UNIVERSIDAD EL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA1
VI SEMESTRE
GUA No 2
EXTRACCIN DE ADN BACTERIANO
1. INTRODUCCIN
Los mtodos de laboratorio tradicionales para identificar bacterias incluyen las pruebas de
diferenciacin por tinciones como la tincin de Gram, el crecimiento en cultivos
enriquecidos o diferenciales y el uso de kits de pruebas bioqumicas (Xua et al., 2004). No
obstante, actualmente se dispone de una serie de tcnicas que permiten la caracterizacin e
identificacin de especies utilizando marcadores moleculares como, por ejemplo, RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphisms), FISH (Fluorescente In Situ Hybridization),
RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic ADN-PCR), Microarrays, y la secuenciacin
de genes ribosomales (16S rRNA) entre otros (Baruzzi et al., 2006; Trevors et al., 2004).
Un paso fundamental para continuar con la aplicacin de cualquiera de estas tcnicas es la
obtencin de un ADN bacteriano de buena calidad.
2. OBJETIVOS
2.1 General
Conocer una metodologa bsica para la extraccin de ADN bacteriano.
2.2 Especficos

Extraer ADN bacteriano por el mtodo de CTAB escala mnima.

Adquirir destreza en la manipulacin de equipos y reactivos para la extraccin de

ADN bacteriano

3. MATERIALES Y EQUIPOS

Incubadora
pHmetro
Centrifuga
Vortex

1 Elaborada por: Ivn Daro Otero, Bilogo, C.M.Sc. Adaptado de: Manual de Biologa Molecular
procedimientos bsicos. Universidad de Nario. Actualizada por: Ing. Roco Bonilla Mndez. C.M.Sc

Micropipetas de diversos volmenes

Balanza analtica
Plancha de calentamiento
Estufa de secado o desecador
Cmara de electroforesis
Fuente de poder
Hielo picado o cajitas refrigerantes
Bao serolgico a 37C
Bao serolgico a 65C
Fotodocumentador o transiluminador
Puntas nuevas y estriles de diferentes volmenes
Tubos eppendorf (3 por grupo)
Tubo falcon de 15 mL (1 por grupo)
Medios de cultivo: 1 tubo por grupo con 10 mL de caldo TSB o LB
Reactivos: (SDS 10%, NaCl 5M, CTAB, cloroformo-alcohol isoamlico 24:1,
alcohol isoproplico 99%, etanol 70%, tampn TE 1X, tampn TAE 1X, agarosa)
Enzimas: (Proteinasa K 20 mg/mL, RNAsa 20 mg/mL)
Agua grado molecular
Mscara y gorro de proteccin
Guantes de nitrilo
Frascos de descarte
Libreta de notas
Lpiz marcador
Flotadores para incubacin en bao serolgico
Jabn antibacterial
Papel toalla

4. METODOLOGA
4.1 PREPARACIN DE SOLUCIONES
A. Solucin SDS 10% (Dodecil Sulfato de Sodio)
Disolver 10 g de SDS en un poco de agua destilada estril y aforar hasta 100 mL. Calentar
a 60 C para disolver completamente.
B. Solucin de NaCl 5M
Disolver 292.2 g de NaCl en 1000 mL de agua destilada. Alicuotar en volmenes no
mayores a 100 mL y autoclavar a 121 C por 15 minutos.
C. Solucin CTAB 10% (Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio)
Disolver 10 g de CTAB en NaCl 0.7 M y aforar a 100 mL. Calentar a 65C para solubilizar
completamente y alicuotar en tubos falcon.

D. Tampn TE (Tris-EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 y 1 mM EDTA, pH 8.0)

Adicionar 10 mL de la solucin stock de Tris-HCl 1M, pH 8.0 y 2 mL de solucin de EDTA
0.5 M, pH 8.0 y completar a un volumen de 1000 mL con agua destilada estril.
E. Solucin stock de Tris-HCl 1M, pH 8.0
Pesar 121.1 g de Tris-base, disolver en 800 mL de agua destilada estril. El pH se ajusta a
8.0 con adicin de 42 mL de cido clorhdrico concentrado y el volumen se completa a
1000 mL con agua destilada estril.
F. Solucin stock de EDTA 0.5M, pH 8.0
Disolver 186.1 g de sal sdico de EDTA en 800 mL de agua destilada, homogenizar
utilizando un agitador magntico. El pH se ajusta a 8.0 con NaOH 10 N y el volumen se
completa a 1000 mL con agua destilada. Finalmente, autoclavar a 121oC por 15 minutos.
4.2 PROCEDIMIENTO

Inocular una colonia en 25 ml de caldo Luria Bertani o MRS (bacterias cido

lcticas) e incubar por 18 h a 35C.
Centrifugar a 8000 rpm por 10 minutos a 4C
Descartar el sobrenadante.
Adicionar 2,4 ml de TE 1M, aplicar vortex fuerte y agregar 500 L de lisozima (20
mg /mL), homogeneizar suavemente y dejar 1 hora a 37C en bao termostatado.
Retirar el tubo del bao y adicionar 62,5 l de solucin de SDS 10%, aplicar vortex
y adicionar 6,25 l de proteinasa K 20mg/mL, homogeneizar con cuidado.
Incubar los tubos a 37C por 1 hora.
Retirar los tubos del bao y ponerlos sobre hielo.
Adicionar 300 l de NaCl 5M e homogeneizar con vortex.
Adicionar 188 l de CTAB 10% y aplicar vortex.
Llevar los tubos a incubar por 20 minutos a 65C (la temperatura no debe bajar de
60C).
Esperar enfriar y adicionar igual volumen de cloroformo-alcohol isoamlico (24:1)
(aproximadamente 3 mL) y agitar vigorosamente.
Centrifugar a 8000 rpm a 25C por 20 minutos
Transferir el sobrenadante para otro tubo de centrfuga cuidadosamente
Cuando sea necesario tratar la muestra con 3 l de RNAsa A (10mg/mL) y dejar en
incubacin a 37C por 1 hora.
Tratar la fase acuosa con igual volumen de cloroformo y aplicar bastante vortex.
Centrifugar a 8000 rpm por 15 minutos a 25C
Transferir el sobrenadante para otro tubo de centrifuga cuidadosamente
Precipitar el ADN con 0,6 volmenes de isopropanol frio. En caso de no observar
precipitado o ADN visible se debe guardar el tubo a -20C hasta El da siguiente.
Centrifugar a 8000 rpm por 20 minutos y descartar el sobrenadante
Lavar o pellet con 100 l de etanol 70 %.
Centrifugar a 8000 rpm por 5 minutos; eliminar el sobrenadante y dejar secar

Re-suspender el pellet en 0,25 0,5 mL de TE y conservar en refrigeracin

5. RECUPERACIN, DESACTIVACIN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE

LOS RESIDUOS QUMICOS, MATERIAL ORGNICO E INORGNICO
Depositar los residuos qumicos en el recipiente asignado para esta prctica y los residuos o
materiales sobrantes debern ser entregados al tutor de la prctica previamente rotulados.
6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1.
Baruzzi, S., Matarante, A., Caputo, L., Morea, M. (2006). Molecular and
physiological characterization of natural microbial communities isolated from a traditional
Southern Italian processed. Meat Science. 72. p. 261269.
2.
Burbano-Rosero, E. M. (2009). Frequncia e diversidade de colifagos somticos
isolados de amostras de gua do mar, plncton e bivalves da Baixada Santista, Canal de So
Sebastio e Ubatuba [en lnea]. So Paulo: Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade
de So Paulo. Tesis Doctoral en Microbiologa. [citado 2012-02-29]. Disponible en
Internet: <http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-23102009-153715/>.
3.
Rivera, I., Chun, J., Huq, A., Sack, B., Colwell, R. R. (2003). Method for ADN
extraction and application of multiplex PCR to detect toxigenic V. cholerae O 1 and O139
in aquatic ecosystems. Environ. Microbiol, v. 5, p. 599-603.
4.
Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory
manual. 2ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
5.
Trevors, J., Kirk, J., Beaudette, L., Miranda Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J.,
Lee, H., Jack T. (2004). Review. Methods of studying soil microbial diversity. J. of
Microbiol. Methods. 58.p.p. 169 188.
6.
Xua J., Smytha C., Buchanana, J., Dolana, A., Rooneya, P., Millara, C., Goldsmitha,
C., Elbornb, C., Moorea, J. (2004). Employment of 16S rDNA gene sequencing techniques
to identify culturable environmental eubacteria in a tertiary referral hospital. Public Health
Laboratory. Department of Bacteriology, Belfast City Hospital, Northern Ireland.