Modificarea chimic a proteinelor

Reactivitatea Lizinei

Reactivitatea argininei, histidinei,

acidului
aspartic,
acidului
glutamic i a captului C-terminat

E.Basle,N. Joubert, M.Pucheault, Chem. Biol., 2010, 213-227.

Reactivitatea Tirozinei

Reactivitatea Cisteinei

E.Basle,N. Joubert, M.Pucheault, Chem. Biol., 2010, 213-227.

Bio-conjugare indus fotochimic

E.Basle,N. Joubert, M.Pucheault, Chem. Biol., 2010, 213-227.

Bio-conjugare indus fotochimic

E.Basle,N. Joubert, M.Pucheault, Chem. Biol., 2010, 213-227.

Crosslinking

Modificri specifice ale captului N-terminal i C-terminal

E.Basle,N. Joubert, M.Pucheault, Chem. Biol., 2010, 213-227.

Reacii bio-ortogonale
Componentele trebuie s reacioneze rapid i selectiv n prezena unei mari
varieti de grupri funcionale

Condensarea aldehidelor/cetonelor cu nucleofili amin

E.Basle,N. Joubert, M.Pucheault, Chem. Biol., 2010, 213-227.

Ligarea Staudinger a azidelor i triarilfosfinelor

Gruparea azid este absent din sistemele biologice
Prezint reactivitate ortogonal cu majoritatea gruprilor funcionale din
moleculele biologice

Limitri:
Cinetic de reacie lent i necesit concentraii mari de triarilfosfin (>250 mM)
E.Basle,N. Joubert, M.Pucheault, Chem. Biol., 2010, 213-227.

Cuplarea peptidelor prin reacia Staudinger

nu necesit prezena cisteinei la punctul de cuplare

E.Basle,N. Joubert, M.Pucheault, Chem. Biol., 2010, 213-227.

Reacia azidelor cu alchinele

Cicloadiia 1,3-dipolar a azidelor cu alchine terminale 1,2,3-triazoli disubstituii
(reacia Rolf Huissgen);
- necesit temperaturi ridicate
Cicloadiia 1,3-dipolar catalizat de cupru (II) - Copper-catalyzed azidealkyne
1,3-dipolar cycloaddition (CuAAC) Sharpless - click chemistry
Cicloadiia 1,3-dipolar indus de tensiunea n ciclu - Ring strain prompted azide
alkyne 1,3-dipolar cycloaddition (SPAAC)

CuAAC
E.Basle,N. Joubert, M.Pucheault, Chem. Biol., 2010, 213-227.

SPAAC

Modificarea chimic a proteinelor Aplicaii

Conjugarea protein-molecule mici prezint aplicaii diverse: detecie, purificare,
modularea funciei proteinelor .
PEGilarea - creterea solubilitii i biodisponiblitatea proteinelor;
- crete stabilitatea (interaciunea cu proteazele);
Molecule micii pentru identificarea interaciilor proteinelor (ex. prin legarea de
proteine a unui compus natural se obin probe care interacioneaz specific cu o
protein sau un grup de proteine, care au afinitate fa de compusul utilizat.
Molecule funcionale (sonde moleculare de activitate, sonde de fotoafinitate)
identificarea de proteine, identificarea de inhibitori etc.
Microarray de proteine
- determinarea partenerilor de interacie
- identificarea de noi inhibitori;
- studii de activitate
Bio-conjugarea
- studiul influenei PTMs asupra proteinelor;
- identificarea interaciunilor protein-protein.

Recunoaterea molecular i afinitate

Funcia i activitatea moleculelor biologice - se bazeaz pe existena proceselor
de afinitate i recunoatere molecular.
Implic interaciuni ntre molecule mici, peptide, proteine, acizi nucleici, lipide
(ligand) i molecule acceptor (receptori) puncte de legare complementare .
Interaciunea receptor ligand este urmat de un proces catalitic (daca receptorul
este un bio-catalizator) sau de modificri conformaionale ale receptorului care
determin o serie de rspunsuri biologice.
Recunoaterea molecular i afinitatea implic interaciuni ne-covalente (fore
electrostatice, interaciuni van der Waals, legturi de hidrogen, interaciuni
hidrofobe).
Exemple de procese de recunoatere molecular:
Neurotransmisie (ex. activatori/antagoniti ai sistemului acetil colinic)
Bio-cataliz
Imunitate (interacia antigen-anticorp)
Inflamaia
Controlul expresiei genelor etc.

Recunoterea molecular implic asocierea receptorului (denumit i molecul

gazd, host) cu o biomolecul sau un compus organic mic (guest , substrat, ligand,
analit).
Formarea complexului (prin leg. ne-covalente, reversibile) determin modificarea
proprietilor zice i chimice ale partenerilor de legare apariia funciei.
Formarea complexului caracterizat prin parametri termodinamici (constanta de
asociere/disociere) i cinetici (constantele de vitez)

Selectivitatea termodinamic dat de raportul dintre constantele de asociere

pentru doi liganzi diferii.

In cazul unei interaciuni ligand/receptor procesul de recunoatere molecular

este un proces de echilibru (guvernat de legea aciunii maselor).
Considernd c:
toate interaciunile sunt reversibile, i procesul de recunoatere (caracterizat
de Ka) este bimolecular iar procesul de disociere este monomolecular
(caracterizat de Kd);
moleculele de receptor nu interacioneaz intre ele;
s-a atins echilibrul termodinamic;
ligandul i receptorul (n stare liber sau n complex) nu dau nicio alt reacie;
afinitatea ligand/receptor (definit de Kd) este proporional cu numrul de
interaciuni.
sau

intersecia cu x nAt/Kd
intersecia cu y nAt
panta dreptei -1/Kd
Devierea de la liniaritate in cazul existei mai multor
situsuri de legare sau legare nespecific

Mecanisme de recunoatere molecular:

(a) lock and key,
(b) induced fit,
(c) selecie conformaional (dynamic fit).

Mecanismul (a) lock and key (E. Fischer 1894)

- moleculele interacioneaz ntr-o manier rigid (complementaritate a
punctelor de interaciune)
Ex. Complexul Tripsin/BPTI

Bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI)

Panagiotis L. Kastritis, and Alexandre M. J. J. Bonvin J. R. Soc. Interface 2013;10:20120835

Mecanismul (b) induced fit (Koshland 1958)

legarea ligandului determin modificri conformaionale ale receptorului,
care permit formarea complexului

Pentru reacie este necesar orientarea exact a gruprolor catalitice;

Legarea ligandului determin o modificare observabil la nivelul interfeei de legare;
Aceste modificri aduc gruprile catalitice n orientarea corect.

Mecanismul (c) selecie conformaional (dynamic fit).

ligandul i/sau receptorul exist n mai multe conformaii posibile. Cea
cu un maxim de puncte de interaciune va forma complexul.

Exemplu:

Mecanismele induced-fit i selecie conformaional:

independent;
simultan (mecanismul de recunoatere depinde de concentraia ligandului la concentraii mici predomin selecia conformaional);
secvenial (conformaia selectat sufer modificri conformaionale n
complexul intermediar)
Cele 2 mecanisme dificil de deosebit experimental.
Studiul proceselor de recunoatere molecular
Chimie supramolecular
fundamental

Molecule
funcionale

Aplicaii practice

(sisteme model receptor/biomolecule)

Metode experimentale de studiu a proceselor de recunoatere molecular

Metode directe (separative)
Metode indirecte (ne-separative)

Metode directe
implic determinarea direct a concentraiei complexului, a compuilor i a
biomoleculelor libere;
ex. gel-filtrare, ultracentrifugare, ultrafiltrare, sau dializa;
pot fi aplicate doar n cazul proceselor cu constante de vitez de disociere
mic.
Metode indirecte
ex. UV-VIS, RMN, fluorescen;
Este necesar prezena unor semnale distincte pentru complex i ligand sau
receptor;
Semnalul msurat este direct proporional cu concentraia.
Cele mai utilizate tehnici experimentale :
Titrate calorimetric izoterm (Isothermal titration calorimetry, ITC) msoar
cldura format sau consumat n cursul interaciunii;
Spectroscopia de rezonan plasmonic de suprafa (SPR) proteinele sunt
imobilizate pe suprafaa unui senzor. Msoar modificarea indicelui de
refracie lng suprafaa senzorului.
Metodele bazate pe fluorescen - experimente FRET, experimente de legare
competitiv

Aplicaii ale proceselor de recunoatere molecular

Biomolecule
Molecule organice
Molecule anorganice
Polimeri
Dendrimeri
Nanoparticole

Exemple de procese de recunoatere

molecular

Separarea cromatografia de afinitate

nelegerea proceselor biologice

Separare
Imagistic i senzori
Cataliz
Activitate farmaceutic

Imagistic i senzori
Sisteme supramoleculare
utilizate n imagistic sau ca
senzori

Exemple de receptori sintetici utilizai n imagistic sa ca senzori

Exemple de receptori sintetici utilizai n imagistic sa ca senzori

Cataliz

Activitatea farmaceutic
- Majoritatea medicamentelor acioneaz prin recunoaterea molecular a
proteinelor (ex. n situsul activ al unei enzime, la nivelul unor receptori, situs-uri
alosterice, suprafa de legare), acizilor nucleici, carbohidrailor, lipidelor
Metodele tradiionale: sintez i screening
calcule teoretice pentru prezicerea
covalente

interaciunilor ne-

Exemple de medicamente i bio-moleculele vizate

Medicamente care vizeaz lipidele
Numr redus de medicamente
Perturba structura lipidelor membranare i ucide celule
Amphotericin B (agent antifungic)
Acioneaz prin formarea de canale hidrofile
HO2C OH

OH CO H
2
Sugar

Sugar

OH

HO

OH

HO

OH

HO

OH

HO

OH

HO

OH

HO

OH

HO

OH

HO

OH

HO

OH

HO

OH

HO

OH

HO

Amphotericin B

CELL
MEMBRANE

Sugar
HO2C

OH

HO

OH

HO

Sugar
OH

OH CO2H

Valinomicin (agent antibacterian/antibiotic)

Canale pentru ionii de potasiu

Exemple de medicamente care vizeaz carbohidraii (membrana celular,

glicoproteine, glicolipide)
Vancomicin inhib bio-sinteza
peretelui bacterian

Tobramicin
(agent antibacterian) altereaz membrana celular i perturb
sinteza proteinelor bacteriene

Exemple de medicamente care vizeaz acizii nucleici

DAUNOMYCIN - modificri ale structurii teriare a ADN, inhib transcrierea i

proliferarea celular

Exemple de medicamente care vizeaz proteine