INSTITUTO DE EDUCACION SUPERIOR TECNOLOGICO PRIVADO

DANIEL ALCIDES CARRION

Carrin con la Acreditacin, hacia la Excelencia Acadmicaa

Introduccin
Para la realizacin de la mayora de los exmenes de Laboratorio , emplean el microscopio y el
espectrofotmetro y la calidad de los resultados dependen de la exactitud en su procesamiento,
estando a su vez sujeto al conocimiento, destreza, manejo y cuidados de estos equipos.
Por lo anterior se considera necesario que el estudiante de Laboratorio Clinico tenga estos
conocimientos y lo va a desarrollar en este curso taller denominado Manejo y cuidado del
Microscopio y del Espectrofotmetro
Practica N 1
DESCRPCION DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
El microscopio es un equipo de precisin, mediante el sistema de lentes y fuentes de iluminacin se
pueden observar imgenes que por su tamao no se podran observar.
El microscopio est compuesto por:
Los oculares: pueden ser uno(monoculares) o dos(binoculares). Los oculares son donde posamos
los ojos. Los lentes ms cerca del observador y su funcin es ampliar la imagen de los objetivos.
Muchos son ajustables para mejor comodidad del observador.. Algunos oculares vienen con
puntero para fines educativos y otros con regla para poder medir las estructuras evaluadas.
Los objetivos: son los lentes que estn ms cerca de la muestra. Su calidad es CRTICA para la
eleccin de un microscopio. Un microscopio con malos objetivos no sirve. Existen en medidas de
4x, 10x, 40x, 45x y 100x(inmersin) y de acuerdo a la amplitud de imagen til existen los
convencionales (muy parecido a los televisores de pantalla vidrio redonda en los cuales la calidad
de imagen de las zonas laterales no es buena) que son la mayora, los semiplancromticos que
tienen una calidad de imagen central ms amplia (ideal para citologa, histologa y hematologa) y
los plancromticos que son los objetivos tipo pantalla plana en los cuales uno obtiene la misma
calidad de imagen en las zonas laterales como en el centro. Casi todos los objetivos son
intercambiables entre marcas con algunas excepciones como Nikon que usa su propio sistema. En
casi todas las marcas de microscopios los objetivos de 4x y 10x suelen ser de calidad aceptable, es
en los aumentos de 45x y 100x que se nota la calidad de un objetivo.
Condensador: es el lente que concentra la luz sobre la lmina o muestra. Necesita buena fuente luz
para que trabaje adecuadamente.
El diafragma: Regula la cantidad de luz que entra al condensador. Es muy til para buscar cristales
en orina, gotas de colesterol o para gente que es muy sensible a la luz. Su calidad no es
determinante en la eleccin de un microscopio y sin una buena (muy buena) fuente de luz, su
utilidad es casi nula.
Foco: fuente de luz que dirige los rayos hacia el condensador. Es otro factor que considero CRITICO
en la eleccin de un microscopio. Debe ser una luz blanca potente, con el diafragma totalmente
abierto debe cegarnos en muestras poco celulares. Sin un buen foco no podremos trabajar
adecuadamente con objetivos de 45x y menos 100x.
Soporte: es la base del microscopio, sobre l se arma el equipo y existen varias formas de soporte
pero casi todas bastante ergonmicas. Mientras ms complejo es el equipo, mas abultado es el
MISIN: Formar integralmente Profesionales Tcnicos lideres y competentes, en el campo de la salud y
bienestar ,con vocacin de servicio y visin global.
VISIN: Ser el Instituto Lider en el campo de la Salud y Bienestar con proyeccin global,acreditado en todas sus carreras que aporte efectivamente a la
mejora de la calidad de vida.
VALORES: Compromiso, Responsabilidad e Integridad.

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compacto.
muy buen equipo y bastante

soporte aunque hoy en da se obtiene

Platina: lugar donde se coloca la lmina o muestra.
Cabezal: contiene los sistemas de los oculares y pueden ser monoculares, binoculares, trinoculares,
Si uno va a usar su microscopio por tiempo corto, 02 o tres veces a la semana se recomienda un
microscopio con cabezal monocular, si uno pasa mucho tiempo con los ojos en el microscopio se
recomienda un binocular con gomas para apoyar el arco superciliar y no cansarse mucho.
Revlver: es donde se alojan los objetivos. Pueden tener espacio para tres, cuatro, cinco y hasta
seis objetivos.
Macromtrico: tornillo de enfoque para acercamiento y alejamiento rpido. Se usa para los
aumentos de 4x y 10x.
Micromtrico: tornillo de enfoque para acercamiento y alejamiento ms sutil. Se usa para
aumentos de 45x y 100x. Suele desajustarse con el paso del tiempo y alejarnos la imagen sin
nosotros desearlo.

Se debe conocer el aumento del microscopio para conocer el tamao de la muestra observada
Multiplicar el aumento del OCULAR x el aumento del OBJETIVO El aumento se expresa mediante
una X

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DETERMINACIN DEL AUMENTO.

El aumento es una medida de la capacidad del microscopio de agrandar una imagen. La resolucin
es una medida de la capacidad del microscopio para separar los diferentes puntos de una imagen.
Determinar el aumento es vital cuando se comparan los tamaos de los diferentes objetos a
observarse con la ayuda de un microscopio. Anote el aumento de los lentes oculares y objetivos de
su microscopio. El aumento est impreso o grabado a un lado de los objetivos y oculares o en la
parte superior en el caso de los oculares. Este aumento se simboliza con un nmero seguido de
una X (ejemplo, 15X)
Estos objetivos se identifican por tener grabada la palabra oil (aceite, en ingls) en un lado, cerca
del nmero que indica el aumento del objetivo. Estos objetivos no pueden ser utilizados sin el
aceite de inmersin. Los otros objetivos no deben ser usados con aceite de inmersin ya que se
pueden daar si son inmersos en este aceite. El uso de lentes de inmersin es esencial cuando se
observan estructuras menores de 10 m de tamao. Por ejemplo, este aumento se requiere
cuando se requiere determinar la forma de una clula bacteriana. El aceite de inmersin no
incrementa el aumento de los lentes, pero mejora la resolucin y la nitidez de la imagen producida
por dicho objetivo. Cuando la luz pasa a travs de un material a otro, por ejemplo del vidrio al aire,
la luz se refracta o distorsiona. La luz de diferentes longitudes de onda se inclina a diferentes
ngulos. Estas refracciones dan como resultado una distorsin la cual se manifiesta ms a medida
que el aumento del lente es mayor. Al colocar una gota de aceite de inmersin, el cual tiene el
mismo ndice de refraccin que el vidrio, entre el objetivo de 100X y el portaobjetos (placa) se
reduce significativamente la dispersin de la luz que ocurrira sino se utiliza el aceite de inmersin.
Por ello, se incrementa la resolucin de la imagen.

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Es importante anotar los diferentes aumentos utilizados para poder

comparar el tamao relativo
de las imgenes que se observen. En muchos casos se requerir de usar uno o varios aumentos
para observar todos los detalles de la muestra.

Practica N 2
COLOCACIN Y ENFOQUE DE ESPECMENES EN UN PORTAOBJETOS.
Asegrese de que su microscopio compuesto este en posicin de poder realizar una observacin
adecuada a travs de los oculares, segn sea necesario. Adems debe estar conectada la fuente
lumnica o si la luz est incorporada en el microscopio, el mismo est conectado y encendido.
Tenga cuidado de que el cordn elctrico est en una posicin que no interrumpa el paso ni la
observacin de otros.
Botn de ajuste del micromtrico utilizado para proporcionar un mayor acceso a la platina y el
ajuste inicial de la imagen.
Botn de ajuste del micromtrico utilizado para proporcionar un mayor acceso a la platina y el
ajuste inicial de la imagen.
Levante el cabezal utilizando el tornillo macromtrico para iniciar la observacin (Figura 6). En
algunos casos la platina es la que se mueve y no el cabezal.
Rotacin del revlver para colocar en posicin al objetivo deseado.
Rotacin del revlver para colocar en posicin al objetivo deseado.
Rote el revlver para iniciar la observacin con el objetivo de menor aumento, usualmente 4x o
10x, segn sea el caso
. Perilla del condensador para ajustar el nivel de luz que pasa a travs de la muestra.
Usando la manija de abertura del diafragma, abra el mismo a aproximadamente la mitad de su
capacidad de abertura.
Coloque la placa sobre la platina con la marca en la placa a su lado opuesto.
Botn para subir y bajar el condensador.
Utilizando el botn respectivo, levante el condensador, hasta que la punta del mismo se encuentre
a una distancia de la placa de aproximadamente el grosor de una lmina de papel toalla.
Botn del ajuste del micromtrico usado para obtener el enfoque mximo. Botn del ajuste del
micromtrico usado para obtener el enfoque mximo.
Rote el tornillo micromtrico a una posicin aproximada de su punto medio.
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Rote el tornillo macromtrico hasta que la placa casi toque el objetivo. Asegrese de observar
desde lado del microscopio mientras alcanza la distancia de observacin. No se recomienda forzar
el objetivo dentro de la placa ya que la rompera o ms importante an se daara el objetivo.
Luego use el tornillo micromtrico hasta obtener la imagen ms ntida posible.
Ahora se proceder a efectuar las observaciones de su muestra.
ORIENTACIN DE LOS ESPECMENES EN UNA PLACA.
El efectuar dibujos lo ms preciso posible de sus observaciones es extremadamente importante.
Para incrementar el aumento se procede como sigue: Asegrese de que su muestra est enfocada
correctamente con el objetivo de ms bajo poder utilizado en un momento dado.
Mientras observa el objetivo, asegrese de que su movimiento no toque la placa y se deslice
adecuadamente, mueve el revlver al siguiente objetivo de superior aumento y que est en la
posicin correcta sobre la muestra. La mayora de los microscopios tienen posiciones en donde el
objetivo, si est colocado adecuadamente, hace un ruido seco o chasquido. Si la luz no se observa
o el crculo de luz no est centrado, coloque el revlver en la posicin correcta.
Use el tornillo micromtrico para que sea ntida su observacin. No debiera tener que utilizar el
tornillo macromtrico, si el enfoque anterior fue el adecuado.
Si se necesita incrementar los aumentos se repiten los pasos anteriormente mencionados.
se necesita usar aceite de inmersin, se requiere usar una gota del mismo en la placa, en el sito
que se desea observar. (Aceite mineral u otros aceites no deben ser utilizados). Al mover el
revlver hacia la posicin del objetivo de inmersin, detngase a media distancia entre el objetivo
anterior y el de inmersin.
Aada la gota de aceite de inmersin sobre el centro de la placa en observacin.
Mueve el revlver de manera que el objetivo de inmersin est directamente sobre la placa. La
gota de aceite de inmersin debe formar un puente entre el objetivo y la placa.
Use el tornillo micromtrico para observar una imagen ntida de su muestra.
Tal vez se requiera de ajustar el condensador, incrementando o disminuyendo la cantidad de luz
que proviene del condensador utilizando la manija del diafragma.
Nota importante: Asegrese de que los otros objetivos no se impregnen de aceite de inmersin, ya
que se pueden daar.
Cuando termine la observacin con el lente de inmersin, levante el cabezal o baje la platina,
segn sea el caso de acuerdo a su microscopio, limpie de inmediato el objetivo del aceite adherido
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y remueva la placa con el aceite. Solamente use papel de lente para limpiar los objetivos ya que
otros materiales como, papel toalla, toallitas, otros, pueden daarlos.
Cada vez que se requiera de remover una placa, siempre levante el cabezal o baje la platina, para
posteriormente remover la placa observada. Para evitar que de manera descuidada se dae el
objetivo al rozarlo con la placa.
ACTIVIDADES

1.- Seale Las partes de un microscopio compuesto

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Pregunta: Cul es el aumento de los oculares de su microscopio compuesto ?

Microscopio compuesto: _______________

Pregunta: Cul es el aumento de los objetivos de su microscopio compuesto? ____________,

____________, ____________, ____________

Pregunta: Su microscopio compuesto tiene objetivo de inmersin? _______________

Pregunta: Cul es su aumento? ___________

Pregunta: Cul es el mximo aumento que puede obtener con su microscopio compuesto?
________________
Con el uso de aceite de inmersin? ____________
Sin el uso de aceite de inmersin? _____________
Pregunta: Si se necesita observar hacia el lado izquierdo de la muestra, haca que direccin se
necesita mover la placa? _______________________
Pregunta: Si se necesita observar la parte superior de su muestra, haca que direccin necesita
mover la placa? ________________________
Pregunta: Por qu lo anterior es importante? _________________________

Sabas que..

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Muestra colocada sobre la platina

LUZ DE LA LMPARA
Lo que observamos es una imagen virtual invertida y de mayor tamao.

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Unidad de volumen equivalente a la millonsima parte de un litro, representada por el smbolo l.

Tambin equivale a 1 milmetro cbico.
Practica N 3
MICROPIPETAS.
Descripcin del equipo
La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeos
volmenes de lquidos y permitir su manejo en las distintas tcnicas cientficas.
Los volmenes captables por estos instrumentos varan segn el modelo: los ms habituales,
denominados p20, p200 y p1000, admiten un mximo de 20, 200 y 1000 l, respectivamente. Es
de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos lquidos sin tener que lavar el
aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plstico, que habitualmente son estriles.
Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las amarillas para pipetear volmenes pequeos (por
ejemplo, 10 l), y las azules para pipetear volmenes grandes (por ejemplo, 800 l).
Tipos
Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un botn en su
parte superior que est conectado a un sistema analgico de confirmacin de volumen, y
automticas, en las cuales dicho sistema es digital. Hay micropipetas simples, que slo acogen una
punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar mltiples puntas (por ejemplo, ocho),
absorbiendo el mismo volumen en todas ellas.
Actualmente, se reconocen fcilmente en el mercado dos de las mejores marcas que existen:
Eppendorf y Nichiryo.
Operacin del Equipo
Tcnica de pipeteo para lquidos claros:
a. Se presiona el botn superior suavemente hasta el primer tope.
b. Se sumerge la punta, en la solucin que se necesita pipetear estando seguros que la punta este
bien colocada y que no haya ningn tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la pipeta.
c. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solucin.
d. Para descartar la solucin de la punta presione el botn hasta el segundo
tope.
e. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas.
Tcnica de pipeteo para lquidos con alta viscosidad:
a. Presione el botn superior hasta el segundo tope.
b. Sumerja la punta en la solucin (2-3 mm) y suelte el botn despacio. La
punta tiene que estar bien llena.
c. Descarte el lquido de la punta presionando suavemente el botn
superior hasta el primer tope.

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Cuidados y Mantenimiento del Equipo:

a. Iniciar el da limpiando la parte externa de las pipetas de polvo o
suciedad.
b. Use solamente etanol al 70% para la limpieza de la pipeta. Otro tipo de
solvente no es aconsejable.
c. Utilizar las puntas adecuadas a las pipetas y a la cantidad de solucin que
se va a medir.
d. El pistn y el cilindro pueden ser chequeados dos veces al ao si la
pipeta es usada diariamente.
El mantenimiento preventivo de la pipeta tiene que ser realizado por personal
especializado de mantenimiento.
Practica N 4
DESCRPCION DEL ESPECTROFOTOMETRO
El espectrofotmetro es un equipo muy empleado en Bioqumica que pueden medir la absorcin
o transmisin de la luz a distintas longitudes de onda.
Por medio del anlisis de la absorcin y transmisin de la luz, el especofotmetro puede
proporcionarnos datos para determinar las concentraciones de los componentes de las sustancias.
Para conocer la concentracin de una sustancia coloreada en solucin se podra comparar
visualmente la intensidad de color de dicha solucin frente a una o varias soluciones de
concentracin conocida. Sin embargo resulta ms preciso utilizar un aparato, el
espectrofotmetro, que mide la cantidad de luz que atraviesa una solucin.

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USO DEL ESPECTROFOTOMETRO/FOTOCOLORIMETRO SPECTRONIC

20

(1) Enchufar el aparato.

(2) Encender con el mando izquierdo frontal (ON-OFF).Dejar encendido hasta que se acabe de
utilizar el aparato.
(3) Seleccionar la longitud de onda haciendo rotar el monocromador. Si se van a hacer lecturas
por encima de 650 nm. cambiar el fototubo azul en el interior por el rojo e insertar el filtro rojo.

(4) El aparato tarda unos 15 minutos en calentarse.

(5) Insertar el "blanco" en el lugar de la muestra y cerrar la tapa.
(6) Ajustar la aguja a 0 de absorbancia con el mando frontal derecho.
(7).Sin cambiar los mandos, quitar el blanco y sustituirlo por la muestra cerrando la tapa.
(8).Leer la absorbancia el %T.
(9).Sacar la muestra.
(10).Repetir los pasos 4-9 para otras muestras o de 7-9 si los ajustes del "blanco" no cambian.

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El esquema que se presenta a continuacin describe la interrelacin de los diversos componentes

de un espectrofotmetro. Los ms importantes son los siguientes:
1. La fuente luminosa
2. El monocromador
3. El portador de muestras
4. El sistema de lectura

Fuente luminosa
Dependiendo del tipo de espectrofotometra, la fuente luminosa puede ser una lmpara con
filamento de tungsteno para luz visible, o una lmpara de deuterio para luz ultravioleta.

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Monocromador

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Separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al
compartimiento de la muestra.
Portador de muestras
Est diseado para sostener la muestra que se quiere analizar dentro del rayo de luz El elemento
que contiene la muestra es una celda o cubeta, por lo general, rectangular. Las celdas o cubetas se
fabrican de vidrio, cuarzo y plstico.
Sistema detector
El sistema de deteccin puede estar diseado con fotoceldas, fototubos, fotodiodos o
fotomultiplicadores. El sistema de deteccin recibe la energa lumnica proveniente de la muestra
y la convierte en una seal elctrica proporcional a la energa recibida.
Sistema de lectura
Existen sistemas de lectura de tipo anlogo (muestra la magnitud leda sobre una escala de
lectura) o digital (muestra la magnitud leda en una pantalla).

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Recuerda :

La regin visible del espectro electromagntico abarca de 380 a 780 nm. Esta regin del espectro
es usada ampliamente en el laboratorio analtico. La siguiente tabla muestra la divisin de la
regin visible del espectro:
Longitud de onda

Color absorbido

Color reflejado

(nm)
380
380-435
435-480
480-490
490-500
500-560
560-580
580-595
595-650
650-780
780

Ultravioleta
Violeta
Azul
Azul verduzco
Verde azuloso
Verde
Verde amarillento
Amarillo
Anaranjado
Rojo
Infrarrojo cercano

---------------------------------------Verde amarillento
Amarillo
Anaranjado
Rojo
Prpura
Violeta
Azul
Azul verduzco
Verde azuloso
-----------------------------------------

La luz que utilizamos para leer, as como la luz del sol es policromtica, contiene todas las
longitudes de onda de la lista anterior. Cuando vemos un objeto, vemos luz reflejada. La luz
reflejada es la que qued de la iluminacin blanca, despus que el objeto absorbi varias
longitudes de onda.

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