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Mtodo de Lowry.
Objetivo.
Mtodo experimental.
Curva de calibracin:
1) adicionar albumina y los reactivos de acuerdo a las tablas
2) Dejar desarrollar el color durante 30 min y leer en el espectrofotmetro a 590 nm
3) Registrar la absorbancia obtenida.
Anlisis estadstico:
1) Preparar 10 tubos con las mismas condiciones del tubo 3 de cada mtodo
2) Dejar desarrollar color durante 30 min y leer en el espectrofotmetro a 590 nm.
Efecto de sustancias no protenicas en el mtodo de Lowry:
1) Preparar 5 tubos con las mismas condiciones del tubo 3.
2) Se adiciona 0.1 ml de las primeras 5 sustancias interferentes de la tabla y se lee en el
espectrofotmetro.
Resultados.
Elaboracin de la curva de calibracin.
Tabla 1. Curva de calibracin de albumina. Mtodo de Lowry
Tubo
No.
Cantidad
de
protena
( g)
1
2
3
4
5
25
50
75
100
125
Serie A
Serie B
590nm
590 nm
0.067
0.127
0.177
0.242
0.292
0.07
0.123
0.188
0.244
0.276
R=0.9965
Serie B
0.1
serie A
0.05
0
20
40
60
80
100
120
Y A
B
Y 0.0159
0.002196
Tubo No.
A590
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.192
0.2
0.211
0.184
0.187
0.187
0.208
0.195
0.197
0.219
Cantidad
de
protena (g)
80.19
83.83
88.84
76.74
77.91
77.91
87.47
81.55
82.46
92.48
Anlisis estadstico.
Tabla 2. Replicas para el anlisis estadstico.
Ejemplo de clculos.
X=
0.1920.0159
0.002196
= 80.19
X=
X=
0.2000.0159
=83.83
0.002196
X=
S= 5.227
S2=S
S 2= (5.227)2
%C.V=
+
-
= X
S
X
t .S
n
%C.V=
5.227
82.93
S2= 27.32
X100
%C.V= 6.30
+
-
= X
t .S
n
= 82.93
2.262 x 5.227
10
+
-
79.79.1911 a 86.6689
Tabla 3. Resultados de anlisis estadstico.
S2
% C.V.
82.73
5.227
27.32
6.30
79.191186.6689
Tubo No.
Sustancia
Tris 1 M, pH 7.0
2
3
4
5
A590
0.18
9
Glicerol al 1 %
0.22
0
Detergente comercial al 1%
0.16
7
Dodecil sulfato de sodio(SDS) 0.20
al 1 %
7
cido tricloroacetico(TCA)
0.17
8
Cantidad
de
protena
(g)
78.82
Tipo
de
interferenc
ia.
92.94
68.80
87.02
73.81
Conclusin.
La curva de calibracin permite obtener la concentracin de albumina y demostrar que
si se cumple la ley Bouguer y Beer.
Las sustancias interferentes producen un aumento o disminucin en la lectura de la
absorbancia, obtenindose una mayor o menor concentracin de protena.
El mtodo de Lowry es un mtodo preciso, fcil de manejar y requiere de demasiado
tiempo para cada reaccin.
Mtodo de Bradford.
Objetivo.
Analizar las ventajas y desventajas de este mtodo, con respecto a otros mtodos
para la determinacin cuantitativa de protenas.
Mtodo experimental.
Curva de calibracin:
1) adicionar albumina y los reactivos de acuerdo a las tablas
2) Dejar desarrollar el color durante 10 min y leer en el espectrofotmetro a 595 nm
3) Registrar la absorbancia obtenida.
Anlisis estadstico:
1) Preparar 10 tubos con las mismas condiciones del tubo 3 de cada mtodo
2) Dejar desarrollar color durante 10 min y leer en el espectrofotmetro a 595nm.
Efecto de sustancias no protenicas en el mtodo de Bradford:
1) Preparar 5 tubos con las mismas condiciones del tubo 3.
2) Se adiciona 0.1 ml de las primeras 5 sustancias interferentes de la tabla y se lee en el
espectrofotmetro a 595 nm.
Resultados.
Elaboracin de la curva de calibracin.
Tabla 5. Curva de calibracin de albumina. Mtodo de Bradford
Tubo No.
1
2
3
4
5
Cantidad
de
protena ( g)
25
50
75
100
125
Serie A
Serie B
0.362
0.574
0.594
0.615
0.645
0.381
0.541
0.525
0.597
0.693
Consideraciones. Se eliminaron los tubos 2 y 3 por estar muy dispersin y tener una mayor R.
Serie A
serie B
0
0 50 100150
Cantidad de proteina (g
A= 0.298
R= 0.9916
La pendiente es positiva, por tanto las lneas tendrn tendencia positiva, pero para que el ndice
de correlacin fuera alto se requiri eliminar los puntos que se salan de la grfica.
b) cumple la curva la ley de Bouger y Beer? Entre que lmites de cantidad de protena?
Si porque al presentar tendencia positiva indica que la concentracin es proporcional a la
absorbancia.
c) a partir de la recta ajustada por regresin lineal y la ecuacin de la misma, obtenga la
expresin matemtica para calcular la cantidad de protena.
Y= A+BX
Y A
B
Y 0.298
3.01 x 103
Anlisis estadstico.
Tabla 6. Replica para el anlisis estadstico.
Cantidad
de Ejemplo de clculos.
Tubo No.
A595
protena (g)
0.5800.298
1
0.580
93.68
X=
3.01 x 103 =93.68
2
0.720
140.19
3
0.761
153.82
4
0.598
99.66
0.7200.298
X=
5
0.601
100.66
3.01 x 103 = 140.19
6
0.641
113.95
7
0.627
109.30
8
0.642
114.28
9
0.616
105.64
10
0.593
98.006
X=
S=
112.92
9
S= 19.44
S2=S
S 2= (19.44)2
%C.V=
S
X
= X+-
t .S
n
%C.V=
S2= 378.22
19.44
X 100
112.92
%C.V= 17.21
= X+-
t .S
n
= 112.92+-
2.262 x 19.44
10
= 99.02 a 126.82
Tabla 3. Resultados de anlisis estadstico.
S2
% C.V.
112.92
19.44
378.22
17.21
99.02-126.82
Tubo No.
sustancia
Tris 1 M, pH 7.0
2
3
4
5
A595
0.69
0
Glicerol al 1 %
0.69
5
Detergente comercial al 1%
0.55
0
Dodecil sulfato de sodio(SDS) 0.59
al 1 %
0
cido tricloroacetico(TCA)
0.70
0
Cantidad
de
protena
(g)
128.59
Tipo
de
interferenc
ia.
131.89
74.12
97.00
133.54
Ejemplo de clculos.
X=
0.6900.298
3.01 x 103 = 128.59
Las interferencias + se pueden deber a que algunas propiedades fsicas del interferente sean
similares al de la muestra estudiada y por tanto de un aumento en la concentracin. La
interferencia negativa se puede deber a que la sustancia interferente disminuya o elimina partes
del componente en estudio reduciendo la concentracin de la muestra.
Comparacin de los mtodos para la determinacin de protenas.
Los mtodos de Bradford, Lowry y 230 son mtodos sensibles, sencillos, rpidos, pero presentan
variaciones sobre la protena (menos 230 nm). El mtodo de Bradford presenta pocas
interferencias, Lowry presenta muchas y 230 nm solo con DNA y RNA. El mtodo 280 no es tan
sensible como los mtodos anteriores, requieren de mucho tiempo de reaccin, es relativamente
sencillo y si presenta variacin sobre la protena.
Discusin.
La curva de calibracin obtenida indica que la ley de Bouguer y Beer se cumple ya que la
X
prueba
93.68
140.19
153.82
99.66
100.66
113.95
109.3
114.28
105.64
98.006
Di
(Di-D)2
13.49
56.36
64.98
22.92
22.75
36.04
21.88
32.73
23.18
5.526
271.59
696.43
1225,70
49.92
52.12
36.84
65.44
7.61
46.10
597.50
Clculos:
299.79 =29.97
D=
10
Di D
)2 = (13.49-29.97)2= 271.59
SD=
( D D )
n1
SD=
3049.25
9
( DD ) =3049.25
SD=18.40
Prueba de t de Student:
10
n
Tcalculada: D x SD T calculada: 29.97 x 18.40 Tcalculada=5.15
Ttablas: 2.262
Tc
Tt
es mayor a
Prueba de F:
Fcalculada =
378.22
=13.84
27.32
Ftablas = 4.03
378.22= S2 de Bradford.
27.32= S2 de Lowry.
Grupo: 4IM1
Seccin: 2