PRCTICA N5

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y MATERIALES PARA

ESTERILIZAR

I.

OBJETIVOS:

Aprender a preparar los materiales de vidrio para la esterilizacin como su

posterior utilizacin.
Comprender la importancia de la esterilizacin as como la proteccin de los
materiales contra la contaminacin microbiana.

II.

INTRODUCCIN:

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el
crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. (Cappuccino, 2013)

III.

MARCO TERICO:

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. La diversidad metablica de estos es tan grande que la variedad de
medios de cultivo es enorme. (Preparacin de medios de cultivo)
Un medio de cultivo est constituido por una mezcla de agua y sustancias que en conjunto
proporcionan los requerimientos nutricionales para el desarrollo de los microorganismos. La
composicin de los medios de cultivo vara en funcin del grupo microbiano que se
pretende estudiar, y la preparacin del medio depende de la complejidad qumica
(composicin), el estado fsico y otras condiciones requeridas (pH, concentracin, etc.).
(Cabezas, 2011) Seala que los tipos de medio de cultivo son los siguientes:

III.1.

SEGN SU ESTADO FSICO:

III.1.1.Medios de cultivo; Slido y Lquido:

Una forma muy til de poder aislar, identificar y conservar los microorganismos es

mediante el uso de medios de cultivo, inicialmente ideados por Pasteur, padre de la

microbiologa, quien se dio cuenta que los microorganismos podan crecer en soluciones
que tuvieran azcar y una fuente de nitrgeno. De ese tiempo hasta la actualidad ha pasado
mucho tiempo y hoy en da existen medios muy especializados para microorganismos muy
exigentes. La forma ms sencilla de clasificar los medios de cultivo es por su consistencia,
entonces aparecen los medios de cultivo slidos y los medios de cultivo lquidos o tambin
llamados caldos. En ambos medios debe haber una buena cantidad de nutrientes que
faciliten el crecimiento bacteriano, pues la diferencia radica en la presencia de una sustancia
que se llama Agar o Agar-Agar que es la encargada de darle la solidez y consistencia al
medio. Esta sustancia proviene, principalmente, de un alga llamada Gelidium.
Robert Koch, mdico alemn dedicado al estudio de los microorganismos y considerado
uno de los autores de la teora microbiana, quien empez a cultivar y aislar
microorganismos. Koch, buscando mejorar la tcnica utilizada hasta ese momento, decidi
solidificar los medios de cultivo aadindoles gelatina.
III.1.2. Medios semislidos:
Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una
proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la
movilidad de las bacterias.
III.2.

SEGN SU UTILIZACIN:

III.2.1.Medios comunes:
Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento
de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este
grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo.
III.2.2. Medios de enriquecimiento:
Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de
factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este
enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero,
leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir
suplementos artificiales a los enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc).
III.2.3. Medios selectivos:
Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una
poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar
nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de
medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de

salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.

III.2.4. Medios inhibidores:
Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios
selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias
antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin
determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los
grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.
III.2.5. Medios diferenciales:
Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a 11 diferenciar
gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se
utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir
los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen.
III.2.6. Medios de identificacin:
Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los
microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos
muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al
que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados
en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios
especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue
simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin.
III.2.7. Medios de multiplicacin:
Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado.
Se emplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms
adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn
(BHI), es medios.
III.2.8. Medios de conservacin:
Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener.
Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados
en el Laboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres
formas:
a) haciendo pases peridicos de placa a placa,
b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y
c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%. 9)
III.2.9. 9) Medios de transporte:
Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su

utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el

interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios
de Stuart Amies,Cary-Blair, etc.
III.3. SEGN SU COMPOSICIN:
III.3.1.Medios complejos:
Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales,
y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por
consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en
condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica
corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados.
III.3.2. Medios sintticos:
Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas
conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio
de composicin perfectamente definida.
III.3.3. Medios semisintticos:
El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la
fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En
este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico
complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en
ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas
con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las
Chlamydias, Rickettsias, etc.
III.4.

SEGN SU ORIGEN:

III.4.1.Naturales:
Son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser
extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente.
III.4.2. Sintticos:
Son los medios que contienen una composicin qumica definida cualitativamente y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
III.4.3. Semisintticos:
Son los sintticos a los que se les aaden factores de 13 crecimientos bajo una forma de un
extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.
En cuanto al estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con
material y medios de cultivo estriles. En Microbiologa la esterilizacin se define como el

proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de

resistencia) de un objeto, medio o superficie y su aplicacin garantiza la ausencia de
microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos
mtodos de esterilizacin, entre ellos: calor (seco o hmedo), filtracin (para sustancias
termolbiles y aire), radiaciones y aplicacin de gas de xido de etileno (para jeringas y
cajas de plstico).
La esterilizacin es la muerte y/ o eliminacin de todo microorganismo. No existen grados
de esterilidad, un objeto es estril o no lo es. La dinmica de la esterilizacin dice que la
proporcin de microorganismos muertos en iguales periodos de tiempo es constante. A
mayor temperatura, mayor accin y menos tiempo necesario para esterilizar. Esto es vlido
para cualquier procedimiento qumico o fsico excepto filtracin. (Leonor, 2006)

IV.

MATERIALES Y MTODOS:
EJERCICIO 1

Objetivo:
Preparar y esterilizar medios de cultivo de diferentes caractersticas para el cultivo
de microorganismos.
Materiales:
-

Medios de cultivo o ingredientes deshidratados

Agua destilada o desionizada
Algodn, gasa
Balanza
Erlenmeyers de 250 y 500 ml
Esptulas
Lpiz marcador de vidrio
Papel indicador de Ph
Papel aluminio y papel corriente no absorbente
Pipetas graduadas
Probetas de 100 ml
Tubos de ensayo

Procedimiento:
a) Caldo nutritivo (extracto de carne, 0.3 % y peptona, 0.5 %):

1. Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la

cantidad de medio deshidratado suficiente para prepara 100ml
de caldo nutritivo.
2. Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml limpio y
seco, y agregue cuidadosamente el agua destilada medida en la
probeta.
3. Mezcle la preparacin con movimientos giratorios hasta
la completa disolucin.
4. Elabore tapones de algodn para 15 tubos.
5. Distribuya el medio lquido con una pipeta graduada a razn de
5 ml en cada tubo.
6. Coloque los tubos los tapones de algodn evitando que queden
flojos o muy compactos.
7. Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor,
envulvalos con papel, identifquelos con el nombre del medio,
la fecha de preparacin y el nombre de la persona responsable
en la elaboracin.
8. Esterilice los tubos con medio en un autoclave a 121 C (15
lb. de presin) durante 15 minutos.
b) Agar nutritivo (Extracto de carne de 0.3; peptona, 0.5 %;
agar, 1.5%):
1. Prepare 200 ml de caldo nutritivo. (repita los pasos 1,2 y 3 del
procedimiento anterior con la correccin en el peso para la nueva
cantidad solicitada y el erlenmeyer a usar, debe tener unas
tres veces el volumen que tendr el medio).
2. Agregue 3 g de agar (1.5 %), y lleve a licuar en bao de agua a
ebullicin hasta que el medio luzca transparente a la luz.
3. Elabore tapones de algodn para unos 16 tubos.
4. Una vez licuado el medio, djelo enfriar ligeramente y
distribyalos en los tubos con una pipeta graduada .Prepare 6
tubos con 12 ml y 10 tubos con 7 ml.
5. Repita los pasos 6, 7, 8 del procedimiento anterior.
6. El medio restante debe ser acondicionado para su
esterilizacin junto a lo anterior.
c) Agar Mac Conkey (peptona, 1.7 %; proteosa peptona, 0.3 %;
lactosa,1%, sales biliares,0.15%; NaCl, 0.5%; agar, 1.5%, rojo
neutro, 0.003%, cristal violeta, 0.0001
%)
d) Agar manitol salado (Extracto de carne 0.1 %; proteosa
peptona, 1.0 %; NaCl,
7.5%; manitol, 1.0%; agar, 1.5%, rojo fenol, 0.0025%):
1. Pese la cantidad de medio deshidratado necesario para preparar

100 ml de cada uno. Observando la formulacin de cada medio

comprobar que los pesos a realizar son distintos.
2. Coloque el polvo de cada medio en Erlenmeyer de 25. ml y llvelos
a licuar en bao de agua caliente hasta la completa disolucin del
agar.
3. Elabore tapones de algodn para cada Erlenmeyer. Luego de
colocarlos cubra los recipientes con papel e identifique el material
con el nombre del medio, fecha de elaboracin y el nombre
de la persona responsable de su preparacin.
4. Esterilice en autoclave a 121 C por 15 min.
e) Agar almidn (Peptona, 1%; K2HPO4 ,0.5 %; almidn, 0.3%; agar,
1.5%):
1. Pese cuidadosamente el almidn necesario para preparar 100 ml
de medio.
2. Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml con un volumen
pequeo de agua destilada que ha medido en la probeta.
3. Caliente el recipiente con el almidn agitando
constantemente hasta su disolucin.
4. Pese el resto de los ingredientes y agrguelos con la cantidad de
agua destilada restante.
5. Licue el medio al bao de agua cliente hasta la completa
disolucin del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH.
6. Coloque en el Erlenmeyer un tapn de algodn a la medida,
cubra con papel, etiquete el material y esterilice a 121 C por 15
min.
f) Agar gelatina (Peptona ,0.1%; extracto de levadura ,0.3%;
gelatina, 0.4%; agar,
1.5%):
1. Pese cuidadosamente la cantidad necesaria de cada ingrediente
para preparar 100 ml de medio.
2. Coloque los ingredientes en un esrlenmeyer de 250 ml y
agregue agua destilada medida en probeta.
3. Lleve el recipiente a licuar en bao de agua en ebullicin
hasta la completa disolucin del agar. Deje enfriar ligeramente y
ajuste el pH a 7.0.
4. Acondicione su medio para esterilizacin como en los
procedimientos anteriores. Esterilice en autoclave a 121 C por
15 minutos.
EJERCICIO 2
Objetivo

Conocer los principios generales de la preparacin y tcnicas de esterilizacin

de diversos materiales y medios de cultivo, de uso en la microbiologa.

Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en la aplicacin de los mtodos
de control microbiano.

Procedimientos:
Preparacin de materiales para su esterilizacin

1. Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con

abundante agua corriente.
2. Dejar escurrir y enjuagar con agua destilada. Dejar escurrir el
material sobre un papel toalla.
3. Elaborar tapones y capuchones para tubos y matraces.
4. Envolver placas Petri, pipetas, tubos y matraces, siguiendo las
indicaciones.

Esterilizacin de materiales y medios de cultivo

1. Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se
colocarn en un horno a
150C durante 2 horas. Despus de sacarlas, dejar enfriar y
abrir los paquetes nicamente en rea asptica (cerca del
mechero).
2. Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de acuerdo
con las siguientes instrucciones:
a.

Revisar que el agua en la autoclave est limpia y el nivel

coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario
cambiar o aadir agua destilada.

b.

Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento

mximo. Con el uso de guantes de asbesto, acomodar los
medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla
dentro.

c.

Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posicin

encontrada y

a que salga el vapor por el orificio de purga,

despus cerrarlo con la vlvula.

d.
Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121C o
15 lbs /in2 de
presin y mantener estas condiciones durante 15 minutos.
Revisar continuamente el manmetro y regular el control de
temperatura a valor medio o mnimo.
e.

Apagar la autoclave y dejar que la presin baje al valor de

cero. Quitar la vlvula y con la ayuda de guantes de asbesto,
abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para
evitar que el vapor caliente cause quemaduras.

Vertido de los medios en cajas Petri y solidificacin

1. Cerrar los tubos con tapn de rosca, los que contienen agar se
colocarn en una superficie inclinada para que el medio solidifique
a una distancia aproximada de 12 cm de la boca del
tubo.
2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una
temperatura aproximada de 45-50C, que coincide con

la

posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin

quemarse.
3. Limpiar la mesa con solucin de alcohol al 70% (v/v),
encender mecheros y
colocarlos a una distancia de 50 cm. Verter entre 20 y 25 mL de
cada uno de los medios

en

tres

cajas

Petri

en

esta

asptica. Dejar que los medios solidifiquen.

EJERCICIO 3
Objeti
vo
Comprobar y evaluar los procedimientos, como prcticas

zona

aspticas realizadas en los anteriores ejercicios.

Prueba de esterilidad de materiales

1. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN
y PDA durante minuto en zonas no aspticas y etiquetarlas.
2. Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, as como un tubo de CN y
PDA durante 1 minuto en zona asptica y etiquetarlas.
3. Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a
30C durante 2448 horas. Las cajas Petri se colocarn con la tapa hacia abajo.
4.

Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de

contaminantes, por la aparicin de turbidez, nata superficial y/o
depsito de material en el fondo de los tubos con medio lquido,
as como la formacin de colonias microbianas en la superficie de
los medios slidos.

IV.

RESULTADOS

1. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay

crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+
++) crecimiento abundante.
2. Describir la morfologa de las colonias.

3.

Discutir los resultados con base en la efectividad de la

esterilizacin y manejo de los materiales.

V.
DISCUSION
ES VI.
CONCLUSI
ONES VII.
CUESTION
ARIO
1. Cules son las ventajas de los medios complejos
para el cultivo de microorganismos?
2. Por qu no es necesario ajustar el pH en el caldo nutritivo
y s lo es en el agar almidn?
3. Determine la naturaleza qumica y la funcin nutritiva
de cada uno de los ingredientes que contienen los
medios que ha utilizado.
4. Describa el autoclave y su forma de uso.
5. Qu otros mtodos de esterilizacin se emplean para los
medios de cultivo?
Qu ventajas otorgan?