PURIFICACIN Y AISLAMIENTO DE ENZIMAS.

Sin perjuicio que un preparado enzimtico puede consistir en el mismo extracto o caldo
fermentado que slo se somete a una clarificacin y concentracin (preparado liquido) o
desecacin (preparado slido) se recurre tambin a mtodos de aislamiento y purificacin de
enzimas en gran escala, lo cual se logra principalmente por los siguientes procesos:
Adsorcin selectiva con hidrxidos de hierro o aluminio coloidales, a cierto pH, pues no todas las
protenas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida se lava con agua o solucin
salina y luego s eluye a pH diferente, generalmente alcalino mediante otra solucin salina, por
ejemplo, de fosfato.
Por precipitacin, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad hasta el punto en
que precipitan. Esto se logra por adicin de sales a cierto pH y a elevada concentracin inica o
por solventes orgnicos (alcohol, acetona, isopropanol) a baja temperatura. La sal ms usada es el
sulfato de amonio por su alta solubilidad, bajo costo, alta atoxicidad para la enzima y por no
afectar mayormente la viscosidad de la solucin.
Dilisis por gradientes de concentracin a travs de membranas semipermeables.
Ultrafiltracin por aspiracin o presin a travs de membranas de porosidad fina como tamiz
molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas, pues no hay cambio de
fases, ni altos gradientes de temperatura .
Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidn, agar o dextrano.
Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina, como en columna con
intercambiadores inicos, geles o tamices moleculares.
Combinando estos procedimientos con otros a base de electroforesis de alta tensin, cataforesis y
electrodilisis se logran actualmente separaciones de mezclas complejas de enzimas.
El control de todas estas etapas en su forma ms rigurosa, es necesario para asegurar el mximo
de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de los productos enzimticos obtenidos.

AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el

interior de clulas que adems poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de
agregados moleculares, complejos con otras enzimas, protenas inertes, cidos nucleicos,
polisacridos o lpidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso
de purificacin.

A)

MTODOS DE ESTIMACIN - UNIDADES

El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad
mediante el cual pueda valorrsela convenientemente. Para decidir si un paso de la purificacin
tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y
despus de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles. Slo en
trminos cuantitativos se puede saber si se ha producido algn progreso. Puesto que una gran
parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima est dedicado a determinar la
actividad de las distintas fracciones, es deseable que sta sea una operacin rpida; es preferible
sacrificar precisin por rapidez en las determinaciones.

La naturaleza del ensayo depender del tipo de reaccin que cataliza la enzima. A veces resultar
conveniente la medicin de la aparicin de un producto y otras la medicin de la desaparicin de
sustrato.

La actividad de una enzima depende de condiciones tales como temperatura, pH, concentracin;
por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades.
La eleccin del sustrato es muy importante: debe ser barato, de fcil determinacin, estable en
ausencia de enzima y no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo en concentracin tal que
sature la enzima, de modo que la velocidad sea independiente de la concentracin de sustrato y
proporcional a la cantidad de enzima.

En general, en los tejidos, una enzima puede estar presente en una proporcin de 1/10 a 1/100
del material total. Es necesario definir una unidad enzimtica arbitraria para poder expresar, en
forma cuantitativa, lapureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la
purificacin. La unidad enzimtica se define en forma particular para cada reaccin segn sea
conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formacin de una determinada cantidad de
producto (desaparicin de reactivo) en un tiempo dado.

La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad especfica que es el cociente de actividad

enzimtica (expresada en unidades enzimticas) y la cantidad total de protenas.

B)

FUENTE DE LA ENZIMA

La actividad de una enzima vara considerablemente en diferente organismos y an en los diversos

tejidos de un mismo organismo. Para estudios mecansticos generales, debe seleccionarse aquella
fuente que sea rica en la enzima. En estos casos, particularmente en tejidos animales, la fuente
debe ser fresca, dado que la mayora de las enzimas se deterioran rpidamente. Frecuentemente
una buena eleccin de la fuente de enzima permite simplificar la extraccin y purificacin de la
enzima.

C)

IMPORTANCIA DE LA LOCALIZACION INTRACELULAR DE LA ENZIMA

Las enzimas pueden localizarse dentro de los siguientes grupos:

I.
Enzimas en solucin verdadera en el citoplasma. Permanecen en el sobrenadante luego de la
eliminacin de los componentes particulados. La ruptura de las clulas en un buffer adecuado
libera tales enzimas al medio.
II. Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas, mitocondrias, etc.). Pueden
encontrarse a) en solucin dentro de una memrana y pueden ser extradas despus de la

destruccin de la misma; b) asociadas a material lipoproteico insoluble. Para pasarlas a solucin

debe disociarse el complejo.

El conocimiento de la localizacin intracelular y solubilidad relativa de las enzimas ha permitido

desarrollar procedimientos de extraccin diferencial que facilitan la purificacin.

D)

EXTRACCION DE ENZIMAS

Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solucin son a menudo crticas y requieren
el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las clulas, eventualmente las estructuras
subcelulares y disociar las enzimas de otras molculas. A veces es necesario pasarlas a solucin
como complejo mucoproteico o nucleoproteico y disociarlo luego durante la purificacin.

Aunque la dispersin de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios

mecnicos, en muchos complejos enzimticos estn involucradas fuerzas especficas; de la
naturaleza de las mismas depende el mtodo a emplear.

En general, el primer paso consiste en la obtencin de un homogenato, que implica la destruccin

de la clula y el pasaje de las enzimas a solucin o suspensin. Esto puede llevarse a cabo por:

a)
Homogenizacin mecnica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero,
licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como almina, arena o bolitas de vidrio y con un
solvente adecuado, isotnico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico,
en un buffer adecuado para controlar el pH.

b)
Homogeneizacin snica: el choque de ondas snicas o ultrasnicas provoca cambios de
presin de miles de atmsferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias
y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, rin, eritrocitos).

c)
Desintegracin trmica: El congelamiento y descongelamiento rpidos y repetidos suelen
usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelacin se forman cristales de hielo
intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las clulas se destruyen
osmticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido.

d)
Desintegracin qumica: se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, ter
de petrleo, isopentanol, etc.

e)
Homogeneizacin por deshidratacin: se basa en la precipitacin de protenas por solventes
orgnicos. En la preparacin del "polvo acetnico" se utiliza acetona en fro.

E)

PURIFICACION

Los mtodos a elegir dependen de la fuente biolgica y de la concentracin de la enzima, y se

basan en las distintas propiedades fisicoqumicas de las protenas.

El primer paso consiste en la separacin de los distintos componentes intracelulares, generalmente

por centrifugacin. Las partculas que difieren en densidad o tamao sedimentan a distintas
velocidades por aplicacin de una fuerza centrfuga (campo gravitacional, g). Una centrifugacin
diferencial permite la separacin del homogenato en varias fracciones. Un esquema tipo es el
siguiente:

Cada una de las fracciones precipitadas puede tratarse con agentes

qumicos para solubilizar las enzimas que fuesen particuladas. A partir de
aqu comienza la purificacin.

Los procesos de purificacin utilizan las tcnicas clsicas de fraccionamiento

proteico y pueden basarse en el movimiento de sustancias en una fase
lquida (electroforesis o filtracin en geles) o en la transicin de sustancias
de una fase a otra (cromatografa o precipitacin). La eleccin de un
determinado procedimiento es un problema de prueba y error: hay que
probar procedimientos y seleccionar. En general, la repeticin de un paso es
ventajoso, ya sea en forma sucesiva o interpolando otros pasos, aunque a

veces provoca grandes prdidas de actividad total. Una vez llevado a cabo
un paso satisfactorio, la cantidad de material resultante debe ser manejable
antes de pasar al paso posterior.

Aparentemente los mtodos pueden usarse en cualquier orden y el mejor

orden se determina experimentalmente. Existen sin embargo ciertas
restricciones que hacen que haya un orden lgico.

Por ejemplo, el calentamiento tiene por objeto eliminar grandes cantidades

de protenas inespecficas y no requiere el agregado de grandes volmenes
de lquido; es lgico, por lo tanto, que se haga al principio. En muchos casos
no es practicable por la inestabilidad de la enzima o por la presencia de
enzimas proteolticas que la daaran mucho al elevar la temperatura, o
bien porque no aumenta el grado de purificacin.

F)

ANLISIS DE LOS DATOS

Para juzgar si un mtodo de purificacin es adecuado, deben calcularse la

recuperacin y el grado de purificacin alcanzados.

Considerando las unidades enzimticas totales de la etapa inicial como el

100% puede calcularse el rendimiento de cada etapa refiriendo las unidades
totales de cada paso a las iniciales. Para calcular el grado de purificacin,
debe obtenerse primero el valor de actividad especfica alcanzado en cada
paso. Si se considera la actividad especfica inicial como unidad de
purificacin, el grado de purificacin de cada etapa se calcula haciendo el
cociente entre la actividad especfica de dicha etapa y la del primer paso.

G)

CRITERIOS DE HOMOGENEIDAD

Cuando una purificacin enzimtica ha alcanzado la etapa donde

posteriores purificaciones o pasos no producen un incremento en la
actividad especfica, pueden investigarse con mtodos analticos la
homogeneidad y pureza de la preparacin obtenida. Pueden utilizarse

mtodos cromatogrficos, electroforesis, ultracentrifugacin, focalizacin

isoelctrica. La obtencin de un nico pico proteico es indicativo de
homogeneidad, si esto ha sido comprobado por varios mtodos.