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Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry y Bradford.

Los mtodos colorimtricos para identificar protenas presentan algunas


desventajas al utilizar la misma protena como patrn para obtener los
valores reales debido a las condiciones como son: la interaccin de los
reactivos, la descomposicin de los reactivos, el tiempo y la temperatura.
El mtodo de Lowry y Bradford son mtodos de alta sensibilidad la cual es
buena cuando se miden concentraciones muy bajas. El ms usado es el
mtodo de Bradford por su rapidez y su facilidad al momento de usar.
Mtodo de Bradford.
Presenta poca sensibilidad donde la protena reacciona con el azul de
coomassie G-250, que existe en dos formas azul y naranja. La protena se
une con el azul de coomassie obtenindose un color azul. Los aminocidos
principales que se unen al colorante son histidina, lisina, tirosina, triptfano
y fenilalanina obtenindose una absorbancia entre 465 a 595 nm. Esta
reaccin es bastante rpida y fcil de manejar.
Mtodo de Lowry.
Se requieren condiciones alcalinas para que el Cu 2+ al momento de
reaccionar con los enlaces peptdicos de la protena se reduzca a Cu +,
formando un compuesto colorido azul. El Cu +
con los reactivos de
aminocidos reacciona con el reactivo de Felin (para reducirlo) dando un
color ms azulado. El nuevo reactivo es muy inestable inicialmente, se va
reduciendo lentamente hasta formar azul de molibdeno/ tungsteno. El
espectro de absorcin presenta barias longitudes de onda debido a que se
encuentran presentes otras sustancias dando un margen entre 500 y 700
nm.

Mtodo de Lowry.
Objetivo.

Elaborar una curva de calibracin para la cuantificacin de protenas empleando


un mtodo fotomtrico.
Determinar si hay diferencia estadsticamente significativa en la precisin y
exactitud entre los mtodos de Bradford y Lowry.
Conocer el efecto de sustancias no protenicas en el desarrollo de color.
Analizar las ventajas y desventajas del mtodo de Lowry con respecto a otros
mtodos para la cuantificacin de protenas.

Mtodo experimental.
Curva de calibracin:
1) adicionar albumina y los reactivos de acuerdo a las tablas
2) Dejar desarrollar el color durante 30 min y leer en el espectrofotmetro a 590 nm
3) Registrar la absorbancia obtenida.
Anlisis estadstico:
1) Preparar 10 tubos con las mismas condiciones del tubo 3 de cada mtodo
2) Dejar desarrollar color durante 30 min y leer en el espectrofotmetro a 590 nm.
Efecto de sustancias no protenicas en el mtodo de Lowry:
1) Preparar 5 tubos con las mismas condiciones del tubo 3.
2) Se adiciona 0.1 ml de las primeras 5 sustancias interferentes de la tabla y se lee en el
espectrofotmetro.
Resultados.
Elaboracin de la curva de calibracin.
Tabla 1. Curva de calibracin de albumina. Mtodo de Lowry
Tubo
No.

Cantidad
de
protena
( g)

1
2
3
4
5

25
50
75
100
125

Serie A

Serie B

590nm

590 nm

0.067
0.127
0.177
0.242
0.292

0.07
0.123
0.188
0.244
0.276

a) Calcule y escriba los valores de la pendiente,


ordenada al origen y el coeficiente de
correlacin y su interpretacin para la curva de
calibracin.
Y=A+BX
A= 0.0159 B= 0.002196

R=0.9965

Curva de calibracin de la albumina a 590 nm


0.35
0.3
0.25
0.2
Absorbancia 0.15

Serie B

0.1

serie A

0.05
0
20

40

60

80

100

120

cantidad de proteina (g)

Se puede observar que la


pendiente es positiva, por lo tanto las rectas tendrn pendiente positiva lo que indica
que a mayor concentracin mayor absorbancia. El coeficiente de correlacin es muy
cercano a 1, por lo tanto el grado de relacin entre las absorbancias obtenida es
cercano.

b) Cumple la ley de Bouger y Beer? Entre que lmites de cantidad de protena?


Si ya que la absorbancia es proporcional a la concentracin de protena. Entre 25 y 125
g
c) a partir de la recta ajustada por regresin lineal y la ecuacin de la misma, obtenga la
expresin matemtica para calcular la cantidad de protena.
Y= A+BX

Y A
B

donde Y= la absorbancia obtenida y X= la cantidad de protena en g.


X=

Y 0.0159
0.002196

Tubo No.

A590

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0.192
0.2
0.211
0.184
0.187
0.187
0.208
0.195
0.197
0.219

Cantidad
de
protena (g)
80.19
83.83
88.84
76.74
77.91
77.91
87.47
81.55
82.46
92.48

Anlisis estadstico.
Tabla 2. Replicas para el anlisis estadstico.
Ejemplo de clculos.
X=

0.1920.0159
0.002196

= 80.19

X=

X=

0.2000.0159
=83.83
0.002196

X=

(80.19+83.83+ 88.84+76.74+77.91+77.91+87.47+ 81.55+82.46+92.48)


= 82.93
10

S= 5.227
S2=S

S 2= (5.227)2

%C.V=

+
-

= X

S
X
t .S
n

%C.V=

5.227
82.93

S2= 27.32
X100

%C.V= 6.30

+
-

= X

donde t con 10 datos a 95% = 2.262

t .S
n

= 82.93

2.262 x 5.227
10

+
-

79.79.1911 a 86.6689
Tabla 3. Resultados de anlisis estadstico.

S2

% C.V.

82.73

5.227

27.32

6.30

79.191186.6689

Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el mtodo de Lowry

Tubo No.

Sustancia

Tris 1 M, pH 7.0

2
3
4
5

A590

0.18
9
Glicerol al 1 %
0.22
0
Detergente comercial al 1%
0.16
7
Dodecil sulfato de sodio(SDS) 0.20
al 1 %
7
cido tricloroacetico(TCA)
0.17
8

Cantidad
de
protena
(g)
78.82

Tipo
de
interferenc
ia.

92.94

68.80

87.02

73.81

Se observa que el tris, el detergente comercial y el cido tricloroacetico son interferentes


negativos porque hay una disminucin de la concentracin de la protena, mientras que
el glicerol y el SDS aumentan la concentracin de protena por lo que son interferentes
positivos.
Discusin.
La curva de calibracin nos permite encontrar la concentracin de albumina a partir de
la absorbancia obtenida. Se puede observar que la ley de Bouguer y Beer se cumple
pues la concentracin es proporcional a la absorbancia. Los datos obtenidos por el
analista fueron precisos pero no exactos, pues en la curva de calibracin a una
concentracin de 20 microgramos hay una dispersin en los datos, esto se puede deber
a errores del analista y errores de los instrumentos, pero el ndice de correlacin es alto,
lo que indica que hay una relacin cercana entre los datos obtenidos.
En el anlisis estadstico las concentraciones obtenidas a partir de la ecuacin de la
recta, demuestran que la desviacin estndar es baja por lo que hay poca dispersin en
los en datos.
El glicerol y el SDS presentan interferencias + , esto se puede deber a que las sustancias
tengan propiedades similares a la protena, por lo que la absorbancia ser mayor y en
consecuencia se leer mayor concentracin de protena. El glicerol, el detergente y el
TCA son interferentes negativos, esto se puede deber a la reaccin de las sustancias con
la albumina, disminuyendo la absorbancia.

Conclusin.
La curva de calibracin permite obtener la concentracin de albumina y demostrar que
si se cumple la ley Bouguer y Beer.
Las sustancias interferentes producen un aumento o disminucin en la lectura de la
absorbancia, obtenindose una mayor o menor concentracin de protena.
El mtodo de Lowry es un mtodo preciso, fcil de manejar y requiere de demasiado
tiempo para cada reaccin.
Mtodo de Bradford.
Objetivo.

Elaborar una curva de calibracin para la cuantificacin de protenas empleando


un mtodo fotomtrico.
Determinar el efecto de algunas sustancias no proteicas que pueden interferir en
el mtodo.
Determinar si hay diferencias estadsticamente significativas en la precisin y
exactitud el mtodo de Lowry.

Analizar las ventajas y desventajas de este mtodo, con respecto a otros mtodos
para la determinacin cuantitativa de protenas.

Mtodo experimental.
Curva de calibracin:
1) adicionar albumina y los reactivos de acuerdo a las tablas
2) Dejar desarrollar el color durante 10 min y leer en el espectrofotmetro a 595 nm
3) Registrar la absorbancia obtenida.
Anlisis estadstico:
1) Preparar 10 tubos con las mismas condiciones del tubo 3 de cada mtodo
2) Dejar desarrollar color durante 10 min y leer en el espectrofotmetro a 595nm.
Efecto de sustancias no protenicas en el mtodo de Bradford:
1) Preparar 5 tubos con las mismas condiciones del tubo 3.
2) Se adiciona 0.1 ml de las primeras 5 sustancias interferentes de la tabla y se lee en el
espectrofotmetro a 595 nm.

Resultados.
Elaboracin de la curva de calibracin.
Tabla 5. Curva de calibracin de albumina. Mtodo de Bradford

Tubo No.
1
2
3
4
5

Cantidad
de
protena ( g)
25
50
75
100
125

Serie A

Serie B

0.362
0.574
0.594
0.615
0.645

0.381
0.541
0.525
0.597
0.693

Consideraciones. Se eliminaron los tubos 2 y 3 por estar muy dispersin y tener una mayor R.

Curva de calibracion de albumina


0.8
0.6

Serie A

Absorbancia a 595 nm 0.4


0.2

serie B

0
0 50 100150
Cantidad de proteina (g

a) calcule y escriba los valores de la pendiente, la ordenada al origen y el coeficiente de


correlacin, diga cmo se interpretan para la curva de calibracin ajustada.
B=3.01X10 -3

A= 0.298

R= 0.9916

La pendiente es positiva, por tanto las lneas tendrn tendencia positiva, pero para que el ndice
de correlacin fuera alto se requiri eliminar los puntos que se salan de la grfica.
b) cumple la curva la ley de Bouger y Beer? Entre que lmites de cantidad de protena?
Si porque al presentar tendencia positiva indica que la concentracin es proporcional a la
absorbancia.
c) a partir de la recta ajustada por regresin lineal y la ecuacin de la misma, obtenga la
expresin matemtica para calcular la cantidad de protena.
Y= A+BX

Y A
B

donde Y= la absorbancia obtenida y X= la cantidad de protena en g.


X=

Y 0.298
3.01 x 103

Anlisis estadstico.
Tabla 6. Replica para el anlisis estadstico.
Cantidad
de Ejemplo de clculos.
Tubo No.
A595
protena (g)
0.5800.298
1
0.580
93.68
X=
3.01 x 103 =93.68
2
0.720
140.19
3
0.761
153.82
4
0.598
99.66
0.7200.298
X=
5
0.601
100.66
3.01 x 103 = 140.19
6
0.641
113.95
7
0.627
109.30
8
0.642
114.28
9
0.616
105.64
10
0.593
98.006

X=

(93.68+140.19+153.82+99.66+ 100.66+113.95+109.30+114.28 +105.64+98.006)


X=
= 112.92
10

S=

112.92
9

S= 19.44

S2=S

S 2= (19.44)2

%C.V=

S
X

= X+-

t .S
n

%C.V=

S2= 378.22

19.44
X 100
112.92

%C.V= 17.21

= X+-

donde t con 10 datos a 95% = 2.262

t .S
n

= 112.92+-

2.262 x 19.44
10

= 99.02 a 126.82
Tabla 3. Resultados de anlisis estadstico.

S2

% C.V.

112.92

19.44

378.22

17.21

99.02-126.82

Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el mtodo de


Bradford.

Tubo No.

sustancia

Tris 1 M, pH 7.0

2
3
4
5

A595

0.69
0
Glicerol al 1 %
0.69
5
Detergente comercial al 1%
0.55
0
Dodecil sulfato de sodio(SDS) 0.59
al 1 %
0
cido tricloroacetico(TCA)
0.70
0

Cantidad
de
protena
(g)
128.59

Tipo
de
interferenc
ia.

131.89

74.12

97.00

133.54

Ejemplo de clculos.
X=

0.6900.298
3.01 x 103 = 128.59

Las interferencias + se pueden deber a que algunas propiedades fsicas del interferente sean
similares al de la muestra estudiada y por tanto de un aumento en la concentracin. La

interferencia negativa se puede deber a que la sustancia interferente disminuya o elimina partes
del componente en estudio reduciendo la concentracin de la muestra.
Comparacin de los mtodos para la determinacin de protenas.
Los mtodos de Bradford, Lowry y 230 son mtodos sensibles, sencillos, rpidos, pero presentan
variaciones sobre la protena (menos 230 nm). El mtodo de Bradford presenta pocas
interferencias, Lowry presenta muchas y 230 nm solo con DNA y RNA. El mtodo 280 no es tan
sensible como los mtodos anteriores, requieren de mucho tiempo de reaccin, es relativamente
sencillo y si presenta variacin sobre la protena.
Discusin.
La curva de calibracin obtenida indica que la ley de Bouguer y Beer se cumple ya que la

concentracin es directamente proporcional a la concentracin. Los datos eliminados (75


y 50 microgramos) producan una dispersin en los datos, esto se debe a los errores del
analista y a los del material ya que el espectrofotmetro variaba en las lecturas de la
misma muestra, se ocuparon diferentes celdas lo cual daba diferentes lecturas por ser
distinto material el que se us. El ndice de correlacin obtenido fue .9916. Esto indica
que no hay mucha dispersin en los datos analizados. la pendiente es positiva y alta,
esto demuestra que el mtodo de Bradford es un mtodo muy sensible ya que cambios
en la concentracin producirn grandes aumentos en la absorbancia
La desviacin estndar obtenida indica que los datos de la replicas se encuentran muy
separados, de nuevo esto se debe a que fue otro analista que preparo las muestras,
problemas con el espectrofotmetro, se ocuparon diferentes celdas, el tiempo de la
reaccin.
En general el mtodo de Bradford presenta pocas interferencias. Tris, glicerol y TCA son
interferencias positivas por tener propiedades semejantes con la albumina, dando un
aumento en la absorbancia y en la concentracin.
El detergente y el SDS son interferencias negativas por la reaccin que tiene con la
albumina disminuyendo la absorbancia y la concentracin de protena.
Conclusiones.
La curva de calibracin cumple la ley de Bouguer y Beer por ser la concentracin
directamente proporcional a la absorbancia.
El mtodo de Bradford es un mtodo que requiere poco tiempo, es fcil de manejar y
bastante sensible.
Las sustancias interferentes producen un aumento o disminucin en la absorbancia
aumentando la concentracin de albumina.

Tabla No.9 Pruebas para establecer diferencias en exactitud y precisin.


X
referenc
ia
80.19
83.83
88.84
76.74
77.91
77.91
87.47
81.55
82.46
92.48

X
prueba
93.68
140.19
153.82
99.66
100.66
113.95
109.3
114.28
105.64
98.006

Di

(Di-D)2

13.49
56.36
64.98
22.92
22.75
36.04
21.88
32.73
23.18
5.526

271.59
696.43
1225,70
49.92
52.12
36.84
65.44
7.61
46.10
597.50

Clculos:
299.79 =29.97
D=
10

Di= Xprueba - Xreferencia Di= 93.68-80-19 Di= 13.49

Di D
)2 = (13.49-29.97)2= 271.59

SD=

( D D )
n1

SD=

3049.25
9

( DD ) =3049.25

SD=18.40

Prueba de t de Student:

10
n
Tcalculada: D x SD T calculada: 29.97 x 18.40 Tcalculada=5.15
Ttablas: 2.262
Tc

Tt

hay diferencia estadsticamente significativa en los mtodos en exactitud.

es mayor a

Prueba de F:
Fcalculada =

378.22
=13.84
27.32

Ftablas = 4.03

378.22= S2 de Bradford.

27.32= S2 de Lowry.

Ft < Fc Si existe diferencia significativa entre los mtodos en precisin.


Discusin final.
En la comparacin entre los mtodos de Bradford y Lowry para identificar protenas se
observa que el mtodo de Bradford es ms sensible pues tiene una mayor pendiente que
Lowry. Tericamente el mtodo de Bradford es ms eficiente, pero se presentaron ms
errores que en el mtodo de Lowry.
En el mtodo de Bradford La desviacin estndar en fue mayor, es decir tenia mayor
separacin entre los datos analizados, se tuvieron que eliminar 2 puntos para ajustar la
lnea y requiri de menos tiempo.
El mtodo de Lowry presenta menos sensibilidad pero los datos analizados no tienen
tanta dispersin entre ellos, la desviacin estndar fue mucho menor, no se elimin
ningn punto para ajustar la lnea y requiri de mucho tiempo.
Como ya se mencion todas las variaciones se deben a errores durante el anlisis como;
dos analistas, problemas en el espectrofotmetro, se ocuparon diferentes celdas, los
tiempos no se midieron de manera correcta, etc.
Las pruebas de precisin y exactitud demuestras que existe diferencia entre ambos
mtodos.
Conclusin final.
El mtodo de Bradford y Lowry son mtodos sensibles para identificar protenas que
cumplen con la ley de Bouguer y Beer.
La concentracin es directamente proporcional a la absorbancia.
La prueba de T y F demuestran que si hay diferencia estadsticamente significativa entre
ambos mtodos.
Referencias.
https://books.google.com.mx/books?
id=R3Hn3NMt0zsC&pg=PA57&dq=metodo+de+lowry&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiR5Y
GnwKrLAhUKnoMKHXlaD1cQ6AEIKzAD#v=onepage&q=metodo%20de
%20lowry&f=false.
https://books.google.com.mx/books?
id=hrd7v5YNo1UC&pg=PA157&dq=metodo+de+lowry&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiR5
YGnwKrLAhUKnoMKHXlaD1cQ6AEIOzAG#v=onepage&q=metodo%20de
%20bradford&f=false
https://books.google.com.mx/books?
id=p2BmCezyycsC&pg=PA52&dq=metodo+de+bradford+en+proteinas&hl=es&sa=X&v
ed=0ahUKEwjfz-GTz6rLAhUCuoMKHRiTAi4Q6AEIHjAB#v=onepage&q=metodo%20de
%20bradford%20en%20proteinas&f=false

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Nombre: Ochoa Poblano Apolinar Rafael.


Laboratorio de mtodos de anlisis II

Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry y Bradford.

Grupo: 4IM1

Seccin: 2

Profesor: Fernando Hernndez Derramadero.

Fecha de Entrega: 9 de Marzo de 2016.