Microscopa deFluorescencia

Aequorea victoria

Lasclulassontransparentes

Cmoverqupasadentrodelasclulas?

1Fluorescencia

Emisinderadiacin
electromagntica(luz)por
partedeunasubstancia
quehaabsorbidoradiacin
enunalongituddeonda
distinta.
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html
Vertutoriales1a3

Conluztransmitidasepuedever
morfologa

Confluorescenciasepuedeverms!

Stokesylasolucindequinina

Procesodeabsorcinyemisinsepuederepetir
indefinidamente

Fluorescenciaendetalle

http://www.olympusfluoview.com/theory/fluoroexciteemit.html

FluorescenciadelaQuinina

Espectros deemision y
absorcion para quinina

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorescenceintro.html

EscalatemporalyExponencial

Molculas fluorescentes

Fluorescena(1871)
Descubierta(1871)porel
qumicoprofesorypremio
NobeldeQumicaAdolfVon
Baever
Excitacin:494nm yemisina
521nm
Derivadosqueinteractuan con
protenas(grupoamino).
Fluoresceinisotiocianato
(N=C=S).FITC.
MarcajedeAnticuerpos(1940s)

Quproporcinfuncionabien
(insuficiente/Quenchingsaturacin)
Paralasprotenasfluorescentes:Tiempode
plegamientoydescomposicin

Estabilidad
Contraste(Simidealgo)

AlexaFluor(2000)

Emisinmx.:(442775nm).
Nombradospornmerosde
acuerdoasuexitacin
mxima
Sntesisporsulfunizacinde
rodaminasyfluoresceinas
Mayorfotoestabilidad,ms
brillantesymenor
sensibilidadapH.
Patentado,altoscostos
Marcajedeclulasytejidos

Atto dyes

Preparacindemuestrasfluorescentes
Sepuedehacerconmuestrasvivasofijadas.El
factorlimitanteescmohacerllegarelfluorforo
alsitioindicado.Hay3maneras:
1. Tincionesfluorescentes.Ponerlosmarcadores
demaneraqumica,estosentranporsucuenta.
Muchosslofuncionanenclulaspermeadas(y
fijas).
2. Inmunofluorescencia.Mtodos
inmunohistoqumicos
3. GFPycompaa.Usodemtodosgenticos

MarcandoADN

Existenfluorforos queseunen
espontneamentealADN.
BromurodeEtido:bajafluorescencia
enaguaysuintensidadaumentaa
medidaqueseunealDNA.
SeuneadsDNA,yseintercalaenlas
bases.Cancergeno,aligualquePI
(propidium Iodide)
Dapi esmenoscancergenoyes
barato,Hoecht todavamenos
cancergeno,yhaymuchosotros
modernoscarosqueaparecencada
da.

Ejemplo:Live/dead assay para

bacterias
Vercap 51dePawley

Enrojo:PIpermemembranascomprometidasytiADN,peronoen
clulasvivasdebidoacarga
Enverde:Syto9,quetieADNdelclulasvivasymuertas,peroconmenor
afinidad
Alternativa:Calcein AM(acetoxymethyl),queslobrillaenclulasvivas
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L7012

Tincionesfluorescentes

Pegandolosfluorforos

http://www.atto
tec.com/attotecshop/index.php?language=en
&cat=c1_Fluoreszenzlabel.html&language=en

Algunossitiostiles
https://www.thermofisher.com/co/en/home/r
eferences/molecularprobesthe
handbook.html
http://www.sigmaaldrich.com/life
science/cellbiology/detection/learning
center/atto.html
Etc(DY,Cyaninas)

Marcadoresysensoresqumicos

dopamina

pH

Fluorescena:uninaAnticuerpos

Inmunohistoqumica (luztransoRadioactividad),
inmunofluorescencia (En tejidos),
Inmunocitoqumica (en clulas)

http://www.rndsystems.com/product_
detail_objectname_northernlights.aspx

Protenaverdefluorescente
GreenFluorescent Protein

Existenprotenasquenaturalmente
fluorescen.Entrelasquese
encuentranlafamiliadelaGFP
PremioNobeldequmica2008

Aequorea victoria
(Shimomura)

UsosdelGFP

Sepuedeexpresarencasicualquierclula
SepuedeunirelgenGFPaelgendela
protenasdeinters,detalformaque
cuandoseexpresalaprotenatambinse
expresaGFP
MartinChalfie,
NobelLecture

VariantesdeGFP(RogerTsien yotros)

Colores
Mediciones
FRET,quenching
Tndem
Fotoactivables

Wikipedia

Aguidetochoosingfluorescentproteins
Shaner,Steibach,Tsien

A timeline of major achievements in the field.

Chudakov D M et al. Physiol Rev 2010;90:1103-1163

2010 by American Physiological Society

Main areas of applications of fluorescent proteins.

Chudakov D M et al. Physiol Rev 2010;90:1103-1163

2010 by American Physiological Society

Porqufluorescencia?
Sensibilidad(sepuedenvermolculas
individuales)
Selectividad(sepuedenmarcarsitiosy
molculasparticulares)
Resolucin(espacialytemporal)
Viabilidad(funcionaconclulasvivas)
Cuantificacin(linealconelnmerode
molculas)

Resolucinyviabilidad
Inmunofluorescencia esmejorque
inmunohistoqumica enresolucinparaco
localizar

Sensibilidad

Selectividad
Alexa Fluor
Fibroblastodeciervo:
Mitocondriamarcadacon
antioxphosyvisualizado
conAlexafluor555
(naranja),Actinase
marcoconalexa488
(verde)elnucleosetio
conTOPRO(morado)

Cuantificacin

Elmicroscopiodefluorescencia
Fuentes
Dicrico ycubo
Filtrosyfluorforos

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/anatomy/fluoromicroanatomy
.html

Fuentesdeluzcomunesen
microscopiosdefluorescencia

AlineacinMercurioyXenn:
http://www.microscopyu.com/tu
torials/arclamp

http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/lightsources/lightsourcefundamentals.html

Cuidadosdelmparasde
Mercurio,Xenn,MetalHalide
Nodejarprendidomenosdeunahora!!!(se
daamsrpido)
Cambiarelbombilloatiempo!!(puede
explotarydaarotraspartes)
Esperarmediahorasisequierecuantificar
paraquelaintensidadseaconstante

Fuentescomunesenmicroscopiosde
fluorescencia

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/lightandcolor/lightsourcesintro.html
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/lightsources/lightsourcefundamentals.html

Nuevasfuentesdeluzpara
microscopios:LEDs

Cuidado:potenciapuedeserinsuficienteparaalgunasaplicaciones/fluorforos

Nuevasfuentesdeluzpara
microscopios:Pumped Phosphor
Fuentedeestadoslido(LEDoLser)

Digitalshuttering:10microsegundos
Vidamedia

9das3meses610aos
~5a10K
$150/lamp ~2K

http://www.89north.com/resources/pumped
phosphorillumination/

ElLser
Monocromtico
Intensidad!

FuenteenConfocal,Hojadeluz,
TIRF,dosfotones,multifotn,
microdiseccin,FRAPyotros.

Coherenteespacialytemporalmente
Polarizadodemaneraplana(vsaleatoria>ruidoenespejos
dicricos)
PerfilGaussiano
Poca divergencia
Vercap 13deHoecht paramsdetallesyel5delhandbook ofconfocal microscopy

tomos y fotones

Modelo deRutherford

Modelo deBohr

Cuntica Bsica

LASER

L ight
A mplification by
S timulated
E missionof
R adiation

StimulatedEmission

Populationinversion,
OpticalPumping

Amplificacin

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/lightandc
olor/lasersintro.html

Cavidadresonanteymodos

Modosenladireccindelacavidad
Modostransversalesala
direccindelacavidad

Divergence(inradians)=ConstantWavelength/BeamDiameter
=>Tocalimpiarmodosdellaserparailuminacinhomogneaespacialmente:
Fibra,Pinhole

Tiposdelserescomunes
Problemasdeloslseresdegas:
Alineacin(menoshoy)
Vidamedia(2ka20khoras(HeNe))
Costo(aunquemenorqueestadoslidoparaalgunas
lneas,todava)
Calor
Tamao

Propiedadesatenerencuenta:
Estabilidad!
detemperaturaypotencia
Vidamedia
~calidaddelhaz
Potenciatotalenlalneadeinters
Potenciaconsumida(calor)(2.5kW
paraArgonion)
Costo (6a20Knormales,100K
pulsados)

Ellserdeestadoslido
Variostipos:
Diode
Diode Pumped SolidState (DPSS)

Vidamedia10a100khoras
Muchascompaas,bastantescolores,muchascalidades,potenciasyprecios.
Algunosbaratos:ej:405nm,532nm,635nm,445nm.

Filtrosenfluorescencia

Eldicrico

Flechaspuedencambiar
Segncompaa!

https://www.semrock.com/introductiontofluorescencefilters.aspx

Cubo defiltros

53

Viejos

Tipos defiltros

https://www.chroma.com/spectraviewer
https://www.semrock.com
/productfamilies.aspx

Qumica

Interferencia

Iluminacincondistintaslongitudesdeonda
Iluminacionesa
longitudesdeonda
mayoromenorenla
exitacinsoloafectala
intensidaddelaluz
emitida.

Combinacindedosfluorforos

Separacindecoloresy
sobrelapamiento espectral

Propiedadesimportantesmolculas
fluorescentes
Qutanbrillantees
Qutantosefotoblanquea enlascondiciones
delsistema
Quproporcinfuncionabien
(insuficiente/Quenchingsaturacin)
Paralasprotenasfluorescentes:Tiempode
plegamientoydescomposicin

Sitiostiles
https://www.thermofisher.com/co/en/home/lifescience/cellanalysis/labeling
chemistry/fluorescencespectraviewer.html
http://www.chroma.com/products/fluorochrome
http://www.olympusmicro.com/primer/java/fluorescence/matchingfilters/index.html
Filtros:
https://www.semrock.com/
Chroma
https://www.microshop.zeiss.com/us/us_en/spektral.php?f=db
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralprofiles/
http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/filtercubes/filterindex.html
https://www.microshop.zeiss.com/us/us_en/spektral.php?f=db