CINTICA ENZIMTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

OBJETIVO GENERAL
El alumno ser capaz de analizar las respuestas que se observan en la velocidad de
la reaccin enzimtica, en funcin de diferentes factores como son el progreso de la
reaccin, el pH, la temperatura, la concentracin de sustrato e inhibidores. As mismo
establecer las condiciones de ensayo para determinar la actividad enzimtica.

OBJETIVOS ESPECFICOS:

Realizar una curva patrn de p-nitrofenol.

Determinar experimentalmente el progreso de la reaccin enzimtica.
Determinar experimentalmente el pH ptimo para la actividad de la enzima.
Determinar experimentalmente la temperatura ptima del ensayo de la
actividad de la enzima.
Determinar el efecto de la concentracin de sustrato en la velocidad de la
enzima.
Estudiar el efecto de un inhibidor.
Calcular los valores de Energa de activacin, Vmax y km.
Determinar el tipo de inhibicin y el efecto sobre la Vmax y la km.

INTRODUCCIN
La catlisis enzimtica es de gran importancia en los seres vivos, pues acelera
reacciones que en su ausencia tardaran mucho en ocurrir. La mayora de las enzimas
son de origen proteico.
La fosfatasa alcalina es una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos de
fosfatos de varios tipos de molculas como nucletidos, protenas y alcaloides. El
proceso de eliminar el grupo se denomina desfosforilacin. Como sugiere su nombre,
las fosfatasas alcalinas son ms efectivas en un entorno alcalino. La fosfatasa alcalina
recibe el nombre de orto-fosfrico-monoster hidrolasa.
La fosfatasa alcalina hidroliza el p-nitrofenilfosfato para formar el cromgeno amarillo
p-nitrofenol de acuerdo con la siguiente reaccin:
Fosfatasa alcalna
p- nitrofenilfosfato + H2O

p-nitrofenol + HPO42- +2H+

La fosfatasa alcalina est presente en las bacterias, rganos de animales y tambin

en leche bronca.

HIPTESIS (la formula el alumno)

METODOLOGA
REACTIVOS
Suero de leche como fuente de enzima.
p-nitrofenol 2x10-4 M
p-nitrofenilfosfato de sodio 2x10-3 M

Amortiguadores 0.06 M
Glicina
Glicina
Glicina
Glicina
TRIS
TRIS
TRIS
Carbonatos
Carbonatos
Carbonatos

pH
9
9.6
10
10.4
7
8
9
10.4
10.8
11.5

NaOH 0.25 M
Molibdato de sodio 50 mM

EQUIPO
Espectrofotmetro
Micropipetas de 200 y 1 000 L
Baos de incubacin
Cronmetro
Vrtex

MATERIALES
Tubos de vidrio de 13 x 100 mm
Celdas

Sugerencias
Mantener el material libre de detergentes.
Mantener los reactivos en fro, en especial la enzima para evitar su inactivacin.
Medir con mucho cuidado el tiempo de incubacin.

DESARROLLO
1. Curva patrn
Realizar una curva patrn de p-nitrofenol como se muestra en la tabla.

Curva patrn de p-nitrofenol

Reactivos

Blanco

50

100

150

200

250

300

H20 (L)

500

450

400

350

300

250

200

Glicina 0.06 M
pH 10 (L)

250

250

250

250

250

250

250

NaOH 0.25 M (L)

750

750

750

750

750

750

750

p-nitrofenol
M (L)

2x10-4

Leer a una de 415 nm

Grafique la curva patrn A vs [p-nitrofenol]

Por qu se hace una curva patrn de p-nitofenol?

2. Progreso de la reaccin enzimtica

Realizar a diferentes tiempos la reaccin enzimtica.

Tubos
p-nitrofenil
fosfato (L)
H20 (L)
Glicina 0.06 M
pH 10 (L)

Blanco
250
220
250

1
250

2
250

3
250

4
250

5
250

220
250

220
250

220
250

220
250

220
250

30

30

30

PREINCUBAR A 37 C 2 MIN
Enzima (L)

30

30

INCUBAR A 37 C
Tiempo min
NaOH 0.25 M
(L)
Enzima (L)

5
750

5
750

10
750

15
750

20
750

30
750

30

Leer a una de 415 nm

Por qu se utiliza sosa?

Qu utilidad tiene este ensayo?
Qu graficara usted con estos datos?
Cmo se calcula la velocidad?
Cinticamente como explicara el comportamiento observado
En base a sus resultados qu tiempo escoger para realizar sus ensayos?

3. Efecto del pH
Realizar ensayos de actividad enzimtica con diferente amortiguadores de pH,
utilizando como blancos glicina pH 9, Tris pH 7, carbonatos pH 10.4. Construya su
tabla de ensayos.
Amortiguador
Glicina
Glicina
Glicina
Glicina
TRIS
TRIS
TRIS
Carbonatos
Carbonatos
Carbonatos

pH
9
9.6
10
10.4
7
8
9
10.4
10.8
11.5

Cul es el propsito de este experimento?

Por qu se utilizan diferentes blancos? qu tubos deben leerse con los
diferentes blancos?
Grafique v vs pH
Cul es el valor de pH del ensayo al cual la enzima presenta la mayor
velocidad?
Hay diferencia entre los distintos amortiguadores con respecto a su efecto en
la velocidad de esta enzima?
4. Efecto de la temperatura
Realizar ensayos de actividad enzimtica a diferentes temperaturas con el tiempo y el
amortiguador elegido en el ensayo anterior.
Tubos

Blanco

p-nitrofenil fosfato (L)

Enzima (L)

250
250
250
250
250
250
250
250
220
220
220
220
220
220
220
220
250
250
250
250
250
250
250
250
PREINCUBAR A LA TEMPERATURA DE CADA ENSAYO 2 MIN
30
30
30
30
30
30
30

Temp. (C)

INCUBAR A LAS TEMPERATURAS INDICADAS

4
20
30
37
45
50
60

H20 (L)
Amortiguador(L)

NaOH 0.25 M
(L)
Enzima (L)

Leer a una de 415 nm

4
750
30

750

750

750

750

750

750

750

Por qu se preincuba la mezcla de reaccin?

Grafique v vs T
Describa el comportamiento de la velocidad enzimtica en funcin de T.
Calcule la energa de activacin

5. Efecto de la concentracin de sustrato

Realizar ensayos de actividad enzimtica a diferentes concentraciones de sustrato,
con el tiempo, el amortiguador y la temperatura elegidos en los ensayos anteriores.
Tubos

Blanco

p-nitrofenil fosfato (L)

0
520
250

H20 (L)
Amortiguador(L)
Enzima (L)

50
75
100
250
300
400
450
470
445
420
270
220
120
70
250
250
250
250
250
250
250
PREINCUBAR A LA TEMPERATURA ELEGIDA 2 MIN
30
30
30
30
30
30
30
INCUBAR A LA TEMPERATURA ELEGIDA

NaOH 0.25 M
(L)
Enzima (L)

750
30

750

750

750

750

750

750

750

Leer a una de 415 nm

Grafique v vs [S]
Describa el comportamiento de la velocidad enzimtica en funcin de la [S]
Grafique los dobles recprocos de la grfica anterior
Calcule la Vmax y la km

6. Efecto de un inhibidor
Realizar el experimento anterior adicionando el inhibidor.
Tubos

Blanco

p-nitrofenil fosfato (L)

0
470
250
50

H20 (L)
Amortiguador(L)
Inhibidor (L)
Enzima (L)

50
75
100
250
300
400
450
420
395
370
220
170
70
20
250
250
250
250
250
250
250
50
50
50
50
50
50
50
PREINCUBAR A LA TEMPERATURA ELEGIDA 2 MIN
30
30
30
30
30
30
30
INCUBAR A LA TEMPERATURA ELEGIDA

NaOH 0.25 M
(L)
Enzima (L)

750
30

750

750

750

750

750

750

750

Leer a una de 415 nm

Grafique v vs [S] en la misma grfica del experimento anterior.

Describa el comportamiento de la velocidad enzimtica en funcin de la presencia de
un inhibidor.
Grafique los dobles recprocos de la grfica anterior en la grfica del experimento de
1/v vs 1/[S]
Calcule la Vmax y la km aparentes
Qu tipo de inhibicin presenta?

RESULTADOS
ANLISIS DE RESULTADOS
CONCLUSIN
BIBLIOGRAFA