Coloracion

ANEXOS
ANEXO 1. COLORACINES
COLORACIN DE GRAM
Tcnica de la coloracin de Gram
1. Aplicar sobre el frotis seco y fijo, cristal violeta, dejar actuar por un
minuto (colorante primario). Lavar con agua.
2. Aplicar lugol, dejar actuar por un minuto (fijador). Lavar con agua.
3. Aplicar
alcohol
acetona,
dejar
actuar
por
treinta
segundos
(decolorante). Lavar con agua.

4. Aplicar fucsina bsica, dejar actuar por un minuto (colorante de
contraste). Lavar con agua.
Control de Calidad de la Coloracin de Gram
Gram positivas: Staphylococcus spp. (cocos gram positivos)

Gram negativas: Escherichia coli. (bacilo gram negativo).
Colorantes para la tincin de Gram

1. Cristal Violeta
Cristal Violeta 2g
Alcohol Metlico 100ml
2. Lugol
Cristal de Yodo 1g
Yoduro de Potasio 2g
Agua destilada 300ml
3. Alcohol Acetona
Acetona 40ml
Alcohol etlico 120ml
4. Fucsina Bsica
Fucsina bsica 1g
Alcohol etlico 95% 20ml.
COLORACIN DE WAYSON
Tcnica de la coloracin de Wayson:
1. Aplicar sobre el frotis seco y fijo el colorante de Wayson, dejar actuar

por 30 segundos.
2. Lavar con agua.
Colorantes para la Tincin de Wayson:
Consta de tres Soluciones:

1. Solucin 1
Rojo congo 2 g
Agua destilada 100 ml
Solucin 1B
Suero 10 ml
Mezclar las dos soluciones, filtrar y mantenerlas en nevera
2. Solucin 2
cido clorhidrico 1,0 ml
3. Solucin 3
Azul de metileno 130 ml
Este se prepara a partir de:
Azul de metileno 0.3 g
Alcohol etlico 30 ml
Hidrxido de potasio 0,01%
Disolver el azul de metileno en alcohol, el hidrxido de potasio en agua y

mezclar las dos soluciones.
AGRADECIMIENTOS
Expresamos un especial agradecimiento a la Dra. Alba Alicia Trespalacios,

por sus enseanzas y su apoyo constante.
A la Dra. Marcela Mercado quien contribuy con el anlisis estadstico de
este estudio.
A la Dependencia de Monitora de la Facultad de Ciencias porque con sus
instalaciones y equipos hicieron posible el desarrollo de este trabajo.
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN IDEAL DE ESPORAS DE

Bacillus stearothermophilus COMO INDICADOR BIOLOGICO PARA EL
CONTROL DE PROCESOS DE ESTERILIZACIN
LILIANA ELISA ROSERO TORRES

ANGELA MARIA ZARAMA ORTIZ
Directora
Dra. Alba Alicia Trespalacios Rangel
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al ttulo de:
BACTERIOLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGA
BOGOT D.C.
2006
NOTA DE ADVERTENCIA
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia.
Artculo 23 de la Resolucin No 13 de Julio de 1946.
DETERMINACION DE LA CONCENTRACIN IDEAL DE ESPORAS DE


APROBADO
____________________________
Dra. Alba Alicia Trespalacios Rangel
____________________________
Dr. DIDIER FRENANDEZ RIOS
Docente PUJ
JURADO
____________________________
Dr. HUGO DIEZ
Docente PUJ
JURADO
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN IDEAL DE ESPORAS DE


Dedicamos este triunfo a Dios, por permitirnos culminar una etapa ms en

nuestras
vidas,
nuestros
padres
quienes
nos
han
apoyado
incondicionalmente, y nos han dado la formacin necesaria para ser

personas ntegras y a nuestros familiares y amigos que nos acompaaron
durante todo este proceso, gracias por estar siempre cuando los
necesitamos.
No es por buena suerte o por pura inspiracin que sobresales,

es por emplear tus dones con gran dedicacin.
El xito es el fruto de la perseverancia,
de la fe en uno mismo,
en Dios y en los otros.
Gonzalo Gallo Gonzalez
RESUMEN
Bacillus stearothermophilus es considerado un microorganismo ideal para

monitorear los procesos de esterilizacin, por carecer de patogenicidad,
pirogenicidad, toxicidad y adems ser resistente a altas temperaturas.
Teniendo
en
cuenta
lo
anterior,
nuestro
proyecto
determin
una
concentracin ideal de esporas de este bacilo como indicador biolgico para

el control de procesos de esterilizacin como calor a vapor, calor seco y
desinfeccin con hipoclorito de sodio a diferentes concentraciones. Para
desarrollarlo se hicieron varios ensayos con tiras de papel filtro impregnadas
con esporas de la bacteria a diferentes concentraciones de acuerdo con el
patrn de Mac Farland. Se encontr que la concentracin apropiada de
esporas para monitorear los procesos de esterilizacin fue de 11. 3 x 108
UFC/ml. Este trabajo es un paso muy importante para proyectos posteriores
que continen con el proceso de validacin de este indicador biolgico en el
control de procesos de esterilizacin y desinfeccin en la Facultad de
ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana.
ABSTRACT
Bacillus stearothermophilus is considered an ideal microorganism to monitor
sterilization process. This is because it lacks pathogenicity, pirogenicity,
toxicity and it is resistant to hight temperatures. According to this premises
our project determined the ideal concentration of spores from this species as
a biologic indicator in several sterilization process such as steam heat, dry
heat and disinfection with sodium hypochlorite. This project was developed
using filter paper strips impregnated with spores at different concentrations
according to the Mac Farland patterns. Using this technique, the appropriate
concentration of spores to monitor sterilization process was found to be 11.3
x 108 UFC/ml this work constitutes an important step towards further projects
seeking to validate this biological indicator in the sterilization and disinfection
processes carried out in the School of Sciences in the Pontificia Universidad
Javeriana.
TABLA DE CONTENIDO
Pg.
1. INTRODUCCIN
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
2.2 Objetivos Especficos
3. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIN
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA
3.1.1Preguntas de investigacin
3.2 IMPACTO ESPERADO
4. MARCO TERICO
4.1 Desinfeccin
4.2 Esterilizacin
4.2.1 Preparacion de los Intrumentos para su esterilizacin
4.2.1.1 Limpieza de los intrumentos
4.2.1.2 Empaquetado del instrumental
4.2.2 Esterilizacin a vapor
4.2.2.1 Requisitos para la esterilizacin a vapor
4.2.2.2 Proceso de esterilizacin a vapor
10
4.2.2.3 Fallas en el proceso de esterilizacin a vapor
11
4.2.2.4 Ventajas del calor hmedo
11
4.2.2.5 Desventajas del calor hmedo
11
4.2.3 Esterilizacin por calor seco
12
4.2.3.1 Requisitos para la esterilizacin por calor seco
12
4.2.3.2 Proceso de esterilizacin por calor seco
13
4.2.3.3 Fallas en el proceso de esterilizacin
13
4.2.3.4 Ventajas del calor seco
14
4.2.3.5 Desventajas del calor seco
14
4.2.4 Controles de los Procesos de Esterilizacin
14
4.2.4.1 Control Mecnico
14
4.2.4.2 Control Qumico
14
4.2.4.3 Control Biolgico
14
4.2.5 Generalidades del Gnero Bacillus
16
4.2.5.1 Caractersticas de las Endosporas
16
4.2.5.2 Germinacin de las Endosporas
18
4.2.5.3 Bacillus stearothermophilus
19
4.2.5.3.1 Requerimientos nutricionales
20
4.2.5.3.2 Colonia y morfologa celular
22
5. MATERIALES Y MTODOS
23
5.1 Recuperacin de la cepa Bacillus stearothermophilus ATCC 7953
23
5.2 Identificacin bioqumica y coloracin de Gram
23
5.3 Obtencin de esporas
23
5.4 Realizacin del Patrn de Mac Farland
24
5.5 Elaboracin del indicador biolgico
24
5.6 Determinacin y verificacin del nmero de esporas presentes en

las tiras de papel filtro y controles de viabilidad
24
5.7 Ensayos con el indicador biolgico en el Autoclave
25
5.8 Ensayos con el indicador biolgico en el Horno
25
5.9 Ensayos con el indicador biolgico para la desinfeccin con

hipoclorito de sodio
26
5.10 Recuento de colonias
26
5.11 Anlisis estadstico
26
6. RESULTADOS
29
6.1 Recuperacin de la cepa de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 29

6.2 Identificacin bioqumica y coloracin de Gram
29
6.3 Obtencin de esporas
30
6.4 Patrn de Mac Farland
31
6.5 Indicador biolgico
32

las tiras de papel filtro y controles de viabilidad
32
6.7 Ensayos con el indicador biolgico en el Autoclave
35
6.8 Ensayos con el indicador biolgico en el Horno
37
6.9 Ensayos con el indicador biolgico con hipoclorito de sodio
39
6.10 Estadstica de los resultados para horno
41
6.11 Estadstica de los resultados para el Autoclave
42
7. DISCUSION DE RESULTADOS
43
8. CONCLUSIONES
46
BIBLIOGRAFA
47
RECOMENDACIONES
50
INDICE DE FIGURAS
Pg.
FIGURA 1. Liberacin de la Endospora.
19
FIGURA 2. Esquema de Metodologa.
28
FIGURA 3 y 4. Aislamiento de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953. 29

FIGURA 5 y 6. Identificacin Bioqumica de Bacillus stearothermophilus
ATCC 7953.
30
FIGURA 7. Obtencin de esporas.
31
FIGURA 8. Indicador Biolgico.
32
FIGURA 9. Controles de Viabilidad.
34
FIGURA 10. Ensayos en el Autoclave.
36
FIGURA 11. Ensayos en el Horno.
38
FIGURA 12. Ensayos con Hipoclorito de sodio.
40
INDICE DE TABLAS
Pg.
TABLA 1. Identificacin Bioqumica de Bacillus stearothermophilus.
21
TABLA 2. Porcentaje de esporas.
30
TABLA 3. Patrn de Mac Farland y las absorbancias obtenidas.
31
TABLA 4. Nmero de esporas presentes en las tiras de papel

filtro y Controles de Viabilidad.
33
TABLA 5. Ensayos en el Autoclave con ciclo para material limpio.
35
TABLA 6. Ensayos en el Autoclave con ciclo para material sucio.
36
TABLA 7. Ensayos en el Horno.
37
TABLA 8. Ensayos con Hipoclorito de sodio.
39
TABLA 9. Estadstica para ensayos en el Horno.
41
TABLA 10. Estadstica para los ensayos realizados en el Autoclave.
42
1. INTRODUCCIN
La funcin clave de los diferentes mtodos de esterilizacin como el calor
seco, calor a vapor y la desinfeccin por productos qumicos con hipoclorito
de sodio, es la destruccin o inactivacin de microorganismos en todo
material y es fundamental que esta tarea se realice correctamente y sea
evaluada por medio de controles mecnicos, qumicos o biolgicos.
Con el fin de disminuir los riesgos de contaminacin a nivel de los
laboratorios en general, dar una mayor confiabilidad a los procesos de
esterilizacin y mejorar la calidad del trabajo que se realiza dentro de la
facultad
de
ciencias,
nuestro
proyecto
pretende
determinar
una
concentracin ideal de esporas de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953

como indicador biolgico,
para el control de los diferentes mtodos de
esterilizacin y desinfeccin mencionados anteriormente.

Para desarrollarlo, se envejeci el cultivo del microorganismo hasta obtener
una buena produccin de esporas, luego se impregnaron en papel filtro a
diferentes concentraciones de acuerdo al patrn de Mac Farland y se
sometieron a los procesos de esterilizacin y desinfeccin. A los resultados
obtenidos se les aplic el anlisis estadstico con el fin de dar respuesta a
los objetivos planteados.
De esta manera consideramos que este trabajo ser un aporte para mejorar
el seguimiento de estos procesos llevados a cabo en la dependencia de
monitora de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General

Determinar
la
concentracin
ideal
de
esporas
de
Bacillus
stearothermophilus como indicador biolgico para el control de procesos de

esterilizacin.
2.2 Objetivo Especficos

Determinar el tiempo requerido para la produccin del 80% de esporas de
Bacillus stearothermophilus.
Estandarizar
la
concentracin
apropiada
de
esoras
de
Bacillus
stearothermophilus para evaluar los procesos de esterilizacin a vapor, calor

seco y desinfeccin con hipoclorito de sodio.
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA
Debido a que es muy frecuente la contaminacin de medios de cultivo y
reas de trabajo con microorganismos ambientales, el trabajo en el
laboratorio de microbiologa debe controlar las diferentes fuentes de
contaminacin para evitar errores en los resultados de los diferentes anlisis
que se realizan en l, por ello es necesario asegurar la completa eliminacin
de todas las formas de vida microbiana mediante un buen control de calidad
llevado a cabo en los procesos de esterilizacin. Para este fin evaluaremos
los procesos de esterilizacin por calor seco, calor a vapor y la desinfeccin
con hipoclorito de sodio a diferentes concentraciones, llevados a cabo en la
dependencia de monitora de la facultad de ciencias de la Pontificia
Universidad Javeriana
y estableceremos una concentracin ideal de
esporas de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 para lograr monitorear la

ausencia total del crecimiento de este microorganismo (utilizado como
indicador biolgico en este proyecto) despus de someterlo a los procesos
de esterilizacin y desinfeccin anteriormente mencionados.
De esta
manera podemos aportar en el cumplimiento de normas aspticas que son

exigidas en laboratorios clnicos y microbiolgicos.
3.1.1 Preguntas de investigacin
Las esporas de Bacillus stearothermophilus son buenas indicadoras de
procesos de esterilizacin y desinfeccin?
Las concentraciones de esporas utilizadas en el proyecto son las
necesarias para determinar una concentracin adecuada que evale los
mtodos de esterilizacin y desinfeccin?
3.2 IMPACTO ESPERADO

Gracias al desarrollo de este proyecto, se logr estandarizar la concentracin
ptima de esporas de Bacillus stearothermophilus que podrn ser utilizadas
como control de los procesos de esterilizacin por calor seco, calor a vapor y
desinfeccin con hipoclorito de sodio en la dependencia de monitora de la
Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana.
El indicador biolgico desarrollado permitir a esta dependencia controlar de
manera ms efectiva los procesos de esterilizacin, ya que en la actualidad
estos son controlados por medio de cintas reveladoras de esterilidad. Dado
los altos costos de los indicadores biolgicos comerciales, el indicador
desarrollado permitir evaluar el sistema de esterilizacin pero a un bajo
costo.
4. MARCO TEORICO
En la historia de las prcticas sociales vinculadas a la salud, siempre se ha
tenido conciencia de un mundo microbiano causante de procesos biolgicos
y de enfermedades. A modo de ejemplo, recordemos que ya en la
antigedad, los romanos tomaban la precaucin de hervir el agua cuando
salan en largas campaas para prevenir la contaminacin de la misma (1).
Sin embargo, la comprobacin de un mundo no perceptible a simple vista se
di a partir de la invencin del microscopio. As fue como mediante diferentes
observaciones de los microorganismos se avanz en la percepcin de un
mundo microscpico. Sucesivos avances cientficos permitieron constatar
que algunos microorganismos son beneficiosos y vitales para nuestra vida y
otros en cambio, transmiten infecciones y enfermedades (1).
Durante el ltimo siglo, en los mbitos de la Salud Pblica, la industria
farmacutica y la fabricacin de dispositivos mdicos ha intensificado la
preocupacin por controlar y/o eliminar microorganismos dentro de los
diferentes procesos y sobre todo en su produccin final. Se ha pretendido
con sta prctica cuidar a las personas que realizan stos procesos, a los
usuarios en general, en especial a los pacientes. Los primeros pasos de la
esterilizacin han estado dados por la necesidad que emergi en relacin a
la problemtica de higiene, desinfeccin y asepsia (1).
4.1 Desinfeccin
Las actividades de desinfeccin son consideradas como los mecanismos
principales para la destruccin de microorganismos mediante agentes de
naturaleza qumica (desinfectantes), con el fin de disminuir el nmero de
formas vegetativas a niveles mnimos (18).
La desinfeccin de instrumentos y superficies de los puestos de trabajo,
bsicamente en el laboratorio donde se manipulan muestras biolgicas,
constituye la forma ms adecuada de evitar el posible contagio. Esto se
consigue con una correcta utilizacin de desinfectantes (15).
Para el empleo de stos productos es necesario conocer los riesgos ligados

a su utilizacin y los consejos de prudencia que deben estar indicados en la
etiqueta y en la ficha de datos de seguridad. En general, el producto debe
poder aplicarse de tal manera que no presente ningn riesgo de toxicidad
aguda o crnica para los animales y el hombre. Debe tenerse en cuenta que,
por su propia funcin, destruccin de microorganismos, la mayora de
desinfectantes tienen unas caractersticas de toxicidad importantes como
irritacin de las mucosas y efecto carcinognico (15).
La primera accin preventiva en cuanto a su uso es comprobar que estn
adecuadamente etiquetados y preparados tanto si se han adquirido
comercialmente, como si se han preparado en el propio laboratorio. Al
adquirir productos qumicos debe exigirse siempre con la primera entrega la
ficha datos de seguridad correspondiente (15).
El cloro es el desinfectante universal, activo sobre todas las bacterias,
incluyendo esporas, y adems es efectivo en un amplio rango de
temperaturas (18).
La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al cido hipocloroso
(HClO) y al cloro gaseoso (Cl2) que se forman cuando el hipoclorito es diluido
en agua. La actividad germicida del ion hipocloroso es muy reducida debido
a que por su carga no puede penetrar fcilmente en la clula a travs de la
membrana citoplasmtica. En cambio, el cido hipocloroso es neutro y
penetra fcilmente en la clula, mientras que el Cl2 ingresa como gas (18).
Dentro de los desinfectantes liberadores de cloro, los ms usados son los
hipocloritos en forma lquida o slida, los cuales despliegan buena actividad
contra bacterias, virus, hongos y en especial contra el bacilo tuberculoso.
Para su correcta utilizacin es necesario usar previamente la validacin de lo
siguiente: calidad de los productos, concentracin y dilucin adecuada, la
carga microbiana del sitio que se va a desinfectar, el tiempo de exposicin
del desinfectante, la concentracin de la materia orgnica y factores que
alteren directamente la actividad (ejemplo: luz, calor).
A concentraciones
altas, temperaturas adecuadas, y tiempo prolongado pueden tener accin

esporicida (7).
Existe controversia entre los autores sobre la mejor concentracin del
hipoclorito de sodio. A mayor dilucin, menor poder desinfectante pero
tambin menor irritacin por lo que se ha recomendado diluir al 2.5%, o al
1% (18).
4.2 Esterilizacin
Se define como la completa eliminacin y destruccin de todas las formas de
vida microbiana que contiene un objeto o sustancia. La FDA (Food & Drug
Administration) considera que un producto es estril cuando la probabilidad
de supervivencia de los microorganismos en l es menor que una en un
milln (1 en 1 x 106) (11).
El material puede esterilizarse a travs de varios procesos segn su
estructura: metal, silicona, plstico, algodn, gasas, compresas de tela,
gomas, sondas, cables, vidrios, lentes, etc. Los objetos a esterilizar deben
ser sometidos previamente a una descontaminacin y limpieza profunda,
para reducir los residuos de material orgnico y la carga bacteriana (4).
4.2.1 Preparacin de los instrumentos para su esterilizacin
4.2.1.1 Limpieza de los instrumentos
Todo instrumento u otro objeto que vaya a ser esterilizado o desinfectado se
debe preparar mediante una cuidadosa limpieza, irrigacin y secado antes de
ser sometido al proceso qumico o trmico que destruir los microorganismos
que aloja. La presencia de sangre, saliva, pelculas de jabn, y otros detritos
orgnicos no solo hacen aumentar el nmero de microorganismos que deben
ser eliminados, sino que tambin le protege del ambiente destructivo. Las
condiciones
de
esterilizacin
y desinfeccin
recomendadas (tiempo,
concentracin y temperatura) dependen del contacto estrecho del agente

qumico o trmico con el microorganismo. Los instrumentos deben lavarse lo
antes posible despus de utilizados para acelerar la eliminacin de sangre y

detritos antes que se sequen. Si no es posible los instrumentos se deben
introducir en una solucin desinfectante o detergente fra. Es preferible
utilizar limpieza con ultrasonido, porque el limpiador ultrasnico puede
desalojar material contaminado de surcos, juntas y otras superficies que no
se alcanzan fcilmente con un cepillo (4).
Cuando no se dispone de un limpiador ultrasnico, es necesario cepillar los
instrumentos. Se requiere un detergente (no jabn) para desalojar sangre y
detritos de las superficies de instrumentos y para reducir la tensin de
superficie. Todas las partes removibles se deben desmontar y los
instrumentos tipo bisagra como tijeras se abren para asegurar que todo el
detergente residual sea eliminado completamente. Los elementos se secan
con una toalla antes de esterilizarse por cualquier mtodo. El exceso de
humedad puede diluir el efecto de los agentes qumicos (23).
4.2.1.2 Empaquetado del instrumental
Se debe empacar o envolver en un material que sea compatible con el
mtodo de esterilizacin que se emplee. Las bolsas de esterilizacin se
fabrican de manera que una vez sellada mantienen la esterilidad de su
contenido. La rotura de las bolsas de esterilizacin se puede prevenir
envolviendo los instrumentos punzantes en toalla de papel. Los instrumentos
que se pueden daar con el contacto con otros instrumentos, se deben
envolver separadamente para que queden protegidos. El tipo ms habitual
de bolsa de esterilizacin es de papel y desechable.
Los instrumentos que se utilicen con poca frecuencia se deben empaquetar
individualmente, cada bolsa se debe etiquetar de forma que los instrumentos
se puedan identificar fcilmente (23).
Cuando los instrumentos y material empaquetado se insertan en la bolsa
etiquetada, el extremo abierto de la bolsa
debe cerrarse con un doble
pliegue y sellarse con un fragmento de cinta de esterilizacin especialmente
diseada. Las bolsas de plstico tambin se pueden sellar con calor. Los
paquetes de plstico y de papel sellados con cinta se deben esterilizar cada
4 meses. Los paquetes de plstico de sellado trmico pueden durar hasta
seis meses antes de precisar reesterilizacin (23).
4.2.2 Esterilizacin a vapor
El vapor es el mtodo de esterilizacin ms antiguo, seguro y con mejor
costo-efectividad. Cuando el vapor es colocado bajo presin y se eleva la
temperatura, el vapor hmedo produce cambios en las protenas de las
clulas, hacindolas inofensivas en un perodo determinado de tiempo. La
relacin entre temperatura, presin y tiempo de exposicin es el factor crtico
en la destruccin de microorganismos (13).
4.2.2.1 Requisitos para la esterilizacin a vapor
Todas las reas de esterilizacin necesitan un procedimiento mediante el
cual se garantice y mejore la eficacia del proceso de esterilizacin. Este
proceso no slo depende del buen funcionamiento del esterilizador sino que
tambin es importante:
La limpieza adecuada de los productos.
La cantidad y calidad del agente esterilizante.
La humedad apropiada en el esterilizador y en el rea de proceso.
El tipo y mtodo de empaque.
La carga del esterilizador.
Los parmetros apropiados para la carga procesada.
Solo se esterilizar el material que sea resistente al calor.

Los equipos de esterilizacin deben contar con:
Manual de instrucciones.
Calificacin de las instalaciones
Calificacin de la operacin
Calificacin del proceso y validacin
Mantenimiento preventivo, programas, calibracin, registradores,

(termmetros de reloj).
Equipos para efectuar las calibraciones.
Historia de vida en cada equipo.
Calificacin del personal que realiza el mantenimiento, reparacin y

calibraciones.
Ficha de registro (Contenido de la carga, temperatura durante la fase

de esterilizacin, identificacin de la persona que la esta operando,
resultado del control biolgico, registro del tiempo del autoclave).
El escape de aire es absolutamente esencial para permitir el llenado del

vapor, por lo tanto el proceso de esterilizacin depende de la presin del
vapor, la temperatura y el tiempo.
Los empaques deben impedir el ingreso de microorganismos al interior y ser
permisible al mtodo, quedando completamente sellado para evitar
contaminacin del artculo una vez terminado el proceso. Adems debe
soportar la traccin y manipulacin habitual para el material sin sufrir
deterioros (6).
4.2.2.2 Proceso de esterilizacin a vapor
Para comenzar con el proceso de esterilizacin se deben colocar los
paquetes marcados con cinta adhesiva (indicador qumico), con abertura
hacia arriba y ordenarlos de modo que haya una mnima resistencia a la
circulacin de vapor. No colocar en el esterilizador una cantidad de objetos
mayor a la adecuada para evitar que los objetos toquen los costados o el
piso de la cmara. Luego se cierra la puerta, el aire que es evacuado aade
vapor caliente a alta presin, este penetra en el material y destruye los
microorganismos (19).
Para los autoclaves a vapor se manejan los siguientes parmetros tanto para
objetos de laboratorio como para medios bacterianos y fngicos: la
temperatura debe estar entre 120 y 140C, se usa un tiempo de
precalentamiento de 7 minutos, la fase de esterilizacin oscila entre 10 a 15
10
minutos y se puede tener un tiempo de secado de 7 a 10 minutos, la presin

debe estar entre 20 y 23 libras (8).
Al terminarse el proceso de esterilizacin se permite la entrada de aire a la
cmara, en este momento los artculos deben estar secos (8).
Mecnicas:
Inadecuada remocin del aire de la cmara o escapes de aire dentro

de la cmara.
Mala exposicin a tiempo y temperatura.
Pobre calidad del vapor afectando el tiempo requerido para esterilizar.
El sobrecalentamiento produce vapor demasiado seco por presin del

vapor, por tanto baja la temperatura de la cmara (10).
Humanas:
Preparar paquetes muy grandes o muy apretados.
Envolver el material impermeable al vapor.
Sobrecarga o incorrecta carga del esterilizador.
Escogencia inapropiada del ciclo del material a esterilizar.
Falla en la limpieza de los artculos (10).
4.2.2.4 Ventajas del calor hmedo:
Rpido calentamiento y penetracin
Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo
No deja residuos txicos
Hay un bajo deterioro del material expuesto
Bajo costo (9).
4.2.2.5 Desventajas del calor hmedo:
No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos (9).
11
4.2.3 Esterilizacin por calor seco

La
esterilizacin
por
calor
seco
produce
la
destruccin
de
los
microorganismos por oxidacin de sus componentes celulares. Es un

proceso menos eficiente que la esterilizacin por calor hmedo porque los
microorganismos mueren con mayor rapidez cuando se encuentran en
presencia de agua, por esta razn para lograr la esterilizacin empleando el
calor seco se debe aplicar temperaturas ms altas durante mayor tiempo.
Como el calor que se usa para destruir los microorganismos es seco, no hay
peligro de corrosin de los instrumentos. Los artculos de hule o los objetos
de tela o papel pueden ser destruidos a las temperaturas extremas del
mtodo de calor seco (3).
4.2.3.1 Requisitos para esterilizacin por calor seco
Antes del proceso de esterilizacin se deben tener en cuenta los siguientes
parmetros:
La limpieza adecuada de los productos.
La cantidad y calidad del agente esterilizante.
La carga del esterilizador.
No se requiere cubierta de aceite para los instrumentos cuando se usa

el mtodo de calor seco.
Solo se debe esterilizar el material que sea resistente a altas temperaturas

como material de vidrio, instrumentos quirrgicos, agujas de metal,
materiales no miscibles con el agua.
Los equipos de esterilizacin deben tener:
Manual de instrucciones.
Calificacin de las instalaciones
Calificacin de la operacin
Calificacin del proceso y validacin
Mantenimiento preventivo, programas, calibracin, registradores como

cronmetros y termostatos integrados para controlar la temperatura.
12
Calificacin del personal que realiza el mantenimiento, reparacin y

calibraciones.
Ficha de registro (Contenido de la carga, duracin y temperatura,

identificacin de la persona que la esta operando, resultado del control
biolgico) (5).
4.2.3.2 Proceso de esterilizacin por calor seco

El horno debe encenderse 30 minutos antes de comenzar el proceso de
esterilizacin, el material debe colocarse correctamente dentro del horno, ya
que la forma como este se ubica puede interferir con la distribucin del calor,
e influir directamente en la eficacia del proceso de esterilizacin; el material
debe estar marcado con cinta adhesiva (indicador qumico). Se registra la
temperatura del horno (5).
Posteriormente se cierra el horno y se comienza a contar el tiempo del
proceso de esterilizacin. La temperatura vara entre 120 y 180C,
requirindose distintos tiempos de exposicin. A 140C se necesitan por lo
menos 5 horas de exposicin, mientras que a 160C se requieren al menos 2
horas de exposicin (21).
Mecnicas:
Escapes de aire dentro del horno.
Inadecuada exposicin a tiempo y temperatura.
Pobre calidad del calor afectando el tiempo requerido para esterilizar

(10).
Humanas:
Preparar paquetes muy grandes o muy apretados.
Sobrecarga o incorrecta carga del esterilizador.
Falla en la limpieza de los artculos (10).
13
4.2.3.4 Ventajas del calor seco:
No es corrosivo para metales e instrumentos.
Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de

sustancias viscosas no voltiles (18).
4.2.3.5 Desventajas del calor seco:
Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo,

debido a la baja penetracin del calor (18).
4.2.4 Controles de los procesos de esterilizacin

Los controles se usan para comprobar la eficiencia de los procesos de
esterilizacin, estos pueden ser mecnicos, qumicos o biolgicos (10).
4.2.4.1 Control Mecnico
Se registran en el esterilizador las condiciones del ciclo como tiempo, presin
y temperatura de los manmetros (10).
4.2.4.2 Control Qumico
Son sustancias qumicas que cambian de color al cumplir condiciones de
temperatura, tiempo de exposicin en el interior de la cmara.
Son de dos clases: Internos y externos. Los internos monitorizan si las
condiciones fsicas de la esterilizacin se logran en el interior del paquete.
Los externos se hacen por cinta testigo y al terminar el proceso debe estar
coloreada en forma homognea (10).
4.2.4.3 Control Biolgico
Son microorganismos no patgenos en forma de esporas bacterianas vivas
que ofrecen gran resistencia
a los agentes esterilizantes y garantizan
eficacia y especificidad al proceso de esterilizacin (10).

El uso de los controles biolgicos para monitorear procesos de esterilizacin
es recomendado por la Association for the Advancement of Medical
14
Instrumentation (AAMI). La frecuencia del uso va de acuerdo con el empleo

del esterilizador, los estndares de la AAMI indican que los esterilizadores
deben evaluarse por lo menos semanalmente (10).
Existen dos presentaciones de los controles biolgicos: El primero es el de la
tira de papel filtro impregnadas con esporas como las del Bacillus
stearothermophilus, el segundo es una ampolla que contiene caldo nutritivo
con esporas de esta bacteria (10).
El control biolgico se coloca en el rea del esterilizador menos favorable
para la esterilizacin, esta rea es llamada punto fro y corresponde a la
parte anterior e inferior del equipo. Debe marcarse con la fecha y el lugar
dentro de la cmara. Despus de exponerse el control biolgico al ciclo de
esterilizacin, se saca del esterilizador y se incuba de acuerdo a las
instrucciones del fabricante (10).
Si el control biolgico no crece despus de la incubacin, el proceso de
esterilizacin ha sido satisfactorio. Si por el contrario crece se deben tomar
las siguientes acciones:
Recuperar todo el material que ha sido procesado, ya que se

considera como no estril.
Recopilar un registro escrito de las actividades llevadas a cabo. Este

informe debe incluir el tiempo y la fecha del ciclo de esterilizacin
fallido, una descripcin del esterilizador, el nmero de carga, un
resultado del indicador qumico y si el esterilizador tiene un monitor
mecnico supervisar tambin los dispositivos de informacin.
Si se determina que el esterilizador funcion mal debe repararse y

debe obtenerse un resultado negativo de una prueba biolgica antes
de que se use de nuevo (10).
15
4.2.5 Generalidades del Gnero Bacillus

El genero Bacillus es una coleccin diversa de bacilos aerobios y anaerobios
facultativos, gram positivos, formadores de esporas. El gnero incluye
bacterias termoflicas, sicroflicas, acidoflicas, alcaloflicas, y bacterias
haloflicas que utilizan un amplio rango de suministro de carbono para
crecimiento heterotrfico o autotrfico. Anlisis de secuencias genticas
rRNA 16S han revelado una alta heterogeneidad filogentico en el gnero
Bacillus (16).
La mayor parte de estos bacilos son quimihetertrofos verstiles capaces de
utilizar una amplia gama de compuestos orgnicos simples (azcares,
aminocidos, cidos orgnicos) como substratos respiratorios, y en algunos
casos capaces tambin de fermentar carbohidratos. La mayora son
mesfilos, con temperaturas ptimas en el margen de 30-45C; sin embargo,
el gnero contiene tambin un cierto nmero de representantes termfilos
que crecen a temperaturas de hasta 65C (14).
Un grupo fisiolgico especial dentro de los productores de esporas aerbicos
es el de los termfilos extremos, que son capaces de crecer a temperaturas
tan elevadas, como 65C y que no logran generalmente crecer a
temperaturas por debajo de los 45C (20).
Este grupo comparte la capacidad de formar un tipo peculiar de clula en
reposo denominada endospora. Las endosporas pueden reconocerse por su
lugar intracelular de formacin, su extremada refringencia y su resistencia a
la tincin por colorantes bsicos de anilina que tien fcilmente las clulas
vegetativas (20).
4.2.5.1 Caractersticas de las endosporas
Son formas de resistencia que desarrollan ciertos bacilos y cocos gram
positivos. Entre los bacilos formadores de endosporas se encuentran las
especies
de
Bacillus
(aerobios),
Sporolactobacillus
(microaerflos),
Clostridium (anaerobios), Desulfotomaculum (anaerbico reductor de sulfato),

Sporohalobacter (anaerbico halfilo) y Anaerobacter (anaerbico fijador de
16
nitrgeno), mientras que los cocos son de la especie Sporosarcina

(aerbicos) (21).
Las esporas bacterianas comienzan a formarse durante la fase estacionaria
de crecimiento cuando se han agotado uno o ms nutrientes del medio,
pueden sobrevivir en ambientes adversos durante meses o aos y una vez
que las condiciones de crecimiento sean apropiadas pueden germinar y
desarrollarse para formar clulas vegetativas (21).
Las endosporas se caracterizan por un bajo contenido de agua, no tienen un
metabolismo detectable y carecen de compuestos de alta energa como ATP,
y otros nuclesidos trifosfatos (20).
Adems son altamente resistentes a la desecacin, congelacin, radiacin y
a la accin de ciertas sustancias qumicas (21).
Normalmente, el DNA de una clula procariote sufre lesiones espontneas,
debido a la depurinizacin, desaminacin, alquilacin y oxidacin de los
nucletidos o al efecto de la radiacin UV. Sin embargo, en las clulas
vegetativas estos daos son rpidamente reparados por efectivos sistemas
enzimticos (20).
En cambio las esporas bacterianas no presentan actividad enzimtica pero
han desarrollado distintas estrategias que evitan la acumulacin de daos
potencialmente letales en su DNA durante el estado de latencia tales como:
Bajo contenido de agua que retarda o altera las reacciones

qumicas que afectan al DNA. Este menor contenido de agua
disminuye la tasa de depurinizacin, la fotoqumica de DNA frente
al UV respecto a las de una clula vegetativa. La radiacin UV no
genera dmeros de timina en el DNA de una espora sino un
compuesto similar a una iminil-timina.
El DNA de la espora se encuentra unido a unas protenas

denominadas /- SASP (small acid soluble proteins) que
disminuyen el dao trmico del DNA evitando la depurinizacin y
cambian la reactividad fotoqumica del DNA frente al UV formando
17
los SP. Estas protenas se hallan altamente conservadas en los

gneros Bacillus y Clostridium
y son sintetizadas durante la
esporulacin y degradadas durante la germinacin.
El DNA alterado durante la latencia es reparado en los primeros

momentos de la germinacin.
Las esporas presentan una elevada concentracin de cido

dipicolnico que permite acumular grandes cantidades de calcio
inico. El cido dipicolnico es una sustancia caracterstica de la
espora pero no se encuentra en la clula vegetativa (20).
4.2.5.2 Germinacin de las Endosporas

La germinacin de una espora que lleva a la formacin de una clula
vegetativa consiste en 3 fases secuenciales:
Inicia con un proceso reversible que condiciona a la espora para germinar en
un ambiente adecuado la cual involucra la desnaturalizacin reversible de
algunas protenas. Contina con la
germinacin, que es un proceso
irreversible en el que participan enzimas que contiene la espora, en esta

etapa hay actividad metablica, y se pierden las caractersticas de la espora
como refractariedad y resistencia a agentes fsicos y qumicos. Por ltimo se
presenta la fase de crecimiento en la cual hay una alta actividad biosinttica
con sntesis de protenas, RNA mensajero y componentes estructurales
como en una clula vegetativa. Se desarrolla la pared celular y se forma la
clula vegetativa (2). Ver Figura 1.
18
FIGURA 1. LIBERACIN DE LA ENDOSPORA
4.2.5.3 Bacillus stearothermophilus

Es considerado un microorganismo ideal para monitorear los procesos de
esterilizacin, porque carece de patogenicidad, pirogenicidad, toxicidad y
adems es resistente a altas temperaturas (24).
De acuerdo a la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM), se
establece
que
los
indicadores
biolgicos
deben
cumplir
con
las
caractersticas morfolgicas, de cultivo y bioqumicas de la cepa Bacillus

stearothermophilus ATCC 7953 para los ciclos de esterilizacin mediante
vapor a presin (17).
19
4.2.5.3.1 Requerimientos Nutricionales

Es un microorganismo termfilo que se desarrolla a 65C, se ha encontrado
en la naturaleza en lugares donde existen formaciones de agua y
yacimientos petroleros como Russia, Kazakhastan y China. Se puede
desarrollar en medios sintticos y no requiere factores de crecimiento,
vitaminas, NaCl o KCl. Se ha observado buen crecimiento sobre agar de
papa, agar nutritivo y agar Infusin Cerebro Corazon (BHI). Es capaz de
utilizar aerbicamente una amplia variedad de azucares tales como glucosa,
sacarosa, maltosa y lactosa (11-89%), pero no producen cido a partir de
xilosa y manitol Reducen nitratos a nitritos (16).
Frente a la catalasa presenta una reaccin positiva y posee la capacidad de
hidrolizar la esculina y el almidn. En el medio Acido Sulfdrico, Indol
Motilidad (SIM) posee motilidad positiva, no produce indol ni cido sulfrico
(H2S). No deamina la fenilalanina. En el medio Triple Sugar Iron (TSI) utiliza
los tres azcares con formacin de cido, no produce gas ni cido sulfrico
(H2S). No produce hidroxiacetona. En el agar Urea de Christensen se puede
presentar una reaccin positiva en un 11 a 89%. La reaccin lecitinasa en
yema de huevo y Voges-Proskauer dan negativas (12,16). Ver tabla 1.
20
TABLA
1.
IDENTIFICACIN
BIOQUMICA
DE
Bacillus
stearothermophilus
IDENTIFICACION BIOQUIMICA
CARACTERISTICAS
B. stearothermophilus
Ancho de la clula (m)
0,6 - 1
Longitud (m)
2 - 3,5
Morfologa Esporas *
O, S
Localizacin Esporas *
ST, T
Coloracin Gram
Positiva
Catalasa
Positiva
Crecimiento:
Rango de Ph
6,0 - 8,0
Temperatura
65C
Produccin de cido a partir de:
Glucosa
Positiva
Xilosa
Negativa
Manitol
Negativa
Lactosa
V*
Sacarosa
Positiva
Maltosa
Positiva
Hidrlisis de:
Esculina
Positiva
Almidn
Positiva
Medio TSI:
Utilizacin de azucares
A/A
H2S
Negativo
Gas
Negativo
Medio SIM:
Motilidad
Positiva
Indol
Negativo
H2S
Negativo
Urea de Christensen
V*
Reduccin de Nitratos
Positivo
Fenilalanina
Negativo
Lecitinasa
Negativo
Voges-Proskauer
Negativo
Rojo de Metilo
Positivo
Morfologa Esporas *: O, ovales o cilndricas; S, las esporas deforman el soma

bacteriano.
Localizacin Esporas *: ST, subterminal; T, Terminal.
V*: 11 89% positivos.
21
4.2.5.3.2. Colonia y morfologa celular

Sobre agar nutritivo, se forman colonias redondas, mucosas, pequeas,
incoloras, con un dimetro de aproximadamente 1mm a 5 mm. Al observar
en microscopia electrnica muestra una clula gram positiva con envoltura
caracterstica. La membrana citoplasmtica es rodeada por una capa
delgada de peptidoglicano. Posee esporas ovales o cilndricas subterminales
o terminales que deforman el soma bacteriano. La divisin celular es
frecuentemente asimtrica (12, 16).
22
5. MATERIALES Y MTODOS
Para
determinar
la
concentracin
ideal
de
esporas
de
Bacillus
stearothermophilus que deben utilizarse como indicador biolgico para el

control de procesos de esterilizacin, se sigui la siguiente metodologa:
5.1 Recuperacin de la cepa Bacillus stearothermophilus ATCC 7953
Se obtuvo una cepa certificada de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953
REMEL INC . De acuerdo a las recomendaciones del fabricante, se
recuper en un tubo con 3 mililitros de Caldo Brain Hearth Infusin (BHI)
Merck 10493 y se incub por 48 horas a una temperatura de 65C.
5.2 Identificacin bioqumica y Coloracin de Gram
Se realiz un repique de la cepa recuperada en una caja de petri con Agar
BHI, y se montaron las siguientes pruebas bioqumicas para su posterior
identificacin: Catalasa, Citrato, TSI, LIA, SIM, Fenilalanina, Hidrlisis de la
esculina, Urea de Christensen, Voges-Proskauer, Rojo de Metilo y Azucares
como Glucosa, Lactosa, Sacarosa y Maltosa. Se realiz tambin la
coloracin de Gram.
5.3 Obtencin de Esporas
Luego de su identificacin, se realizaron resiembras a 15 cajas de petri con
Agar BHI y se incubaron a 65C para el envejecimiento del cultivo y la
obtencin de esporas. Se realiz diariamente un conteo de esporas por
medio de la coloracin de Wayson (Ver anexo 1) las cuales se observaron
como cuerpos esfricos libres antes encontrados dentro del bacilo. El conteo
se realiz hasta obtener un porcentaje mayor al 80%. De acuerdo a Beaman
et al (1988).
23
5.4 Realizacin del Patrn de Mac Farland

Una vez obtenidas las esporas se prepararon 11 patrones de Mac Farland
desde 0.5 a 10, utilizando para la lectura el espectrofotmetro Spectronic
21D a una longitud de onda de 540 nanmetros. Para esto se tomaron
colonias de cada una de las 15 cajas, se suspendieron en tubos con agua
destilada estril y se leyeron las absorbancias hasta verificar que cada uno
de los patrones se encontraran dentro del rango establecido para cada
patrn y de esta forma se determin la concentracin de clulas por mililitro.
5.5 Elaboracin del Indicador Biolgico
Se cortaron 340 tiras de papel filtro de 0.5 centmetros de ancho por 3
centmetros de largo y se esterilizaron. Luego se impregnaron
con 50
microlitros (volumen necesario para impregnar toda la tira) de la suspensin

de esporas de cada patrn y se llevaron a incubar a 37C durante tres horas
aproximadamente hasta que el papel estuviera seco y las esporas quedaran
fijadas a este.
las tiras de papel filtro y Controles de Viabilidad
Los controles de viabilidad se prepararon resuspendiendo la tira en 100 l de
caldo BHI y a partir de este tubo se hicieron seis diluciones seriadas con un
volumen final de 10 l. De cada dilucin se tom 1 l y se sembr en cajas
de petri con agar BHI, se incubaron a 65C durante 48 horas para su
recuento. Luego se obtuvieron las UFC/ml para poder comparar las
concentraciones con el patrn de Mac Farland y de esta forma establecer a
que patrn realmente equivala cada indicador biolgico. Simultneamente
se hizo el muestreo de cada patrn para la esterilizacin en horno, autoclave
y desinfeccin con hipoclorito de sodio.
24
5.7 Ensayos con el Indicador Biolgico en el Autoclave

Para la esterilizacin a vapor se utiliz el autoclave marca Sterilof . En este
autoclave se evaluaron 5 puntos diferentes: parte superior derecha, parte
superior izquierda, centro, parte inferior derecha y parte inferior izquierda.
Para cada una de estas partes se colocaron las tiras impregnadas de los
once patrones por duplicado y se llev a esterilizar junto con el material
limpio de la dependencia de monitora. El ciclo de esterilizacin se llev a
cabo de la siguiente manera: 30 minutos de precalentamiento, 20 minutos de
esterilizacin a 20 libras de presin y 121C de temperatura. Despus de la
esterilizacin se sacaron las tiras de papel filtro, se suspendieron en 100 l
de caldo BHI y se sembraron 50 l en agar BHI. Por ltimo se incubaron a
65C durante 48 horas para su recuento.
Despus de obtener los resultados del recuento de colonias de las cajas que
presentaron crecimiento luego de la esterilizacin con el anterior ciclo, se
repiti el proceso de esterilizacin a vapor pero con el ciclo de material sucio
el cual se llev a cabo de la siguiente manera: 30 minutos de
precalentamiento,
15 minutos de esterilizacin a 35 Libras de presin y
135C de temperatura. Se sacaron las tiras de papel filtro, se suspendieron

en 100 l de caldo BHI y se sembraron 50 l en agar BHI. Se incubaron a
65C durante 48 horas para su recuento.
5.8 Ensayos con el Indicador Biolgico en el Horno
La esterilizacin por calor seco se hizo en el horno marca Binder . De igual
forma se evaluaron los 5 puntos empleados en el autoclave con la misma
cantidad de tiras impregnadas por duplicado. El ciclo de esterilizacin del
horno se realiz de la siguiente manera: 30 minutos de precalentamiento y
dos horas de esterilizacin a una temperatura de 220C. Despus de la
esterilizacin se sacaron las tiras de papel filtro, se suspendieron en 100 l
25
de caldo BHI y se sembraron 50 l en agar BHI. Luego se incubaron a 65C

durante 48 horas para su recuento.
5.9 Ensayos con el Indicador Biolgico para la desinfeccin con
Hipoclorito de Sodio
La desinfeccin se llev a cabo utilizando tubos con 3 ml de hipoclorito de
sodio en dos concentraciones, la primera a una concentracin de 0.52% y la
segunda al 2.5% las cuales son empleadas por la dependencia de monitora
de la Facultad de Ciencias. Se hicieron cuatro ensayos con las tiras de papel
filtro de cada patrn sumergindolas durante 1 minuto y sacndolas para
resuspender en 100 l de caldo BHI. Por ltimo se tomaron 50 l de sta
suspensin y se sembraron en cajas de petri con agar BHI. Se incubaron a
65C por 48 horas para su posterior recuento.
5.10 Recuento de Colonias
Pasadas las 48 horas de incubacin, se realiz el recuento de colonias en
todas las cajas que presentaron crecimiento. Las cajas de los controles de
viabilidad, se leyeron de acuerdo al mtodo de contaje en placa por siembra
en superficie, en las cajas que contenan entre 30 y 300 colonias las cuales
correspondan a la ltima dilucin. A las cajas del muestreo que tuvieron
crecimiento se les hizo el recuento de colonias para establecer las UFC/ml.
5.11 Anlisis Estadstico
Los resultados correspondientes a los procesos de esterilizacin tanto para
horno como para autoclave con ciclo de material limpio, se analizaron con el
programa Statistix utilizando la prueba para la proporcin.
En esta prueba se plante la siguiente hiptesis:
26
La proporcin de pruebas de esterilidad con ausencia total de crecimiento de

Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 es del 95%.
Hiptesis nula (Ho): P=0.95
Hiptesis alterna (Hi): P0.95
Para el rechazo o no de esta hiptesis se determin el valor de p para los
resultados obtenidos
en cada concentracin del indicador biolgico
empleada en este estudio.

Si p<0.05 se rechaza la hiptesis nula.
Si p>0.05 no se rechaza la hiptesis nula.
Los resultados obtenidos en la desinfeccin con hipoclorito de sodio y la
esterilizacin en autoclave con material sucio se analizaron de forma
apreciativa debido a que el nmero de pruebas evaluadas en estos procesos
no era suficiente para analizarlo estadsticamente, ya que para material sucio
se evalu solo las dos ltimas concentraciones que correspondieron a las
cajas en que hubo crecimiento despus de la esterilizacin con material
limpio.
Para la desinfeccin con hipoclorito de sodio se realizaron 4
repeticiones de igual forma no aptas para el anlisis estadstico.
27
FIGURA 2. ESQUEMA DE METODOLOGA

Recuperacin en caldo BHI cepa
Bacillus stearothermophilus
ATCC 7953.
Realizar
Repiqueun
Agar
repique
BHI aAgar
partirBHI
de
Caldo BHI
Se
Realizar
realizbatera
pruebabioqumica
bioqumicayy
coloracin de gram para su
confirmacin.
Sembrar
Se sembr
en 15
en cajas
15 cajas
de Agar
de Agar
BHI
BHI
Se
Envejecer
envejecicultivo,
cultivo,hasta
hasta
obtencin de esporas.
Se
Realizar
realizrecuento
recuentode
deesporas
esporas
diariamente hasta que el 80 % de
cultivo
cultivo
esteestuviera
en fase esporulada.
en fase
esporulada.
Se realizaron los 11
patrones de Mac
Farland
Se cortaron tiras de
papel filtro de 3cm de
largo x 0.5 cm de
ancho
.
Se impregnaron con
cada patrn de Mac
Farland
Para los controles de

viabilidad de hicieron
seis diluciones
seriadas
Se realizaron los
ensayos
Esterilizacin con
calor seco a 220C
por 2 horas
Esterilizacin a vapor
121C 20 Lb, 20 min
y a 135C, 35 Lb, 15
min
Desinfeccin con
hipoclorito de sodio
0.52% y 2.5%
Se sembraron en
agar BHI y se realiz
el conteo de UFC/mL
a las 48 horas.
28
6. RESULTADOS
6.1 Recuperacin de la cepa de Bacilllus stearothermophilus ATCC 7953
Para
desarrollar
este
estudio
se
recuper
la
cepa
de
Bacilllus
stearothermophilus ATCC 7953 en el agar BHI a una temperatura de 65C, la

cual mostr colonias redondas, mucosas, pequeas, blanquecinas, con un
dimetro de aproximadamente 1mm a 5 mm, como se muestran en la figura
3 y 4.
FIGURA 3 y 4. Aislamiento de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953.
6.2 Identificacin Bioqumica y Coloracin de Gram

Frente a la catalasa present una reaccin positiva e hidroliz la esculina.
En el medio SIM present motilidad positiva, indol negativo y cido sulfrico
negativo (H2S). La fenilalanina no fue deaminada. En el medio TSI se di una
reaccin A/A sin produccin de gas ni cido sulfrico (H2S). En el Agar Urea
de Christensen se obtuvo una reaccin positiva. El Voges-Proskauer fue
negativo y el Rojo de Metilo positivo. Ferment los siguientes azucares:
glucosa, lactosa, sacarosa y maltosa. Ver figura 5. En cuanto a la Coloracin
de Gram
se observaron bacilos gram positivos esporulados, como se
observa en la Figura 6.
29
FIGURA 5 y 6. Identificacin Bioqumica

stearothermophilus ATCC 7953.
y Coloracin de Gram de Bacillus
6.3 Obtencin de Esporas

Empleando la coloracin de Wayson se realiz un conteo de esporas
diariamente sobre un total de 500 bacilos, como se muestra en la tabla 2.
TABLA 2. Porcentaje de Esporas.
DIA
1
2
3
No DE ESPORAS EN 500
BACILOS OBSERVADOS
155
260
435
PORCENTAJE DE
ESPORAS
31%
52%
87%
Se obtuvo un recuento de 31% de esporas en el primer da, 52% de esporas

en el segundo da y 87% de esporas al tercer da, como se muestra en la
figura 7.
30
PRODUCCIN DE ESPORAS
100
PORCENTAJE
80
60
Esporas
40
20
0
1
3
DIAS
FIGURA 7. Obtencin de esporas.
6.4 Patrn de Mac Farland

Se prepar el patrn de Mac Farland con el fin de obtener un amplio rango
de concentraciones para impregnar las esporas en el papel filtro y realizar los
ensayos en el horno, autoclave y con hipoclorito. En la Tabla 3 se indican las
absorbancias
de cada Patrn de Mac Farland y la concentracin
correspondiente para cada uno y se aaden las absorbancias obtenidas en

nuestro estudio, ledas a una longitud de onda de 540 nm.
TABLA 3. Patrn de Mac Farland y las absorbancias obtenidas.
No PATRN DE
MAC FARLAND
ABSORBANCIAS
PATRN
CONCENTRACIN
PATRN cel/ml
0.5
0.05
1.5 x 10
0.1
3 x 10
0.170
0.2
6 x 10
0.245
0.3
9 x 10
0.383
0.4
12 x 10
0.469
0.5
15 x 10
0.556
0.6
18 x 10
0.683
0.7
21 x 10
0.778
0.8
24 x 10
0.868
0.9
27 x 10
0.960
10
1.0
30 x 10
1.160
ABSORBANCIA
OBTENIDA
0.052
31
6.5 Indicador Biolgico

Se realiz a partir de tiras de papel filtro de 0.5 centmetros de ancho por 3
centmetros de largo, impregnadas con 50 microlitros (volumen necesario
para impregnar toda la tira) de la suspensin de esporas
de Bacillus
stearothermphilus ATCC 7953 de cada patrn. Ver figura 8.
FIGURA 8. Indicador Biolgico.

las tiras de papel filtro y Controles de Viabilidad
En la tabla 4 se indica el nmero de esporas impregnadas en la tira para
cada patrn y se muestra el nmero de unidades formadoras de colonias por
mililitro recuperadas a partir de la ltima dilucin seriada. Estos datos se
compararon con el rango de concentracin del patrn de Mac Farland y se
obtuvo una equivalencia que da como resultado una recuperacin del 50%
de esporas presentes en la tira de papel filtro. En la figura 9 se muestran las
UFC recuperadas para cada patrn a partir de la ltima dilucin.
32
TABLA 4. Nmero de esporas presentes en las tiras de papel filtro y
Controles de Viabilidad
No
PATRN
No
ESPORAS
POR TIRA
0.5
7.5 x 10
UFC/ml
RECUPERADAS
0.6 x 10
15 x 10
1.2 x 10
30 x 10
2.6 x 10
45 x 10
4.0 x 10
60 x 10
5.3 x 10
75 x 10
6.5 x 10
90 x 10
8.0 x 10
105 x 10
120 x 10
135 x 10
10
150 x 10
RANGO DE
CONCENTRACIN
PATRON
EQUIVALENCIA
AL PATRN Mac
Farland
0.75 x 10 - 2.25 x 10
2.26 x 10 - 4.5 x 10
4.6 x 10 - 7.5 x 10
4.6 x 10 - 7.5 x 10
7.6 x 10 - 10.5 x 10
7.6 x 10 - 10.5 x 10
8.8 x 10
11.3 x 10
12.9 x 10
14.3 x 10
Aprox. 0.5
0.75 x 10 - 2.25 x 10
Patrn 0.5
2.26 x 10 - 4.5 x 10
Patrn 1
Patrn 1
Patrn 2
Patrn 2
Patrn 3
Patrn 3
10.6 x 10 - 13.5 x 10
Patrn 4
10.6 x 10 - 13.5 x 10
Patrn 4
13.6 x 10 - 16.5 x 10
Patrn 5
33
FIGURA 9. CONTROLES DE VIABILIDAD

A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
K.
FIGURA 9. Controles de Viabilidad: A. Patrn 0.5: 6 colonias recuperadas. B.

patrn 1: 12 colonias recuperadas. C. Patrn 2: 26 colonias recuperadas. D. Patrn
3: 40 colonias recuperadas. E. Patrn 4: 53 colonias recuperadas. F. Patrn 5: 65
colonias recuperadas. G. Patrn 6: 80 colonias recuperadas. H. Patrn 7: 88
colonias recuperadas. I. Patrn 8: 113 colonias recuperadas. J. Patrn 9: 129
colonias recuperadas. K. Patrn 10: 143 colonias recuperadas.
34
6.7 Ensayos con el Indicador Biolgico en el Autoclave

Para el autoclave con el ciclo de 15 min, 20 Lb y 121C, se evaluaron 5
puntos diferentes con el indicador biolgico: parte superior derecha, parte
superior izquierda, centro, parte inferior derecha y parte inferior izquierda.
Como se muestra en la tabla 5, desde la concentracin 0.6 x 108 hasta la
11.3 x 108 no hubo crecimiento de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953
despus del proceso de esterilizacin. Mientras que para las concentraciones
12.9 x 108 y 14.3 x 108 hubo crecimiento del indicador biolgico ubicado en
la parte inferior derecha y en la parte inferior izquierda.
TABLA 5. Ensayos en el Autoclave con ciclo para material limpio.
Concentracin
Cel/ml
AUTOCLAVE UFC/ml (15 min, 20 Lb, 121C)

Sup. Der
Sup. Izq
Centro
Inf. Der
Inf. Izq
10
50
30
40
0.6 x 10
1.2 x 10
2.6 x 10
4.0 x 10
5.3 x 10
6.5 x 10
8.0 x 10
8.8 x 10
11.3 x 10
12.9 x 10
14.3 x 10
Con el fin de observar si estos resultados afectaran a la esterilizacin de

productos contaminados, se prob el ciclo de esterilizacin utilizado para
material sucio (15 minutos, 35 Libras de presin a 135C), se evaluaron las
mismos cinco partes para las ltimas concentraciones (12.9 x 108 y 14.3 x
108) sin obtener crecimiento. Ver tabla 6.
35
TABLA 6. Ensayos en el Autoclave con ciclo para material sucio.

Concentracin
Cel/ml

Sup. Der
Sup. Izq
Centro
Inf. Der
Inf. Izq
12.9 x 10
14.3 x 10
A continuacin se muestra en la Figura 10 las cajas donde hubo crecimiento

despus de la esterilizacin en cada una de las partes del autoclave
evaluadas con el ciclo de material limpio.
A.
B.
C.
D.
Figura 10. Ensayos en el Autoclave: A una concentracin de 12.9 x 108 UFC/ml

despus de esterilizar se observ crecimiento en: A. Autoclave Inferior Derecho: 1
colonia. A la concentracin de 14.3 x 108 UFC/ml se observ crecimiento en B.
Autoclave Inferior Izquierdo: 4 colonias. C y D. Autoclave Inferior Derecho: 3 y 5
colonias respectivamente.
36
6.8 Ensayos con el Indicador Biolgico en el Horno

Se evaluaron 5 puntos diferentes con el indicador biolgico: parte superior
derecha, parte superior izquierda, centro, parte inferior derecha y parte
inferior izquierda. En la tabla 7 se observ que desde la concentracin 0.6 x
108 hasta la 11.3 x 108 no hubo crecimiento de Bacillus stearothermophilus
ATCC 7953 despus del proceso de esterilizacin. Mientras que para las
concentraciones 12.9 x 108
y 14.3 x 108 hubo crecimiento del indicador
biolgico ubicado en la parte central, en la parte inferior derecha y en la parte

inferior izquierda.
TABLA 7. Ensayos en el Horno.
Concentracin
UFC/ml
Sup. Der
HORNO UFC/ml
Sup. Izq
Centro
Inf. Der
Inf. Izq
30
20
20
60
20
40
0.6 x 10
1.2 x 10
2.6 x 10
4.0 x 10
5.3 x 10
6.5 x 10
8.0 x 10
8.8 x 10
11.3 x 10
12.9 x 10
14.3 x 10
En la figura 11 se muestran las cajas que presentaron crecimiento del bacilo

en las cinco partes del horno evaluadas, despus de la esterilizacin. Este
crecimiento correspondi a las concentraciones ms altas.
37
A.
B.
C.
D.
E.
F.
FIGURA 11. Ensayos en el horno: A una concentracin de 12.9 x 108 UFC/ml

despus de esterilizar se observ crecimiento en: A. Horno Inferior Derecho: 2
colonias. B. Horno Centro: 3 colonias. A la concentracin de 14.3 x 108 UFC/ml se
observ crecimiento en C. Horno Centro: 2 colonias. D y F. Horno Inferior Derecho:
2 y 6 colonias respectivamente. E. Horno Inferior Izquierdo: 4 colonias.
38
6.9 Ensayos con el Indicador Biolgico con Hipoclorito de sodio

Se realizaron 4 ensayos con Hipoclorito de sodio al 0.52% y al 2.5%. En la
tabla 8 se puede ver que desde la concentracin 0.6 x 108 hasta la 11.3 x
108 no hubo crecimiento de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 despus
del proceso de desinfeccin con hipoclorito de sodio al 0.52% y 2.5%.
Mientras que para las concentraciones 12.9 x 108
y 14.3 x 108 hubo
crecimiento del indicador biolgico despus de la desinfeccin con hipoclorito

al 0.52%.
TABLA 8. Ensayos con hipoclorito de sodio.
Concentracin
UFC/ml
Hipoclorito 0.52%
UFC/ml
Hipoclorito 2.5 %
UFC/ml
20
10
30
50
30
20
0.6 x 10
1.2 x 10
2.6 x 10
4.0 x 10
5.3 x 10
6.5 x 10
8.0 x 10
8.8 x 10
11.3 x 10
12.9 x 10
14.3 x 10
En la figura 12 se muestra las cajas en las que hubo crecimiento del bacilo
despus de la desinfeccin con hipoclorito de sodio al 0.52%.
39
A.
B.
C.
D.
E.
F.
Figura 12. Ensayos con Hipoclorito de sodio: Despus de realizar el proceso de

desinfeccin se observ crecimiento a una concentracin de 12.9 x 108 UFC/ml en:
A, B y C. Hipoclorito de sodio 0.52%: 1, 2 y 3 colonias respectivamente. Con la
concentracin de 14.3 x 108 UFC/ml se observ crecimiento en: D, E y F. Hipoclorito
de sodio 0.52%: 3, 2 y 1 colonia respectivamente.
40
6.10 Estadstica de los resultados para el Horno

Segn los datos arrojados por el programa statistix, en la tabla 9 se indica el
valor de p para cada concentracin del indicador biolgico el cual se emplea
para rechazar o no la prueba, se muestra tambin el nmero de repeticiones
realizadas y el nmero de cajas en las que no hubo crecimiento de Bacillus
stearothermophilus ATCC 7953 despus de realizada la esterilizacin en el
horno. Con color azul se sealan las pruebas rechazadas y con color verde
se sealan las pruebas no rechazadas.
TABLA 9. Estadstica para Ensayos en el Horno.

Concentracin
UFC/ml
HORNO UFC/ml
No Repeticiones
Sin Crecimiento
Valor de P
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
0.029
10
0.0002
0.6 x 10
1.2 x 10
2.6 x 10
4.0 x 10
5.3 x 10
6.5 x 10
8.0 x 10
8.8 x 10
11.3 x 10
12.9 x 10
14.3 x 10
41
6.11 Estadstica de los resultados para el Autoclave

Segn los datos arrojados por el programa statistix, en la tabla 10 se indica
el valor de p para cada concentracin del indicador biolgico el cual se
emplea para rechazar o no la prueba, se muestra tambin el nmero de
repeticiones realizadas y el nmero de cajas en las que no hubo crecimiento
de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 despus de realizada la
esterilizacin en el autoclave para material limpio. Con color azul se sealan
las pruebas rechazadas y con color verde se sealan las pruebas no
rechazadas.
TABLA 10. Estadstica para los Ensayos realizados en el Autoclave.

Concentracin
UFC/ml

No Repeticiones
Sin Crecimiento
Valor de P
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
10
0.468
10
0.468
10
0.0037
0.6 x 10
1.2 x 10
2.6 x 10
4.0 x 10
5.3 x 10
6.5 x 10
8.0 x 10
8.8 x 10
11.3 x 10
12.9 x 10
14.3 x 10
42
7. DISCUSIN DE RESULTADOS
Bacillus stearothermophilus es considerado un indicador biolgico ideal para
el monitoreo de los procesos de esterilizacin porque carece de
patogenicidad, pirogenicidad, toxicidad y sus esporas son altamente
resistentes al calor. Publicaciones como las del World Health Organization
(2003),
Fallis (1998), Parra et al. (1999) se han basado en el
comportamiento de estas esporas a diferentes condiciones de tiempo y

temperatura, los resultados de la muerte de estas esporas nos llevan a
pensar que al ser verificada la eliminacin de estas esporas, se puede
pensar tambin en la muerte de formas bacterianas menos resistentes,
garantizando un proceso de esterilizacin altamente eficiente. Por esto
nuestro estudio utiliz Bacillus stearothermophilus ATCC 7953, para obtener
una concentracin ideal de esporas en el control de los procesos de
esterilizacin.
De acuerdo con los resultados obtenidos en la produccin de esporas, se
obtuvo el 87% del cultivo en fase esporulada a los tres das. Este resultado
no era el esperado por nosotras ya que en estudios como los de Zmidzinska
et al. (2004) y Kralovic (2000), los cultivos de Bacillus stearothermophilus a
55C duraban alrededor de siete das en producir un porcentaje mayor al
80%, esto pudo deberse al medio empleado, ya que se present una mayor
desecacin del medio con la consecuente disminucin de nutrientes,
aportando un ambiente desfavorable que pudo acelerar de alguna manera
el proceso de esporulacin.
Teniendo en cuenta que hay dos presentaciones de indicadores biolgicos
disponibles como lo menciona Fallis (1998), uno con esporas impregnadas
en papel filtro y otro a manera de ampollas que contienen las esporas en un
caldo nutritivo; nosotras desarrollamos nuestro propio indicador biolgico a
manera de esporas de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 impregnadas
en papel filtro, el cual fue sometido a los diferentes ensayos de esterilizacin
y desinfeccin y de acuerdo a los resultados obtenidos se obtuvo que en los
controles de viabilidad hubo una recuperacin del 50% de esporas presentes
43
en la tira de papel filtro, lo cual pudo deberse a que no se emple un

tratamiento con lisozimas, centrifugacin y lavados repetidos para permitir la
liberacin de todas las endosporas desde el esporangio y la lisis de algunas
clulas no esporuladas presentes en la solucin, como lo explica el estudio
de Zmidzinska et al. (2004). Otro aspecto importante que puede explicar la
disminucin en la recuperacin total de esporas dada en nuestro estudio, se
basa en que segn Beaman et al. (1988) menos del 10% del nmero total de
esporas sin un tratamiento previo al calor germinan y forman colonias. Sin
embargo la poblacin de esporas recuperadas en nuestro estudio fue apta,
suficiente y superior al compararla con indicadores comerciales como el
Sterikon
Plus Bioindicador de Merck en donde la concentracin de
esporas (5 x 105 1 x 107 por unidad) es similar a la empleada en nuestro

estudio.
En cuanto a los resultados de los ensayos de esterilizacin a vapor y calor
seco se puede ver que la concentracin ideal de esporas para el control de
estos procesos es la de 11.3 x 108 UFC/ml p(0.468), porque fue la ltima
concentracin en la que present ausencia total del crecimiento de Bacillus
stearothermophilus ATCC 7953 en un 95% de acuerdo a la prueba para la
proporcin realizada en este estudio. Aunque hay carencia de informacin
acerca de los efectos de la temperatura sobre la resistencia de esporas
segn Beaman et al. (1988), al comparar con el estudio de Zmidzinska et al.
(2004) en donde se analizaron los efectos de diferentes concentraciones de
esporas al calor, se encontr que diferentes niveles de inculos afectan la
resistencia de las esporas, esto puede explicar porque en nuestro estudio a
concentraciones mayores a 11.3 x 108 UFC/ml, hubo un crecimiento gradual
del bacilo.
En la publicacin tambin se mostr que las esporas a
concentraciones bajas procesadas a temperaturas de 105C y 130C

requirieron 65.9 minutos y 23.5 minutos respectivamente para destruir el 90%
de la poblacin. Este porcentaje de destruccin con esporas de inculos ms
altos tratados con las mismas temperaturas no pudo ser calculado aun
despus de 80 minutos de procesamiento. Las esporas tratadas a
44
temperaturas altas (145, 160, 175C) fueron eliminadas mas rpidamente

para el caso de los inculos de mayor concentracin. Esto se puede
comparar
con
nuestro
estudio
en
donde
se
evalu
las
mayores
concentraciones de esporas en el autoclave para material sucio el cual

trabaja con un ciclo de mayor temperatura y mayor presin (135C 35 Lb de
presin) que el autoclave para material limpio y se encontr una eliminacin
total de esporas a estas concentraciones.
Si se comparan los dos procesos de esterilizacin se puede decir que la
concentracin ideal de esporas requiri una menor temperatura y tiempo en
el autoclave que en el horno para eliminar el 95% de esporas, esto puede
deberse a que segn lo afirmado por Spicher y Peters (1997) las molculas
de agua son capaces de desplazar a los puentes de hidrgeno rompindose
ms fcilmente que con el calor seco, por el contrario, la esterilizacin con
calor seco necesita recurrir a mayores temperaturas ya que al no existir
molculas de agua la rotura de puentes de hidrogeno y la desnaturalizacin
de protenas as como la fusin de membranas se efecta a mayores
energas.
De los resultados de los ensayos de desinfeccin desarrollados con
Hipoclorito de sodio, de manera descriptiva se puede decir que fueron los
esperados por nosotras ya que de acuerdo con el Manual de Limpieza,
Desinfeccin y Esterilizacin de la Universidad Autnoma de Barcelona
(2004), ste desinfectante tiene un extenso espectro de actividad
(bactericida, virucida y esporicida) segn la concentracin de uso. A una
mayor concentracin de desinfectante se elimina mayor carga microbiana.
Por ltimo, a partir de los resultados obtenidos en este estudio nosotras
queremos
aportar un buen punto de referencia para proyectos posteriores
que continen con el proceso de validacin de este control biolgico y as

establecer calidad en los procesos de esterilizacin.
45
8. CONCLUSIONES
La concentracin ideal de esporas de Bacillus stearothermophilus

ATCC 7953, establecida en este estudio para el control de los
procesos de esterilizacin como calor seco y calor a vapor fue de 11.3
x 108 UFC/ml.
Se obtuvo el 87% del cultivo de Bacillus stearothermophilus ATCC

7953 en fase esporulada a los tres das despus de recuperada la
cepa.
Las esporas de Bacilllus stearothermophilus ATCC 7953, son buenas

indicadoras de los procesos de esterilizacin porque cumplen con las
caractersticas de termoresistencia y no patogenicidad para el ser
humano.
Si se comparan los dos procesos de esterilizacin se puede decir que

la concentracin ideal de esporas requiri una menor temperatura y
tiempo en el autoclave que en el horno para eliminar el 95% de
esporas.
Se observ que la concentracin de hipoclorito de sodio al 2.5% fue

ms efectiva que la de 0.52% por eliminar una mayor carga
microbiana.
46
BIBLIOGRAFA
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Interministerial. 2004. Perfil Profesional y bases para la organizacin
curricular de la carrera tcnica superior en esterilizacin. Ministerio de
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47
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Treatment of Bacillus stearothermophilus Spores. ASAE. MBO4 - 208218
49
RECOMENDACIONES
Como en este trabajo se estandariz la concentracin de esporas nosotras
recomendamos continuar el estudio con un proceso de validacin frente a un
indicador biolgico comercial. De igual manera se recomendamos el uso de
tratamientos con lisozimas, centrifugacin y lavados con buffer salino con el
fin de optimizar el proceso de recuperacin de esporas.
Es importante que se contine con la realizacin de pruebas suficientes que
confirmen estadsticamente la eficiencia del proceso de desinfeccin con
hipoclorito de sodio frente a la concentracin determinada en este estudio
50
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN
IDEAL DE ESPORAS DE Bacillus stearothermophilus
COMO INDICADOR BIOLGICO PARA EL
CONTROL DE LOS PROCESOS DE
ESTERILIZACIN
ANGELA MARA ZARAMA ORTZ
DRA. ALBA ALICIA TRESPALACIOS RANGEL

Directora
Determinar la concentracin ideal de esporas de Bacillus

stearothermophilus como indicador biolgico para el control de
procesos de esterilizacin.
Determinar el tiempo requerido para la produccin del 80% de

esporas de Bacillus stearothermophilus.
Estandarizar la concentracin adecuada de esporas de Bacillus
stearothermophilus para evaluar los procesos de esterilizacin a
vapor, calor seco y desinfeccin con hipoclorito de sodio.
Frecuente contaminacin de medios de cultivo y reas

de trabajo con microorganismos ambientales.
Asegurar la completa eliminacin de todas las formas

de vida microbiana.
El indicador biolgico desarrollado permitir a la

dependencia de monitora controlar de manera ms
efectiva los procesos de esterilizacin.
Dado los altos costos de los indicadores biolgicos

comerciales, el indicador desarrollado permitir evaluar
el sistema de esterilizacin pero a un bajo costo.
Mecanismo para la destruccin de microorganismos

mediante agentes de naturaleza qumica
(desinfectantes).
El hipoclorito de sodio acta sobre todas las bacterias

incluyendo el bacilo tuberculoso, virus, hongos y
esporas.
Completa destruccin de todas las formas de vida

microbiana, contenidas en un objeto o sustancia.
Entre los procesos ms empleados estn el calor a vapor y

calor seco
CONTROL MECNICO
CONTROL QUIMICO
CONTROL BIOLOGICO
Bacilo Gram positivo

Formador de esporas
Termorresistente
Habita en lugares donde existe formacin de agua y
yacimientos petroleros
Carece de patogenicidad, pirogenicidad y toxicidad
Empleado para monitorear los procesos de esterilizacin
RECUPERACIN DE LA CEPA
Reconstituir
48 h-65 C
Repique a agar BHI
COLORACIN DE GRAM E IDENTIFICACIN BIOQUIMICA
Coloracin de
Gram
Catalasa
SIM
TSI
Fen Urea
RM
VP
Glu
Lac Sac
Repique a 15 cajas
agar BHI
Coloracin de
Wayson
Mal
PREPARACIN PATRN DE MAC FARLAND
0.5
FABRICACIN DEL INDICADOR BIOLGICO
0.5 cm x 3 cm
0.5-10
37C
10
CONTROLES DE VIABILIDAD
Stock
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
1 l
65C por 48 h
30-300 colonias
10-6
ENSAYOS EN AUTOCLAVE
Ciclo material limpio

20 Lb 121C 20 min
Ciclo material sucio
35 Lb 135C 15 min
BHI
65C por 48 h
ENSAYOS EN HORNO
220C por 2 horas
BHI
65C por 48 h
ENSAYOS CON HIPOCLORITO DE SODIO
0.52% 1 min
BHI
2.5% 1 min
65C por 48 h
ANLISIS ESTADSTICO
La proporcin de pruebas de esterilidad con ausencia

total de crecimiento de Bacillus stearothermophilus
ATCC 7953 es del 95%.
Hiptesis nula (Ho): P=0.95
Hiptesis alterna (Hi): P0.95
Si p<0.05 se rechaza la hiptesis nula.
Si p>0.05 no se rechaza la hiptesis nula.
Recuperacin de la cepa Bacillus stearothermophilus

ATCC 7953
Coloracin de Gram
Identificacin Bioqumica
SIM
Mot: pos
Indol: neg
H2S: neg
TSI
Fenilalalnina
A/A
Negativa
H2S: neg
Gas: neg
Urea
RM
Positiva
Positivo
VP
Negativo
Glucosa
Positiva
Lactosa
Sacarosa
Positiva
Positiva
Maltosa
Positiva
Produccin de esporas
PORCENTAJE
100
80
60
40
20
0
Esporas
3
DIAS
Patrn de Mac Farland

No PATRN
DE Mac Farland
ABSORBANCIA
PATRN
CONCENTRACIN
PATRN cel/ml
ABSORBANCIA
OBTENIDA
0.5
0.05
1.5 x 108
0.052
0.1
3 x 108
0.170
0.2
6 x 108
0.245
0.3
9 x 108
0.383
0.4
12 x 108
0.469
0.5
15 x 108
0.556
0.6
18 x 108
0.683
0.7
21 x 108
0.778
0.8
24 x 108
0.868
0.9
27 x 108
0.960
10
1.0
30 x 108
1.160
Indicador Biolgico
Verificacin del nmero de esporas presentes en las tiras del

papel filtro
No
PATRN
No
ESPORAS POR
TIRA
UFC/ml
RECUPERADAS
7.5 x 106
0.6 x 108
0.5
1
RANGO DE
CONCENTRACIN
PATRN
EQUIVALENCIA
AL PATRN Mac
Farland
Aprox. 0.5
0.75 x 108 - 2.25 x 108

15 x 106
1.2 x 108
Patrn 0.5
0.75 x 108 - 2.25 x 108
30 x 106
2.6 x 108
Patrn 1
2.26 x 108 - 4.5 x 108
45 x 106
4.0 x 108
Patrn 1
2.26 x 108 - 4.5 x 108
60 x 106
5.3 x 108
4.6 x 108 - 7.5 x 108
Patrn 2
75 x 106
6.5 x 108
4.6 x 108 - 7.5 x 108
Patrn 2
90 x 106
8.0 x 108
7.6 x 108 - 10.5 x 108
Patrn 3
105 x 106
8.8 x 108
Patrn 3
7.6 x 108 - 10.5 x 108
120 x 106
11.3 x 108
Patrn 4
10.6 x 108 - 13.5 x 108
135 x 106
12.9 x 108
10.6 x 108 - 13.5 x 108
Patrn 4
10
150 x 106
14.3 x 108
13.6 x 108 - 16.5 x 108
Patrn 5
Controles de Viabilidad
Ensayos con el Indicador Biolgico en el Autoclave

Concentracin
Cel/ml

Sup. Der
Sup. Izq
Centro
Inf. Der
Inf. Izq
0.6 x 108
1.2 x 108
2.6 x 108
4.0 x 108
5.3 x 108
6.5 x 108
8.0 x 108
8.8 x 108
11.3 x 108
12.9 x 108
10
14.3 x 108
50
30
40
Ensayos con el Indicador Biolgico en el Autoclave

(15 min, 35 Lb a 135C)
Concentracin
Cel/ml

Sup. Der
Sup. Izq
Centro
Inf. Der
Inf. Izq
12.9 x 108
14.3 x 108
AUTOCLAVE
Ensayos con el Indicador Biolgico en Horno

Concentracin
HORNO UFC/ml
UFC/ml
Sup. Der
Sup. Izq
Centro
Inf. Der
Inf. Izq
0.6 x 108
1.2 x 108
2.6 x 108
4.0 x 108
5.3 x 108
6.5 x 108
8.0 x 108
8.8 x 108
11.3 x 108
12.9 x 108
30
20
14.3 x 108
20
60
20
40
HORNO
Ensayos con el Indicador Biolgico con Hipoclorito de Sodio

Concentracin
UFC/ml
Hipoclorito 0.52%
UFC/ml
Hipoclorito 2.5 %
UFC/ml
0.6 x 108
1.2 x 108
2.6 x 108
4.0 x 108
5.3 x 108
6.5 x 108
8.0 x 108
8.8 x 108
11.3 x 108
12.9 x 108
20
10
30
14.3 x 108
50
30
20
HIPOCLORITO DE SODIO
Concentracin
HORNO UFC/ml
UFC/ml
No
Repeticiones
Sin
Crecimiento
Valor de p
No
Repeticiones
Sin
Crecimiento
Valor de p
0.6 x 108
10
10
0.468
10
10
0.468
1.2 x 108
10
10
0.468
10
10
0.468
2.6 x 108
10
10
0.468
10
10
0.468
4.0 x 108
10
10
0.468
10
10
0.468
5.3 x 108
10
10
0.468
10
10
0.468
6.5 x 108
10
10
0.468
10
10
0.468
8.0 x 108
10
10
0.468
10
10
0.468
8.8 x 108
10
10
0.468
10
10
0.468
11.3 x 108
10
10
0.468
10
10
0.468
12.9 x 108
10
0.029
10
0.468
14.3 x 108
10
0.0002
10
0.0037
Bacillus stearothermophilus es considerado un indicador

biolgico ideal para el monitoreo de los procesos de
esterilizacin. World Health Organization (2003), Fallis
(1998), Parra et al. (1999).
Se obtuvo el 87% del cultivo en fase esporulada a los tres

das. Otros cultivos duraban alrededor de siete das en
producir un porcentaje mayor al 80%. Zmidzinska et al.
(2004) y Kralovic (2000).
En los controles de viabilidad hubo una recuperacin del 50%

de esporas presentes en la tira de papel filtro ya que no se
emple un tratamiento con lisozimas, centrifugacin y
lavados repetidos. Zmidzinska et al. (2004).
La concentracin ideal de esporas para el control de la

esterilizacin a vapor y calor seco es de 11.3x108 UFC/ml.
Diferentes niveles de inculos afectan la resistencia de las
esporas. Zmidzinska et al. (2004).
La concentracin ideal de esporas requiri una menor

temperatura y tiempo en el autoclave que en el horno para
eliminar un 95% de esporas. Las molculas de agua son
capaces de desplazar a los puentes de hidrgeno rompindose
ms fcilmente que con el calor seco. Spicher y Peters
(1997).
El desinfectante tiene un extenso espectro de actividad

(bactericida, virucida, esporicida) segn la concentracin de
uso. Manual de Limpieza, Desinfeccin y Esterilizacin de la
Universidad Autnoma de Barcelona (2004).
La concentracin ideal de esporas de B. stearothermophilus

ATCC 7953 establecida en este estudio para el control de
los procesos de esterilizacin como calor seco y calor a vapor
fue de 11.3x108 UFC/ml.
Se obtuvo el 87% del cultivo de B. stearothermophilus en

fase esporulada a los tres das despus de recuperada la
cepa.
Las esporas de B. stearothermophilus son buenas indicadoras

de los procesos de esterilizacin porque cumplen con las
caractersticas de termoresistencia y no patogenicidad para
el ser humano.
La concentracin ideal de esporas requiri una menor

temperatura y tiempo en el autoclave que en el horno para
eliminar el 95% de esporas.
Se observ que la concentracin de Hipoclorito de sodio al

2.5% fue ms efectiva que la de 0.52% por eliminar una
mayor carga microbiana.
Se recomienda continuar el estudio para un proceso de

validacin frente a un indicador biolgico comercial.
Se recomienda el uso de tratamiento con lisozimas,

centrifugacin y lavados con buffer salino con el fin de
optimizar el proceso de recuperacin de esporas.
Es importante continuar con la realizacin de pruebas

suficientes que confirmen estadsticamente la eficiencia del
proceso de desinfeccin con Hipoclorito de sodio frente a la
concentracin determinada en este estudio.
Es necesario aumentar la concentracin de Hipoclorito de

sodio cuando hayan accidentes de trabajo en el laboratorio.
Un agradecimiento especial a la Dra Alba Alicia

Trespalacios, Dra Marcela Mercado, Dra Ofelia
Dez y a la Dependencia de Monitora de la
Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad
Javeriana.

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ANEXOS

(decolorante). Lavar con agua.

Control de Calidad de la Coloracin de Gram

Gram positivas: Staphylococcus spp. (cocos gram positivos)

Colorantes para la tincin de Gram

Tcnica de la coloracin de Wayson:

1. Aplicar sobre el frotis seco y fijo el colorante de Wayson, dejar actuar

Colorantes para la Tincin de Wayson:

Consta de tres Soluciones:

Mezclar las dos soluciones, filtrar y mantenerlas en nevera

Disolver el azul de metileno en alcohol, el hidrxido de potasio en agua y

Expresamos un especial agradecimiento a la Dra. Alba Alicia Trespalacios,

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN IDEAL DE ESPORAS DE

LILIANA ELISA ROSERO TORRES

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

Artculo 23 de la Resolucin No 13 de Julio de 1946.

DETERMINACION DE LA CONCENTRACIN IDEAL DE ESPORAS DE

LILIANA ELISA ROSERO TORRES

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN IDEAL DE ESPORAS DE

LILIANA ELISA ROSERO TORRES

Dedicamos este triunfo a Dios, por permitirnos culminar una etapa ms en

incondicionalmente, y nos han dado la formacin necesaria para ser

No es por buena suerte o por pura inspiracin que sobresales,

Gonzalo Gallo Gonzalez

Bacillus stearothermophilus es considerado un microorganismo ideal para

concentracin ideal de esporas de este bacilo como indicador biolgico para

2.1 Objetivo General

2.2 Objetivos Especficos

3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA

3.2 IMPACTO ESPERADO

4.2.1 Preparacion de los Intrumentos para su esterilizacin

4.2.1.1 Limpieza de los intrumentos

4.2.1.2 Empaquetado del instrumental

4.2.2 Esterilizacin a vapor

4.2.2.1 Requisitos para la esterilizacin a vapor

4.2.2.2 Proceso de esterilizacin a vapor

4.2.2.3 Fallas en el proceso de esterilizacin a vapor

4.2.2.4 Ventajas del calor hmedo

4.2.2.5 Desventajas del calor hmedo

4.2.3 Esterilizacin por calor seco

4.2.3.1 Requisitos para la esterilizacin por calor seco

4.2.3.2 Proceso de esterilizacin por calor seco

4.2.3.3 Fallas en el proceso de esterilizacin

4.2.3.4 Ventajas del calor seco

4.2.3.5 Desventajas del calor seco

4.2.4 Controles de los Procesos de Esterilizacin

4.2.4.1 Control Mecnico

4.2.4.2 Control Qumico

4.2.4.3 Control Biolgico

4.2.5 Generalidades del Gnero Bacillus

4.2.5.1 Caractersticas de las Endosporas

4.2.5.2 Germinacin de las Endosporas

4.2.5.3 Bacillus stearothermophilus

4.2.5.3.1 Requerimientos nutricionales

4.2.5.3.2 Colonia y morfologa celular

5.1 Recuperacin de la cepa Bacillus stearothermophilus ATCC 7953

5.2 Identificacin bioqumica y coloracin de Gram

5.3 Obtencin de esporas

5.4 Realizacin del Patrn de Mac Farland

5.5 Elaboracin del indicador biolgico

5.6 Determinacin y verificacin del nmero de esporas presentes en

5.7 Ensayos con el indicador biolgico en el Autoclave