muestra P)

b) Incube los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.

c) Lea la absorbancia en espectrofotmetro a 546nm.
Tubo 1 (Blanco)

Tubo 2 (Estndar)

A 546 nm

d) Obtenga la concentracin de Triglicridos de ambas muestras.

Absorbancia de la muestra X 200 (mg/dL)
Trigliceridemia (mg/dL)=
Absorbancia del Estndar
RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.

25

SESIN N 6: METABOLISMO NITROGENADO: DETERMINACION DE AMINOTRANSFERASAS Y DE

GAMMAGLUTAMILTRANSPEPTIDASA
INTRODUCCIN:
Las AMINOTRANSFERASAS son enzimas ampliamente expresadasen el organismo, que catalizan la
transferencia de un grupo amino de un aminocido a un cetocido, en una de las reacciones ms
importantes del metabolismo de los aminocidos.
El inters clnico est centrado especialmente en dos de ellas:
GPT (transaminasa glutmico pirvica) o ALAT (alaninaaminotransferasa)
GOT ( transaminasa glutmico oxalactica) o ASAT (aspartatoaminotransferasa)
Las reacciones catalizadas por GOT y GPT son las siguientes:
Alanina + ac.-cetoglutarico
GPT
Ac. Asprtico+ac.-cetoglutrico
GOT

ac.Pirvico + ac. Glutmico

ac.Oxalactico + ac.Glutmico

Determinacin de aminotransferasas.
Fundamento:Las determinaciones de estas enzimas se basan en la medicin de los cetocidos, ya sea
del cetocido consumido o del cetocido formado. A medida que la reaccin transcurre, un cetocido
aumenta de concentracin, a medida que el otro disminuye.
Para su medicin, se utilizan reacciones enzimticas acopladas, y los cetocidos producidos por la
respectiva aminotransferasa, son reducidos a hidroxicidos por las enzimas lactato deshidrogenasa (LDH)
omalato deshidrogenasa (MDH)que utilizan coenzima reducida (NADH) para oxidarla a NAD+. En razn de
que el NADH absorbe a 340 nm, por la accin enzimtica de la aminotransferasa, se observar una
disminucin de la absorbancia a esta longitud de onda.

Piruvato + NADH + H+
LDH
** en la reaccin catalizada por GPT.

Oxalacetato + NADH + H+
MDH
**en la reaccin catalizada por GOT.

Lactato + NAD+

Malato + NAD+

La desaparicin del NADH por unidad de tiempo puede medirse por la disminucin de la absorbancia a
340nm.En estas mediciones el cambio de absorbancia por minuto (Abs/min) puede relacionarse
directamente con los micromoles de NADH oxidados que sern proporcionales a su vez con los
micromoles de sustrato transformados por minuto, lo que equivale a la actividad enzimtica de la
transaminasa respectiva.
26

Determinacin de gammaglutamiltransferasa(GGT)
La GGT cataliza la transferencia de una porcin de gamma-glutamil desde el glutatin a un aceptor (un aminocido, un
pptido o una molcula agua). Esta enzima juega un papel clave en el ciclo del gamma-glutamil, que permite transferir
aminocidos a travs de la membrana, y ser una va para la sntesis o la degradacin del tripptido glutatin.

Fundamento del mtodo de determinacin:

La gamma-glutamiltransferasa (-GT) cataliza la transferencia del grupo -glutamilo de la -glutamil-3carboxi-4-nitroanilida (sustrato artificial) a la glicilglicina, produciendoGlutamilglicilglicinay 3-carboxi-4nitroanilina.
La actividad de la enzima se determina midiendo la velocidad de formacin de la 3-carboxi-4- nitroanilina
que es el producto coloreado. Este producto absorbe a 405 nm.

1,2 Glutamil3carboxi4-nitroanilida + Glicilglicina Glutamilglicilglicina + 3carboxi4nitroanilina

MATERIALES

Tubos de ensayo.
Bao de agua termorregulado
Espectrofotmetro
Micropipetas de 100 Ly de 1 mL y sus respectivas puntillas.
Reactivo para determinacin de GOT
Reactivo para determinacin de GGT

MUESTRAS
Suero N
Suero P
ESTRATEGIA
Aprendizaje Colaborativo, se trabajar en grupos de 3-4 alumnos los que medirn cinticamente las
enzimas GOT y GGT en dos muestras distintas y discutirn sus resultados para realizar un informe grupal.

PROCEDIMIENTOS
Determinacin de la actividad de GOT
Se determinar la actividad de la enzima en dos muestras de suero y a una temperatura de 37C, para
ello, con cada muestra de suero realice el siguiente procedimiento:
a) En una cubeta de 1.0 mL agregue 1.0 mL de Reactivo y 100 L de suerob) Mezcle, incube y lea la absorbancia a 340 nmdespus de un minuto exacto. Realice lecturas despus
de 1, 2 y 3 minutos a contar dede la primera lectura. Lea frente a blanco de aire.
c) Luego de obtener las lecturas en absorbancia, calcule la diferencia de absorbancia por minuto
(Abs/min).

27

 Absorbancia = Absorbancia 1 absorbancia 2

Absorbancia = Absorbancia 2 absorbancia 3
Absorbancia = Absorbancia 3 absorbancia 4
Obtenga el promedio Abs/min.
Este promedio se multiplica por un factor estandarizado segn la temperatura con la que se trabaja ( F a 37
C =2143).
Actividad enzimtica (U/L) = Absorbancia340 nm/min x F
Determinacin de la actividad de gammaglutamiltranferasa
Se determinar la actividad de la enzima en dos muestras de suero y a una temperatura de 37C, para
ello,con cada muestra de suero realice el siguiente procedimiento:
a) En una cubeta de 1.0 mL agregue 1.0 mL de Reactivo y 100 L de suero
b) Mezcle, incube y lea la absorbancia a 405 nm despus de un minuto exacto. Realice lecturas despus
de 1, 2 y 3 minutos a contar de la primera lectura. Lea frente a blanco de aire.
c) Luego de obtener las lecturas en absorbancia, calcule el cambio de absorbancia por minuto
(Abs/min).

Absorbancia = Absorbancia 2 absorbancia 1

Absorbancia = Absorbancia 3 absorbancia 2
Absorbancia = Absorbancia 4 -- absorbancia 3
Obtenga el promedio Abs/min.
Este promedio se multiplica por un factor estandarizado segn la temperatura con la que se trabaja ( F a 37
C =1158).
Actividad enzimtica GGT(U/L) = Absorbancia405 nm/minx F
RESULTADOS:
Los resultados obtenidos debe presentarlos contestando las preguntas del Informe.

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