FACULTAD DE INGENIERA

ESCUELA DE INGENIERA EN ALIMENTOS

"INMOVILIZACIN DE CLULAS DE LEVADURA"

Integrantes: Cecilia Suarez

Kendy Ljubetic
Gustavo Jara
Profesor: Osvaldo Torres
Asignatura: Biotecnologa

1.- Introduccin
La inmovilizacin de microorganismos es una alternativa para superar la
baja productividad y la fuerte inhibicin por producto que experimenta la
fermentacin en lote convencional, adicionalmente tiene otras ventajas sobre
esta ltima como actividad estable, reusabilidad, posibilidad de operacin
continua y bajo riesgo de contaminacin.
En los ltimos aos, la biotecnologa ha experimentado grandes avances
y, paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtencin de productos
qumicos, en la industria alimentaria y farmacutica.

(1)

1.1.0.- Inmovilizacin de levaduras

Las levaduras inmovilizadas se pueden definir como biocatalizadores
localizados fsicamente en un espacio definido, de tal manera que se pueden
emplear de forma repetitiva y continua, conservndose su capacidad
metablica. As pues, el uso de levaduras inmovilizadas para vinificacin est
recibiendo una gran atencin por sus ventajas tcnicas y econmicas. Los
sistemas de inmovilizacin aumentan la productividad, reducen los costes de
proceso y tambin influyen en el metabolismo de las levaduras y, en
consecuencia, en las caractersticas organolpticas del producto final.

(2)

La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o

localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas
insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas
repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso
por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de
movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte.
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:

El aumento de la estabilidad de la enzima;

La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes

del proceso.

La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control,

adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada.

Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas

elevadas de enzima, la cual mantendr su actividad durante ms tiempo. Estos
sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtencin de productos
con mayor pureza.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son:

La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado

nativo.

La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden

existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente
nmero de uniones al soporte.

Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la

movilizacin.

El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.

En general, los mtodos de preparacin difcil y de mayor coste

proporcionan biocatalizadores ms estables y duraderos; en cambio aquellos

mtodos ms sencillos como el atrapamiento o la adsorcin, donde la unin de
la enzima con el soporte es dbil, originan derivados inmovilizados que
presentan prdidas de actividad y que deben ser repuestos continuamente. (3)

2.- Antecedentes Bibliogrficos

En este experimento, las clulas de levadura sern atrapadas en geles
de alginato de calcio utilizando tcnicas similares a las de inmovilizacin de
enzimas. Otros medios de atrapamiento celular que se han intentado
previamente incluyen los geles de poliacrilamida, gelatina, quitosano y kcarragenano. Debido a la obligacin, por el equipamiento disponible, de
efectuar la tcnica de inmovilizacin en forma asptica, el experimento se
realizara sin autoclavado. El sistema de inmovilizacin convierte la glucosa a
etanol en forma anaerbica. Las razones para utilizar este sistema de
microorganismos son varias. Primero, la condicin anaerbica elimina la
necesidad de aireacin, la cual genera varios problemas tcnicos. Segundo, la
ausencia de oxgeno evita el crecimiento descontrolado de contaminantes
aerbicos en un sistema no esterilizado. Este es un aspecto importante si se
considera escalar hacia sistemas de fermentador a mayor volumen. La
liberacin de etanol tambin sera un freno para los contaminantes en un
fermentador. Para disminuir an ms la posibilidad de contaminacin por
bacterias, el pH debe ser bajo. Un pH de 4,0 disminuye drsticamente el
desarrollo de bacterias pero afecta levemente la capacidad de producir etanol
por parte de la levadura. (Torres, 2013)
2.1.0.- Mtodos de Inmovilizacin
Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y
sean estables es necesario aplicar un mtodo de inmovilizacin adecuado, que
depender del tipo de actividad cataltica de inters. Existen diversos mtodos
para inmovilizar clulas, los cuales pueden dividirse en:
- Entrecruzamiento fsico (floculacin).
- Entrecruzamiento covalente.
- Adsorcin sobre matrices insolubles
- Enlace covalente con matrices insolubles.
- Entrampamiento fsico en materiales porosos.
- Encapsulamiento.

Segn la ruta seguida para su preparacin los sistemas pueden clasificarse en

cuatro:

2.1.1.- Inmovilizacin sin Carrier

Es el caso de clulas unidas con otras clulas, tanto por adsorcin o por
uniones covalentes. La floculacin de clulas, durante su fermentacin o por
procesos secundarios mediante variacin en parmetros fisicoqumicos (pH,
fuerza inica) es un proceso de unin por adsorcin. Este proceso puede
ayudarse por el agregado de pequeas cantidades de agentes de floculacin
(polmeros). Es tambin comn el uso de agentes qumicos bifuncionales, tal
como el glutaraldhedo para unir clulas mediante entrecruzamiento qumico.
El caso tpico es la floculacin de algunas cepas de Zymomonas mobilis,
empleadas en la produccin de etanol. El mtodo de inmovilizacin es sencillo,
pues espontneamente se producen flocs cuando se crecen clulas en un
medio adecuado sin agitacin. Los flocs as formados se utilizan como inculo
de medios de cultivo frescos, y pueden ser usados en la produccin de etanol a
partir de glucosa en reactores especialmente diseados. Las clulas
inmovilizadas son retenidas dentro del reactor.
Este mtodo permite alcanzar altas concentraciones celulares, y se lleva
a cabo en condiciones de reaccin suaves, que no perjudican la estabilidad del
biocatalizador. Presenta algunas desventajas: se alcanza una baja resistencia
mecnica frente a la agitacin y a la compresin, hay limitaciones difuncionales
al transporte de nutrientes, y est limitado a pocas clases de microorganismos.
2.1.2.- Inmovilizacin del Biocatalizador en Carriers Preformados
Es la estrategia tpica en la inmovilizacin de enzimas, especialmente
por medio de enlaces covalentes. La matriz puede generarse sin las
limitaciones en condiciones fsicas y qumicas (temperatura, pH, etc.)
impuestas por el biocatalizador, por lo que pueden mejorarse y optimizarse las
caractersticas de estabilidad mecnica, la estructura porosa del material, la
resistencia, etc. En el caso de clulas, el problema estriba en cmo favorecer la
adhesin de las clulas (relativamente grandes) a las superficies de la matriz,

manteniendo la estabilidad y la resistencia al lavado. La matriz debe presentar

poros de mayor dimetro que la clula para permitir la penetracin a las
superficies internas. Se emplean carriers porosos, que son embebidos por
inmersin en suspensiones celulares. En el caso de enzimas es necesario
activar el soporte, mediante la generacin de grupos reactivos capaces de
reaccionar con los grupos amino o carboxilo libres presentes en la enzima.
2.1.3.- Inmovilizacin durante la preparacin del Carrier
Es la estrategia ms comn en la inmovilizacin de clulas enteras Si
bien hay dos mtodos, entrampamiento y encapsulamiento, este ltimo es de
limitada importancia. Debido al tamao de las clulas enteras, es relativamente
sencillo preparar redes de porosidad tal que garanticen la completa retencin
de las clulas, y que los procesos de transporte de sustratos y productos sean
suficientemente rpidos para obtener alta eficiencia en la actividad cataltica. La
dificultad se encuentra en la bsqueda de condiciones de preparacin de
carriers que cumplan con los requerimientos exigidos para que se retenga la
actividad del biocatalizador y/o la viabilidad celular. Es el mtodo de
inmovilizacin ms usado, debido a su flexibilidad y simplicidad, y a las poco
agresivas condiciones de reaccin (en el caso de polmeros naturales).
2.1.4.-Inmovilizacin por crecimiento de clulas previamente inmovilizadas
En realidad es un caso particular del criterio anterior. Esta estrategia es
utilizada para aumentar la concentracin de clulas dentro del carrier, por lo
que, evidentemente, slo sirve para inmovilizacin de clulas. Permite
inmovilizar clulas que contienen sistemas multienzimticos, ya sea en estado
estacionario o en condiciones de crecimiento. La desventaja es, al igual que en
caso de clulas libres, la existencia de reacciones laterales no deseadas.
Generalmente se realiza por entrampamiento en redes inicas. Es posible
restaurar la actividad cataltica, e inclusive aumentarla. Es un mtodo til para
obtener clulas difciles de inmovilizar como tales, como por ejemplo micelio
celular. La tcnica en este caso consiste en la inmovilizacin de esporos en
matrices insolubles, los cuales originarn micelio una vez inmovilizados en la
matriz.

2.1.5.- Tipos de Carriers

Desde el punto de vista qumico, las sustancias usadas para soportar a
los biocatalizadores pueden ser divididas en inorgnicas u orgnicas, y el
origen de las mismas puede ser natural u obtenido por sntesis.
a).- Inorgnicos:
- Naturales: arena, silicatos, arcillas.
- Sintticos: vidrios de porosidad controlada, cermicas.
b).- Orgnicos:
- Naturales: virutas de madera, antracita, colgeno, celulosa, alginatos,
carragenatos, albmina.
- Sintticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio inico,
epxidos, poliuretanos.
La seleccin del material se realiza siguiendo algunos criterios heursticos:
materiales de alta disponibilidad y bajo costo
materiales que permitan un proceso de inmovilizacin simple y efectivo
respecto de la retencin de la actividad.
materiales con alta capacidad y eficiencia
materiales que permitan un diseo de reactores sencillo.
Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales y que
permitan tcnicas de inmovilizacin por adsorcin. Los dos ltimos criterios
dirigen la eleccin hacia carriers orgnicos complejos. Obviamente la eleccin
final deber tener en cuenta el biocatalizador a utilizar, el proceso en el cual va
a participar y, fundamentalmente, el producto que se desea obtener.
De todos los mtodos mencionados se har especial nfasis en aquellos
que involucran la formacin de redes polimricas a partir de prepolmeros de
cadena larga, tales como alginatos y kappa-carragenatos (K-carragenatos). La

variedad de sistemas de este tipo es tan grande que pueden subdividirse segn
los mecanismos de formacin de las redes polimricas:
1. Precipitacin: formacin de red sin reaccin qumica, por separacin de
fases.
2. Gelificacin: formacin de redes sin reaccin qumica, por transicin de fase
debida a cambios de pH, temperatura, etc.
3. Gelificacin ionotrpica: formacin de redes con reaccin qumica
(intercambio de iones) debido al entrecruzamiento de cadenas polinicas con
contraiones multivalentes.
4. Entrecruzamiento covalente: formacin de redes con reaccin qumica
debida al entrecruzamiento de polmeros multifuncionales entre s o con
reactivos bifuncionales de bajo peso molecular. (Owen P Ward, 1998)

3.- Objetivos

Inmovilizar clulas de levadura de cerveza en alginato de calcio.

Verificar fermentacin de azcar en sistemas de levaduras
inmovilizadas.

4.- Materiales y Mtodos

4.1.0.- Materiales
Matraces
Pipetas
Balanza
Agitador magntico
Jeringa y aguja
Espectrofotmetro con cubetas
pH metro

4.1.1.- Reactivos

Medio de crecimiento pH 4,0

Alginato de sodio

CaCl2 100 mM

Cultivo de levadura

Reactivo DNS

4.2.- Procedimientos
1. Se centrifug a 4000 rpm el cultivo de levaduras (fueron 30 ml).
2. Se elimin el sobrenadante.
3. Se resuspendi el sedimento en 5 ml de alginato de sodio al 4% y se mezcl
bien.
4. Luego se transfiri la mezcla a una jeringa estril y se gote sobre 100 ml de
cloruro de sodio 100 mmolar, dejndose solidificar 10 min.

5. Se colocaron las esferas sobre un colador y luego se transfirieron al medio

de fermentacin. Luego se agit por un minuto y se extrajo 1 ml para
determinacin de azcares.
6. Se incub el recipiente con esferas a 35 C y se extrajeron muestras de 1 ml,
cada 20 min a un tubo limpio.
4.2.1.- Medicin de Azcares
1. Se diluy 1 ml de muestra 10 veces.
2. En un tubo limpio se agreg 1 ml de la dilucin ms 1 ml del reactivo DNS, y
se agit.
3. Se efectu la reaccin colocando el tubo en bao de agua hirviendo durante
5 minutos exactos.
4. Luego se enfri y se agregaron 10 ml de agua fra, se agit y se ley la
absorbancia a 500 nm contra un blanco.
5. El blanco se realiz con 1 ml de agua ms 1 ml de DNS, y se realiz el
mismo procedimiento anterior.

5.- Datos Experimentales

Tabla 1.indica absorbancia obtenida en ambos tubos analizados medida
en intervalos de 30 minutos.
Tiemp

Abs. Tubo 1

Abs. T2

o.
T0
T1
T2
T3

0,513
0,339
0,628
0,488

0,296
0,340
0,595
0,371

0,4045
0,3395
0,6115
0,4295

Tabla N2, indica datos de la curva Y=A + BX.

A
B

0,01
0,098

Tabla N3, indica pesos obtenidos durante la realizacin del practico.

Contenido del Tubo
Tubo + tapa
Tubo + tapa + clulas (T1)
Tubo + tapa + clulas (T2)

Peso
14,3 gr
15,5 gr
15,4 gr

6.- Resultados.
Tabla N4, indica resultados obtenidos de concentracin a distinta
absorbancias.
Absorbancia.
T0 = 0,4045
T1 = 0,3395
T2 = 0,6115
T3 = 0,4295

Concentracin en mM
4,025 mM
3,362 mM
6,137 mM
4,280 mM

Tabla N5, indica resultados obtenidos a partir de clculos realizados.

Glucosa consumida.
Tasa (RI)

4,59 x 10 - kg/lt
19,04 kg/lt

Concentracin (CX)
Tasa de biomasa especifica (QI)
Rendimiento.

m
7,5 (kg/m)
2,536
0,133

Tabla N%, indica concentracin de glucosa en el tiempo.

Concentracin mM
402,55
336,22
613,77
428,06

Tiempo.
0
30
60
90

7.- Discusin
La tcnica realizada de inmovilizacin de levadura seca de pan presenta
algunas dificultades debido a que esta levadura fue prensada con harina de
maz sin inactivacin de amilasas lo que se traduce en que hay presencia de

glucosa por lo tanto el sistema de inmovilizacin convirti esta glucosa en

etanol en forma anaerbica, esta condicin anaerbica es importante debido a
que elimina la necesidad de aireacin que trae consigo variados problemas
tcnicos, entre los que se encuentran el crecimiento descontrolado de
contaminantes aerbicos.
Otro aspecto importante de discutir es que debido a la actividad diastsica, la
que se genera por la diastasa que es una enzima de origen vegetal que se
encuentra en determinadas semillas germinadas y otras plantas cuya funcin
es

la

de

catalizar

la

hidrlisis,

primero

del almidn en dextrina e

inmediatamente despus, en azcar o glucosa, esto sucedi debido a que se

prendo con harina de maz.
En cuanto a los valores obtenidos en la tcnica de inmovilizacin, estos se
consideran ptimos y si se realizara esta tcnica a gran escala, se podrn
lograr altos rendimientos en cuanto a la produccin de biomasa generado por
cada unidad de sustrato consumido.

8.- Conclusin
Se logro concretar la inmovilizacin de clulas de levadura en alginato de
calcio, esto se baso en el principio de las conversiones microbianas efectuadas

por clulas unidas a superficies, en donde la inmovilizacin de clulas se

efectu mediante la unin de clulas o su inclusin en distintas fases o
soportes slidos permitiendo de esta manera el intercambio de sustratos,
productos, inhibidores, etc. Pero que a la vez mantiene separada la biomasa
cataltica del medio lquido que contienen sustratos y productos.
Se aprecio de igual manera la fermentacin de azcar en sistema de levadura
inmovilizada, donde la concentracin fue disminuyendo a medida que se
realizaba el procedimiento de inmovilizacin de levadura.
Esta tcnica de inmovilizacin se efectu de manera asptica debido a que
este es un parmetro de vital importancia para evitar la contaminacin
microbiana.
Las

fermentaciones

usando

clulas

inmovilizadas

generan

mayor

productividad, y esta diferencia en productividad es debido a la alta densidad

celular y a las modificaciones genticas y fisiolgicas y tambin a las clulas
inducidas por la inmovilizacin.
Se logro apreciar tambin que este tipo de inmovilizacin de clulas unidas a
un soporte son mas tolerantes a las perturbaciones del medio de reaccin y
menos sensibles a las sustancias toxicas.
Finalmente se concluye la que productividad obtenida en este tipo de tcnicas
es considerablemente mayor comparada con las fermentaciones tradicionales y
es por esto que cada da se realiza mas este tipo de operacin en fermentacin
y biotecnologa.

9.- Bibliografa
9.1.0.- Libros

Inmovilizacin de Clulas de Levadura. Osvaldo Torres. Gua de

Laboratorio de Ingeniera en alimentos. 2016
-

Owen P Ward Biotecnologa de la Fermentacin . Editorial Acribia,

Espaa 1998. Pg.

9.1.1.- Referencias de Internet

(1)http://bioprocesos.unq.edu.ar/Biopro%20II/Celulas%20inmovilizadas
%20TP.pdf
(2)http://www20.gencat.cat/docs/DAR/OR_Organismes/OR01_INCAVI/OR01_1
1_Documentacio_tecnica/Documents/2010/Fitxers_estatics/2010_levaduras_bi
oinmovilizadas_foro_logrono.pdf
(3) http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf

10.- Anexos
Y = A + BX

Factor de dilucin = 100

Concentracin obtenida en la primera medicin a tiempo T0.
0,4295 = 0,01 + 0,098 X
0,4395 0,01 = 0,098 X
0,4195 = X
0,098
X= 4,280 x 100
X = 428,06 mM
Concentracin obtenida en la primera medicin a tiempo T1.
0,3395 = 0,01 + 0,098X
0,3395 0,01 = 0,098 X
0,3295 = X
0,098
X = 3,362 x 100
X= 336,22 mM
Concentracin obtenida en la primera medicin a tiempo T2.
0,6115 = 0,01 + 0,098 X
0,6115 0,01 = 0,098 X
0,6015 = X
0,098
X = 6,137 x 100
X= 613,77mM
Concentracin obtenida en la primera medicin a tiempo T3.
0,4045 = 0,01 + 0,098 X
0,4045 0,01 = 0,098 X
0,3945 = X
0,098
X = 4,025 x 100
X=402,5mM

A partir de la concentracin de glucosa, se determinaron los siguientes

clculos.
1.-Calculo del porcentaje de consumo de glucosa.

-concentracin inicial de glucosa T0 = 402,55 mM

-concentracin final de glucosa T3= 428,06 mM
Glucosa consumida =T0 T3
= 402,55 mM 428,06 mM
= -25,51 mM
1 mM 180 mg/lt
-25,51 mM X
X = -4591,8 mg/lt
1 gr 1000 mg
X -4591,8 mg
X = -4,59 gr/ lt
1 kg 1000 gr
X -4,59 gr
X = -4,59 x 10 - kg/lt
Como los clculos del consume de glucosa se realizaron en un intervalos de
tiempo de 90 minutos, se proceder a realizar los clculos por minute y luego
por hora del consumo de glucosa.
-4,59 x 10 - kg/lt 90 min
X 1 min
X= -5,102 x 10 -5 kg/lt min
5,102 x 10 -5 1 min
X 60 min
X= -3,06 x 10 - kg/lt hr.

Volumen = ml alginato + ml del sedimento + ml caldo del matraz.

Volumen = 5 ml + 55,7 ml +100 ml
Volumen = 160,7 ml

2.- Tasa (Ri) = glucosa consumida por hora

Volumen (m)

Tasa (Ri) = -3,06 x 10 - kg/hr

1,607 x 10 m
= - 19,04 kg/hr

m
peso tubo = 14,3
peso muestra centrifugada con sedimento = 15,5
15,5 14,3 = 1,2 gr
1000gr 1 kg
1,2 gr X
X= 1,2 x 10 - kg
3.- Concentracin = Cx = 1,2 x 10 -
1,607 x 10

Cx =7,5 (kg /m)

4.- Tasa de biomasa especifica.

Qi = Ri
Cx
Qi= -19,04
7,5
Qi = 2,536 tasa de biomasa especifica.
5.- Rendimiento = Qi
Ri
Rendimiento = 2,536
19,04
Rendimiento = 0,133 por cada unidad de sustrato consumido se esta
produciendo 0,133 de biomasa.