Dosage multi-rsidu de pesticides dans

les denres grasses par GC-MS/MS et

UPLC-MS/MS

1 Objet et domaine dapplication

Cette procdure dcrit lanalyse quantitative des organophosphors, organochlors et
pyrthrodes par GC-MS/MS et UPLC-MS/MS dans les denres grasses (viande, produits laitiers,
ufs, huiles et autres denres alimentaires grasses).

2 Dfinitions et abrviations
AcOEt : actate dthyle
cHex : cyclohexane
MeOH : mthanol
DCM : dichloromthane
OP : pesticides organophosphors
OC : pesticides organochlors
Pyr : pyrthroides

3 Principe de la mthode
Si lchantillon nest pas de la graisse, la matire grasse est isole de la denre par extraction
(SOP 22/F/1234). Les pesticides sont spars de la graisse par passage sur une colonne de gel
en HPLC prparative (GPC) suivi par une SPE ou une cryopurification. Aprs concentration sous
azote, lextrait est analys par GC-MS/MS et UPLC-MS/MS.

4 Scurit
Outre les mesures habituelles, on prendra soin la manipulation des standards de pesticides et
particulirement aux pesticides marqus aux 13C.

5 Prlvement des chantillons

Les prlvements se font par le commettant.

6 Rception, circulation, stockage et vacuation des chantillons

Les chantillons sont rceptionns laccueil de lISP suivant la SOP 03/F/12 et puis dans la
section denres alimentaires selon la SOP 22/F/17. Les chantillons ne pouvant tre analyss le
jour mme sont placs dans un surglateur sauf le lait ou les chantillons liquide base de lait
(qui sont placs au rfrigrateur). Les restants des chantillons sont jets, avec laccord du chef
de programme, dans les bacs prvus cet effet.

7 Partie exprimentale
7.1

Produits consommables

Cyclohexane : biosolve pesti-S ou q.

Actate dthyle : biosolve pesti-S ou q.
Hexane : biosolve pesti-S ou q.
Dodecane : aldrich
Dichloromthane : biosolvepesti-S ou q
Methanol : biosolvepesti-S ou q
Eau milli-Q
Standards : Standards purs et solutions commerciales conservs au surglateur.

7.2

Equipement et matriel de laboratoire

Outre le matriel habituel de laboratoire, on notera lutilisation de :

Filtre PVDF 0,45m, Tubes vaporation, Agitateur de type Vortex, Etuve
Balance mettler AE160 ou quivalent
Systme GPC : Pompe Waters 1515, autosampler Waters 717, DAD Waters 996,
rfractomtre Waters 2414 et collecteur de fraction Waters Fraction collector III, Colonne
10m : 46*30, 150*30, 190*30 mm ou q.
Turbovap : LV caliper lifescience
Support SPE avec des colonnes NH2 de Grace de 100 mg
GC-MS/MS : Varian CP3800 et Varian 320-MS TQ MS quip dune colonne Restek RxiXLB 30*0.25 mm 0,25m ou q
UPLC-MS/MS : Acquity et Quattro-premier de WATERS, colonne BEH C18 de Waters de
100*21 mm et particules de 1,7 m

7.3

Prparation des solutions

7.3.1

Ractifs

Phase mobile GPC:

Prlever 1600 ml de cHex et 400 ml dAcOEt dans un cylindre gradu. Filtrer sur filtre micropore
0,45 m. Conservation 6 mois temprature ambiante.
Phases mobiles LC:
Voir SOP 22/F/1238.
7.3.2

Solutions de calibration

Solutions standard
Un fichier Excel ( solution GCMS-graisse stock et mlange ) reprend la prparation (SOP
22/F/22) et la concentration des solutions stock et des mlanges. Une copie de ces feuilles est
conserve dans la farde analyse multi AO .
Solutions stock 1 mg/ml : voir SOP 22/F/1208 Conservation : 5 ans au surglateur

Solutions intermdiaires mlange 10 g/ml : Prlever plus ou moins 500 l (maximum 20

pesticides par mlange), pour obtenir une concentration de 10 g/ml, de la solution stock et
porter au trait avec de lhexane dans un matras de 50 ml. Conservation : 1 an au surglateur
Solutions intermdiaires mlange 1 g/ml : Prlever 2 ml de la ou des solution(s) 10 g/ml et
porter au trait dans un matras de 20 ml. Conservation : 1 an au surglateur
Solutions intermdiaires 0,1 g/ml : Prlever 2 ml de la ou des solution(s) 1 g/ml porter au
trait dans un matras de 20 ml. Conservation : 1 an au surglateur
Solutions intermdiaires 0,01 g/ml : Prlever 2 ml de la ou des solution(s) 0,1 g/ml porter
au trait dans un matras de 20 ml. Conservation : 1 an au surglateur
Rem gnrale : les solutions intermdiaires sont prpares dans le mthanol pour lUPLC et dans lhexane pour la GC

Solutions de SI et de 13C HCB

Solutions SI 10 g/ml : Prlever 500 l de la solution stock de bupirimate et porter au trait dans
un matras de 50 ml avec de lhexane ou du mthanol. La premire est destine aux injections en
GC et la deuxime pour les injections en LC. Conservation : 1 an au surglateur.
Solutions de

13

C HCB 10 g/ml : Prlever 1 ml de

13

C HCB de la solution commercial et porter

au trait dans un matras de 10 ml avec de lhexane. Conservation : 1 an.

Solutions de calibration
Les solutions de standard de calibration sont prpares au dpart des solutions intermdiaires,
de solvant et/ou dextrait dchantillon blanco suivant les proportions reprises dans les tableaux
ci-dessous :
GC-MS/MS
Standard (ng/ml et ng/g)
Dodecane (ml)
Std 0,1 g/ml (l)
std 1 g/ml (l)
Bupirimate hexane (ml)
Hexane (l)
Rem :

10
2.5
500
1.5
500

20
2.5
1000
1.5
0

50
2.5

100
2.5

200
2.5

250
1.5
750

500
1.5
500

1000
1.5
0

Volume final : 5
ml

- la concentration en ng/ml correspond la concentration en ppb de lchantillon.

La solution rendement est ralise avec 200 l dHCB 13C 10 g/ml, 300 l de bupirimate et
500 l de dodcane.

UPLC-MS/MS
Standard (ng/g)
Standard (ng/ml)
Blanco dans le bupirimate (l)
Std 0.01 g/ml (l)
Std 0.1 g/ml (l)
Std 1 g/ml (l)
MeOH (l)

10
5
100
100

20
10
100

50
25
100

100
50
100

20

50

100

80

50

200
100
100
Volume final = 200 l
20
80

Rem :

- une concentration de 5 ng/ml correspond la concentration 10 ppb dans lchantillon.

- Pour obtenir lextrait blanco, on injecte 1,250 ml de solution 160 mg/ml de graisse blanche.
Lchantillon est trait comme explicit dans le paragraphe 7.4.2.2. except que les deux fractions sont
vapores sec et 100 l de bupirilmate 10 g/ml dans le mthanol y sont ajouts.

7.4

Mode opratoire
7.4.1

Extraction de la graisse

Voir 22/F/1234
7.4.2

Mode opratoire

7.4.2.1 Purification
Placer les rcipients contenant la graisse ltuve (entre 50-60C). Lorsque la graisse est
fondue, peser 800 +/- 8 mg de graisse dans un matras de 5 ml. Ajouter de la phase mobile
(GPC). Vortexer quelques secondes afin dhomogniser le mlange et porter au trait avec la
phase mobile (GPC). Filtrer les chantillons (filtre 0.45 m) et injecter 1250 l en GPC.
Paramtres du GPC :
Dbit constant de 5 ml/min ; Collecter la fraction entre 15 et 30 minutes en trois tubes (15-20 ;
20-25 ; 25-30 ; 30-35)
7.4.2.2 Concentration et purification
Evaporer les trois tubes au turbovap pendant 25 minutes (turbovap, 40C, Pression dazote :
9 bars). Prlever le volume restant et le placer dans un matras de 10 ml y ajouter 20 l de
HCB

13

C 10 g/ml. Nettoyer 3 fois les tubes avec un peu dhexane. Mettre au trait avec de

lhexane. Prlever 2*5 ml (fraction 1 et 2) et les mettre dans des tubes dvaporation.
La premire fraction est vapore sec sous azote, ensuite 100 l de bupirimate (dans le
mthanol) et 100 l de mthanol y sont ajouts. Mixer et placer dans les vials dinjection. Les
vials dinjection sont placs au moins 2 heures au conglateur. Le surnageant est prlev (sil
y a un dpt au fond des vials) et est inject en UPLC-MS/MS.
La deuxime fraction est vapore jusqu plus ou moins 500 l (attention pas sec) et
dpos sur colonne SPE pralablement conditionne avec 1,5 ml dhexane. Le tube est
nettoy trois fois avec un peu dhexane et dpos aussi sur la colonne. Llution est ralise
avec 600 l de DCM. Les fractions de charge et dlution sont collectes et rassembles, 50
l de dodcane y sont ajouts et elles sont vapores jusqu volume constant. Ensuite 30 l
de bupirimate (dans lhexane) et 20 l dhexane sont ajouts pralablement linjection en
GC-MS/MS.

7.4.2.3 Injection
GC-MS/MS.
Chromatographie :
Injection : 2 l (autres paramtres voir mthode)
Pre-injection wash : hexane Post injection wash : acetone Dbit : 1 ml/min dHe
Temprature du four :
T (C)
Gradient de temprature
(C/min)
110
200
25
280
10
320
25

Temps de garde (min)

Temps total (min)

0.5
0
3
3

0.5
4.1
15.1
19.7

Spectromtrie :
Les paramtres dacquisition sont sauvs dans la mthode multi AO . Ces mthodes sont
imprimes et conserves dans la farde de lappareil.
UPLC-MS/MS.
Chromatographie :
Injection : 2.5 l en partial loop with needle overfill (autres paramtres voir mthode)
Weak wash : eau : MeOH 90 : 10 Strong wash : eau : MeOH 5 : 95 dbit : 0.45
ml/min
Gradient :
Temps (min)
0
3
5
5.2
7.2

Ph M A (%)
95
0.1
0.1
95
95

Ph M B (%)
5
99.9
99.9
5
5

Spectromtrie :
Les paramtres de la masse utiliss (TUNE) sont repris dans la mthode multi_ISP_
(utilis dans la SOP 1238). Les paramtres dacquisition sont sauvs dans la mthode multi
AO . Ces mthodes sont imprimes et conserves dans la farde de lappareil.
7.4.2.4 Blanc et chantillon de contrle
Pour le blanc, procder comme au point 7.4.2 mais remplacer la graisse par la phase mobile.
Pour lchantillon de contrle, spiker 800mg de graisse avec 80 l de la solution 1g/ml et
porter au trait dans un matras de 5 ml avec la phase mobile. Ensuite procder comme au
point 7.4.2.
7.4.3

Etalonnage

Le standard 200 ppb est utilis pour dterminer les fentres de mesure. Les autres
paramtres utiliss pour vrifier le bon fonctionnement de lappareil sont repris au point 8.
7.4.4

Programme de mesure

La squence danalyse pour les chantillons se compose des injections suivantes :

Injection solvant blanc

5 standards de calibration

Echantillon de contrle

Blanc Procdure

Maximum 10 chantillons

Standard 4 (100ng/ml en GC, 50 ng/ml en UPLC)

Pour confirmer un rsultat positif, une contre-expertise, la mthode de calibration par

bracketing peut-tre utilis en lieu et place de la calibration 5 points. Le seul point de
calibration, qui est pris en compte dans ce cas, est celui dont la concentration est proche de la
concentration de lchantillon. La squence est la suivante :
-

Point de calibration

Echantillon

Point de calibration

Pour les chantillons qui seront au-dessus de la limite de linarit, une dilution avec de la
solution matrice pour lUPLC sera ralise pour se ramener dans la gamme de mesure. Tandis
que pour la GC, la dilution pourra se faire avec le solvant. Remarque : la concentration de SI doittre la mme.