Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
fibuligera
Amidonul este sursa cea mai abundent de producere a energiei, este un polizaharid mare
degradat de enzimele amilolitice.
Saccharomycopsis fibuligera este o drojdie amilolitic care prezint activitate de amidon
degradat se gsete ntr-o varietate de substraturi amidon,
cum ar fi aluat de pine i prjituri de orez.
Capacitatea drojdiei S. fibuligera de a degrada amidonul este datorat de dou enzime, i
anume -amilaz i glucoamilaz. Unele tulpini de S. fibuligera sintetizeaz ambele enzime, n
timp ce altele sintetizeaz doar un singur tip de enzim.
Introducerea sau tergerea de gene de interes ar putea fi crucial pentru inginerie de
proprietile dorite ale S. fibuligera i pentru nelegerea mecanismelor care stau la baza
reglementarii de sintez a enzimelor amilolitice i de a folosi amidonul. Ca un prim pas spre
dezvoltare , secvena de nucleotide a genei dehidrogenate LEU2 codat -izopropilmalat , un
marker pentru transformare, a fost studiat.
Toate produsele folosite n cadrul acestui proiect au fost substanele chimice de calitate
analitic sau mai mare. S. fibuligera i S. cerevisiae YPH499. Pentru a prepara ADN
genomic,culturile de S. fibuligera au fost crescute la 30 grade Celsius. E. coli utilizat pentru
ADN-ul plasmidic, a fost crescut la 37 C n mediu LB suplimentat cu ampicilin (100 mg / l).
Pentru msurarea activitii- izopropilmalat dehidrogenaza , tulpina S. cerevisiae au fost
crescut n mediu sintetic triptofan complet lipsit (SC-TRP) sau leucin (SC-LEU) la 30 C.
Oligonucleotidele degenerate au doi polimeri LEU2-F (5'-CTNTAYGCNA
AYNTNMGNCCNKKN-3 ') i LEU2-R (5'-NYWNGGNAVNAGNCCNAG
NTWNCC-3 ')care au fost concepute pe baza consensului de conservare a regiuni LYANLRPC
i GSLGLLPSA.
Condiiile de reacie au fost 10 min la 94 de grade Celsius, urmat de 35 cicluri de
denaturare timp de 30 secunde la 94 grade Celsius, recoacere pentru 30 secunde la 55 C, i
extensie timp de 30 s la 72 grade Celsius cu alungirea finala timp de 5 minute la 72grade Celsius.
Fragmentele amplificate au fost clonate n vectorul TA pTOP V2 i ealonate.
Pentru a obine SfLEU2 cu regiunile promotor i terminator , SfLEU2 fost
amplificat folosind PCR cu SfLEU2-Sacl-F (5'-AATTGAGCTCAAGAGC
TTTCAATCAGCTGAC-3 ') i SfLEU2-Sall-R (5'-AATTGTCGACACTGTTT Primeri
AGTTAATCGTAGTTTATC-3 ').
n concluzie, reiese c lungimea complet a genei SfLEU2 fost recuperat prin
degenere PCR i traseul genomului. Funcionalitatea de clonat a genei a fost confirmat pe baza
complementrii leu2 auxotrofie n S. cerevisiae.
Aadar ca gena marker pentru ingineria drojdiei de amidon, S. fibuligera este acum
disponibil.