Deteco e Quantificao Viral

Anlise e Tratamento de Dados

Cit
Citomegalovirus
l i
Carga Viral Vrus Epstein Barr

`
`
`

Vrus a DNA
Amplificao de fragmento de 74 pb
Regio
g BNRF1 (LMP2)
(
)

Extraco do DNA Viral:

Equipamento automtico

Amplificao e Deteco:

`
`

ABI 7300
ABI 7900

1 Curso de Virologia Molecular em

Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012

PCR em T
Tempo R
Reall
PCR

Quantificao Absoluta:
`
`

`
`
`

Uso de calibradores(4 diluies, em triplicado)

Expresso em Cpias/ml

Controlo Negativo: NTC (Non Template Control)

C t l IInterno
Controlo
t
Extraco:
E t

Fluorforo de normalizao: ROX

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V lid da
Validao
d corrida
id
Calibrador: com amplificao especifica (valor de Ct em
funo da Concentrao)
NTC sem amplificao
NTC:
lifi especifica
ifi
Controlo Interno Extraco: controla INIBIO
Quantificao:

`
`
`
`

Avaliar Regresso Linear

1 Curso de Virologia Molecular em

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V lid da
Validao
d corrida
id

1 Curso de Virologia Molecular em

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V lid da
Validao
d corrida
id

1 Curso de Virologia Molecular em

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V lid da
Validao
d corrida
id

1 Curso de Virologia Molecular em

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V lid da
Validao
d corrida
id

1 Curso de Virologia Molecular em

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Q
Quantificao
tifi

Quantificao Absoluta:
y
y
y

Recta com padres (diluies logaritmicas em srie)

D t
Determinao
i da
d equao
da
d recta
t atravs
t de
d Regresso
R

Linear
C l l
Calcula-se
a quantidade
tid d d
de cpias
i d
de DNA presente
t na
amostra

1 Curso de Virologia Molecular em

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Q
Quantificao
tifi
Absoluta
Ab l t
`
`

Em condies ideiais, o nmero de moleculas duplicado

em cada ciclo.
ciclo
Se inicialmente, tivermos uma quantidade N0 de DNA
d l cadeia,
dupla
d i aps
x ciclos
i l teremos:
t

NC = N0 2

10

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Efi i i PCR
Eficincia
`

`
`
`

Numa reaco de PCR,

PCR no h duplicao do nn de
molculas de DNA em todos os ciclos, uma vez que a
Eficincia inferior a 100%
Eficincia: fraco de molculas que so copiadas por
ciclo:
i l 0E 1
1.
A Eficincia depende do gene-alvo (t) e do tipo de
amostra (s):
Aps C ciclos, o n
n de molculas dupla cadeia de:

N C = N ( Ets + 1)
0
t

11

1 Curso de Virologia Molecular em

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Efi i i PCR
Eficincia
`
`

A quantidade Nc depende de N0,0 apos um determinado nn

de ciclos de amplificao
R
Rearranjando
j d a equao:
a quantificao
tifi de
d NC permite
it o
calculo do N0 caso se conhea a eficincia de amplificao

N = N C /( Ets + 1)
0
t

12

1 Curso de Virologia Molecular em

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Efi i i PCR
Eficincia
`

Aplicando o mtodo do Threshold

Threshold , desenvolvido por
Higuchi et al, temos a seguinte equao:

N = N T /( Ets + 1)
0
t

Ct

em que Ct corresponde a um ponto terico em que cada

ciclo
i l d
de ampliao
li ((amostra)) atinge
i
um d
determinado
i d nvel
l
de fluorescncia Threshold

13

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14

1 Curso de Virologia Molecular em

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Efi i i PCR
Eficincia

15

1 Curso de Virologia Molecular em

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Efi i i PCR
Eficincia
`

Quantificao Absoluta pode ser obtida atravs de uma

curva padro, construda atravs da amplificao de
[DNA] conhecidas - valores de Ct em funo da [DNA]
Aplicando logaritmos, temos a seguinte equao:

Log ( N ) = Log ( Ets + 1) * Ct + Log ( N T )

0
t

Uma vez que E e N0 so

U
constantes,
t t esta
t equao
tem
t
a
estrutura geral de uma recta: Y=mX+b

16

1 Curso de Virologia Molecular em

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Efi i i PCR
Eficincia
`

Representando graficamente Log (N0) em funo do Ct,

temos uma equao com o declive:
1
Declive =
l ( Et + 1)
log(

17

Et = 10

1
Declive

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Efi i i PCR
Eficincia

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Efi i i PCR
Eficincia
EBV

45,0

y = -3,256x + 40,661
R = 0,998

40,0
35,0
Valor de C
V
Ct

30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
0,0

0,5

1,0

1,5

2,0
EBV

19

1 Curso de Virologia Molecular em

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2,5

3,0

3,5

R
Regresso
Li
Linear
`

O objectivo da Regresso Linear consiste no ajuste do

declive e da ordenada na origem de modo a encontrar
uma linha que preveja o mais correctamente possivel os
valores de Y (Ct) a partir de X (log[DNA]):

Minimiza a Soma dos Quadrados dos desvios verticais dos

pontos linha
p

y = a + bx

20

1 Curso de Virologia Molecular em

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R
Regresso
Li
Linear
`

Assumimos que:
`
`
`

21

O erro est associado aos valores de Ct medidos.

medidos No h erro
associado s concentraes
A variao dos valores de Ct obedece a uma distribuio
normal
O erro nos valores de Ct independente da concentrao

1 Curso de Virologia Molecular em

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V lid corrida
Validao
id
`

Avaliar os seguintes elementos:

`
`

NTC
C t l IInterno
Controlo
t
de
d Extrao
E t (amostras)
(
t )

Representar graficamente valores de Ct das diluies

seriadas do calibrador vs o logaritmo da concentrao
das diluies em srie
Parmetros de Regresso Linear:
`
`
`

22

Declive: eficincia de amplificao

Ord. Origem:
R2:

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Efi i i Amplificao
Eficincia
A
lifi

`
`
`

Teoricamente, uma eficincia de 100% corresponde a um

declive de -3,32 (FAM 1 cpia detectada ao ciclo 33.3-36.5)
Deve estar compreendida entre 90 e 105%
Valores superiores a 100% revelam amplificaes inespecificas

23

1 Curso de Virologia Molecular em

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P t
Parmetros
R
Regresso
Li
Linear
`

Declive:
`

O d d Origem:
Ordenada
Oi
`
`

Valores entre -3.1 e -3.6

Varivel de acordo com o ensaio
Entre 36 e 40

R2:
`

24

0.98

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P t
Parmetros
R
Regresso
Li
Linear

25

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Li it D
Limite
Deteco/
t
/Q
Quantificao
tifi

26

Limite Deteco: Quantidade mais baixa de um dado

analito numa amostra
analito,
amostra, que pode ser detectado mas no
necessariamente quantificado
Li it Q
Limite
Quantificao:
tifi
a menor concentrao
do
d
analito que pode ser determinada com um nivel aceitavel
d preciso
de
e veracidade.
d d

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Li it D
Limite
Deteco/
t
/Q
Quantificao
tifi

Metodologia mais comum:

`
`

LD: Regresso Logistica por software (MultiD) ou avaliao de

amostras com baixa quantidade de DNA/ RNA
LQ: Desvio Padro da resposta

LQ = 10x(

)
Slope
p

= Residual Standard Deviation of the Regression (Excel)

27

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V lid da
Validao
d corrida
id

28

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V lid da
Validao
d corrida
id

29

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V lid da
Validao
d corrida
id

30

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E
Expresso
d
de R
Resultados
lt d
`

No Detectado:
`

Amostras sem cpias detectadas

Controlo Interno detectado (Ct do CI Amostra Ct NTC 4)

I ibid
Inibido
`

Amostras sem cpias detectadas

Controlo Interno no detectado ((Ct da Amostra Ct NTC 4))

Detectado (> Limite Quantificao, n de rplicas > 1):

`

Amostras acelulares: Detectado (indicar o n cpias/mL)

Amostras celulares: Detectado (indicar o n cpias/g DNA)

Detectado (> Limite Quantificao, n de rplicas = 1):

`

Detectado e colocar em observao: Por

Por favor enviar nova amostra para confirmao
da quantificao

Detectado (< Limite Quantificao):

`

31

Detectado com n de cpias inferior ao Limite Quantificao

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Q
Quantificao
tifi
Relativa
R l ti
`
`

Determina razo entre a quantidade de um dado DNA e

uma amostra de referncia
E t referncia
Esta
f i pode
d ser:
`
`
`

Amostra ao tempo zero

Amostra no tratada (vs amostra tratada)
Linha celular normal

Anlise realizada por software

32

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