PRINCIPIOS GENERALES DEL DIAGNSTICO DE LABORATORIO

2.1. MICROSCOPA Y CULTIVO IN VITRO

2.1.1. MICROSCOPA
Es el conjunto de tcnicas para producir imgenes visibles de estructuras demasiado pequeas
para ser percibido a simple vista; el estudio detallado de los componentes de clulas y tejidos
animales o vegetales, por el tamao que poseen, requiere el uso de instrumentos (microscopio).
En microbiologa se utiliza para dos fines bsicos: 1) deteccin inicial de microorganismos e 2)
identificacin preliminar o definitiva de los mismos.
El microscopio fue empleado por los primeros bilogos para estudiar la clula y los tejidos. El
nombre deriva etimolgicamente de dos races griegas: mikrs, que significa pequeo y skopoo,
que significa observar. Es decir el microscopio es un instrumento que sirve para observar objetos o
estructuras pequeas.
Existen dos tipos de microscopios que emplean la luz como fuente de energa para formar
imgenes aumentadas y detalladas de objetos que a simple vista no es posible observar:
a) Microscopio fotnico simple o lupa.
b) Microscopio fotnico compuesto.
COMPONENTES DEL MICROSCOPIO FOTNICO
El microscopio fotnico compuesto est integrado por tres tipos de componentes:
a) COMPONENTES MECNICOS: Son aquellos que sirven de sostn, movimiento y sujecin de
los sistemas pticos y de iluminacin as como de los objetos que se van a observar.
Base o pi: Es una pieza metlica, amplia y slida que proporciona estabilidad y sirve de
soporte para los otros componentes del microscopio.
Brazo, estativo o columna: Permite la sujecin y traslado del microscopio. Soporta al
tubo ptico, a la platina y el revlver.
Platina: Pieza metlica, cuadrada y plana de posicin horizontal que posee una
perforacin circular central, por la que pasara la luz del sistema de iluminacin.
En ella se apoya la preparacin (lmina portaobjetos que contiene a la muestra que se va a
examinar) a observar, que es sujetada por un par de pinzas que tiene un sistema
mecnico, denominado carro, que permite el movimiento de derecha a izquierda y de
adelante hacia atrs.
Tubo ptico: Consiste en un cilindro metlico que suele medir 160mm o 170 mm de
longitud (dependiendo del fabricante del microscopio) el cual en el extremo inferior, est
conectado al revolver o portaobjetivos y en el otro superior se relaciona con el (los)
ocular(es).

 Revolver o portaobjetivo: Es una pieza sobre la que se montan los objetivos y es capaz
de girar para permitir el cambio de dichos objetivos con el fin de que coincidan de manera
perpendicular con la perforacin central de la platina.
Tornillos macromtrico y micromtrico: Generalmente estn situados en la parte inferior
del brazo o columna. Pueden estar separados (en los 2 microscopios antiguos) o el tornillo
micromtrico est incorporado en la circunferencia del tornillo macromtrico (microscopios
actuales).
Ambos tornillos permiten el movimiento de la platina hacia arriba y hacia abajo con la
diferencia de que el Tornillo macromtrico mueve la platina de forma brusca y poco
precisa; en cambio, el tornillo micromtrico mueve la platina hacia arriba y hacia abajo de
forma lenta y muy precisa para efectuar el enfoque fino y definitivo de la imagen.
La finalidad es de acercar o alejar la preparacin hacia los objetivos y as conseguir un
enfoque ptimo de la imagen.

b) COMPONENTES PTICOS: comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que

produce el aumento de las imgenes que se observan a travs de ellas.
Objetivos: son unos pequeos cilindros incrustados en el revlver, situados cerca de la
preparacin y obtienen la imagen real aumentada e invertida.
Considerados los elementos ms importantes en la formacin de la imagen microscpica,
ya que establecen la calidad de la imagen en cuanto a su nitidez, la capacidad que tiene
para captar los detalles de la misma (poder de resolucin) y determinan la cantidad total de
aumento.
Cada objetivo tiene grabadas en su superficie unas cifras que indican: el aumento propio,
la apertura numrica, la longitud del tubo ocular y el grosor de los cubreobjetos que debe
utilizarse en la preparacin para una correcta observacin. Suelen llevar dibujado un anillo
de color que indica su aumento y suelen ser de x4 (rojo), x10 (amarillo), x40 (azul) y x100
(blanco).
Por ejemplo, las siguientes cifras grabadas: 40x/0.70; 160/0.17, indican: 40x el aumento
del objetivo; 0.70 la abertura numrica, es decir, la medida del tamao del cono de luz que
el objetivo puede admitir; 160 la longitud (en mm) del tubo del ocular que debe ser
utilizados con ese objetivo y 0.17 el espesor del cubreobjetos (en mm) que debe usarse
con ese objetivo.

 OCULAR: Es otro componente ptico del microscopio, debe su nombre porque la imagen
final se observa a travs de l acercando el ojo del observador a la lente ocular del
componente.
Es el encargado de formar una segunda imagen a partir de la imagen primaria que forma el
objetivo. La imagen del ocular es de mayor tamao, virtual y derecho. Esta imagen
nicamente ampla un nmero determinado de veces (5x, 8x, 10x, 12x) a la imagen
formada por el objetivo. No aade, por ms aumentos propios que posea, ningn detalle a
los generados por el objetivo.
Ojo humano: de 100 metros a 0,1 milmetro
microscopio ptico: de 0,1 mm a 0,25m (micras)
microscopio electrnico: de10 m a 0,1 nm (manmetro).

b) COMPONENTES DE ILUMINACION: Se consideran dentro de este grupo a las partes del

microscopio que reflejan, transmiten, y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la
observacin a travs del microscopio.
FUENTE DE LUZ: Para observar la muestra microscpica es necesario que esta se
ilumine con algn tipo de luz y nuestros microscopios cuenta con un foco que da energa
elctrica que dirige sus rayos luminosos hacia el sistema condensador
CONDENSADOR: Es una lente de gran abertura que Es el componente ptico que tiene
como funcin principal dirigir y concentrar los rayos luminosos que provienen de la fuente
luminosa. Est formado por una o dos lentes convergentes que renen los rayos luminosos
y los orientan hacia la abertura central de la platina en la preparacin.
Se encuentra debajo de la platina y tiene un diafragma unido en la parte inferior.
DIAFRAGMA: Est en el interior del condensador y sirve para limitar el haz de rayos que
atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la luz y
ajusta la apertura numrica).
Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

TIPOS DE MICROSCOPIOS FOTNICOS.

MICROSCOPIO DE TRANSPARENCIA O DE CAMPO CLARO (OPTICA):
Los componentes bsicos de los microscopios pticos son una fuente de luz que se utiliza para
iluminar la muestra colocada en una platina, un condensador para enfocar la luz en la muestra y
dos sistemas de lentes (lente del objetivo y lente del ocular) que se utilizan para ampliar la imagen
de la muestra. En la microscopia de campo claro la muestra se ve mediante transiluminacin, de
manera que la luz procedente del condensador atraviesa la muestra. Despus se ampla la
imagen, primero por la lente del objetivo y despus por la lente del ocular. La ampliacin total de la
imagen es el producto de las ampliaciones de las lentes del objetivo y del ocular. Habitualmente se
utilizan tres lentes del objetivo diferentes: bajo aumento (aumento de 10 veces), que se puede
utilizar para explorar una muestra; alto aumento en seco (40 veces), que se utiliza para buscar
microorganismos grandes como parsitos y hongos filamentosos; e inmersin en aceite (100
veces), que se utiliza para observar bacterias, levaduras (fase unicelular de los hongos) y los
detalles morfolgicos de los microorganismos y las clulas de mayor tamao. Las lentes del ocular
pueden ampliar an ms la imagen (generalmente de 10 a 15 veces).
La limitacin de la microscopia de campo claro es la resolucin de la imagen (es decir, la
capacidad de distinguir que dos objetos estn separados y que no son uno solo). La capacidad de
resolucin de un microscopio est determinada por la longitud de onda de la luz utilizada para
iluminar el objeto y el ngulo de la luz que entra en la lente del objetivo (el que se denomina
abertura numrica). La capacidad de resolucin es mxima cuando se interpone aceite entre la
lente del objetivo (habitualmente la lente de 100x) y la muestra, porque el aceite reduce la
dispersin de la luz. Los mejores microscopios de campo claro tienen una capacidad de resolucin
de aproximadamente 0,2 um, lo que permite ver la mayora de las bacterias pero no los virus.
Aunque la mayora de las bacterias y los microorganismos de mayor tamao se pueden ver
mediante microscopia de campo claro, los ndices de refraccin de los microorganismos y el fondo
son similares. Por tanto, los microorganismos se deben teir con un colorante para poder
observarlos, o se debe utilizar un mtodo microscpico alternativa

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO:

En los microscopios de campo oscuro se utilizan las mismas lentes del objetivo y del ocular que en
los microscopios de campo claro; sin embargo, se utiliza un condensador especial que impide que
la luz transmitida ilumine directamente la muestra. Solo la luz oblicua y dispersa llega a la muestra
y atraviesa los sistemas de las lentes, lo que hace que la muestra est muy iluminada sobre el
fondo negro. La ventaja de este mtodo es que la capacidad de resolucin de la microscopia de
campo oscuro es significativamente mayor que la de la microscopia de campo claro (es decir, 0,02
um en comparacin con 0,2 um), lo que posibilita la deteccin de bacterias muy delgadas, como
treponema pallidum (microorganismo causal de la sfilis) y el gnero leptospira (leptospirosis). La
desventaja de este mtodo es que la luz pasa alrededor de los microorganismos y no la atraviesa,
lo que dificulta el estudio de su estructura interna.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES.

La microscopia de contraste de fases permite examinar los detalles internos de los
microorganismos. En esta forma de microscopia, como se hacen pasar haces de luz paralelos a
travs de objetos de densidades diferentes, la longitud de onda de un haz se desfasa en relacin
con el otro haz de luz (es decir, el haz que atraviesa el material ms denso se retrasa ms que el
otro). Mediante el uso de anillos anulares en el condensador y en las lentes del objetivo se
amplifican las diferencias de fases, de modo que la luz en fase parece ms brillante que la luz
fuera de fase. Esto crea una imagen tridimensional del microorganismo o de la muestra y permite
un anlisis ms detallado de las estructuras internas.

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA O DE RADIACIN ULTRAVIOLETA:

Algunos compuestos, denominados fluorocromos, pueden absorber la luz ultravioleta o ultraazul de
la longitud de onda corta y emitir energa con una longitud de onda visible y mayor. Aunque
algunos microorganismos tienen fluorescencia natural (autofluorescencia), la microscopia
fluorescente habitualmente se supone la tincin de microorganismos con colorantes fluorescentes,
y despus de su estudio con un microscopio fluorescente de diseo especial. El microscopio utiliza
una lmpara de vapor de mercurio, de un halgeno o de xenn a presin elevada que emite una
longitud de onda de luz ms corta que la que emiten los microscopio de campo claro tradicionales,
se utiliza una serie de filtros para bloquear el calor que genera la lmpara, eliminar la luz infrarroja
y seleccionar la longitud de onda adecuada para excitar el fluorocromo. Posteriormente la luz que
emite el fluorocromo se amplifica con las lentes del objetivo y del ocular tradicionales. Los
microorganismos y las muestras teidas con fluorocromos aparecen brillantes sobre un fondo
oscuro, aunque los colores varan dependiendo del fluorocromo seleccionado. El contraste entre el
microorganismo y el fondo es suficientemente grande para que se pueda realizar una bsqueda
rpida del microorganismo con bajo aumento y despus el material se explora con mayor aumento
una vez que se ha detectado con fluorescencia.

MICROSCOPIO ELECTRNICO:
Al contrario de otros formas de microscopio, en los microscopios electrnicos se utilizan bobinas
magnticas (y no lentes) para dirigir un haz de electrones desde un filamento de tungsteno a travs
de una muestra y hacia una pantalla. Dado que la longitud de onda en este caso es mucho ms
corta que la de la luz, la resolucin y la ampliacin mejoran drsticamente. Con microscopio
electrnico se pueden ver partculas vricas individuales (en contra posicin con los cuerpos de
inclusin vricos). Las muestras habitualmente se tien o se cubren con iones metlicos para crear
contraste.
Hay 2 tipos de microscopios electrnicos:

Microscopios electrnicos de transmisin, en los cuales los electrones, igual que la luz en los
microscopios pticos, atraviesan directamente la muestra.
Se requieren tcnicas de precipitado de metales pesados en lugar de colorantes hidrosolubles.

Microscopios electrnicos de barrido, en los que los electrones rebotan en la superficie de la

muestra con un determinado ngulo y se generan una imagen tridimensional.
A diferencia de la microscopia de transmisin, se usa para observar la superficie de un espcimen
slido. Por lo general el objeto que se observa se prepara en una forma especial que permite
depositar en la superficie del espcimen una capa muy delgada de un metal pesado, como oro o
paladio.

2.1.2 MTODOS DE ESTUDIO EN EL DIAGNOSTICO MICROBIOLICO.

Existen 2 tipos de estudio: Mtodo Directo( in vivo) y Mtodo Indirecto (in vitro)
A. ESTUDIO DIRECTO: Tienen como objetivo primordial identificar al microorganismo
especfico que est causando el dao o la patologa.
A.I Tradicionales.
- Observacin microscpica.
- Cultivo.
A.II Moleculares.
- Hibridizacion
- P.C.R.
A.III Deteccin de antgenos:
- Inmunofluorescencia directo
- Elisa directo
B. Mtodos indirectos:
- Inmunofluorescencia Indirecto
- Elisa Indirecto
A) Observacin Microscopica:
Podemos distinguir dos tipos diferentes de muestras biolgicas:
A) Preparaciones en fresco o in vivo.
Las preparaciones al fresco son muy fciles de preparar; se prepara una disolucin acuosa
donde se introduce el microorganismo, se pone una gota en un porta, se tapa con un cubre y
se observa. Se emplean para observar la morfologa de bacterias, especialmente de
espiroquetas. Sirve tambin para observar la movilidad de las bacterias y para observar
cambios citolgicos; mitosis, esporulacin, etc. Tambin sirve para observar inclusiones
(grasas, etc.)
Ejemplos
- Suero fisiolgico: demostrar la presencia de Tricomonas y Treponemas.
- Solucin de KOH (10%): Permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere
parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta
sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos.
- Tinta china: El frotis se hace con la nigrosina; no hay que fijarla (por eso no se considera a la
tinta china como tincin). Nos sirve para observar la cpsula de bacterias, indicadora de
virulencia. Esta tcnica se utiliza principalmente para identificacin del Cryotococcus
Neoformans.

Cryptococcus neoformans en una tincin con

tinta china.

B) Preparaciones fijadas y teidas

Las preparaciones fijadas y teidas son las ms utilizadas en Microbiologa por dos razones:
- La tincin facilita la visualizacin de la bacteria
- Con varios colorantes clasificamos la bacteria en distintos grupos.
La mayor desventaja es que la bacteria ya est muerta.. Estas tinciones utilizan los colorantes
diferenciales, que se componen de ms de una sustancia tintrea. En algunas tcnicas de
coloracin, las tinciones diferenciales ms importantes que se emplean en bacteriologa son las de
Gram y la tincin cido-resistente. Ambas tinciones se utilizan para obtener informacin acerca de
la composicin de las capas de la pared celular de las clulas bacterianas
Otras tinciones como Las tinciones de hematoxilina frrica y tricromica son sumamente tiles
para la identificacin de parsitos protozoarios, y La tincin de Wright-Giemsa se utiliza para
identificar parsitos sanguneos

LA TINCIN GRAM
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio
bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las
referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan
justamente en la tincin de GRAM
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en
1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene
nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de
bacterias).
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tien de azul oscuro o violeta
por la tincin de Gram, La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la
membrana citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano,
que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtica mediante molculas

de cido lipoteicoico. La capa de peptidoglucano confiere una gran resistencia a estas bacterias y
es la responsable de retener el tinte durante la tincin de Gram.

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas)

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Las Bacterias Gram-Negativas son aquellas que presentan dos membranas lipdicas y entre ellas
se localiza un fina pared celular compuesta fundamentalmente por peptidoglucano ( al ser fina esta
pared, no se tie de violeta o azul en la tincin ).Estas bacterias se tien de Rosa.

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas)

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. El material de la pared celular
bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene
poca afinidad con las clulas.

2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas
grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del
tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta yodo.
El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son
ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y
otras gramnegativos.

Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gramnegativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias grampositivas contienen menos aminocidos que las gram-negativa; el contenido graso es mucho ms
elevado en las gram-negativa que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como
explicacin del mecanismo de la reaccin al gram.
Tincin Hematoxilina Frrica
Se utiliza para la deteccin e identificacin de protozoos fecales. Los huevos y las larvas de
helmintos retienen demasiado colorante, por lo que se identifican con mas facilidad en
preparaciones en fresco.

Tincin Tricrmica
Alternativa a la hematoxilina frrica para teir protozoos. Esta tincin se usa para la visualizacin
de protozoos, permite examinar la morfologa y las estructuras internas, lo que facilita su
identificacin.

Tincin de Wright-Giemsa
La tincin de Giemsa (pr. gumsa), ideada por el alemn Gustav Giemsa, es un mtodo habitual
para el examen de frotis sanguneos, cortes histolgicos y otro tipo de muestras biolgicas. Este
mtodo tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las
clulas huspedes. La coloracin de Giemsa se emplea tambin para teir frotis de sangre en el
examen para protozoos.
Esto permite distinguir perfectamente en microscopio ptico el ncleo celular,
los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN
mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Trypanosoma).

B. TINCIN ACIDORRESISTENTE
Se utilizan al menos tres tinciones, cada una de las cuales aprovecha el hecho de que algunos
microorganismos conservan una tincin principal incluso despus de exponerlos a agentes
decolorantes potentes.
Tincin De Ziehl-Neelsen (Baar)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos)
de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se
denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los
parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol
resistencia. La coloracin clsica de Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante
atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Tincin Rodamina-Auramina
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color
amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como
contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol resistentes,
incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser
reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el
fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos
pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la diferenciacin
morfolgica
.

Tincin De Kinyoun
Tincin acidorresistente en frio, tiene los mismos principios que la tincin de ZIEHL-NEELSEN.

Tincin Naranja De Acridina

El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia
puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado
como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est
muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se
inactivar poco tiempo despus de la tincin.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido
ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tincin de

hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin
inicial de hemocultivos positivos.

Tincin De Blanco De Calcoflor

Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando
considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage y
Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los
materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos
morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de
lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescentes con luz blanco-azulada o verde
manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.

2.1.3 CULTIVO IN VITRO

Se utilizan medios de cultivo para la recuperacin de los microorganismos a partir del hbitat
natural donde se encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales que les proporcionan sus
requerimientos nutricionales, las cuales permiten el su crecimiento en el laboratorio, in vitro.
La base de la microbiologa se cre en 1676 cuando Anton van Leeuwenhoek observo bacterias en
el agua utilizando uno de los primeros microscopios. No fue hasta casi 200 aos despus cuando
Pasteur consigui cultivar bacterias en laboratorio en un medio de cultivo compuesto de extractos
de levaduras, azcar y sales de amoniaco. En 1881 Hesse utilizo agar que consigui en la cocina
de su mujer para solidificar este medio, lo que permiti cultivar colonias macroscpicas de
bacterias. A lo largo de los aos los microbilogos y los cocineros han vuelto a la cocina para crear
cientos de medios de cultivo que actualmente se emplean en los laboratorios de microbiologa
clnica.
El xito de los mtodos de cultivo depende de la biologa del microorganismo, del lugar de la
infeccin, de la respuesta inmunitaria del paciente frente a la misma y de la calidad del medio de
cultivo. La bacteria Legionella es un patgeno respiratorio importante; sin embargo, nunca se
consigui cultivar hasta que se reconoci que su recuperacin dependa de disponer de un medio
enriquecido con hierro y L-cistena. Campylobacter, un importante patgeno entrico, no se
consigui recuperar de las muestras de heces hasta que se incubaron medios altamente selectivos
a 42 C en una atmosfera microaerfila. Chlamydia, una importante bacteria responsable de
enfermedades de transmisin sexual, es un patgeno intracelular obligado que debe ser cultivado
en clulas vivas. Staphylococcus aureus, que es la causa del sndrome del shock toxico
estafiloccico, produce la enfermedad mediante la liberacin de una toxina hacia el sistema
circulatorio.
Tipos de medios de cultivo
Los medios de cultivo se pueden clasificar en cuatro grupos generales:
medios enriquecidos no selectivos
medios selectivos
medios diferenciales
medios especializados
Medios de cultivo no selectivos enriquecidos
Estos medios estn diseados para permitir el crecimiento de la mayor
parte de los grmenes que no necesitan unas condiciones exigentes.
Algunos de los ms empleados son:
a) Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza adems
para la investigacin de los diversos tipos de hemlisis (, o
gamma). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para
la preparacin del agar sangre se puede utilizar dos
componentes el agar nutritivo, enriquecido con cloruro sdico
o un preparado enriquecido con otras sustancias como
Columbia o el tripticasa de soja, y el agregado de 5 % de
sangre (ovina, caballo, conejo, tambin puede usarse
sangre humana) para cultivos en una placa de Agar. El agar
sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa
tambin para ver la capacidad hemoltica de los
microorganismos patgenos (que es un factor de virulencia).
b) Agar chocolate: es un medio de cultivo enriquecido y no
selectivo. Es un agar modificado. Cuando se aade sangre

o hemoglobina al medio de base calentado, se vuelve marrn de ah viene su nombre.

Contiene glbulos rojos, que han sido lisados por el suave calentamiento a 56 C. Este
medio permite el crecimiento de la mayor parte de las bacterias, incluidas algunas que no
crecen en el agar sangre (es decir, Haemophilus, algunas cepas de Neisseria
patgenas).Estas bacterias necesitan factores de crecimiento, como el NAD y hematina,
componentes que podemos encontrar dentro de los glbulos rojos; por lo tanto, un
prerrequisito lgico para el crecimiento es la lisis de los glbulos rojos. El agar se llama as
debido a su parecido con el chocolate, pero no contiene nada de este.
c) Agar Mueller-Hinton: es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad
antimicrobiana en microorganismos aerbicos por el
mtodo de Bauer-Kirby. Utilizando un solo disco
impregnado con una alta concentracin de un
antimicrobiano. Este medio es el seleccionado para
realizar las pruebas de susceptibilidad por su alta
reproducibilidad, su bajo contenido de substancias
inhibidoras y el crecimiento satisfactorio que presentan
la mayora de los patgenos.
Su composicin est bien definida e incluyen extractos
de ternera y casena, sales, cationes divalentes y
almidn.
d) Caldo tioglicolato: Fue descripto originalmente por Brewer. Favorece el crecimiento de
una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricionalmente exigentes.
Las sustancias reductoras como tioglicolato de
sodio, el sulfito de sodio y cistena disminuyen el
potencial de xido reduccin y proporcionan una
anaerobiosis suficiente y debido a los grupos SHde estos compuestos, se neutralizan los efectos
bacteriostticos de los derivados mercuriales,
arsenicales y de otros metales pesados que
pudieran estar presentes en la muestra en
estudio.
El bajo contenido de agar le otorga la propiedad de ser un medio fluido y retarda la
dispersin de CO2 y O2. Debido a todas estas caractersticas desarrollan microorganismos
aerobios, anaerobios facultativos y estrictos.
e) Agar dextrosa de Sabouraud: Se trata de un medio de cultivo enriquecido que contiene
casena y tejido animal digeridos suplementados con glucosa; es utilizado para cultivo de
mohos y levaduras patgenas y no patgenas. El bajo pH del medio resulta favorable para
el crecimiento de los hongos y ligeramente inhibitorio para las bacterias.
Medios de cultivos selectivos y diferenciales

Los medios de cultivo selectivos se disean para poder recuperar grmenes especficos
que pueden estar presentes en una mezcla de otros grmenes (p. ej., un patgeno entrico
en las heces).
Los medios se enriquecen con inhibidores que suprimen el crecimiento de los grmenes no
deseados.
Estos medios se hacen diferenciales aadiendo ingredientes especficos que permiten la
identificacin del germen en una mezcla (p. ej., aadiendo lactosa y un indicador de pH
para identificar los grmenes que fermentan la lactosa).
Ejemplos de medios de cultivos selectivos y diferenciales:
a) Agar MacConkey: es un medio de cultivo especfico para bacterias gramnegativas y
diferencial cepas que fermenten la lactosa. Sirve como un indicador visual de pH,

distinguiendo as las bacterias gramnegativas que pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las
que no pueden (Lac-). Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias
Lac+ como Escherichia coli, enterobacter y Klebsiella producen
acidez, lo cual baja el pH bajo 6,8 lo que tiene como
consecuencia la aparicin de colonias de color rosadas o rojas.
Algunas bacterias en cambio fermentan la lactosa de manera
lenta, estas siguen siendo Lac+ por ejemplo: Serratia y
Citrobacter. Bacterias que no fermenten la lactosa como
Salmonella, Proteus y Shigella utilizaran peptona en su lugar,
formando amoniaco, lo cual incrementa el pH del agar,
formando colonias blancas o incoloras.
b) Agar sal Manitol: es un medio de cultivo selectivo que se utiliza en el aislamiento de
estafilococos. Permite el crecimiento de bacterias Grampositivas mientras inhibe el
crecimiento de Gram negativas. Este medio es importante en el laboratorio clnico debido a
que es capaz de distinguir los microorganismos
patognicos en un corto periodo de tiempo. Contiene
una alta concentracin de sal (NaCl), hacindolo
selectivo para Staphylococcus debido su alta
concentracin de NaCl es inhibitorio para la mayora de
las bacterias Gram negativas. Adems contiene manitol
otro inhibidor de bacterias Gramnegativas y un
indicador de pH indicador de fermentacin; rojo de
fenol. Coagulasa-positivo Staphylococcus producen
colonias amarillas con zonas amarillas, mientras que
coagulasa-negativo Staphylococcus producen colonias
rojas o ligeramente rosadas sin cambio alguno al medio. Si un organismo es capaz de
fermentar el manitol, un subproducto cido es creado que hace que el rojo de fenol cambie
a amarillo. Se usa para el aislamiento selectivo de colonias de Staphylococcus sospechosas
de ser patgenas.
c) Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD): es un medio selectivo diferencial, utilizado para el
aislamiento y diferenciacin de patgenos entricos Gramnegativos, especialmente del
gnero Shigella. La degradacin de los carbohidratos presentes en el medio (xilosa, lactosa
y sacarosa) genera la produccin de cido haciendo virar el indicador (rojo fenol) de rojo a
amarillo. En este medio se incorpora la xilosa porque es prcticamente fermentada por
todas las enterobacterias con excepcin de los microorganismos pertenecientes al gnero
Shigella.
La salmonella fermenta la xilosa, pero tambin descarboxila la lisisna y genera el producto
alcalino diamino cadaverina. Este producto neutraliza los productos de fermentacin de los
cidos, de manera que las colonias sern rojo.
d) Medio de Lowenstein-Jensen (L J): Originalmente la frmula de Lowenstein de 1931
contena los indicadores rojo congo y verde de malaquita. En 1932 Jensen modific el
medio eliminando el rojo congo e incrementando la concentracin de verde de malaquita.
Este medio se utiliza para aislar micobacterias, contiene glicerol, harina de patatas, sales y
huevos coagulados. Se aade verde malaquita para inhibir las bacterias grampositivas
e) Agar Middlebrook: Este medio de cultivo de agar se emplea tambin para aislar
micobacterias. Contiene nutrientes necesarios para el crecimiento de las micobacterias y
verde malaquita para la inhibicin de bacterias grampositivas. A diferencia del medio L J se
solidifica con agar
f) CHROMagar: Es un medio selectivo y de diferenciacin para el aislamiento de hongos. Es
usado para aislar e identificar algunas especies distintas de la levadura Candida.

Con la inclusin de sustratos cromgenos en el medio, las colonias de C. albicans, C.

tropicalis y C. krusei producen colores diferentes, lo que permite la deteccin directa de
estas especies de levaduras en la placa de aislamiento.
Las colonias de C. albicans presentan un color de verde claro a mediano
Las colonias de C. tropicalis, moradas (de azul verdoso a azul metlico)
Las colonias de C. krusei, rosado claro con borde blancuzco.
Es posible que otras especies de levaduras produzcan su color natural (crema) o
presenten un color rosado o malva de claro a oscuro (por ejemplo, Candida [Torulopsis]
glabrata y otras especies). Una ventaja adicional del medio es la fcil deteccin de cultivos
mixtos de levaduras, debido a los diferentes colores que presentan sus colonias. Peptonas
especialmente seleccionadas suministran los nutrientes en CHROMagar. La mezcla
cromgena est formada por sustratos artificiales (cromgenos), que liberan compuestos
de colores diferentes al ser degradados por enzimas especficas. De esta manera es
posible diferenciar determinadas especies o detectar ciertos grupos de organismos con
slo un mnimo de pruebas de confirmacin. El cloranfenicol inhibe la mayora de los
contaminantes bacterianos.
g) Agar de levaduras inhibidor: Este medio de cultivo es un compuesto selectivo enriquecido
que se emplea para aislamiento de hongos patgenos distintos de los dermatofitos. Se
aade cloranfenicol para suprimir el crecimiento de las bacterias contaminantes.

Medios especializados
Se han creado muchos medios de cultivo especializados distintos para detectar grmenes
especficos, que pueden ser exigentes o que se presentan mezclados con muchos otros.
CULTIVO CELULAR
Algunas bacterias y todos los virus son grmenes intracelulares estrictos, de forma que
solo se pueden cultivar en clulas vivas.
En 1949 John franklin Enders describi una tcnica para cultivar clulas de mamfero y
aislar el virus de la poliomielitis. Esta tcnica se ha ampliado para poder cultivar la mayor
parte de los grmenes intracelulares estrictos.
Los cultivos celulares pueden ser clulas que crecen y se dividen sobre una superficie (es
decir, una monocapa de clulas) o clulas
suspendidas en un medio de cultivo. Algunos
cultivos celulares estn bien establecidos y se
pueden mantener de forma indefinida. Estos
medios se comercializan en general.
Otros cultivos celulares se deben preparar
inmediatamente antes de infectarlos con
bacterias o virus y no se pueden mantener en el
laboratorio ms de unos pocos ciclos de divisin
(cultivos celulares primarios). La entrada a las
clulas se suele regular por la existencia de receptores
especficos, de forma que se puede emplear la capacidad diferencial de infectar lneas
celulares especficas para predecir la identidad de una bacteria o virus.

2.2. DIAGNSTICO MOLECULAR

El ADN y el ARN o las protenas de un agente infeccioso de una muestra clnica se puede
utilizar para ayudar a identificarlo Las ventajas de las tcnicas moleculares radican en su
sensibilidad, su especificidad y su seguridad. Desde el punto de vista de seguridad, estas tcnicas
no requieren aislamiento del agente infeccioso y se pueden llevar a cabo en muestras o extractos
fijados qumicamente. Debido a su sensibilidad, permite detectar muestras diluidas de ADN
microbiano en un tejido, aunque el agente no se est replicando ni produciendo otros indicios de
infeccin.
2.2.1 DETECCIN DE MATERIAL GENTICO MICROBIANO
A._ANALISIS ELECTROFORETICO DEL ADN Y POLIMORFISMO DE LONGUITUD DE
FRAGMENTOS DE RESTRICCION

a)

enzimas de restriccin

Son endonucleasas capaces de reconocer secuencias especficas de bases en el DNA bicatenario

y cortarlo en ese punto. Su papel biolgico consiste en la degradacin de cualquier DNA extrao.
El DNA propio no es escindido gracias a un sistema de proteccin conocido como modificacin
mediante el cual las bases nitrogenadas estn metiladas en los puntos susceptibles de ser
cortados por la enzima.

b) polimorfismos en el tamao de los fragmentos de restriccin.

Existen casos en los que no se conoce la secuencia del gen implicado en una enfermedad
gentica y, por lo tanto, no se dispone de una sonda especfica.
Mediante el estudio de un rbol familiar se puede relacionar la presencia de una determinada
enfermedad con la presencia de un polimorfismo concreto.
Los

polimorfismos,

variaciones

al

azar

en

la

secuencia

del

DNA,

pueden producir

variaciones de los sitios de corte para una enzima de restriccin, dando lugar a fragmentos
de restriccin de distinta longitud a los obtenidos en otro sujeto.
Estos polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin (PLRF) se heredan segn las
leyes de Mendel.
Si el polimorfismo se encuentra en el mismo cromosoma que el gen en cuestin, se
dice que estn ligados y la distancia entre ellos se mide por la frecuencia
recombinacin durante la meiosis gamtica.

con

la

que

ocurre

Cuanto menor sea esta distancia, mayor ser la probabilidad de que ambos rasgos (enfermedad y
polimorfismo) se transmitan unidos a la descendencia.
Si ambos genes se encuentran muy separados en el mismo cromosoma se heredan como si se
encontraran en cromosomas distintos, debido a la alta probabilidad de que se produzcan
entrecruzamientos entre dos distantes.
c) analisis electrofortico
La estructura del genoma y la secuencia
gentica

constituyen

dos

caractersticas

fundamentales para la distincin de la familia

tipo y la cepa del microorganismo. Se
pueden distinguir cepas especficas de los
microorganismos a partir de su ADN o ARN,
o por los fragmentos de ADN obtenidos
cuando esta molcula es atacada por
endonucleasas
(enzimas

de

de

restriccin

restriccin).

especfica

Las

enzimas

reconocen secuencias concretas de ADN

que tiene una estructura polindrmica.
Las regiones de ADN reconocidas por las
distintas
difieren

endonucleasas
en

su

de

restriccin

secuencia,

longitud

frecuencia de aparicin. Como resultado de

ello, las diferentes endonucleasas inciden
del ADN de una muestra en diferentes sitios
y

dan

lugar

longitudes.

fragmentos

de

diferentes

escisin

de

diferentes

La

muestras de ADN con una endonucleasa de

restriccin

tambin

puede

generar

fragmentos de longitudes diferentes. La diferencia en la longitud de fragmentos de ADN entre las

diferentes cepas de un microorganismo especfico producido por las endonucleasa de restriccin
se denomina polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin (PLFR).
B.- DETECCION, AMPLIFICACION Y SECUENCIIADO DE ACIDOS NUCLEICOS
a) sondas gnicas
Una sonda es un fragmento de ADN (o raramente ARN) de pequeo tamao (normalmente
entre

100

1000 bases)

usado

en biologa molecular como herramienta para detectar la

presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual. En su uso, la sonda se

une a la secuencia
hibridacin que

diana

forma

monocatenaria

una

estructura

(ADN/ARN)

bicatenaria,

una

mediante
de

las

un

mecanismo de

hebras pertenece a la

sonda, y la otra a la secuencia diana. Esta unin se establece porque tanto la sonda como la diana
tienen secuencias en parte o totalmente complementarias, formndose pares de bases
complementarias
Bioqumicamente una sonda es una molcula de ADN o ARN homologa a una secuencia de ARN o
ADN diana, con la que hbrida de forma estable y especifica (por

asociacin de

bases

complementarias). La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN

o ADN y se unir exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama
especificidad de la sonda. Una vez que la sonda se une a la secuencia diana se detecta
cuantifica. La

deteccin solo es

posible

si

la sonda se ha marcado con un grupo

detectable. Dependiendo del nmero de estos grupos incorporados

de

la

seal

que

emitan la sonda puede tener diferente sensibilidad.

b) Tipos de sondas
Distintos tipos de sondas de cidos nucleicos pueden ser utilizadas para la hibridacin in situ:
1. Sondas de DNA de doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando tcnicas
como nick translation, random priming o PCR, en las cuales el nucletido marcado es
incorporado. PCR y random priming proporcionan una

buena

Estas

de

sondas

pueden

ser desnaturalizadas

antes

actividad

usar.

especfica.

Cuando

se

usan

para detectar una cadena simple como mRNA, estas son menos sensibles debido a que
la concentracin de la sonda marcada es reducida.

2. Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas utilizando

primer extensin en templados de cadena simple o por PCR con un nucletido marcado.
ste ltimo es el ms usado porque es ms fcil de llevar a cabo y las marcas pueden
sintetizarse con poca cantidad de material.

3.

El PCR permite una gran flexibilidad en la eleccin de las secuencias marcadas por el
uso de primeras. Estas marcas han sido ampliamente usadas.

4.

Oligonucletidos

(entre

20

40

bases).

Son

marcados

incorporando

oligonucletidos modificados durante la sntesis qumica o adicionando una

cola

marcada. Una de las desventajas es que algunos oligonucletidos marcados no

se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye.

5.

Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso de una RNA
polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la sonda es clonada en un
vector que flanquear dos sitios distintos de iniciacin.

6.

La cadena de RNA anti sentido (sonda) es sintetizada en direccin opuesta al

gen endgeno. Se recomienda linealizar la sonda de RNA con enzimas que dejen el
extremo 5 cohesivo, porque se ha reportado, que el extremo 3 romo promueve la sntesis
de transcritos anormales.

c) Preparacin de la sonda
Para sondas de cadena sencilla, se debe usar la secuencia reversa complementaria.
Cuando

las

sondas

son

sintetizadas

por

transcripcin, involucra generar mRNA del gen

endgeno. Cuando se disean los oligos marcados, es importante recordar que la secuencia
antisentido es la hebra complementaria reversa de la cadena lder y debe ser leda de 5 a 3.
En general es preferible usar sondas especficas, ya que esto garantiza una buena hibridacin.
Existen situaciones en las cuales esto no puede llevarse a cabo, por ejemplo, si los genes todava
no estn clonados de las especies usadas para la hibridacin o si la secuencia gnica es muy
similar entre especies.
d) Eleccin de la sonda:
Las sondas largas de cadena simple (RNA o DNA) proporcionan una alta sensibilidad
en la deteccin de cadena sencilla. Los oligonucletidos son muy sensibles y la seal puede ser
incrementada por el uso de un cocktail de sondas que flanquearn en regiones distintas.
e) Tamao de la sonda:
Las sondas largas pueden emitir una seal ms fuerte debido a que incorporan mayor

nmero

de nucletidos marcados dentro de ella. Sin embargo, las sondas que son tan largas dan
seales dbiles, debido a que la sonda penetra menos eficientemente en el tejido. La mejor
estrategia es usar una secuencia larga como templado para la sntesis de la sonda pero asegurar
que la sonda generada

es

lo

suficientemente

pequea

para

poder

penetrar.

Muchos

procedimientos estn basados en que la sonda de 50-150 bases porque emiten seales ptimas
para la hibridacin en secciones de ciertos

tejidos. Se ha encontrado que las sondas de RNA

que miden por arriba de 1 kb proveen seales

ptimas

para

la

hibridacin

in

situ,

en

embriones fijados en para formaldhedo. La penetracin est influenciada por el tamao

de

la

sonda aunque tambin depende de la naturaleza del tejido, de la forma de fijacin y si el

pre tratamiento ha sido realizado para remover las protenas celulares.

2.2.2 TECNICAS MOLECULARES

Son Procedimientos basados en la caracterizacin fsica de molculas de acidos nucleicos.
Permiten llegar al diagnstico rpido de las enfermedades infecciosas en aquellos casos
donde el dispositivo convencional no pueda ser utilizado
2.2.3DETECCIN DE PROTENAS
En algunos casos lo virus y otros agentes infecciosos se pueden detectar a travs de
hallazgos de ciertas enzimas caractersticas o protenas especficas. Por ejemplo, la deteccin de
una actividad enzimtica de transcriptasa inversa en suero y cultivo celular indica la presencia de
un retrovirus. El patrn proteico de un virus u otros agentes formados tras la electroforesis con
dodecil sulfato sdico en gel poliacrilamida tambin se puede utilizar para identificar y distinguir
diferentes cepas vricas o bacterianas.
2.3. DIAGNSTICO SEROLGICO
Las tcnicas inmunolgicas se utilizan para detectar, identificar y cuantificar antgenos en
muestras clnicas, as como para evaluar la respuesta humoral frente a la infeccin y los
antecedentes de exposicin a agentes infecciosos de un individuo. En la mayora de los casos se
puede adaptar la misma tcnica para evaluar el antgeno y el anticuerpo. Esta unin antgenoanticuerpo se ha venido usando desde hace mucho tiempo y se han desarrollado mtodos
diferentes para evaluarlos y cuantificarlos.
2.3.1 ANTICUERPOS
Como ya se sabe (exposiciones anteriores) que un antgeno es la sustancia extraa (
exotoxinas y endotoxinas de bacterias, protenas vricas,etc) que al entrar a nuestro cuerpo el
sistema inmunolgico lo reconocer como una amenaza y desencadenara una respuesta
inmunitaria y la consiguiente formacin de anticuerpos.
Que son los anticuerpos?
Son protenas circulantes que se producen en respuesta a una exposicin a agentes
extraos (antgenos). Son increblemente diversos y especficos; son los mediadores de la
inmunidad humoral contra toda clase de microbios. En un comienzo como se les descubri que
ofrecan proteccin contra la toxina diftrica se les llamo antitoxinas.
Los anticuerpos solo son sintetizados por clulas de la estirpe de los linfocitos B y existen
en dos formas: los anticuerpos unidos a la membrana en la superficie de los linfocitos B actan
como receptores para el antgeno y los anticuerpos secretados neutralizan las toxinas, impiden la
entrada y propagacin de los microorganismos patgenos y eliminan los microbios. El
reconocimiento del antgeno por los anticuerpos unidos a la membrana de los linfocitos B vrgenes
activa a estos linfocitos e inicia una respuesta inmunitaria humoral. Los linfocitos B activados se
diferencian en clulas plasmticas que secretan anticuerpos de la misma especificidad que el
receptor para el antgeno.
Entre las funciones efectoras mediadas por los anticuerpos estn la neutralizacin de
microbios o productos microbianos txicos; la activacin del sistema del complemento; la
opsonizacin de microorganismos patgenos para potenciar su fagocitosis; la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos, por la que los anticuerpos hacen que el sistema inmunitario innato

provoque la Iisis de las clulas infectadas; y la activacin del mastocito mediada por anticuerpos
para expulsar a parsitos helmintos.

ESTRUCTURA

Tipos
ANTICUERPOS POLICLONALES: Son preparaciones heterogneas de anticuerpos que
pueden reconocer numerosos eptopos en un nico antgeno. Se pueden obtener del suero de
pacientes convalecientes o se pueden preparar en animales.

ANTICUERPOS MONOCLONALES: Son los anticuerpos que reconocen eptopos

individuales en un antgeno.
Ventajas de los anticuerpos monoclonales: Radican en la posibilidad de restringir su
especificidad a un nico eptopo antignico y de la preparacin en cultivos tisulares a escala
industrial.
Desventaja de los anticuerpos monoclonales: Es que muchas veces son demasiado
especficos, de manera que es posible que un anticuerpo monoclonal especfico para un eptopo
de un antgeno vrico de una cepa no sea capaz de detectar cepas diferentes de ese mismo virus.

2.3.2 MTODOS DE DETECCIN

Los complejos antgeno-anticuerpo se pueden detectar directamente por tcnicas de precipitacin
o marcando el anticuerpo con una sonda radiactiva, fluorescente o enzimtica, o indirectamente
por la medicin de una reaccin dirigida por el anticuerpo, como la fijacin del complemento.

2.3.3 INMUNOANLISIS PARA ANTGENOS ASOCIADOS A CLULAS

Se pueden distinguir los complejos antgeno-anticuerpo especficos y las reacciones cruzadas
mediante tcnicas de inmunoprecipitacin. Dentro de un intervalo limitado de concentracin
tanto de antgenos como de anticuerpos, denominado zona de equivalencia, el anticuerpo reticula
el antgeno para formar un complejo que es excesivamente grande para permanecer en solucin y
termina por precipitar. Esta tcnica se basa en la naturaleza multivalente de las molculas de
anticuerpo.
Los complejos antgeno-anticuerpo son solubles a unas relaciones de concentracin de antgeno
con respecto a anticuerpo situadas por encima y por debajo de la concentracin de equivalencia.
La inmunodifusin radial simple:
Se puede utilizar para detectar y cuantificar un antgeno. En esta tcnica, el antgeno se coloca en
un pocillo y se permite que difunda en un agar que contenga anticuerpo. Cuanto mayor sea la
concentracin del antgeno, ms lejos difundir hasta alcanzar la equivalencia con el anticuerpo en
el agar y precipitar en forma de anillo alrededor del pocillo.

La
inmunodifusin doble de Ouchterlony:

tcnica de

Se aplica para determinar las relaciones existentes entre diferentes antgenos. Esta tcnica
tambin se emplea para determinar si las muestras son idnticas, si comparten algn eptopo,
pero no todos (identidad parcial), o bien si se trata de muestras diferentes. Se usa para detectar
anticuerpos de antgenos micticos.

Inmunoelectroforesis: Se coloca en antgeno en un posillo y se separa por electroforesis. Despus

se coloca anticuerpo en un surco y se forma lneas de precipitacin a medida que el antgeno y el
anticuerpo difunden el uno hacia el otro.

Contrainmunoelectroforesis: Esta tcnica es similar al mtodo de Ouchterlony, pero el

movimiento del antgeno es facilitado por electroforesis. El antgeno y el anticuerpo se pueden
colocar en pocillos separados y permitir que se desplacen electroforticamente el uno hacia el
otro.

Electroforesis en
cohete: Los antgenos se separan por electroforesis en un gel de agar que contiene anticuerpos. La
longitud del cohete indica la concentracin del antgeno.

INMUNOHISTOLOGA

Los antgenos existentes en la superficie o en el interior de la clula se pueden detectar por

inmunofluorescencia o enzimoinmunoanlisis.
INMUNOFLUORECENCIA DIRECTA: Una molcula fluorescente se une de forma covalente al
anticuerpo.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: Se utiliza un segundo anticuerpo fluorescente especfico
para el anticuerpo primario con el fin de detectar el anticuerpo antivrico primario y localizar el
antgeno.

ENZIMOINMUNOANLISIS: En esta tcnica, una enzima como la peroxidasa del rbano picante o la
fosfatasa alcalina, se conjuga con el anticuerpo y convierte un sustrato en un cromforo si hay
unin con el antgeno.

CITMETRO DE FLUJO:
Se utiliza para analizar la inmunofluorescencia de clulas en suspensin y es especialmente til
para identificar y cuantificar linfocitos (inmunofenotipificacin). La citometra de flujo emplea un
lser para excitar el anticuerpo fluorescente unido a la clula y determinar el tamao se esta por
medio de determinaciones de la dispersin de luz.

SEPARADOR DE CELULAS ACTIVADAS DE FLUORESCENCIA: Es un citmetro de flujo que tambin

puede aislar subpoblaciones especficas de clulas para su crecimiento en cultivo tisular basndose
en su tamao e inmunofluorescencia
El citmetro de flujo puede efectuar un anlisis diferencial de los leucocitos y comparar
poblaciones de linfocitos T CD4 y CD8 de manera simultnea.
La citometra de flujo tambin es til para analizar el crecimiento celular con posterioridad al
marcado fluorescente del cido desoxirribonucleico y otras aplicaciones de la fluorescencia.

2.3.4 INMUNOANLISIS PARA ANTICUERPOS Y ANTGENOS SOLUBLES

Enzimoinmunoanlisis por adsorcin (ELISA)
Los enzimoinmunoanlisis (EIA) o ELISA (Enzyme-Linked Iramuno Sorbent A ssay), descritos
hace 25 aos, se basan en dos fenmenos biolgicos importantes:
1. la elevada especificidad de los anticuerpos (Ac);
2. la alta actividad de algunas enzimas usadas en este tipo de ensayos, lo que permite la
amplificacin de la seal generada por la muestra.
Independientemente de los esquemas experimentales empleados, los EIA comprenden dos etapas
generales;
1. la reaccin de un inmunorreactante con un antgeno (Ag) o anticuerpo (Ac);
2. la deteccin de ese inmunorreactante mediante la utilizacin de un conjugado
enzimtico.

La sencillez de los ELISA, sumada a la potencialidad de los anticuerpos monoclonales (AcMo), hace
que da a da se vayan imponiendo sobre mtodos tales como aquellos basados en la utilizacin de
un trazador radiactivo (radioinmunoanlisis-RIA-), un trazador emisor de luz (quimioluminiscencia)
o un trazador fluorescente (fluorografa). La gran ventaja del ELISA sobre los-otros mtodos reside
en que no requiere un equipamiento demasiado sofisticado para su implementacin en el
laboratorio. Adems, los reactivos empleados son de una vida media muy alta (en el caso del RIA,
un trazador radiactivo marcado con iodo tiene una vida media de 60 das, mientras que un
conjugado enzimtico usado en ELISA suele conservarse en buen estado durante aos) y no se
corre el riesgo de contaminacin producida por el manipuleo de istopos radiactivos.
Clasificacin de los enzimoinmunoanlisis:
Los enzimoinmunoanlisis pueden clasificarse en:
a. EIA homogneos;
b. EIA heterogneos.
Los primeros se realizan exclusivamente en fase lquida, mientras que en los segundos se emplea
un soporte slido para inmovilizar a uno de los inmunorreactantes. Por cuestiones de sencillez y
aplicabilidad general, slo nos dedicaremos al estudio de los EIA heterogneos. Los ElA
heterogneos pueden clasificarse en dos tipos:
1. enzimoinmunoanlisis de amplificacin de actividad; y
2. enzimoinmunoanlisis de modulacin de actividad.
o

En los enzimoinmunoanlisis de amplificacin de actividad o no competitivos, se em plea

un gran exceso del inmunorreactante con el objeto de obtener una seal mxima debida a
la presencia del compuesto a ser dosado. De acuerdo a la ley de accin de masas, un
exceso de inmunorreactante permite detectar niveles muy bajos del analito que se quiere
determinar. Estos ELISA se subdividen de acuerdo a la molcula inmovilizada en la fase
slida. La inmovilizacin del Ag para detectar Ac es un sistema que tiene una alta
detectabilidad debido a que varias molculas del conjugado enzimtico, que en este caso
son Ac anti-Ig marcados con la enzima, pueden unirse a cada molcula de Ac que
reaccion con el Ag inmovilizado. Este efecto se traduce en una gran amplificacin de la
seal. Mediante la utilizacin de mtodos de puenteo inmunolgico (con Ac anti-Ig) o
no inmunolgico (con el sistema avidina-biotna o protena A) es posible aumentar an
ms la detectabilidad. En general, estos sistemas se denominan ELISA de amplificacin.
Otro sistema de amplificacin de actividad es el ELISA de captura, en el que se inmoviliza
un Ac (Ac de captura), se captura Ag y se revela su presencia con un conjugado
enzimtico anti-Ag. Este sistema se emplea para la cuantificacin de Ag o para la deteccin
de Ac contra el Ag capturado. En general, es deseable que el conjugado enzimtico y el Ac
inmovilizado provengan de la misma especie para evitar interferencias en el sistema
originadas por reaccin cruzada del conjugado con el Ac de captura.

En enzimoinmunoanlisis de modulacin de actividad o competitivos se modula la

actividad del conjugado enzimtico por competicin con el analito. Menores cantidades
del conjugado enzimtico permiten obtener una detectabilidad mayor, ya que pequeas
cantidades del competidor tienen un gran impacto sobre la actividad enzimtica detectada
en la fase slida.
Existen dos diseos generales de ensayos de modulacin de actividad: en uno de ellos, el
ligando marcado con enzima y el ligando sin marcar que se quiere dosarse- incuban
simultneamente en el sistema; en el otro diseo, el ligando no marcado a ser dosado se
incuba en una primera etapa y en una segunda etapa se incuba con el ligando marcado
enzimticamente, el que reaccionar con los sitios no ocupados por el ligando que
reaccion en la primera etapa.

Independientemente de estos dos diseos generales, en ELISA de modulacin de actividad se

puede inmovilizar el Ag en la fase slida y agregar el Ag marcado con la enzima. Una tercera
variante es usar el sistema descrito en el prrafo
anterior con la diferencia de que se emplea un
Ac anti-Ag sin marca enzimtica y en una etapa
siguiente agregar un conjugado anti-Ig marcado
con la enzima. Este ensayo es de modulacin y
amplificacin de actividad y tiene la ventaja de
que permite aumentar la detectabilidad del
sistema.
En todos los ensayos inmunoenzimticos en fase
slida, independiente de las numerosas
estrategias existentes, se pueden distinguir 3
etapas:
1. inmovilizacin del inmunorreactante (Ac o Ag)
en la fase slida:
2. incubacin con la muestra de modo que sta
reaccione con el inmunorreactante inmovilizado:
3. amplificacin o modulacin por medio de la
utilizacin de un conjugado enzimtico (esta
etapa puede en realidad ser de ms de un paso).

 Western blot es una variante del anlisis ELISA. Esta tcnica transfiere protenas vricas
separadas por electroforesis segn su peso molecular o su carga a un papel de filtro (p. ej.,
nitrocelulosa, nailon). Cuando se exponen al suero del paciente, las protenas
inmovilizadas capturan los anticuerpos antivricos especficos y se visualizan mediante
anticuerpos antihumanos conjugados con enzimas. El Western blot se usa para confirmar
los resultados del anlisis de ELISA en sujetos con sospecha de infeccin por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH).
Radioinmunoanlisis (RIA) se emplean anticuerpos o antgenos marcados con sondas radioactivas,
para cuantificar complejos antgeno-anticuerpo. El radioinmunoanlisis se puede efectuar como
una anlisis de captura (como se describi para el anlisis de ELISA), o tambin como un anlisis de
competencia, donde los anticuerpos presentes en el suero de un paciente se cuantifican es su
funcin de su capacidad de competir con un anticuerpo marcado radioactivamente en el
laboratorio y reemplazarlo en los complejos antgeno-anticuerpo. El desarrollo del
radioinmunoensayo {radioimmunoassay,RIA) comienza en 1956 de forma un tanto desapercibida,
con los trabajos de Yalow y Berson sobre el metabolismo de la insulina. Esos autores hallaron que
la cantidad de insulina marcada con tomos de iodo radiactivo que se una a una fraccin de
globulinas de individuos diabticos (luego reconocida como anticuerpos), se relacionaba con la
concentracin de insulina fra existente. Tal observacin constituy la base de la deteccin de esa
hormona plasmtica y del posterior desarrollo de todos los mtodos radioinmunolgicos de
saturacin y desplazamiento. A partir de las primeras publicaciones en 1959 y 1960 que
describieron explcitamente la determinacin de insulina plasmtica sin previa extraccin, result
ampliamente reconocido que el RIA era un mtodo ventajoso. Entre sus cualidades se hallan la
alta sensibilidad, su comparativa sencillez respecto de los mtodos biolgicos usados en
endocrinologa, y su versatiUdad para aplicarlo a muestras de pequeos volmenes y en grandes
series. Esas propiedades lo convierten en uno de los mtodos analticos de base inmunolgica de
mayor importancia, con proyecciones en medicina, veterinaria y en reas no mdicas interesadas
en la deteccin de muy bajas concentraciones de compuestos orgnicos. Las variantes
metodolgicas acumuladas ltimamente hacen que no exista un RIA en particular, sino un
conjunto de procedimientos basados en un principio general.
El fundamento es muy sencillo:
Se mezcla una cantidad constante de antgeno marcado radioactivamente y una
cantidad constante de un anticuerpo para ese antgeno
Se produce la reaccin entre antgeno (Ag) y anticuerpo (Ac)
Se separa la fraccin de antgeno que se ha unido de la que permanece libre (hay
varias formas de hacerlo. En la figura inferior se utiliza un 2 anticuerpo dirigido
contra el primero)
Se determina la radioactividad
Si la muestra contiene adems antgeno fro (no marcado), ste competir con el
marcado para unirse al anticuerpo, y se observar un descenso en la medida de la
radioactividad

 Este descenso es proporcional a la concentracin de antgeno fro en la muestra.

Fijacin del complemento representa una prueba serolgica estndar, aunque entraa diversas
dificultades a nivel tcnico. En esta prueba, la muestra de suero del paciente reacciona con el
antgeno del laboratorio y el complemento adicional. Los complejos antgeno-anticuerpo se unen,
activan y fijan el complemento (consumen). A continuacin se analiza el complemento residual
por medio de la lisis de eritrocitos recubiertos de anticuerpos.

En los anlisis de inhibicin de anticuerpos se aprovecha la especificidad de un anticuerpo para

evitar una infeccin (neutralizacin) u otra actividad (inhibicin de la hemaglutinacin) para
identificar la cepa del agente responsable de la infeccin, habitualmente un virus, o bien para
cuantificar las respuestas de anticuerpos a una cepa especfica de un virus.

Aglutinacin con ltex es una prueba rpida y tcnicamente simple para la deteccin de un
anticuerpo o un antgeno soluble. Los anticuerpos especficos de un virus hacen que las partculas
de ltex recubiertas de antgenos vricos se agrupen. A la inversa, las partculas de ltex
recubiertas de anticuerpos se emplean para detectar antgenos vricos solubles. Cuando un
anticuerpo es puesto en contacto con su antgeno especfico, si ste se encuentra al estado
particulado (hemates, bacterias, clulas), las partculas se agruman y aglutinan. Los principios que
regulan esta reaccin son los mismos que para la precipitacin. La ocurrencia de uno u otro
fenmeno depende de si el antgeno es particulado (suspensin) o est en solucin. En un
comienzo se crey que el hecho estaba regido por el anticuerpo al que se denominaba aglutinina.
Hoy sabemos que un mismo anticuerpo puede dar aglutinacin con una suspensin bacteriana y
precipitacin con un lisado obtenido a partir del mismo microorganismo. La aglutinacin se lleva a
cabo en medio salino.
La concentracin ptima de electrlitos es 0,15 M. Concentraciones mayores pueden neutralizar
las cargas superficiales negativas que las bacterias y otros antgenos particulados poseen a pH
neutro y provocar aglutinacin espontnea no especfica. Concentraciones de NaCl inferiores a
0,001 M son inefectivas. El mecanismo de la aglutinacin ha sido explicado de diferentes maneras.
Bordet y Eagle consideraron que inespecficamente el electrlito era el responsable de la
aglutinacin, sobre la base del siguiente mecanismo: durante la reaccin el antgeno se rodeara
de una capa monomolecular de globulina anticuerpo; si en el medio no hay electrlitos, la
ionizacin de la protena sera suficiente como para mantener la dispersin, pero la presencia de
electrlitos impedira esa ionizacin, y al disminuir las cargas por debajo de ciertos lmites se
originara el fenmeno de aglutinacin. Si la interpretacin de Eagle fuera la correcta, los grumos
microscpicos de la experiencia.

2.3.5 SEROLOGA
La serologa de emplea con el fin de identificar el agente responsable de la infeccin, evaluar la
evolucin de una infeccin o determinar la naturaleza de la infeccin: infeccin primaria frente a
reinfeccin, aguda frente a crnica.
Infeccin primaria: primera infeccin que sufre un organismo por un agente patgeno.
Reinfeccin: Segunda o posterior infeccin en un organismo ocasionada por un mismo
tipo de agente patgeno.
Infeccin aguda: es aquella que se presente bruscamente, y resuelve en el corto plazo.
Infeccin crnica: es aquella que de presentacin paulatina, y resuelve a largo plazo.
Los datos serolgicos de una infeccin se obtienen a partir del tipo y el ttulo de los anticuerpos y
la identidad de las dianas antignicas.
Cuando un individuo se pone en contacto con un antgeno por primera vez ocurren los siguientes
fenmenos que se relacionan con el diagnstico serolgico.
1. Aparicin precoz de anticuerpo especfico de clase IgM. La concentracin de este anticuerpo no
es muy alta y su persistencia es generalmente corta. Su deteccin se identifica habitualmente con
infeccin aguda, aunque en algunas infecciones se correlaciona no solo con la fase temprana de la
enfermedad sino tambin con la actividad de la misma en estados crnicos (Hepatitis B, delta).
Este marcador no es siempre detectable en la fase aguda de la infeccin.
2. Aparicin algo ms tarda de anticuerpo especfico de clase IgG. La concentracin de este
anticuerpo va creciendo hasta alcanzar, en 3-6 semanas, una meseta que muy lentamente
desciende. Su persistencia suele ser muy prolongada, mucho ms all de la curacin del enfermo y
en ocasiones es detectable durante toda la vida. Este hecho de mantenerse positiva despus de la
curacin limita su interpretacin cuando se detecta aisladamente. Estos dos datos relativos a la

respuesta inmune nos permiten un uso ms apropiado para el diagnstico. Efectivamente, la

deteccin de IgM especfica a unas concentraciones determinadas y dada la brevedad de su
duracin nos faculta para realizar un probable diagnstico de la infeccin aguda. Por otra parte, la
observacin de un incremento en la concentracin de IgG especfica en dos muestras separadas en
el tiempo - una en fase aguda y otra convaleciente (habitualmente dos semanas) - nos indica la
presencia de un estmulo antignico en ese momento, o lo que es lo mismo, la existencia de una
infeccin aguda. Este incremento en la concentracin de anticuerpos especficos cuando
comparamos dos muestras de suero en un paciente recibe el nombre de seroconversin, y para
buscarla, el estudio se realiza; con dos muestras de suero del mismo enfermo con objeto de
comprobar el aumento de la concentracin de anticuerpos.
Eleccin de una prueba serolgica. Sensibilidad, especificidad
La incorporacin de una tcnica nueva a un laboratorio clnico debe de estar precedida de estudios
de evaluacin. Una prueba serolgica se evala, fundamentalmente, por los parmetros de
sensibilidad, especificidad y valor predictivo. Del conocimiento de estos tres valores intrnsecos de
la misma se deducir su aplicacin o no en determinadas circunstancias y como deber
interpretarse su resultado ya sea positivo o negativo.
La medida de la sensibilidad se realiza probando la prueba en pacientes que sabemos que estn en
la situacin que queremos diagnosticar. Cuantos ms resultados positivos produzca en este grupo
de enfermos ms sensibilidad tendr la prueba y menos resultados falsos negativos (FN)
obtendremos; definimos pues la sensibilidad como el porcentaje de verdaderos positivos (VP) que
son detectados en individuos con esa enfermedad y esa tcnica. En serologa es difcil tener
pruebas con el 100% de sensibilidad y casi todas producen algn resultado negativo falso.
La especificidad se mide, por el contrario, realizando la prueba en colectivos de personas que no
padecen la enfermedad que queremos diagnosticar con ella. La especificidad por tanto se define
como el porcentaje de verdaderos negativos que sern detectados en pacientes sanos con esa
prueba. Las pruebas apropiadas producen, en este colectivo, gran cantidad de resultados
negativos y muy escasos falsos positivos (FP). Existen muchas pruebas serolgicas con
especificidades casi del 100%. Estos dos parmetros son propiedades intrnsecas del test y no
varan nunca con relacin a la poblacin estudiada.
Perfiles serolgicos
En la prctica diaria el diagnstico indirecto se ha decantado, en los ltimos aos, por el estudio de
las muestras mediante perfiles serolgicos. La lgica de estas agrupaciones, similar a lo que realiza
en el diagnstico directo, descansa en que generalmente el problema clnico requiere investigar
varios patgenos como posibles agentes etiolgicos, como responsables de la patologa del
paciente. Las alternativas son pues explorarlos uno a uno o simultneamente. Obviamente la
primera frmula es ms lenta y, probablemente, ms econmica. La segunda es lo contrario y
probablemente ms eficaz desde el punto de vista clnico. En ocasiones el perfil se divide en dos o
tres niveles que se ejecutan progresivamente segn los resultados obtenidos en el nivel anterior.
Este mtodo de perfiles no es nuevo, pero en la actualidad la disponibilidad comercial de muchos
antgenos y la automatizacin ha impulsado su utilizacin y a nosotros nos parece un sistema
bueno y eficaz para el diagnstico dada la excelente relacin entre coste, eficacia y tiempo de
respuesta diagnstica. Esta filosofa de trabajo supone una organizacin especial del laboratorio
de tal suerte que la mayora de las tcnicas se realicen con una frecuencia mayor a la requerida si
se buscan patgenos de manera independiente.

Utilizacin clnica de los perfiles serolgicos

Dependiendo de la clase de anticuerpos que ponga en evidencia la tcnica empleada (IgG, IgM o
ambos) ser necesario, como ya se cit en otra parte, el estudio de una o dos muestras de suero
realizadas, en este ltimo supuesto, simultneamente. En el caso de deteccin de IgM una
muestra extrada en la fase aguda ser suficiente. En el supuesto de que midan IgG o ambas clases
es mandatorio el estudio seriado
III.DIAGNOSTICODELABORATORIO PARAENFERMEDADES BACTERIANAS

Tcnicas de identificacin

El propsito fundamental del diagnstico microbiolgico clnico es optimizar la asistencia que se presta al
paciente. Para alcanzar este objetivo es esencial obtener y comunicar, lo antes posible, al mdico
responsable del mismo resultados tiles para su manejo y tratamiento, usando eficientemente los
recursos disponibles. Conjugar estos objetivos, con el mximo rigor cientfico y una creciente demanda
asistencial, es lo que se persigue en los Servicios de Microbiologa Clnica.
El diagnstico etiolgico directo de las enfermedades infecciosas pretende demostrar la presencia del
microorganismo causal en productos patolgicos adecuados obtenidos del paciente e incluye, entre otros
procedimientos, el cultivo, el cual persigue el aislamiento del microorganismo causante de la infeccin.
Cuando es factible, el cultivo se considera el mtodo diagnstico de eleccin, porque permite la identificacin
del microorganismo implicado, el estudio de su sensibilidad a los antimicrobianos apropiados y facilita la aplicacin
de marcadores epidemiolgicos.
Una vez aislado el microorganismo de la muestra, se procede a su identificacin, es decir, a clasificarlo
dentro de un grupo o taxn ya establecido, con el que tenga la mayor semejanza. La complejidad de este
proceso depende del nivel de precisin o discriminacin que se pretende conseguir.
Aunque en los ltimos aos se ha asistido a un crecimiento importante en la oferta de mtodos genotpicos
aplicados al diagnstico microbiolgico, en la mayor parte de los procesos de identificacin se siguen
utilizando mtodos fenotpicos, puesto que su realizacin, lectura y coste los hacen ms asequibles.
En este captulo se revisan las tcnicas de identificacin de las bacterias patgenas. Los mtodos clsicos
para la tipificacin de las bacterias se basan en sus caractersticas morfolgicas y metablicas. Las pruebas
diagnsticas se seleccionan en una base emprica, con el fin de proporcionar informacin suficiente para
hacer posible la discriminacin entre los gneros y especies. Adems, hoy en da, las tcnicas de biologa
molecular (basadas en la caracterizacin de genes especficos o segmentos de ellos) son cada vez ms
comunes y utilizadas en Microbiologa Clnica.
ESTRATEGIA EN LA ELECCIN DE LOS MTODOS
El laboratorio de microbiologa deber tener a disposicin del clnico todas las pruebas necesarios para el diagnstico y la atencin de los pacientes a servir. Pero no todas las pruebas
pueden ser realizadas en el laboratorio, por lo tanto ste deber decidir cules se realizarn all,
cules se enviarn a un laboratorio de referencia y cul ser ese laboratorio.
Las necesidades de los pacientes dictarn el nmero y la variedad de mtodos que el laboratorio
ofrecer. Basado en estudios numricos histricos y predictivos de las pruebas solicitados, el
laboratorio puede discontinuar pruebas poco usadas que resultan costosas y de baja calidad.

MTODOS
El cultivo y la identificacin de los patgenos especficos a partir de los materiales recogidos de los

pacientes en los que se sospecha una infeccin es la mejor herramienta diagnstica disponible,
aunque no la ms rpida. En algunas situaciones dicho estudio resulta difcil o incluso imposible,
por ejemplo en rickettsiosis y en la sfilis.
En algunos casos puede ser necesaria la serologa u otros mtodos, ya sea porque no se conocen
las condiciones necesarias para su cultivo in vitro o por los riesgos que implica la manipulacin de
estos microorganismos.
Hoy se dispone de tcnicas para detectar y cuantificar muchos marcadores especficos de
enfermedades infecciosas. Por un lado, se usan tcnicas inmunolgicas para cuantificar las
inmunoglobulinas especficas o deteccin de antgenos en los tejidos; por otro, la introduccin de la
gentica molecular en el laboratorio clnico, ha sido un gran avance al respecto.

Mtodos directos
Son aquellos que detectan: al microorganismo por microscopia, al microorganismo
por cultivo, a los antgenos del microbio y los cidos nucleicos (reaccin en
cadena de la polimerasa). Para la deteccin de antgenos se usan tcnicas
inmunolgicas como la inmunofluorescencia (IF), el enzimoinmunoanlisis (EIA)
y los test de aglutinacin.
Mtodos indirectos
Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) que
desarrolla el hus- ped. Se basan en la deteccin de anticuerpos especficos
mediante tcnicas inmunolgicas (EIA, IF, western blot, etc.).
DIAGNSTICO MICROSCPICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
El microscopio de luz es una de las herramientas ms tiles en el diagnstico bacteriolgico. An
hoy con el desarrollo de mtodos ms rpidos (muchos requieren instrumentos sofisticados o caros), la
simple visualizacin microscpica de muestras clnicas es todava la forma ms rpida y especfica
de orientar el diagnstico clnico. Basta recordar la utilidad del examen en fresco para la
visualizacin de algunas bacterias, por ejemplo el examen en fresco con campo oscuro para
Treponema y las muestras fijadas y teidas con coloraciones simples o diferenciales, como la
coloracin de Gram o de Ziehl Neelsen.
Existen distintos tipos de microscopios pticos o de luz. El ms usado en el laboratorio de
bacteriologa es el microscopio de campo claro (de luz transmitida), el resto (de campo oscuro, de
contraste de fases, de luz ultravioleta) tienen uso ms restringido.
El microscopio de luz consta de dos sistemas de lentes convergentes: el objetivo (prximo al objeto
de estudio) y el ocular (prximo al ojo del observador). Posee un objetivo de bajo aumento (10X),
uno de mediano aumento (40X) y uno de alto aumento (100X o lente de inmersin). Este ltimo es
el ms usado en bacteriologa, porque al sumergir el lente en el aceite que recubre el preparado
aumenta el poder de resolucin a 0,2 micras, siendo posible observar la mayora de los tipos
bacterianos. El microscopio posee adems una fuente de luz (incluida o externa al instrumento), un
condensador mvil, un espejo que refleja la luz y un diafragma que permiten regular el paso de la
luz concentrando los rayos luminosos sobre el objeto. Por ltimo, tiene una platina para colocar la
lmina de estudio y un mecanismo de ajuste para enfocar el sistema de lentes sobre el objeto.
Dicho mecanismo consta de un macromtrico (de ajuste grosero) que coloca al objeto prximo al
foco y un micromtrico (de enfoque fino) que permite el enfoque del objeto.
La microscopia ptica es un mtodo sencillo y rpido que muchas veces orienta al diag- nstico
etiolgico. Nos informa la cantidad y morfologa bacteriana, adems de la presencia de
determinados tipos celulares presentes en el preparado que validan o no la muestra para el anlisis
microbiolgico; por ejemplo: las clulas epiteliales en muestra de secreciones respiratorias.

El examen microscpico puede realizarse en fresco u obteniendo un frotis fijado y colorea- do. El
examen en fresco permite apreciar la existencia de bacterias y la presencia de movilidad de las
mismas y caractersticas de esta. Esto ltimo muchas veces orienta a la identificacin de una cepa
bacteriana o al diagnstico etiolgico.
Algunas bacterias como las espiroquetas tienen un dimetro muy pequeo como para ser
observadas en un microscopio de luz transmitida, por lo cual se usa el microscopio de campo
oscuro que permite distinguir sus propiedades morfolgicas y de movilidad. En este microscopio, la
luz pasa a travs de un condensador que proyecta luz transversalmente sobre la muestra, de modo
que el haz de luz incide oblicuamente sobre la superficie del microorganismo siendo reflejado.
Los rayos desviados son los que penetran en el objetivo y hacen que los cuerpos bacterianos se
observen rodeados de un halo brillante.
La microscopia de fluorescencia tiene los mismos principios de ptica, las diferencias estn
relacionadas con la generacin y transmisin de la luz til para la excitacin de colorantes
fluorocromos o de fluorescencia natural de los microorganismos. Algunos producen luz despus de
absorber luz ultravioleta; otros lo hacen luego de haber tomado un fluorocromo, por ejemplo las
bacterias cido alcohol resistente. Por ltimo, otros producen luz luego de la unin del antgeno a
un anticuerpo conjugado previamente con un colorante fluorescente, este mtodo es muy usado en
virologa y ser expuesto con las tcnicas Inmunolgicas; tambin es muyusado en el diagnstico
de algunas enfermedades bacterianas, poe ejemplo Chlamydia spp. y virus sincicial respiratorio.
La microscopia electrnica usa electrones en lugar de luz. Dicho mtodo de estudio es til por
ejemplo para el diagnstico de virus causantes de gastroenteritis. Con el microscopio electrnico se
puede observar la morfologa de los viriones presentes en las muestras clnicas. La limitacin de este
mtodo, adems del costo del microscopio, es que necesita una concen- tracin elevada de viriones
(aproximadamente 109 partculas virales por ml, dependiendo del virus) en la muestra, por lo tanto
decimos que es poco sensible. Por esto es una tcnica poco usada, ms an con el desarrollo de
tcnicas alternativas de similar utilidad. El microscopio electrnico nos permite, por ejemplo,
obtener resultados positivos rpidos de muestras de materia fecal de pacientes con diarrea.
Rotavirus, Adenovirus, Coronavirus y Calcivirus pueden ser visualizados e identificados como
causantes de esta enfermedad. Por ejemplo, Rotavirus posee una forma caracterstica en doble
rueda y un tamao distintivo (70 nm de dimetro) y se los encuentra en concentraciones de hasta
1011 partculas virales por gramo de heces. Tambin en otras muestras, como lquido vesicular,
biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible obtener resultados positivos mediante
coloracin negativa. Si la concentracin de virus en la muestra clnica es baja y por tanto no son
visibles directamente por el microscopio electrnico, se pueden usar tcnicas que aumentan la
visualizacin, por ejemplo la inmunoelectromicroscopia. sta consiste en el agregado de anticuerpos
especficos antivirales y la formacin de agregados de partculas que son visibles con mayor
facilidad que las partculas solas.

Objetivos Y utilidad de Las tcnicas de Identificacin

La identificacin de una bacteria sospechosa de ser la causa de una infeccin es uno de los instrumentos
principales del diagnstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas. Diferenciar un microorganismo
patgeno per se, potencialmente patgeno o contaminante, y deducir sus posibles mecanismos de
resistencia, facilita el tratamiento de la enfermedad infecciosa con la mayor eficiencia posible. Tambin permite
realizar un seguimiento y control de las infecciones hospitalarias, detectar un posible brote infeccioso y
establecer una poltica de antibiticos coherente y apropiada en concordancia con el centro hospitalario o el rea
asistencial, lo que traer consigo una disminucin de las infecciones nosocomiales y/o comunitarias, y una
menor generacin de resistencias en los microorganismos.
Para poder ser clnicamente til, la identificacin de un microorganismo debe ser lo ms rpida posible. La
economa y la prctica dictan el uso de un nmero mnimo de pruebas diagnsticas. Por necesidad, la
identificacin en Microbiologa Clnica representar siempre un compromiso entre la exactitud y precisin, por
una parte, y la rapidez y la economa por otra. Cmo se logra este compromiso es lo que determina la calidad

diagnstica en Microbiologa.

Identificacin bacteriana
La taxonoma bacteriana tiene como objetivo la construccin de sistemas que permitan clasificar a las
bacterias. Dentro de la clasificacin taxonmica, las categoras y definiciones ms utilizadas son familia
(un grupo de gneros relacionados entre s), gnero (un grupo de especies relacionadas entre s),
especie (un grupo de cepas relacionadas entre s), tipo (grupos de cepas interrelacionados dentro de las
especies; por ejemplo, biotipo, serotipo) y cepa (aislamiento concreto de una especie en particular).
Uno de los factores clave para identificar a las bacterias como agentes patgenos depende de su
aislamiento en cultivo puro. Una colonia en cultivo puro est compuesta por un solo tipo de microorganismo
y procede de una sola clula original. Las pruebas de identificacin se deben hacer siempre con colonias
nicas procedentes de cultivos puros.
La taxonoma bacteriana convencional permite la identificacin de gneros y especies mediante la aplicacin de
diversos criterios, como los que se resumen a modo de ejemplo en la tabla.

Observacin directa (Microscopia)

Mtodos rpidos de identificacin bacteriana
El trmino de mtodo rpido en microbiologa engloba una amplia variedad de procedimientos y tcnicas
que permiten obtener resultados en menos tiempo que las pruebas diagnsticas convencionales. Existen
mtodos rpidos aplicables a la microscopa, tcnicas de identificacin bioqumicas, pruebas de deteccin de
antgenos y de anticuerpos. Incluso en las tcnicas de diagnstico molecular existe una gradacin de
celeridad, siendo algunas de estas pruebas tan rpidas como la PCR a tiempo real.
Los procedimientos microscpicos que utilizan tinciones estndar y/o anticuerpos fluorescentes para
detectar microorganismos especficos se consideran mtodos rpidos y se utilizan para la diferenciacin inicial
o la identificacin presuntiva de ciertos grupos de microorganismos. La identificacin rpida de los cultivos
clnicos tambin incluye equipos de identificacin comerciales e instrumentos o sistemas robticos e
informticos completamente automatizados.
Los equipos comercializados son habitualmente sistemas de pruebas miniaturizadas que utilizan sustratos
cromognicos o fluorognicos para estudiar las enzimas preformadas. Las reacciones buscadas pueden ser
obtenidas en un tiempo de 2 a 6 horas de incubacin, aunque algunas de ellas pudieran requerir
una incubacin ampliada hasta el da siguiente.
Criterios y ejemplos metodolgicos aplicados a la identificacin
bacteriana
Criterio

Metodologa de ejemplo

Observacin
macroscpica

observacin e inspeccin de colonias:

disposicin, tamaos, textura, formas, pigmentos,
etctera
tinciones: formas, agrupacin, esporas, cpsula,

Observacin
microscpica
Metabolismo
Otras propiedades

flagelos, etctera
bateras
bioqumicas:
uso
de
sustratos
(oxidacin/fermentacin), produccin de metabolitos
secundarios,
resistencia etctera
a antibiticos: antibiograma y

antibiotipos, ribotipos, fagotipos, estudio de las

concentraciones mnimas inhibitorias, estudio de
sinergias o antagonismos, etctera
Las capacidades y prestaciones de estos equipos y sistemas son muy variables y suelen
incorporar sistemas de lectura mecanizada y automatizada mediante espectrofotmetros, cdigos
numricos y bases de datos computarizadas, realizando de forma secuencial la incubacin,

lectura e interpretacin de los resultados de las pruebas.

Tinciones rpidas
El examen de las muestras debe iniciarse con la inspeccin visual ordinaria y proceder al nivel de magnificacin
necesario para visualizar el patgeno o de- terminar la ausencia del mismo. En la mayora de los Servicios de
Microbiologa se realiza un examen macroscpico de la muestra mediante la inspeccin visual en el momento
de realizar la extensin sobre el portaobjetos, la preparacin de los cultivos y, posteriormente, un examen
microscpico mediante las tinciones elegidas (Tabla 2); por lo tanto, el microscopio es el instrumento ms
necesario para un microbilogo, dado que permite la observacin de microorganismos que no pueden ser
apreciados con detalle a simple vista.
Las muestras pueden prepararse de diferentes formas para hacer a los microorganismos ms fcilmente
visibles y mostrar sus caractersticas estruc- turales. Las suspensiones en fresco permiten valorar algunos
elementos, como motilidad bacteriana, recuento de leucocitos, deteccin de parsitos o protozoos o
visualizacin de estructuras fngicas; por otra parte, las tinciones microbiol- gicas permiten observar a los
microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener, o no, determinados colorantes
(Tabla 3)
Las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos mtodos, siendo las ms usadas las tinciones
diferenciales, que permiten distinguir a los microorganis- mos por alguna de sus caractersticas tintoriales
peculiares:
Tincin de Gram: es de gran importancia en Microbiologa, ya que permite hacer diferenciaciones
taxonmicas, separando dos grandes grupos de bac- terias (gram-positivas, de color violeta azulado, y gramnegativas, de color granate o rojo-rosado), segn se comporten ante esta tincin.
Tincin cido-alcohol resistente: se basa en que ciertos microorganismos no pierden la coloracin por
una mezcla de cido y alcohol si han sido pre- viamente teidos con fucsina fenicada. Se dice que son
microorganismos cido-alcohol resistente.
Otras: hematoxilina frrica, tricrmica, May Grunwald-Giemsa, Wright-Giemsa.

Tabla 2.
patgenos
Herramienta
Ojo humano
Lupa o gafa-lupa

Sistemas de observacin de los microorganismos

Magnificacin (x) Aplicacin

0
Examen visual ordinario
5
Examen visual ordinario con
precisin y manipulacin visual
Examen
Microscopio de diseccin 2,5-30
precisa y detallada
Microscopio ptico:
De campo claro
100-1.000
Clulas teidas
Clulas no fcilmente teidas para
De campo oscuro
100-400
visua- lizacin en campo claro
Contraste de fases
100-400
Clulas vivas y/o no teidas
Preparaciones usando tinciones
con fluo- rocromos, los cuales
Microscopio
de100-1.000
pueden teir direc- tamente las
fluorescencia
clulas o pueden acoplarse a
Microscopio electrnico:
anticuerpos que se fijan a las
clulas

Determina la ultraestructura de los

org- nulos celulares
Determina las formas y estructuras
De barrido
de la superficie celular
La tincin ms utilizada en microbiologa es, sin lugar a dudas, la tincin de Gram, que proporciona informacin
sobre los siguientes aspectos:
De transmisin

150
a
millones
20-10.000

100

Taxonmico: permite la clasificacin inicial de las bacterias usando crite- rios morfolgicos (tamao,
forma, agrupacin, carcter tintorial).
Clnico: permite un diagnstico presuntivo de bacteriuria significativa, tambin un diagnstico
etiolgico orientativo del lquido cefalorraqudeo (LCR) de un paciente con sospecha de meningitis,
etctera.
Control de calidad y validez de la muestra remitida para cultivo, como
sucede con los esputos y otras muestras del tracto respiratorio.
Gua para el procesamiento de la muestra: orienta sobre la eleccin de los medios de cultivo,
temperaturas y atmsferas de incubacin, requerimientos nutricionales adicionales, etc. ms
apropiados segn los microorganismos observados en la tincin.
tinciones y mtodos microscpicos para la deteccin rpida de microorganismos en muestras y
Tabla 3.
materiales infectados
Tincin o mtodo

Aplicacin
Resultados esperados
Comentarios
LBA, preparaciones de Tzanck,
Morfologa general de las Permite
visualizar
bacterias,
Wright-Giemsa
muestras
estructuras celulares
levaduras, parsitos e inclusiones
con fondo celular
complejo
virales
diphteriae
Grnulos
metacromticos
de Morfologa general y seleccionada Corynebacterium
azul de metileno
corinebacterias
Permite
hacer
diagnstico Deteccin
de
leucocitos, Requiere
experiencia
para
presuntivo,
sobre
todo,
en
reconocimiento
de
la
morfologa
valoracin
adecuada;
no
incluye
Gram
neumona y meningitis bacteriana de bacterias comunes
otros agentes in- fecciosos, pero
puede diferenciar leva- duras
Tinciones
de
muestrasLos microorganismos
AAR Las micobacterias son bacilos
(esputos, LBA, LCR, orina, etc.)muestran un color rojo granate, rectos, cortos o largos y las
Ziehl-neelsen,
para identificar bacterias cido-contrastado sobre un fondo nocardias, bacilos arboriformes y
Kinyoun
alcohol resistentes (AAR) y paraazulado;
permite
detectar ramificados
diferenciacin de micobacterias ytambin
parsitos
como
Microscopa
de Examen
de lesiones
con Se
ven espiroquetas
mviles
Requiere experiencia
Cryptosporidium
y Cyclospora
algunos directo
actinomicetales
aerobios
campo oscuro
sospecha
de
sfilis
primaria
(AAR parcial)
Examen directo de la extensin Los criptococos poseen una Tincin inversa, la cpsula no se
tinta china
de LCR, sangre y orina para cpsula de polisacridos que tie; requiere experiencia para
Cryptococcus
aparece como un halo sobre un diferenciar leucocitos de levaduras
Examen
directo
de
las
extensiones
Visualiza
elementos fngicos
Digiere las protenas de las
fondo oscuro
KoH 10%
de piel, pelos y uas para ver
muestras y facilita la visualizacin
dermatofitos
Es eficaz para diferenciar Tincin de fluorocromo fijada aRequiere el uso de microscopio
verdaderos mi- croorganismos de los ncleos de las bacterias, quede fluo- rescencia
naranja de acridina artefactos, especialmen- te en muestran fluorescencia naranja
hemocultivos
sobre
un fondo oscuro;
fluorescen tanto bacterias viables
Examen directo de LCR, LBA y Las
levaduras
y
mohos Tincin fluorescente que se fija a la
como no
viables
otros lquidos corporales para muestran
una fluorescencia pared
celular de hongos y levaduras,
detectar estruc- turas fngicas y blanquecina suave
blanco calcoflor
pero no a bacterias o clulas
algunos quistes parasi- tarios
inflamatorias; se prefiere a la tinta
china y a preparaciones de KOH
Requiere el uso de microscopio de
fluo- rescencia

auramina-rodamina

Es til para bsqueda de AAR Extensiones concentradas

en una variedad de muestras sedimentos de micobacterias
clnicas, especial- mente, las ms
contaminadas con flora normal

de Tincin
preferida
para
microorganismos AAR, por
su
rendimiento en el cribado de gran
nmero de muestras
Requiere el uso de microscopio de
fluo- rescencia

Puede indicar la conveniencia de aplicar otras tcnicas de diagnstico rpido (deteccin de

antgenos o de anticuerpos, tcnicas de biologa molecular).
Gua la calidad del proceso que exige concordancia entre los micro organismos que se
observan en la visin directa y los que se obtienen, recuperan o aslan por cultivo.
Puede proporcionar ayuda para orientar la asistencia, tanto en pautas teraputicas empricas
de antimicrobianos, como en la adopcin precoz de medidas preventivas y de control
epidemiolgico

El aspecto de las bacterias en el microscopio permite plantear las siguientes cuestiones clave para el
diagnstico microbiolgico:
Qu caractersticas tintoriales presentan las imgenes o elementos vi- sualizados en las
preparaciones?: se trata de bacterias gram-positivas o gram-negativas?, son bacilos cidoalcohol resistentes (BAAR), o no, o slo parcialmente?
Cul es la morfologa de las clulas bacterianas visualizadas?: bastones o bacilos, cocos,
cocobacilos, difteromorfos o corinebacteriformes, espirales o helicoidales, pleomrficas (forma
variable),
Cul es su disposicin y estructura individual o integrada?, aparecen las clulas en forma
separada o configurando cadenas, parejas, ttradas, racimos, agrupamientos ordenados o
desordenados, etc.? y
De qu tamao son las clulas?: grandes, pequeas, de dimensiones bac- terianas o de
aspecto fngico (levaduriforme o filamentoso micelial)?

Un cultivo celular es obtenido de explantes de rganos o de embriones de animales. Estas clulas

obtenidas aspticamente se disocian por accin de una enzima (tripsina) que rompe el cemento
intercelular. La suspencin de clulas libres as obtenidas, se coloca en la superficie plana de un
recipiente de vidrio o de plstico, donde se adhieren y multiplican formando una capa fina de
clulas que se llama monocapa celular. sta crece en un medio de cultivo complejo que contiene
albmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene la contaminacin
bacteriana agregando antibiticos adecuados al medio de cultivo. Los cultivos celulares en
monocapa son los ms usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensin, explantos,
cultivos de rganos, cultivos en microcarriers, etc.).
Los cultivos celulares se dividen en primarios, diploides y lneas celulares continuas. Los
primeros se obtienen a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente del organismo y
pueden subcultivarse una o dos veces. Las lneas celulares diploides, crecen en pasajes sucesivos
hasta aproximadamente 50 subcultivos y conservan, por lo menos en un 75%, el cariotipo
correspondiente a la especie de que provienen. Las lneas celulares conti- nuas, permiten un
nmero finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una
lnea continua, esta debe haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Estas lneas celulares
continuas ofrecen las siguientes ventajas: disponibilidad para todos los investigadores de stocks de
clulas idnticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa en botella de cultivos, con la
posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario. Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en
todos los laboratorios. Libre de contamina- cin con agentes extraos.
Los distintos cultivos celulares varan en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que

existe una relacin especfica entre el husped y el virus, que est en relacin con los datos
clnicos y el tipo de muestra para inocular. As por ejemplo la lnea celular HEp-2, son clulas
heteroploides humanas derivadas del carcinoma larngeo y se recomiendan para virus sincicial
respiratorio y Adenovirus.
La MRC5, es una lnea diploide fibroblstica de pulmn embrionario humano, que se usa para el
aislamiento del Citomegalovirus, el virus sincicial respiratorio, herpesvirus , Echo virus, etc. La
MDCK, es una lnea celular diploide de rin canino que se recomienda para el aislamiento del virus
Influenza.
Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37 C por un perodo de hasta 14 das en
promedio, esperando la aparicin del efecto citoptico, la toxicidad o la degeneracin celular. El
cultivo se observa al microscopio a las 24, 48, 72 horas y luego 2 veces por semana. Se usan
cultivos celulares no inoculados para control y comparacin con cualquier cambio morfolgico
observado en los cultivos inoculados. El efecto citoptico es la visualizacin de cambios
morfolgicos ms o menos caractersticos en las clulas inoculadas producidas por la accin del
virus en el cultivo celular. As, por ejemplo, el virus sincicial respiratorio forma sincicios o clulas
gigantes en HEp-2.
Los Adenovirus, forman clulas redondeadas con forma de racimo en HEp-2, dejando reas libres de
clulas.
Cuando los virus no producen efecto citoptico, se puede recurrir a tcnicas que ponen en
evidencia la presencia de este en el cultivo. Las ms usadas son: hemadsorcin, hemaglu- tinacin
y tinciones con anticuerpos monoclonales. (Ver figura 2). Hay virus que durante su multiplicacin
intracelular expresan en la membrana de la clula husped elementos estructurales virales
llamados hemaglutininas, glicoprotenas capaces de unirse a receptores especficos en la
membrana de glbulos rojos de diferentes especies animales. Por lo tanto, si se agregan glbulos
rojos a un cultivo inoculado, se puede evidenciar la infeccin de esas clulas a travs de la unin
de los glbulos rojos a la superficie celular. Dicho fenmeno se conoce como hemadsorcin. En la
hemaglutinacin, las hemaglutininas pueden evidenciarse en el sobrenadante de los cultivos usando
el mismo fundamento que para la hemadsorcin
Gracias al cultivo microbiolgico se obtiene informacin adicional que es muy valiosa para aislar e identificar a los
microorganismos. Los medios de cultivo slidos pueden clasificarse en:
1. Medios no selectivos (agar sangre y agar chocolate): posibilitan el cre- cimiento de muchas especies
diferentes de bacterias, pero no permiten el aislamiento de una sola especie bacteriana a partir de muestras
propensas a la contaminacin con un gran nmero de microorganismos comensales.
2. Medios selectivos: ayudan en el aislamiento de especies de importan- cia mdica en presencia de
especies comensales, mediante la adicin de sustancias inhibidoras, sistemas indicadores y tampones que
ayudan a la deteccin diferencial (agar MacConkey, agar CLED, agar XLD, agar VCAT o VCN). Se utilizan para
sembrar diferentes tipos de muestras contaminadas (intraabdominales, heces, orina o exudados
genitourinarios).
Caractersticas macroscpicas de las colonias
Despus de un examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar, se deben apreciar las
principales caractersticas de las colonias: tamao (en general, las bacterias gram-positivas producen colonias
algo ms pequeas que las gram-negativas), forma, grado de elevacin, borde, color, superficie, densidad,
consistencia y olor.

Reacciones en el medio de agar usadas para la identificacin de bacterias

1. Tipo de hemlisis en el medio de agar sangre. La hemlisis es una reaccin observada en el medio
circundante o subyacente a la colonia; sirve de ayuda para la identificacin presuntiva, particularmente, de los
estreptococos, y debe valorarse frontalmente y por transiluminacin.
a-hemlisis: eliminacin parcial de la sangre en torno a la colonia, ori- ginando una decoloracin
verduzca en el medio (ej.: S. pneumoniae, estreptococos del grupo viridans).
b-hemlisis: eliminacin completa de la sangre circundante o subyacente a las colonias por lisis
completa de los hemates (ej.: Streptococcus pyo- genes, Streptococcus agalactiae, Listeria
monocytogenes).
2. Produccin de pigmentos en medio de agar: es una de las caractersticas inherentes de cada
microorganismo especfico y pueden estar confinados a la propia colonia o colorear el medio: verde, a veces,
con brillo metlico (P. aeruginosa), rojo-rosado (Serratia marcescens), azul (Kluyvera spp.), pr- pura
(Chromobacterium violaceum) o marrn negruzco (Prevotella melanino- genica).
Cambios en medios diferenciales: en los medios de cultivo diferenciales se incluyen diversos colorantes,
indicadores de pH y otros componentes meta- blicos, que actan como indicadores de las actividades
enzimticas y ayudan a identificar a las bacterias aisladas, muy tiles en determinados tipos de muestras, como
los coprocultivos y urocultivos.
Crecimiento en medios lquidos: hay claves importantes para la identi- ficacin de los microorganismos
que pueden ser detectadas observando el crecimiento en los medios lquidos, especialmente, en el caldo
de tioglicolato o en otros como el Brain-Heart-Infusion (BHI).
La capacidad de la morfologa colonial para hacer una identificacin presuntiva permite:

Realizar un diagnstico presuntivo rpido en un momento de necesidad crtica basado en el

razonado del microbilogo.
Incrementar la calidad de los cuidados del paciente a travs de la comunicacin rpida de
los resultados, aumentando el coste-efectividad de las pruebas microbiolgicas (diferenciacin
de patgenos potenciales de la flora normal).

juicio

Tener un papel significativo en el control de calidad, especialmente, de los

procedimientos
automatizados y de otros sistemas de identificacin comercial disponibles (evitar interpretaciones
errneas, debidas a inculos mixtos que alteraran la identificacin), valorando la correlacin de
los resultados generados con la identificacin esperada

IDENTIFICACION POR PRUEBAS BIOQUIMICAS

Pruebas bioqumicas rpidas

Existen varias pruebas bioqumicas de realizacin fcil y rpida sobre colonias aisladas a partir de medios de
cultivo que permiten la diferenciacin presuntiva rpida entre grupos de microorganismos o entre especies
bacterianas. Adems, estas pruebas pueden orientar sobre las tcnicas adicionales necesarias para hacer
una identificacin definitiva. En la tabla 4 se resumen los principios, los modos de accin y las aplicaciones
de algunos de estos procedimientos.
Bacterias y pruebas adicionales
En la prctica, la identificacin bacteriana se puede realizar con mtodos convencionales o con
mtodos semi o totalmente automatizados. Los mtodos convencionales se suelen llevar a cabo
en forma de cascada decisoria, con un algoritmo de identificacin consensuada o estandarizada que
permite simplificar la batera a un mnimo de pruebas necesarias y apropiadas.

Principios, modos de accin y aplicaciones de algunas

Tabla 4.
pruebas bioqumicas rpidas
Prueba
Indol

Enzima
bacteriana
Triptofanasa

Aplicaciones
Reaccin positiva (color rojo) identifica a
E. coli, Proteus vulgaris

ONPG

b-galactosidasa Determina la fermentacin de lactosa

(color amarillo) en fermentadores lentos
de la lactosa. Diferencia, por ej., Neisseria
lactamica de especies patgenas de
Oxidasa
Citocromo
C Neisseria
Diferenciacin
entre
los
nooxi- dasa
fermentadores (reaccin +, color azulmorado); tambin ayuda a la
identificacin de Neisseria, Aeromonas,
Vibrio y Campylobacter
Catalasa
Catalasa
Diferenciacin
de
estafilococos
(reaccin + con burbujeo) de
estreptococos (reaccin -) y de Listeria de
los
estreptococos presuntiva
Solubilidad en bilis
Identificacin
de
Streptococcus pneumoniae (colonias
lisadas) en cultivos de esputo, sangre o
LCR
PYR (L-pirrolidonil- LIdentificacin de estreptococos del
Bpirroglutamil- grupo A de Lancefield.
Diferencia
naftilamida)
amino-peptidasa Enterococcus de los es- treptococos del
grupo D (reaccin +, color rojo brillante)
Ureasa (rpida)
Ureasa
Prueba de cribado (positiva, color rojo)
para Cryptococcus, Proteus, Klebsiella y
Yersinia ente- rocolitica
Hipurato (rpido)

Especiacin de Streptococcus agalactiae,

Campy- lobacter jejuni y Listeria

Plasmocoagulasa

Diferencia S. aureus de estafilococos

coagulasa negativos

Ejemplo de identificacin por algoritmo en cascada. ECN: estafilococos negativos para la coagulasa
.
Existen varias pruebas bioqumicas de realizacin fcil y rpida sobre colonias aisladas a partir de medios de
cultivo que permiten la diferenciacin presuntiva rpida entre grupos de microorganismos o entre especies
bacterianas. Adems, estas pruebas pueden orientar sobre las tcnicas adicionales necesarias para hacer
una identificacin definitiva. En la tabla 4 se resumen los principios, los modos de accin y las aplicaciones
de algunos de estos procedimientos.
Para la identificacin de los bacilos gramnegativos (BGN) aerobios, del tipo de las enterobacterias, se
realiza una batera de pruebas bioqumicas con la que se identifica a los que se aslan ms frecuentemente
en nuestro medio. Adems, conocer el fenotipo de sensibilidad antibitica de una determinada especie
ayuda de forma determinante a la identificacin final.
En la identificacin de los cocos Gram positivos catalasa positivos es muy importante diferenciar a
Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de los estafilococos coagulasa negativos (ECN).
Por otra parte, para la identificacin de los cocos Gram positivos catalasa negativos, la identificacin
preliminar es esencial, ya que existe una gran varie- dad de gneros. Por ello, se aconseja una identificacin
en cascada con unas pocas pruebas convencionales, que permitan identificar el gnero, y en algn caso,
la especie (patrn hemoltico, crecimiento en forma de satlite con una cepa de S. aureus hemoltica,
piracinamidasa, hidrlisis del hipurato, prueba del CAMP, solubilidad en bilis y optocina). Si interesa la
identificacin de la especie, lo ms habitual es utilizar galeras comerciales (API rapid ID 32 STREP, Vitek2,
MicroScan Walk-Away, Phoenix o Wider).
Para la identificacin de los bacilos gram-positivos de los gneros Coryne- bacterium y Bacillus, la
diferenciacin preliminar debe hacerse por la morfologa de la colonia, color, hemlisis, caractersticas al

microscopio, presencia de espo- ras, etc. Aunque para una mayor seguridad en la identificacin se puede
utilizar tambin un sistema de galeras para los bacilos corineformes (API Coryne), o el API 50 CHB para el
gnero Bacillus o mediante mtodos automticos, como el sistema Phoenix.
Para la identificacin de bacterias anaerobias es importante realizar una identificacin preliminar, que
permite, en algunos casos, conocer el gnero, en funcin de la morfologa, tincin de Gram, disposicin y
patrn de hemlisis. Una identificacin definitiva se puede realizar con galera de pruebas como el API rapid
ID 32 A.

Estos ensayos se basan en la deteccin de anticuerpos (Ac) especficos que permiten sealar a
determinado microorganismo presente en una infeccin. La otra posibilidad es la deteccin de
antgenos (Ag) solubles en los materiales a estudiar. Son todas reacciones de tipo antgeno
anticuerpo (Ag-Ac).
La especificidad de los antisueros de uso corriente en el laboratorio suele ser muy variada.
Generalmente, los microorganismos son un mosaico de antgenos expuestos. Segn su especificidad podemos encontrar tres tipos de inmunoglobulinas: policlonales, monoespecficas y
monoclonales. Por ejemplo supongamos que dos bacterias A y B son diferentes; que la bac- teria
A presenta en su superficie tres Ag diferentes y que la bacteria B posee un Ag idntico al de la
bacteria A, un Ag propio y nico y, un Ag que reacciona en forma cruzada con A. Un antisuero
policlonal contra la bacteria A, la reconocer en todos sus Ag, pero tambin reconocer a B por el
Ag idntico al de A y por aquel que tiene reaccin cruzada con A. Si pensamos en un antisuero
monoespecfico contra el Ag en que B tiene reaccin cruzada con A, tambin reconocer las dos
bacterias, tanto por reconocimiento especfico, como por reaccin cruzada. Por ltimo, un Ac
monoclonal solo reconocer a la bacteria A, dado que no hay posibilidades de reaccin cruzada.
Es importante destacar que generalmente, todas las pruebas mejoran la especificidad y
sensibilidad con los Ac monoclonales, pero su uso debe ser valorado junto a las necesidades, los
costos, etc.
Aunque existen tcnicas diferentes para la deteccin de Ag o de Ac, todas se basan en diferentes
formas de evidenciar una reaccin Ag-Ac. La contrainmunoelectroforesis (CIE) fue una de las
primeras tcnicas en usarse. sta se basa en la carga negativa que presentan los Ag bacterianos en
medio alcalino, cuando son sometidos a una corriente elctrica; en cambio, los Ac permanecen
neutros. Esta tcnica es poco usada en la actualidad porque es menos sensibles que otras que se
desarrollaron posteriormente y de mayor costo econmico.

Tcnicas muy usadas y de fcil realizacin son las que se basan en aglutinacin de part- culas, por
ejemplo la aglutinacin de ltex o la coaglutinacin que usa S. aureus y su protena A fijadora de
inmunoglobulinas. La prueba de aglutinacin es un mtodo sencillo, de un solo paso. Adems es una
tcnica rpida y barata. Los ensayos de aglutinacin dependen de la fijacin inicial de Ac o de los
Ag especficos sobre eritrocitos o partculas de ltex. Luego este reactivo se incuba con la muestra
clnica, en la que se investiga el Ag o los Ac y las partculas se aglutinan si el Ag o Ac adecuado se
encuentra presente. La prueba de aglutinacin ha sido usada para detectar el Ag (el ms
importante) de Rotavirus en heces, mostrando buena sensibilidad cuando se lo compara con el
EIA para Rotavirus. Tambin se ha usado para detectar Ag de Adenovirus.
Las tcnicas de anlisis inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) que usan Ac unidos a enzimas
que catalizan reacciones colorimtricas, son de uso corriente. Los ELISA para la deteccin de Ag
se basan en la captura del Ag por Ac especficos unidos a una fase slida, generalmente el pocillo
de una microplaca o una esfera de plstico pequea. El Ag viral presente en la muestra clnica se
combina con el Ac fijado a la fase slida y el Ag viral se detecta mediante la adicin de otro Ac
especfico conjugado a una enzima. La enzima con- jugada suele ser peroxidasa o fosfatasa
alcalina. En la reaccin con peroxidasa el substrato es un perxido capaz de oxidar un compuesto
qumico incoloro, que en su forma oxidada tiene un color caracterstico. Si la enzima es fosfatasa,
la desfosforilizacin es la responsable directa de la aparicin del color.
En los ltimos aos los EIA indirectos se han aplicado al diagnstico de Ac virales. En esta tcnica los
Ag virales se inmovilizan en una fase slida (esferita, policubetas para microtitula- cin u otros
elementos de plstico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la
reaccin Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima,
seguida por el substrato apropiado para sta. Con esta tcnica se pueden procesar muchas muestras
en forma rpida y automatizada, sin requerir de un observador experimen- tado para leer los
resultados, dado que estos se leen con espectrofotmetros especialmente diseados. Por lo tanto,
dicha tcnica se considera ms objetiva (ver figura 3).
Las tcnicas inmunomicroscpicas que usan la fluorescencia (IF), tambin son usadas para la
deteccin de Ag o Ac. Es una de las tcnicas ms antiguas y de uso ms difundido en el laboratorio
clnico. El principio bsico de la IF directa se ilustra en la figura 4. Las muestras clnicas apropiadas
son recolectadas y colocadas en un portaobjetosdonde se dejan secar

y se fijan. Luego se agregan Ac especficos marcados con isotiocianato de fluorescena que

difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los Ag virales expresados en las
clulas. La reaccin Ag-Ac se observa con el microscopio de fluorescencia por la apari- cin de
fluorescencia de color verde manzana. Esta tcnica se puede usar para identificar rpidamente el
virus directamente en la muestra (por ejemplo en las clulas del lavado nasal o de un hisopado
nasofarngeo) o para confirmar el efecto citoptico observado en cultivos celulares. Esta tcnica se
llama IF directa.
Adems con el uso de Ac monoclonales especficos para los Ag inmediatos de Citomegalo- virus, es
posible determinar la presencia de dicho virus en cultivos celulares algunos das antes de que se
pueda reconocer el efecto citoptico. Sin embargo, la eficacia de la tcnica depende mucho de la
calidad de los reactivos, del microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para
llegar a un diagnstico certero; adems de la recoleccin y preparacin de la muestra adecuada. Aun
as, la tcnica realizada en manos expertas resulta til para identificar algunos virus como los
respiratorios, dado que proporciona un diagnstico etiolgico en una jornada de trabajo. Tambin
pueden estudiarse muchas muestras simultneamente.
El advenimiento de los Ac monoclonales ha incrementado la especificidad y en algunos casos la
sensibilidad de estos ensayos. Los Ac monoclonales conjugados con isotiocianato de fluorescena
pueden usarse para identificar el virus sincicial respiratorio, Influenza A y B, Parainfluenza 1y se
fijan. Luego se agregan Ac especficos marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a
travs de la membrana celular y se combinan con los Ag virales expresados en las clulas. La
reaccin Ag-Ac se observa con el microscopio de fluorescencia por la apari- cin de fluorescencia
de color verde manzana. Esta tcnica se puede usar para identificar rpidamente el virus
directamente en la muestra (por ejemplo en las clulas del lavado nasal o de un hisopado
nasofarngeo) o para confirmar el efecto citoptico observado en cultivos celulares. Esta tcnica se
llama IF directa. Adems con el uso de Ac monoclonales especficos para los Ag inmediatos de
Citomegalo- virus, es posible determinar la presencia de dicho virus en cultivos celulares algunos
das antes de que se pueda reconocer el efecto citoptico. Sin embargo, la eficacia de la tcnica
depende mucho de la calidad de los reactivos, del microscopio de fluorescencia y de una persona
con experiencia para llegar a un diagnstico certero; adems de la recoleccin y preparacin de la
muestra adecuada. Aun as, la tcnica realizada en manos expertas resulta til para identificar
algunos virus como los respiratorios, dado que proporciona un diagnstico etiolgico en una jornada
de trabajo. Tambin pueden estudiarse muchas muestras simultneamente.

La tincin con inmunoperoxidasa es similar a la de IF y es la tcnica de eleccin en algunos

laboratorios. El procedimiento requiere algunos pasos adicionales, dado que en este caso el Ac
monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adicin de un substrato, para evidenciar
la reaccin por un cambio de color visible micro y macroscpicamente.
La IF indirecta es un mtodo rpido y confiable para la determinacin de Ac en el suero del
paciente. El principio de la tcnica se ilustra en la figura 4. Se basa en la unin del Ac presente en
el suero del paciente, con los Ag expresados en la superficie y el citoplasma de las clulas
infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan
clulas no infectadas. Primero se incuba el suero del paciente con las clulas infectadas y no
infectadas; luego se realiza un lavado con solucin amortiguadora y se agregan Ac contra la
inmunoglobulina G humana conjugada con isotiocianato de fluorescena. ste ltimo es una sustancia
que se vuelve fluorescente a la exposicin de la luz ultravioleta y emite una luz de color verde
caracterstica. El conjugado se unir a los Ac del paciente si la reaccin es positiva, leyndose la
prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la aparicin de
fluorescencia en el citoplasma y la superficie de las clulas infectadas, mientras que las clulas
control no fluorescen, generalmente se ven de color rojo. (Ver figura 4).
El radioinmunoensayo (RIA) fue originalmente aplicado para identificar el Ag de super- ficie de la
hepatitis B (HBsAg) y el Ac anti-HBsAg. Estos ensayos tienen buena sensibilidad y especificidad,
pero la aparicin del EIA con mayor tiempo de conservacin de los reactivos, costo ms bajo y
ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las tcnicas de RIA en la mayora de las
situaciones en las que se requiere la deteccin de Ag viral.
La tcnica de western blot (WB) tiene muchas aplicaciones en el diagnstico virolgico. Son
particularmente tiles para el diagnstico del virus de la inmunodeficiencia humana
Figura 5. Esquema de Western blott para la deteccin de anticuerpos

(VIH). Dicha tcnica se basa en la separacin electrofortica de protenas virales que son
posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa, con el objeto de determinar la pre- sencia
de Ac especficos contra cada una de esas protenas. Se realiza esquemticamente en tres pasos.
En el primero se realizan cultivos celulares de grandes cantidades de virus que luego son
tratados qumicamente para su disgregacin e inactivacin. Los Ag resultantes del lisado viral se
separan por electroforesis en gel de poliacrilamida. A continuacin se realiza una transferencia
(blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa. Por ltimo
se coloca el suero del paciente en la membrana de nitrocelulosa y se agregan Ac antiinmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina); finalmente se
agrega el substrato enzimtico para la visualizacin de las bandas reactivas con un producto final
coloreado. Esta tcnica es similar a un EIA, aunque menos sensible pero ms especfica. En la
prctica, solamente el tercer paso se realiza en los labo- ratorios de diagnstico, dado que los
equipos comerciales proveen tirillas con los Ag; esto facilita la estandarizacin de las

determinaciones. (Ver figura 5 La interpretacin de las pruebas serolgicas que detectan Ac

tienen como concepto central, el aumento del ttulo. El ttulo de Ac es la recproca de la mayor
dilucin del suero del paciente, en que los Ac son an detectables. Los pacientes con muchos Ac
tienen ttulos altos, ya que los Ac sern detectables an en diluciones altas del suero. Los
pacientes con respuesta humoral ntegra, aumentarn el ttulo de Ac durante la enfermedad. Por lo
tanto, se deben realizar dos extracciones de suero con un intervalo de dos semanas para poder
detectar las modificaciones en el ttulo, la cual tiene que ser cuatro veces (dos diluciones) mayor
para considerarse significativa. En algunas infecciones sern necesarios perodos de tiempo
mayores para evidenciar dichos cambios. Una forma alternativa es la deteccin de
inmunoglobulina M (IgM) especfica. Como mtodo directo, la deteccin de Ag es de uso corriente
en el laboratorio para el diagnstico de agentes de meningitis, para la deteccin de Ag de S.
pyogenes en la faringe y para muchos virus (sicicial respiratorio, Rotavirus, virus de la hepatitis).
Como mtodo indirecto para la deteccin de Ac contra el microorganismo se usa en: brucelosis,
fiebre tifoidea, infecciones por Chlamydia o Mycoplasma, infecciones virales como hepatitis, VIH,
virus herpes y enfermedades eruptivas como sarampin, rubola, paperas y dengue.

DETERMIBACIN DE ACIDOS NUCLEICOS

(Tcnicas moleculares)

En los ltimos aos, ha ganado aceptacin en el laboratorio clnico el uso de tcnicas basadas en la
deteccin de cidos nucleicos. La combinacin del reconocimiento de fragmentos de cidos
nucleicos por medio de sondas y la amplificacin previa continan en desarrollo.
Actualmente es posible extraer secuencias especficas de un fragmento de cido desoxirribonucleico (ADN) por medio de endonucleasas de restriccin. Luego estas secuencias
extradas se pueden desnaturalizar y marcar con una enzima o con un istopo radioactivo. A
estas cadenas marcadas, que tienen una secuencia de ADN conocida se llaman sondas de
cidos nucleicos. Hoy se estn produciendo sondas de cidos nucleicos sintticas, y as se obtienen
sondas de oligonucletidos de alta especificidad que estn disponibles en.
La amplificacin de cidos nucleicos mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), es
otra tcnica alternativa a los cultivos. Primero se realiza la amplificacin de los
Figura 6. Hibridacin de AND con una sonda marcada

Fragmentos de ADN a hibridar, con la reaccin en cadena de la polimerasa que aumenta

notablemente la sensibilidad de las tcnicas de deteccin de ADN. Aunque todava son costosos,
estos mtodos de microbiologa molecular, ya tienen su espacio en el laboratorio clnico. Son
tiles en la investigacin de algunas bacterias como Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia sp.,
Mycoplasma. Tambin se usan para la deteccin de genes que le confieren a la bacteria resistencia
a algunos antibiticos, por ejemplo la meticilino resistencia de S. aureus y las betalactamasas de N.
gonorrhoeae. En virologa han introducido importantes cambios en el diagnstico de enfermedades,
tales como la encefalitis herptica y otras enfermedades neurolgicas virales, la infeccin por VIH del
recin nacido y la infeccin por Papilomavirus humano.
La PCR fue desarrollada por Saiki et al., para aumentar el nmero de molculas de ADN blanco en
las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una nica mol- cula de ADN y
una sola copia de genes puede ser extrada de mezclas complejas de secuencias genmicas y
visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa. Esta tcnica consiste, en una
amplificacin de secuencias especficas del ADN. Se basa en el uso de secuencias cortas de
nucletidos sintticos llamados primers o cebadores, que se hibridan especficamente con cada una
de las cadenas de ADN previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la
reaccin se produzca se usa una enzima llamada Taq pol (ADN polimerasa ter- moestable
obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucletidos trifosfatos. La funcin natural de la
ADN polimerasa consiste en reparar y replicar el ADN. Los deoxinucletidos trifosfatos se
necesitan como ladrillos para la construccin. El nucletido al cual se una la polimerasa ser
complementario al de la base en la posicin correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza
as una cadena simple de ADN, complementaria y alineada a cada cebador. Se realiza una serie
repetida de ciclos, cada uno compuesto por tres pasos bsicos: desnaturalizacin a altas
temperaturas (95C) del ADN de doble cadena; acoplamiento de los cebadores, la temperatura se
desciende a 55 - 72C y elongacin del cebador, aqu se eleva la temperatura a 72C permitiendo la
incorporacin de los deoxinucletidos. Mientras tanto se van deplecionando los cebadores y los
deoxinucletidos y se van sintetizando nuevas cadenas de ADN. Al final se consiguen miles de
copias de ADN del fragmento de ADN limitado por los cebadores. Los fragmentos de ADN
obtenidos se pueden identificar por varias tcnicas: visualizacin en geles de agarosa o
poliacrilamida con tincin con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta o hibridacin con una
sonda marcada. La combinacin de la PCR y las sondas de cidos nucleicos marcadas promete ser
el mtodo ms sensible para la deteccin e identificacin de los virus.
En conclusin decimos que para elegir un mtodo diagnstico, adems de la sensibilidad y la
especificidad, hay que considerar aspectos operativos de las tcnicas a usar tales como el costo, la
complejidad tcnica del ensayo, el volumen necesario y preparacin de la muestra, el tiempo que
requiere el proceso y la disponibilidad comercial de los reactivos de calidad reconocida. Adems,
se debe considerar el nivel de complejidad del laboratorio y la disponi- bilidad tecnolgica y de
recursos que requiere cada tcnica.

DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES MICTICAS

1.- CONSIDERACIONES CLNICAS
Las infecciones fngicas pueden causar un gran nmero de entidades clnicas, con manifestaciones
variadas que dependen del lugar de infeccin y del tipo de paciente. En general, podran
clasificarse segn un criterio de profundidad, en superficiales, cutneo-mucosas, subcutneas y
profundas (endmicas y oportunistas). Son las micosis profundas oportunistas las que han
adquirido un protagonismo especial en los ltimos tiempos debido, entre otros motivos, al
aumento de incidencia, gravedad y trascendencia del diagnstico precoz, a lo que habra que
aadir la dificultad para diferenciar la colonizacin de la infeccin invasora. El aumento
significativo de las infecciones fngicas sistmicas oportunistas es debido, entre otras causas, a las
medidas de soporte vital, al aumento del uso de antibiticos de amplio espectro, a la implantacin
de material protsico, a la terapia con corticoides y, en general, cualquier tipo de
inmunosupresin (teraputica o adquirida). Sin el tratamiento adecuado, la mortalidad de las
infecciones fngicas sistmicas es muy alta, lo que unido a los costes de hospitalizacin que este
tipo de infecciones genera, las convierten en entidades de gran trascendencia en la prctica diaria
en el medio hospitalario. El diagnstico micolgico tradicional, basado en el cultivo, se caracteriza
por su lentitud y, en el caso de las micosis sistmicas, por su baja sensibilidad y por la necesidad de
obtener muestras por mtodos invasores. El hemocultivo, por ejemplo, es, sin lugar a duda, un
buen mtodo diagnstico de las micosis sistmicas; pero requiere incubacin prolongada y posee
una sensibilidad global de alrededor del 50% en el caso de la infeccin producida por levaduras,
que en el caso de la aspergilosis invasora no llega al 10%. Sigue siendo, sin embargo, el mtodo de
eleccin para el diagnstico de las micosis superficiales y mucocutneas. En los ltimos aos se
han desarrollado nuevas tcnicas diagnsticas independientes del cultivo con la intencin de
mejorar la sensibilidad y reducir el tiempo necesario para realizar el diagnstico. El papel del
laboratorio de microbiologa es de gran importancia, siendo fundamental para la eleccin de un
tratamiento adecuado la identificacin del agente causal de la infeccin.
1.1. MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTANEAS Estas micosis incluyen infecciones muy frecuentes que
afectan al estrato crneo de la piel, a la epidermis y a los anejos cutneos: pelo y uas. Son
infecciones que constituyen una parte importante de las consultas dermatolgicas y cuyo
diagnstico de eleccin sigue siendo el examen directo y el cultivo de las muestras de piel y anejos
cutneos.
1.2. MICOSIS SUBCUTNEAS Estn causadas por hongos ambientales inoculados directamente en
el tejido celular subcutneo mediante un traumatismo. Presentan una agresividad local variable.
Caractersticamente no se diseminan a distancia. Entre ellas se incluyen la cromoblastomicosis,
esporotricosis, micetomas y una serie de cuadros raros: rinosporidiosis, entomophtoramicosis y
lobomicosis. El diagnstico de estas infecciones suele realizarse por examen microscpico directo
y cultivo. En algunas de ellas, como la lobomicosis, el hongo causal no ha podido cultivarse y el
diagnstico es histolgico.

1.3. MICOSIS TROPICALES ENDMICAS Conforman un grupo de infecciones cuyos agentes

causales acumulan una serie de caractersticas curiosas: 1) presentan dimorfismo de temperatura,
2) son patgenos primarios, 3) causan patologa diseminada, incluso en pacientes no
inmunocomprometidos, 4) tienen una distribucin geogrfica caracterstica. Aunque pueden
afectar a individuos inmunocompetentes, las infecciones en pacientes inmunodeprimidos son ms
frecuentes y graves. El diagnstico se realiza por una combinacin de mtodos convencionales:
histologa, cultivos y serologa; y no convencionales, como la deteccin de antgenos especficos en
sangre y orina (histoplasmosis).

1.4. OTRAS MICOSIS OPORTUNISTAS Constituyen un grupo muy heterogneo de enfermedades

que tienen en comn la situacin del paciente, la gravedad y la relativa dificultad de diagnstico.
Por otra parte, el diagnstico etiolgico es muy importante, pues la respuesta a los distintos
antifngicos vara con las especies implicadas. En este grupo se incluyen: pneumocistosis,
fusariosis, penicilinosis, zigomicosis, pseudalescheriasis, pitosis, infecciones por Dipodascus
capitatus, trichosporonosis, infecciones por Scedosporium prolificans y otras. Algunas de estas
infecciones se diagnostican con mas facilidad, porque los hongos crecen en abundancia de
muestras accesibles, como ocurre en la infeccin por Penicillium marneffei, mientras que otras
requieren procedimientos muy invasores y cierta dosis de fortuna.
2. DIAGNSTICO DE LABORATORIO CONVENCIONAL
Recogida de la muestra:
Consejos generales para optimizar la recogida de las muestras:
1. Debe disponerse de un protocolo de recogida de muestras que ser actualizado
peridicamente.
2. Es responsabilidad del mdico asegurar una correcta recogida y envo en condiciones adecuadas
de las muestras, funciones que no deben ser delegadas en personal no cualificado.

3. Es necesario recoger las muestras aspticamente, utilizando contenedores estriles, remitirlas

al laboratorio antes de 2 horas y sembrarlas lo antes posible.
4. La muestra debe recogerse antes de instaurar el tratamiento y siempre de la parte activa de la
lesin (cuando se sospecha una micosis pulmonar es preferible una muestra respiratoria que un
hemocultivo).
5. Se debe evitar la utilizacin de hisopos siempre que el tipo de lesin lo permita, pues estn
contaminados frecuentemente con microbiota bacteriana. Sin embargo, algunas muestras
(conducto auditivo, faringe, vagina, crvix) no pueden ser recogidas de otra forma.
6. Las muestras de lesiones cerradas y abscesos suelen presentar un gran rendimiento. Deben
aspirarse con jeringa y transferirse a un contenedor estril con solucin salina, prestando atencin
a la recogida de grnulos, si los hubiese.
7. El raspado de lesiones de piel y faneras puede realizarse con distintos materiales; los ms
utilizados son bistur, moqueta o cepillo.
8. En situaciones que requieran un estudio epidemiolgico, debe establecerse la necesidad de una
recogida de muestras ambientales, familiares o animales.
9. El recipiente de recogida se identificar con los datos del enfermo (nombre y localizacin), y
debe protegerse para que no se rompa en su transporte al laboratorio.
10. Las muestras deben ir acompaadas obligatoriamente del volante de peticin para
Microbiologa. En el cual, al menos, debe hacerse constar la siguiente informacin: datos del
paciente (nombre y apellidos, nmero de 5 historia clnica, fecha de nacimiento y sexo); datos
clnicos (orientacin diagnstica, tratamiento antimicrobiano, enfermedad de base y antecedentes
de inters); datos del mdico solicitante.
11. Al laboratorio se le debe informar de la sospecha de presencia de hongos peligrosos. Tambin
si se sospecha la presencia de hongos con requerimientos especiales, Malassezia sp, por ejemplo,
as como de viajes u origen de paciente.

Procedimiento de la toma y siembra de muestra. a- Toma de muestra con pinza (mtodo

convencional). b- Toma de muestra con cepillo dental. c- Siembra de pelos en la mitad de una
placa de agar Sabouraud. d- Siembra de escamas en la otra mitad de la placa agar Sabouraud.

Procesamiento de la muestra:
Para realizar un buen diagnstico micolgico es importante que la muestra se recoja y se
transporte en condiciones idneas y que no se demore su cultivo. Aunque hay pocos estudios
sobre la disminucin de la viabilidad de los hongos a temperatura ambiente o por la accin del
hielo seco, es conocida la dificultad de recuperar Rhizopus arrhizus en muestras en las que se
demora el cultivo, y tambin, la prdida de viabilidad de algunos hongos por la desecacin,
temperatura elevada (>37 C) o baja (<10 C), sobrecrecimiento bacteriano, presencia leucocitos,
etc. La refrigeracin puede comprometer el aislamiento de hongos dermatofitos, Malassezia sp. H.
capsulatum. Las muestras que estn potencialmente contaminadas con microbiota bacteriana
(muestras de piel, aspirados transtraqueales, aspirados de odo interno, muestras de conjuntiva)
deben enviarse a temperatura ambiente. En trminos generales, los procedimientos utilizados en
el laboratorio de bacteriologa son adecuados para el cultivo de hongos, pero hay que tener en
cuenta que, habitualmente, la carga microbiana es inferior en el caso de los hongos con respecto a
las bacterias. Esto obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un rendimiento
ptimo. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el facultativo debe ser informado
inmediatamente. Todo laboratorio debe distribuir por escrito las normas de rechazo de muestras.

Tinciones y exploracin por microscopia directa:

Las tinciones en microbiologa son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para
el diagnstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace ms de un siglo han ayudado a
resolver problemas de etiologa microbiana. Hay una gran variedad de tinciones, que se han ido
desarrollando para la deteccin de los diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen
bacterias, parsitos y hongos
Tincin de blanco de calcofluor: Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante
blanco de calcoflor aumentando su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Este
colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales
clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos
de los cultivos puros de los hongos. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o
verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice Las especies del
gnero Malassezia integran la flora habitual del ser humano, pero en ocasiones, causan
diversas afecciones. Durante mucho tiempo, el diagnstico temprano se vio demorado por
la dificultad de obtener los cultivos de estos hongos. El objetivo de este trabajo es evaluar
las ventajas del empleo de la microscopa de fluorescencia con blanco de calcoflor para la
observacin de especies de Malassezia, tanto de material extrado de los pacientes, como
de los cultivos. La tcnica de fluorescencia ofrece, en comparacin con la coloracin

tradicional de azul de lactofenol, la ventaja de facilitar adems de la observacin de los

elementos fngicos, observar el patrn de brotacin de estos organismos, til para la
identificacin. El anlisis de materiales clnicos con la coloracin de blanco de calcoflor y
posterior observacin con microscopio de fluorescencia, resulta entonces un mtodo
sencillo y rpido para la identificacin presuntiva y contribuye, por lo tanto, al diagnstico
temprano.

Tincin de Giemsa: Detecta formas intracelulares de Histoplasma capsulatum. No tie la

pared qustica del genero Pneumocystis. Tie otros microorganismos adems de los
pertenecientes a los gneros Histoplasma y Pneumocystis. Estos poliorganismos adquieren
una coloracin diferencial y se ven dentro del citoplasma de la clula husped. La tcnica
de Giemsa est formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el
azul de metileno como tinte bsico y la eosina como tinte cido, lo que da una amplia
gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromtico, de ah que muchas
estructuras se tian de prpura y no de azul. El pH de la solucin de coloracin es crtico y
se debe ajustar idealmente segn diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y
6.9.

Tincin Gram: es un tipo de tincin diferencial empleado en bacteriologa para la

visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Se utiliza tanto para poder
referirse a la morfologa celular bacteriana, como para poder realizar una primera
aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose bacterias gram positivas a las
que se visualizan de color morado, y bacterias gram negativas a las que se visualizan de
color rosa, rojo o grosella. Tie la mayor parte de las levaduras y las hifas presentes en las
mismas. Casi todos los hongos son grampositivos aunque muestran un patrn moteado o
aparecen como gramnegativos, como el Cryptococcus neoformans

Metenamima argntica de Gomori: Tincin ms adecuada para detectar todos os hongos.

Tie las hifas y las levaduras de negro sobre un fondo verde. La reaccin tintorial est
basada en que, en presencia de cido perydico, los polisacridos de la pared celular de
los hongos son oxidados a aldehdos; stos, a su vez, reducen el complejo nitrato-plata
metanamina (o metenamina) produciendo una coloracin de caf a negra, debido al
depsito de plata reducida en los lugares de localizacin de los aldehdos.

Tincin de Mucicarmn: Se trata de un kit que contiene soluciones de:

Mucicarmn Concentrada Biopur
Actica de Tartrazina Biopur
Colorante Histolgico.

Usado en la identificacin de sitios de tumores primarios, ayudando a la distincin de

clulas escamosas indiferenciadas mucina-negativas de los adenocarcinomas mucinapositivos.
La cpsula de los criptococos (hongos) se tie de rosa oscuro.
La tartrazina tie el citoplasma de amarillo. Es una tincin anatomopatolgica para
detectar mucina. Resulta til para mostrar material capsular de Cryptococccus
neoformans, tambin puede teir las paredes celulares de Blastomyces dermatitidis y
Rhinosporidium seeberi.

Cultivo:
Agar Czapek Dox: se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmente Aspergillus
spp. y Penicillium sp. Es el medio de referencia para la identificacin de Aspergillus sp.
Agar de papa dextrosa: es un medio utilizado para la estimulacin de la formacin de
conidias, en la preparacin de inculos de hongos miceliales y en la estimulacin de
produccin de pigmentos: rojo en Trichosporum rubrum, rosa salmn en Microsporum
audouinii y amarillo en Microsporum canis. Se utiliza con frecuencia en microcultivos para
observar las caractersticas morfolgicas.
Agar Dixon modificado: utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puede modificarse
aadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida. 21 22
Agar Sabouraud + Glucosa modificado por Emmons: es el medio estndar para el
aislamiento, esporulacin y conservacin de muchos hongos. Su pH y la concentracin de
glucosa favorecen la esporulacin.
Agar infusin de cerebro corazn: puede utilizarse como medio enriquecido para facilitar
el crecimiento de C. neoformans a partir de muestras estriles como el LCR y el
mantenimiento de la fase levaduriforme de algunas micosis sistmicas, ya sea con sangre
o sin ella. En general, est indicado para el aislamiento de una gran variedad de
patgenos, incluyendo levaduras, mohos y bacterias como Nocardia. Enriquecido con
sangre de carnero al 10%, se utiliza para el aislamiento de todos los hongos, incluyendo los
hongos dimrficos. Pueden aadirse antibacterianos (cloranfenicol y/o gentamicina) para
convertirlo en selectivo. En algunas ocasiones tambin puede completarse con

cicloheximida (facilita el aislamiento de Histoplasma capsulatum y Blastomyces

dermatitidis).
Agar inhibidor de mohos: es un medio enriquecido que contiene cloranfenicol o
gentamicina, pero no actidiona. Se utiliza en el aislamiento de hongos sensibles a la
cicloheximida (Cryptococcus, zigomicetos, etc.) a partir de muestras contaminadas.
Permite el desarrollo de la mayora de los mohos y de las levaduras.
Agar Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol: es un medio selectivo utilizado para el
aislamiento de hongos patgenos a partir de muestras muy contaminadas con hongos
saprofitos y bacterias. Se utiliza fundamentalmente en el aislamiento de dermatofitos y
hongos dimrficos. Inhibe algunas especies de hongos de inters mdico (Candida no
albicans, Aspergillus, zigomicetos, C. neoformans, etc.).
Agar urea de Christensen: se utiliza en la identificacin de algunos dermatofitos,
especialmente Trichophyton rubrum de Trichophyton mentagrophytes y de algunas
levaduras (C. neoformans).
Medios cromognicos para levaduras: Cromocandida contienen diversos sustratos
enzimticos que estn unidos a compuestos cromognicos. Muy til para el estudio de
levaduras.
Dermatophyte test medium: medio utilizado para el aislamiento de dermatofitos en
muestras muy contaminadas, proporcionando una identificacin presuntiva. Los
dermatofitos producen alcalinizacin, virando el medio de amarillo a rojo. Algunas
bacterias y algunos hongos tambin pueden producir alcalinizacin. Debido a que se trata
de un medio coloreado, no es un medio til para la caracterizacin de los pigmentos
producidos por los dermatofitos. La cicloheximida inhibe muchos de los hongos saprofitos.
Agar harina de maz con/sin Tween 80: se utiliza en el cultivo y diferenciacin de especies
de Candida basndose en las caractersticas miceliales. El Tween 80 se incorpora para
demostrar la formacin de clamidoconidias. Si se le aaden 10 g de glucosa puede
utilizarse en la diferenciacin de T. rubrum y T. mentagrophytes basndose en la
produccin de pigmento.
Agar Lactrimel: Medio conteniendo leche, harina de trigo, y miel. Adems contiene
inhibidores lo que impide el desarrollo de Bacterias :(E.Coli y cocceas: S.aureus)
3. DIAGNSTICO DE LABORATORIO NO CONVENCIONAL
Basados en mtodos inmunolgicos
Aunque los anticuerpos que se forman durante las infecciones fngicas no son el principal
mecanismo de defensa, se han utilizado en algunas infecciones para ayudar a su diagnstico. Se
puede realizar determinacin de anticuerpos en suero y LCR frente a Coccidioides immitis e
Histoplasma capsulatum, la deteccin en suero y LCR del antgeno del criptococo o la deteccin del
antgeno en orina y suero del Histoplasma.
Basados en la deteccin de componentes fngicos
Identificacin del galactomanano para el Aspergillus. Muestra elevada sensibilidad cuando se
realizan determinaciones seriadas, por lo que puede contribuir al diagnstico precoz de la
aspergillosis invasiva.

 La prueba del Beta-glucano para la Candida. Este es un antgeno de pared, pero se encuentra
tambin en Aspergillus y Pneumocystis, y no es especfico de Candida. Hay varios sistemas
comerciales con alta sensibilidad y especificidad, con 90% y 100%, respectivamente, pero el valor
predictivo positivo es muy bajo (54%); el valor predictivo negativo es alto y la eficacia global, segn
algunos estudios, llega a 85%. Puede haber falsos positivos en pacientes en hemodilisis que
utilizan sistemas con membranas de celulosa y en pacientes en tratamiento con albmina,
inmunoglobulinas, sulfamidas y anticancergenos.
Identificacin de las caractersticas de distintos hongos:
La determinacin de la identidad del agente etiolgico causante de una micosis puede influir
directamente en el pronstico y las consideraciones teraputicas. La identificacin de los
patgenos fngicos puede tener tambin otras implicaciones diagnsticas y epidemiolgicas.
Conocer el gnero y la especie del agente infeccioso permite tambin acceder a los datos
contenidos en los registros fngicos y las publicaciones especializadas, en especial en las micosis
oportunistas ms infrecuentes.
El primer paso de la identificacin de una cepa fngica consiste en la diferenciacin de un hongo
levaduriforme de una forma micelial. La morfologa macroscpica de las colonias suele orientar el
proceso, ya que los hongos levaduriformes crean colonias opacas plidas, mientras que las formas
miceliales dan lugar a grandes colonias filamentosas de textura, color y topografa variables. El
estudio microscpico delimita en mayor medida el proceso y, a menudo, es suficiente para
identificar numerosos especies de hongos. La identificacin del gnero y la especie requiere
estudios microscpicos ms detallados para determinar las estructuras caractersticas. La
identificacin de las esporas suele implicar anlisis fisiolgicos y bioqumicos adicionales; la
identificacin tanto de esporas como de formas miceliales mejora mediante procedimientos
especficos de caracterizacin molecular e inmunolgica.

TOMA DE MUESTRAS Y CULTIVOS

La toma apropiada de una muestra para cultivo es posiblemente el paso ms importante en la
confirmacin final de que un microorganismo es el responsable de un proceso de enfermedad
infecciosa.
Una muestra mal tomada no solo puede resultar en la recoleccin fallida de microorganismos
importante , sino tambin conducir a una terapia equivocada y aun daina si el tratamiento es
dirigido hacia un comensal o contaminante.
La muestra debe ser de material del sitio real de infeccin y tiene que ser tomada con el mnimo de
contaminacin de los tejidos, rganos o secreciones adyacentes.
CONSIDERACIONES GENERALES DE LA TOMA DE MUESTRAS:

Para una ptima recoleccin de los microorganismos debe utilizarse una serie adecuada
de dispositivos de recuperacin, envases para muestras y medios de cultivo.

Deben usarse recipientes estriles

Es ideal obtener los cultivos antes del uso de antibiticos.

TRANSPORTE DE MUESTRAS:
El transporte de muestras biologicas tiene importancia a nivel mundial. Un manejo incorrecto de
sustancias con agentes infecciosos puede ocacionar morbilidad y mortalidad.
MEDIOS DE TRANSPORTE:
1. ENVASE ESTRIL DE BOCA ANCHA: Para biopsias, orinas, escamas, lquidos, esputos,
secreciones
bronquiales.
2. TUBO ESTRIL DE TAPN VERDE: Para lquidos estriles. Para estudiar micobacterias,
microorganismos aerobios y hongos.
No vlido para microorganismos anaerobios, ni para lquidos con alto contenido hemtico
3. HISOPO CON MEDIO DE TRANSPORTE AMIES: Para abscesos y heridas recogidas con
escobilln. Estudia microorganismos aerobios y hongos.
No vlido para: anaerobios y micobacterias.
4. TUBO DE PLSTICO ESTRIL: Para catteres, tejidos y lquidos. Se puede estudiar:
microorganismos aerobios, hongos, micobacterias. Se requiere de 3-4 ml por frasco.
RECOLECCION DE MUESTRAS:
a) LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO: La recoleccin de lquido cefalorraqudeo (LCR) es un
examen para analizar el lquido que rodea el cerebro y la mdula espinal. El lquido
cefalorraqudeo acta como un amortiguador, protegiendo el cerebro y la columna de
lesiones. Por lo regular, el lquido es transparente. Tiene la misma consistencia que el
agua. El examen tambin se utiliza para medir la presin en dicho lquido.
- RESULTADOS NORMALES: Los valores normales normalmente fluctan de la siguiente
manera:
- Presin de 70 a 180 mm H20
- Apariencia: transparente, sin color
- Protena total en LCR: 15 a 60 mg/100 mL
- Gamma globulina: 3 a 12% de la protena total
- Glucosa en LCR: 50 a 80 mg/100 mL (o mayor a 2/3 del nivel de azcar en la
sangre)
- Conteo de clulas del LCR: 0 a 5 globulos blancos (todos mononucleares) y
ausencia de globulos rojos.
- Cloruro: 110 a 125 mEq/litro
- SIGNIFICADO DE LOS RESULTADOS ANORMALES: Si el LCR luce turbio, eso podra
significar que hay una infeccin o una acumulacin de glbulos blancos o protena. Si el
LCR luce sanguinolento o rojo, puede ser un signo de sangrado u obstruccin de la mdula

espinal. Si es marrn, naranja o amarillo, puede ser un signo de aumento de la protena en

el LCR o un sangrado previo (hace ms de 3 das). Puede haber sangre en la muestra
proveniente de la puncin raqudea misma. Esto hace ms difcil la interpretacin de los
resultados del examen.
PRESIN DEL LCR: El aumento de la presin en el LCR puede deberse al
aumento de la presin intracraneal (presin en el crneo). La disminucin en
la presin del LCR puede deberse a un tumor de mdula espinal, shock,
desmayo o coma diabtico.
PROTENA EN EL LCR: El aumento de la protena en el LCR puede deberse
a sangre en dicho lquido, diabetes, polineuritis, tumores, lesin o cualquier
afeccin inflamatoria o infecciosa. La disminucin de la protena es un signo
de produccin rpida de LCR.
GLUCOSA EN EL LCR: El aumento de la glucosa en el LCR es un signo de
nivel de azcar elevado en la sangre. La disminucin de la glucosa en el LCR
puede deberse a hipoglucemia (azcar bajo en la sangre), infeccin
bacteriana o mictica (como meningitis), tuberculosis o ciertos tipos de
meningitis.
CLULAS SANGUNEAS EN EL LCR: El aumento de los glbulos blancos en
el LCR puede ser un signo de meningitis, infeccin aguda, inicio de una
enfermedad crnica, tumor, absceso, accidente cerebrovascular o una
enfermedad desmielinizante (como la esclerosis mltiple). La presencia de
glbulos rojos en la muestra de LCR puede ser un signo de sangrado en dicho
lquido o el resultado de una puncin lumbar traumtica.
OTROS RESULTADOS EN EL LCR: El aumento de los niveles de
gammaglobulina en el LCR puede deberse a enfermedades tales como
esclerosis mltiple, neurosfilis o sndrome de Guillain-Barr.
b) LQUIDO PLEURAL - LIQUIDO SINOVIAL: El anlisis del lquido pleural es un examen
con el que se analiza el lquido que se ha acumulado en el espacio pleural, que es el
espacio entre el revestimiento de la parte externa de los pulmones (pleura) y la pared
torcica. Cuando el lquido se acumula en el espacio pleural, la afeccin se denomina
derrame pleural.
- RESULTADOS NORMALES: La cavidad pleural contiene normalmente menos de 20
mililitros de lquido transparente y amarillento (seroso).
- SIGNIFICADO DE LOS RESULTADOS ANORMALES: Los resultados anormales
pueden indicar las posibles causas de derrame pleural, como: Cncer, Cirrosis,
Insuficiencia cardaca, Infeccin, Desnutricin grave, Traumatismo, Conexiones
anormales entre el espacio pleural y otros rganos (por ejemplo, el esfago).
Si el proveedor sospecha la existencia de una infeccin, se realiza un cultivo del lquido para ver si
hay bacterias. El examen tambin se puede llevar a cabo en busca de hemotrax, una
acumulacin de sangre en la pleura.
c) LQUIDO PERITONEAL LIQUIDO ASCITICO: El anlisis del lquido peritoneal se utiliza
para ayudar a diagnosticar la causa de una inflamacin del peritoneo (peritonitis) y/o de
una acumulacin de lquido peritoneal (ascitis). Existen dos causas principales por las que
se acumula lquido y se utiliza un conjunto de pruebas iniciales (niveles de albmina en
lquido, recuento celular y apariencia del lquido) para diferenciar estos dos tipos de fluidos
que se pueden producir.

Un desequilibrio entre las presiones de los vasos sanguneos (se favorece la salida de
fluido de los vasos) y la cantidad de protenas en la sangre (favorece la retencin de
lquido en los vasos) puede provocar la acumulacin de lquido con caractersticas de
trasudado. La insuficiencia cardaca congestiva y la cirrosis constituyen las principales
causas de trasudados. Si el lquido acaba siendo un trasudado no suelen requerirse
pruebas adicionales.
Un dao, lesin o inflamacin del peritoneo ocasiona la formacin de un exudado. Los
exudados se asocian a diversos procesos y enfermedades, y normalmente, se solicitan
pruebas adicionales que permitan establecer el diagnstico final, como por ejemplo:
- PROCESOS INFECCIOSOS: Ocasionados por virus, bacterias u hongos. Las
infecciones pueden proceder de otros sitios del organismo u originarse en el
peritoneo, por ruptura del apndice o perforacin del intestino o de la pared
abdominal, o por contaminacin durante una intervencin quirrgica.
- PROCESOS INFLAMATORIOS: La peritonitis puede ser consecuencia de la
exposicin a ciertas sustancias qumicas, puede aparecer despus de un
tratamiento con radioterapia o ms raramente, ser consecuencia de una
enfermedad autoinmune.
- Cncer: Sera el caso de mesoteliomas, hematomas (tumores del
hgado), linfomas o cnceres metastticos.
- Pancreatitis: En caso de tratarse de un exudado se pueden solicitar
las siguientes pruebas adicionales:Glucosa, amilasa y marcadores
tumorales en lquido peritoneal.
- EXAMEN MICROSCPICO: en caso de sospecha de infeccin o de cncer. Se
puede examinar directamente el lquido peritoneal o examinarlo una vez se ha
centrifugarlo con una centrfuga especial (citoentrfuga) con la finalidad de
concentrar las clulas. La muestra se coloca en un portaobjetos, se tie y se
evalan los distintos tipos de clulas presentes.
- Tincin de Gram: observacin directa de bacterias u hongos al
microscopio; normalmente no debera de existir ningn
microorganismo
- Cultivo
bacteriolgico
y
antibiograma:
para
detectar
microorganismos y para orientar el tratamiento antimicrobiano. Existen
algunas pruebas que se solicitan menos frecuentemente, por ejemplo
para detectar infecciones por virus, micobacterias (cultivo de
micobacterias) y parsitos.
d) SECRECION DE ABSCESOS SECRECION DE HERIDAS: Aspiracin del lquido
cavitario o pus de las profundidades de heridas pustulares o vesiculares con aguja y
jeringa estriles es el mtodo ms apropiado para obtener material para cultivo. El sitio a
partir del cual se va a obtener el cultivo es el primero en ser descontaminado con jabn
quirrgico y luego alcohol isoproplico al 70%.
V.- DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES VRICAS
La anamnesis del paciente y sus sntomas proporcionan las primeras claves para el diagnstico de
una infeccin vrica, a menudo tras excluir otros tipos de infeccin (p. ej., bacteriana, fngica). Las
pruebas vricas de laboratorio pretenden:
1) confirmar el diagnstico identificando el agente vrico de la infeccin;
2) seleccionar un tratamiento antivrico adecuado;

3) definir el cuadro patolgico;

4) hacer un seguimiento epidemiolgico de la enfermedad, y
5) educar a mdicos y pacientes.
Los mtodos de laboratorio permiten llevar a cabo las siguientes tareas:
1. Descripcin de los efectos citopatolgicos (ECP) inducidos por el virus en las clulas.
2. Visualizacin de partculas vricas al microscopio electrnico.
3. Aislamiento y crecimiento del virus.
4. Deteccin de componentes vricos (p. ej., protenas, enzimas, genomas).
5. Evaluacin de la respuesta inmunitaria del paciente frente al virus (serologa).

5.1. OBTENCIN DE MUESTRAS

La sintomatologa del paciente y sus antecedentes de viajes, la estacin del ao y el diagnstico de
sospecha ayudan a determinar las tcnicas adecuadas para identificar a un agente vrico. La
eleccin de la muestra adecuada para el cultivo vrico acostumbra a ser complicada debido a que
diversos virus son capaces de producir un mismo cuadro clnico. Por ejemplo, la meningitis
asptica puede ser provocada por varios agentes vricos, por lo que puede ser necesario obtener
diversos tipos de muestras para identificar al virus causante de la misma.

Las muestras se deben obtener en una etapa precoz de la fase aguda de la infeccin, antes de que
deje de difundirse el virus. Por ejemplo, los virus respiratorios solamente se pueden diseminar
durante un perodo comprendido entre tres y siete das, y su diseminacin puede interrumpirse con
anterioridad a la desaparicin de los sntomas. El VHS y el virus de la varicela-zster (VVZ) no se
pueden obtener de las lesiones transcurridas ms de cinco das desde la aparicin de la
sintomatologa.
Tan slo es posible aislar un enterovirus del lquido cefalorraqudeo 2-3 das despus de la
aparicin de las manifestaciones del sistema nervioso central. Adems, el anticuerpo producido
como respuesta a la infeccin puede impedir la deteccin del virus. Cuanto menor sea el intervalo
transcurrido entre la obtencin de la muestra y su remisin al laboratorio, mayor ser la posibilidad
de aislar un virus. Los motivos son que muchos virus son lbiles y que las muestras son
susceptibles de contaminacin bacteriana o fngica.

La mejor forma de transportar y almacenar los virus es en hielo y en un medio especial que
contenga antibiticos y protenas, como albmina srica o gelatina. Cuando los virus encapsulados
(p. ej., VHS, VVZ, virus de la gripe) se mantienen a temperatura ambiente o congelados a -20 C
se producen disminuciones significativas en los ttulos de infeccin. Esto no constituye un riesgo
para los virus no encapsulados (p. ej., adenovirus, enterovirus).
CONCEPTOS BASICOS PARA LA TOMA DE MUESTRA:

Elegir el material que mejor represente el proceso infeccioso.

Tomar la muestra en el momento adecuado y en lo posible antes de que el paciente reciba

antivirales.

Obtener la muestra evitando contaminarla con la flora normal del paciente.

Tamao o volumen de la muestra adecuado.

Utilizar un recipiente estril y adecuado para su conservacin y transporte.

Identificar la muestra correctamente.

5.2. CITOLOGA

El examen citolgico de las muestras permite elaborar un diagnstico inicial rpido de las
infecciones vricas que producen unos ECP caractersticos. Entre estos ECP observados
habitualmente en las muestras tisulares o los cultivos celulares figuran modificaciones de la
morfologa celular, lisis celular, formacin de vacuolas, sincitios y cuerpos de inclusin. Los
sincitios son clulas gigantes multinucleadas formadas como consecuencia de la fusin vrica de
clulas individuales. Los paramixovirus y los virus VHS, VVZ y VIH estimulan la formacin de
sincitios.

Los cuerpos de inclusin constituyen cambios histolgicos de las clulas provocados por
componentes vricos o bien alteraciones de las estructuras celulares inducidas por los virus. Por
ejemplo, los cuerpos nucleares de inclusin en ojo de buho presentes en las clulas de tejidos
infectados por citomegalovirus (CMV) o en el sedimento de la orina de pacientes con una infeccin
se identifican con facilidad. Las inclusiones de Cowdry de tipo A en las clulas o en los grandes
sincitios (mltiples clulas fundidas) son un hallazgo caracterstico en las clulas infectadas por
VHS o VVZ. La rabia se puede diagnosticar cuando se encuentran cuerpos de Negri (inclusiones
del virus de la rabia) en los tejidos cerebrales.

5.3. AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL VIRUS

Para cultivar virus se utilizan tipos especficos de clulas de cultivo tisular. Los cultivos de clulas
primarias se obtienen por tratamiento de algn rgano animal especfico con tripsina o
colagenasa. Las clulas obtenidas con este mtodo se cultivan en monocapa (fibroblastos o
clulas epiteliales) o en suspensin (linfocitos) en medios artificiales complementados con suero
bovino u otra fuente de factores de crecimiento. Las clulas primarias se pueden separar con
tripsina, se diluyen y crecen en nuevas monocapas (subcultivos) para convertirse en cultivos
celulares secundarios. Las lneas de clulas diploides son cultivos de un nico tipo de clula con
los que se puede hacer un gran nmero de pases, aunque finito, antes de presentar signos de
senescencia o experimentar cambios significativos en sus caractersticas. Las lneas celulares
tumorales y las lneas celulares inmortalizadas, iniciadas a partir de tumores de pacientes o por
efecto de virus o compuestos qumicos respectivamente, se componen de clulas de un solo tipo
que pueden ser sometidas a pases continuos sin envejecer.

En general, la deteccin de cualquier virus en los tejidos, lquido cefalorraqudeo, sangre o lquido
vesicular del organismo anfitrin se puede considerar un hallazgo altamente significativo. Sin
embargo, la diseminacin vrica tambin puede estar inducida por cualquier trastorno subyacente
(p. ej., otra infeccin, un estado de inmunosupresin, estrs) y, por tanto, puede que no guarde
relacin con los sntomas de la enfermedad. Algunos virus pueden eliminarse de forma intermitente
sin provocar sntomas en la persona afectada, durante perodos que oscilan desde unas semanas
(enterovirus en las heces) hasta muchos meses o aos (VHS o CMV en la bucofaringe y la vagina;
adenovirus en la bucofaringe y en el tubo digestivo). Por otra parte, puede que no se pueda aislar
un virus a partir de una muestra cuando la manipulacin de la misma haya sido incorrecta,
contenga anticuerpos neutralizantes o se haya obtenido con anterioridad al comienzo de la
diseminacin de las partculas vricas.
5.4. DETECCIN DE PROTENAS VRICAS
Durante la multiplicacin vrica se sintetizan enzimas y otras protenas que se pueden detectar a
travs de mtodos bioqumicos, inmunolgicos y de biologa molecular. La deteccin y el anlisis
de las enzimas caractersticas o sus actividades permiten identificar y cuantificar virus especficos.

Los anticuerpos se pueden utilizar como instrumentos sensibles y especficos para detectar,
identificar y cuantificar virus y antgenos vricos en muestras clnicas o cultivos celulares
(inmunohistoqumica).
La deteccin del CMV y otros virus se puede intensificar utilizando una combinacin de cultivo
celular y medios inmunolgicos. Con este mtodo la muestra clnica se centrifugasobre clulas
cultivadas en un cubreobjetos o en el fondo de un shell vial reforzado (tubo de cristal). Este paso
aumenta la eficacia del mtodo y acelera la progresin de la infeccin en las clulas localizadas en
el cubreobjetos. A continuacin, las clulas se analizan mediante tcnicas de inmunofluorescencia
(fluorescencia directa) o EIA de deteccin de antgenos vricos precoces, los cuales se pueden
detectar al cabo de 24 horas en lugar de los 7 a 14 das que precisa la aparicin de ECPs.

5.5. DETECCIN DE MATERIAL GENTICO VRICO

La estructura del genoma y la secuencia gentica son caractersticas diferenciales de la familia,
tipo y cepa de virus.
Los patrones electroforticos del cido ribonucleico (ARN) (virus de la gripe, reovirus) o las
longitudes de los fragmentos de restriccin resultantes de la digestin del ADN del genoma vrico
por una endonucleasa son semejantes a las huellas dactilares genticas de estos virus. Las
sondas de ADN con secuencias complementarias a regiones especficas del genoma vrico se
pueden utilizar como herramientas sensibles y especficas para detectar un virus, igual que los
anticuerpos. Estas sondas son capaces de detectar el virus incluso en ausencia de multiplicacin
vrica. Los genomas vricos tambin se pueden detectar en muestras clnicas aplicando la
transferencia puntual o de Southern.

El ARN vrico separado por electroforesis (transferencia de Northern: hibridacin de sonda

ARN:ADN) y aplicado sobre un filtro de nitrocelulosa se puede detectar de forma similar. La
deteccin de genomas vricos mediante PCR, PCR con transcriptasa inversa (PCR-TI) y otras
pruebas relacionadas con las anteriores se han convertido en el instrumento principal de deteccin
e identificacin de diversos virus en un gran nmero de laboratorios. La cuantificacin de la
cantidad de VIH de un paciente (carga vrica) se lleva a cabo a travs de la PCR en tiempo real.
La concentracin de genoma de este virus en una muestra srica es proporcional a la tasa de
amplificacin por PCR del ADN genmico. Otras tcnicas de amplificacin y deteccin genmicas
son semejantes al mtodo de ELISA. Estos abordajes emplean secuencias inmovilizadas de ADN
que son complementarias para una secuencia genmica vrica relevante y permiten capturar el
genoma vrico.

5.6. SEROLOGA VRICA

Se utilizan estudios serolgicos para identificar los virus difciles de aislar y cultivar en cultivos
celulares, as como para aquellos virus que provocan enfermedades de larga duracin.
Las pruebas serolgicas se pueden utilizar para identificar un virus y su cepa o serotipo con el fin
de determinar si se trata de una enfermedad aguda o crnica y definir si la infeccin es de tipo
primario o bien constituye una reinfeccin. Los datos serolgicos sobre una infeccin vrica los
proporcionan el tipo y el ttulo de anticuerpos y la naturaleza de las dianas antignicas. El curso
crnico de la infeccin tambin puede determinarse a partir de un perfil serolgico. Concretamente,
la presencia de anticuerpos frente a determinados antgenos vricos clave y sus ttulos se pueden
utilizar para identificar la fase de la enfermedad provocada por determinados virus. Este
planteamiento es especialmente til para el diagnstico de las enfermedades vricas de evolucin
lenta (p. ej., hepatitis

B, mononucleosis infecciosa producida por el virus de Epstein- Barr). En general, los primeros
anticuerpos que se detectan son los que van dirigidos contra los antgenos ms accesibles para el
sistema inmunitario (p. ej., expresados en el virin o en las superficies de las clulas infectadas).
Se puede utilizar una batera o panel serolgico para el anlisis de diversos virus en el diagnstico
de determinadas enfermedades. Los factores epidemiolgicos locales, la poca del ao y factores
del anfitrin tales como inmunocompetencia, los antecedentes de viajes y la edad, influyen en el
tipo de anlisis vricos que se deben incluir en un panel. Por ejemplo, el VHS y los virus de la
parotiditis, las encefalitis equinas occidental y oriental, la encefalitis de San Luis y la encefalitis de
California se pueden incluir en un panel de anlisis de enfermedades del sistema nervioso central.

LIMITACIONES DE LOS MTODOS SEROLGICOS:

La presencia de un anticuerpo antivrico indica una infeccin previa, pero no basta para
indicar cundo se produjo la misma.
En los anlisis se producen resultados falsos positivoso falsos negativos que tambin
pueden confundir el diagnstico.
Las reacciones serolgicas cruzadas entre los distintos virus tambin pueden generar
confusin con respecto a la identidad del agente infectante (p. ej., los virus paragripal y del
sarampin expresan antgenos similares).