Unidad de Epidemiologia Molecular

IMTAvH

XII Curso y Taller de Adiestramiento en Tcnicas de Biologa Molecular

Aplicadas a Enfermedades Infecciosas y Tropicales (PCR, Real-time PCR y
Secuenciamiento)
Gua de Prctica: Anlisis de Secuencias
Objetivo: Tipificacin y estudio de evolucin de organismos a base de
secuenciamiento.
PULIDO DE LOS CROMATOGRAMAS
1. Iniciar MEGA5.
2. Abrir el cromatograma Sen_Ant_F893.ab1 en el men Align Edit/View
sequencer files.
3. Mirando la secuencia, cortar el inicio / corregir errores de la secuencia /
cortar el trmino: para practicar!
4. Si hay alguna duda, dejar el cdigo IUPAC (W, S, K, M, R, Y, B, D, H, V, N).

5. Analizar la parte terminal, qu secuencia es?

6. Observar la A final.
7. Observar las posiciones 87, 257, 286, 309 y 346.
8. Guardar con Data Safe file en formato scf.

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9. Agregar al alineamiento Data Add to alignment explorer.

10. Sin cerrar el primer cromatograma, continuar con Sen_Ant_R429.ab1.
11. Observar las posiciones 78, y 84.
12. Repetir desde el paso 4, pero entre los pasos 8 y 9, hacer el reverso
complementario Edit Reverse complement. Por qu hacerlo?
13. Repetir pasos 4-12 por cada cromatograma ab1 de LH2511. No olvide
hacer el reverso complementario cuando est analizando una secuencia
complementaria.
CONSTRUCCIN DE CONTIGS DE SECUENCIAS

1. Abrir el alignment explorer en MEGA (Align Edit/build alignment).

2. Alinear las secuencias (si olvido tomar el reverso complementario cuando lo
necesitaba, puede hacerlo aqu en Data Reverse complement. Para
facilitar el alineamiento, ubique las posiciones de los primers en el gen. En
esta etapa, NO se usa el programa ClustalW para alinear!

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3. Revisar conflictos entre los cromatogramas. Para resolver, mirar los

cromatogramas que todava deben estar abiertos en MEGA.
4. Observar algunos casos donde 2 nucletidos estn presentes en la misma
posicin, qu significa?
5. Observar algunas posiciones donde haya una diferencia entre las
secuencias: Cul es la razn? Cmo se resuelve?
6. Eliminar las secuencias de los primers. Por qu?

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7. Hacer una nueva secuencia en el alignment explorer (Edit Insert blank

sequence), y copiar el consenso.
8. En general se necesita al menos 2 secuencias por posicin, idealmente en
diferente direccin.
9. Guardar como archivo fasta (LH2511.fas), Data Export alignment
FASTA format.
ALINEAR CONTIG CON UN ALINEAMIENTO DE REFERENCIA
1. Abrir hsp70.fas en MEGA5 (File Open a File/Session Align).
2. Aadir LH2511.fas (Edit Insert sequence from file).
3. Eliminar las secuencias de los cromatogramas separadas (solamente dejar
el consenso de LH2511).
4. Asegurar que no se introduzcan cambios (Edit Allow base editing).
5. Alinear de manera manual o con el algoritmo ClustalW (Alignment Align
by ClustalW).
6. Eliminar los primers y si es necesario las regiones a excluir del anlisis.
7. Mirar la secuencia de aminocidos Translated protein sequences.
8. Guardar como LH2511_alineada.fas.
9. Exportar en formato MEGA Data Export alignment MEGA format
(protein coding).
CONSTRUCCIN DEL RBOL Y TIPIFICACIN
1. Abrir el archivo LH2511_alineada.meg
2. Abrir datos (Data Explore active data).
3. Seleccionar secuencias para usar en el anlisis (secuencias incompletas,
Trypanosoma).
4. Minimizar datos (no cerrar!)
5. Analisis Phylogeny Construct/test neighbor-joining tree.
6. Seleccionar estas opciones:

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7. Compute.
8. Esperar, tomar un caf.
9. View Options para cambiar la vista (jugar).
10. Anlisis del dendrograma, tipificacin de LH2511 observa grupos y valores
de bootstrap.
11. Tipificacin de LH2511.
12. Definir subgnero L. (Leishmania).
13. Abrir Caption.
14. Guardar como LH2511.mts (File Save current session).
15. Imprimir en una pgina (File Print in a sheet). Guardar como .pdf es
posible.

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Tipificacin por BLAST

1. Entrar a la pgina web NCBI BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
2. Seleccionar nucleotide blast
3. Pegar la secuencia hsp70 del aislado LH2511 (consenso contig).
4. Seleccionar database Nucleotide collection.
5. Click BLAST.
6. Tipificar a base de similitud.
7. Comparar con el dendrograma.
Programas y pginas web adicionales
Otros programas que pueden apoyarte (algunos gratis o hay una versin demo):
1. PeakTrace (base calling): http://www.nucleics.com/peaktrace-sequencing/
Sequence Scanner (analisis de cromatogramas):
https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?
cmd=catNavigate2&catID=600583&tab=Overview
2. Sequencher (construir contigs): http://genecodes.com/
3. VectorNTI (hacer contigs, analisis de secuencias):
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-andServices/Applications/Cloning/vector-nti-software.html
4. CLC Workbench (hacer contigs, analisis de secuencias):
http://www.clcbio.com/index.php?id=92
5. BioEdit (analisis de secuancias, no mantenido):
http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)
6. Chromas y ChromasPro (visualisacion y construir contigs):
http://www.technelysium.com.au/chromas.html
http://www.technelysium.com.au/ChromasPro.html
7. DNAMAN (analisis de secuencias): http://www.lynnon.com/
8. GeneDoc (analisis de secuencias): http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/
9. SRS (online sequence retrieval system): http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgibin/wgetz?-page+query+-libList+EMBL
10. Simplot (recombinacin, VIH):
http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot/