Sunteți pe pagina 1din 24

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

Facultatea de Biologie i Geologie


Catedra de Genetic Molecular

Doctorand Roxana Ola

Metilarea ADN i controlul genelor


implicate n procesele maligne
Rezumatul tezei de doctorat

Coordonator tiinific
Acad. Prof. Dr. OCTAVIAN POPESCU

CLUJ-NAPOCA
2012

CUPRINS
PUBLICAII
ABREVIERI
PARTEA TEORETIC
1
INTRODUCERE
1.1
Mecanismele epigenetice
1.1.1
Metilarea ADN
1.1.1.1 Reacia de ADN metiltransferaz
1.1.1.2 Proteinele implicate n reacia de ADN metiltransferaz
1.1.1.3 Proteina DNMT1
1.1.1.4 Pprotein DNMT2
1.1.1.5 Proteina DNMT3
1.1.1.6 Proteine de legare a metil citozinei
1.1.2
Factorii de remodelare ai cromatinei
1.1.2.1 Cromatina
1.1.2.2 Factorii de remodelare dependeni de ATP
1.1.3
Mofificri ale histonelor i codul histonic
1.1.3.1 Asamblarea cromatinei
1.1.3.2 Complexele proteice Policomb
1.2
Implicaii ale metilarii ADN
1.2.1
Metilarea ADN n timpul embriogenezei
1.2.2
Inactivarea Cromozomului X
1.2.3
Hipometilarea ADN i telomerii
1.2.4
Metilarea ADN n amprentarea genic
1.2.5
Metilarea ADN i elementele transpozabile
1.2.6
Metilarea ADN n diferenierea celular
1.2.7
Demetilarea ADN
1.3
Mecanismele epigenetice n carcinogenez
1.3.1
Metilarea ADN n cancer
1.3.1.1 Hipometilarea global
1.3.1.2 Hipometilarea oncogenelor
1.3.1.3 Hipermetilarea genelor tumorale supresoare
1.3.2
Rolul mi-ARN-urilor n cancer
1.3.2.1 Reglarea mecanismelor de ctre miRNA-uri
1.3.2.2 Controlul miRNA-urilor prin mecanisme epigenetice
1.3.3
Metilarea ADN- marker n iniiarea tumoral
1.3.4
Metilarea ADN n predicia tratamentului
1.3.5
Metilarea ADN ca i inta terapeutic
1.3.6
Importana clinic a mecanismelor epigenetice
1.4
Cancerul de plaman cu celule de tip non-small (NSCLC)
1.5
Glioblastoamele
1.6
Oncogena Igf-1r
1.6.1
Strategii moleculare pentru inhibarea IGF
PARTEA EXPERIMENTALA
2
OBIECTIVELE STUDIULUI
3
MATERIALE SI METODE
3.1
Linii celulare i reactivi
3.2
Metoda MTT
3.3
Tratamentul celular
3.3.1
Tratatmentul celular cu SAM
3.3.2
Tratatmentul celular cu 5Aza-dC
3.4
Extracia ADN
3.5
Tratamentul cu bisulfit
3.6
PCR-ul specific metilrii ADN
3.7
Msurarea proteic

4
5
6
7
7
8
10
10
11
11
12
12
14
14
15
16
18
18
19
19
20
21
21
21
22
22
22
24
25
26
27
28
28
29
30
30
31
31
32
33
34
35
36
37
38
38
38
39
39
39
39
40
41
42

3.8
3.9
4
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.1.5
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
5
6
7
8

Tehnica de Western blot


Analize statistice
REZULTATE
Profilul de metilare al genei igf-1r n linii de NSCLC i GB
Identificarea regiunii promotoare a genei Igf-1r
Metilarea genei Igf-1r i expresia de protein IGF-1R n liniile de NSCLC i GB
Efectul SAM asupra viabilitii celulare a liniilor de NSCLC i GB
Efectul SAM asupra profilului de metilare al genei Igf-1r
Efectul SAM asupra expresiei de protein IGF-1R
Profilul de metilare al genelor p16 i Rb1 n liniile de NSCLC i GB
Metilarea genelor p16/Rb1 n liniile de NSCLC i GB
Expresia de proteine P16 i RB1 n liniile de NSCLC i GB
Efectul 5Aza-dC asupra viabilitii celulare
Efectul tratamentului cu 5Aza-dC asupra expresiei de gen p16
Efectul tratamentului cu 5Aza-dC asupra expresiei de protein P16
DISCUII
CONCLUZII
MULUMIRI
BIBLIOGRAFIE

43
44
45
45
46
47
51
57
62
67
68
71
73
79
81
83
98
103
104

Cuvinte cheie: metilarea ADN, receptorul factorului de cretere insulinic 1 (Igf1r), cancer de plmn cu celule de mrime diferit (NSCLC), glioblastom (GB),
carcinogenez

Rezumat
Metilarea de novo n cadrul regiunilor promotoare ale genelor implicate n creterea
celular poate induce inactivarea transcrierii ADN, oferind astfel avantajul iniierii i dezvoltrii
de tumori maligne. Pe de alt parte, schimbri n profilul de metilare al proto-oncogenelor
reprezint unul din mecanismele responsabile pentru proliferarea celular necontrolat prin
supraexprimarea oncogenelor.
Cancerul pulmonar cu celule de tip non-small (NSCLC) i Glioblastoamele (GB) sunt
printre cele mai letale forme de cancer. n ciuda existenei unui tratament multimodal, aceti
pacieni au un prognostic rezervat, justificnd necesitatea descoperirii de noi abordri terapeutice.
O activitate crescut a oncogenei Igf-1r a fost observat n multe tipuri de cancer,
inclusiv n cancerul pulmonar i n tumorile gliale. Dar, mecanismul molecular responsabil de
supraexprimarea genei rmne a fi elucidat.
n prima parte a studiului a fost investigat profilul de metilare al oncogenei Igf-1r n
linii celulare de NSCLC i GB. Deasemenea, studiul a evaluat posibilitatea utilizrii unor ageni
de hipermetilare n tratamentul cancerului. Rezultatele obinute arat c oncogena Igf-1r este
parial metilat n toate cele 6 linii de NSCLC i n cele 2 linii de GB analizate. Pentru a

determina dac creterea profilului de metilare al genei Igf-1r poate induce scderea nivelului de
protein IGF-1R, celulele canceroase au fost tratate cu un agent de metilare, SAdenosilmetionina (SAM). S-a observat un rspuns difereniat al viabilitii celulare la tratamentul cu
SAM pe liniile celulare studiate, fr ca agentul de metilare s influeneze profilul de metilare al
oncogenei Igf-1r, sugernd faptul c efectul citotoxic indus de SAM nu este determinat de
modificarea profilului de metilare al genei Igf-1r.
Modificri n exprimarea genelor tumorale supresoare p16 i Rb1, implicate n reglarea
ciclului celular sunt adesea ntlnite n cancer. Astfel, n a doua parte a studiului a fost analizat
profilul de metilare al genelor p16 i Rb1 n aceleai linii tumorale. S-a observat metilarea genei
p16 n dou linii celulare de NSCLC i intr-o singur linie celular de GB. n urma tratamentului
cu agentul de demetilare, 5Aza-dC, nivelul de protein P16 a fost restaurat n celulele cu gena
p16 iniial metilat, sugernd posibilitatea utilizrii agenilor de demetilare n oprirea creterii
tumorale prin reactivarea genelor dormante inhibate prin metilare de novo.

A. Introducere
Epigenetica face referire la mecanismul prin care informaia genetic sau fenotipul
celular pot fi transmise de la o generaie la alta, de-a lungul diviziunilor celulare (epi in limba
greaca inseamn deasupra). Odat cu creterea puterii noastre de nelegere a mecanismelor
genetice, a devenit totui evident faptul c funcionalitatea genelor nu este determinat numai de
sevenele ADN din genom. Un interes major l constituie descifrarea mecanismelor i a
evenimentelor care au loc n interiorul unei celulei eucariote i care nu sunt coninute n secvena
ADN.

A.1. Mecanismele epigenetice n cancer


Cancerul este un grup heterogen de boli din punct de vedere clinic, anatomo-patologic i
molecular, n care un grup de celule cu proprieti biologice diferite de celulele normale din
organism sunt caracterizate prin cretere i diviziune necontrolat, invazie i adesea metastazare.
Cuvntul cancer provine de la Hippocrate - printele medicinei, care a folosit
cuvintele greceti, carcinosi carcinom (traducere-crab) pentru a descrie tumorile maligne.
Dezvoltarea procesului malign depinde att de aberaii genetice ct i de cele
epigenetice. n ultimii ani, s-a artat c metilarea ADN poate fi un indicator al activitii genice,
precum i al organizrii ntregului genom, aceste evenimente epigenetice avnd rol n iniierea
neoplaziilor. Mecanismele epigenetice aberante se manifest la nivel de cromatin, afectnd
regiunile promotoare ale genelor care influeneaz procesul de transcriere al unor factori
importani pentru creterea i dezvoltarea celular.

A.1.1. Metilarea ADN


Metilarea citozinelor n poziia 5 a inelului pirimidinic este o modificare adesea dar nu
exclusive intlnit in ADN-ul mamiferelor la nivelul secventelor CpG.

La mamifere, regiunile bogate n dinucleotide CpG sunt numite insule CpG; n


genomul uman cel puin 60% din regiuniile promotoare ale genelor care codific proteine sunt
asociate cu o insul CpG. n funcie de densitatea gruprilor metil din regiunile promotoare
situate la capatul 5 terminal sau n primul exon/intron al genei, metilarea ADN va dicta poziia
i momentul cnd este iniiat expresia genelor. Metilarea ADN ofer deasemenea informaii
asupra locului unde regiunile codante se regsesc n gene.
n celulele normale, insulele CpG sunt nemetilate, n timp ce dinucleotidele CpG
sporadice regsite n restul genomului sunt metilate. n timpul procesului de mbtrnire, are loc
o inversare treptat a profilului de metilare, care conduce la metilarea insulelor CpG i la o
pierdere global a nivelului de metilare; aceast schimbare este foarte pronunat i n decursul
procesului de carcinogenez.
n cancer au fost descrise trei evenimente majore legate de nivelul de metilare al
citozinelor din insulele CpG: (1) reducerea n ntregul genom a coninutului de 5-metilcitozin
hipometilare ADN global. Hipometilarea global induce instabilitate genomic, activarea
retrotranspozomilor, a proto-oncogenelor sau a microARN, precum i pierderea amprentrii
genomice.
Proto-oncogenele sunt activate n timpul perioadelor de diviziune i difereniere celular rapid
i sunt n general asociate cu mecanismul de control al creterii.
(2) hipermetilarea insulelor CpG n numeroase gene tumorale supresoare este asociat
cu inhibarea procesului de transcriere ADN. Hipermetilarea insulelor CpG este considerat a fi
modificarea epigenetic major n cancer.
Hipermetilarea este caracterizat prin (3) stimularea exprimrii ADN metiltransferazelor
(DNMTs), enzime responsabile de stabilitatea i meninerea profilului de metilare la nivel de
ADN.

A.2. Proto-oncogena Igf-1r


Receptorul 1 al factorului de cretere insulinic (IGF-1R) este un receptor tirozin kinazic
codificat de proto-oncogena Igf-1r cu rol n promovarea transformrii maligne, n creterea i
supravieuirea celulelor tumorale. Supraexprimarea proteinei sau creterea activitii Igf-1r a fost
observat n diferite tipuri de cancer: n cancerul de sn [1, 2], n cancerul de plmn [3, 4], n
cancerul de colon [5], n cancerul de prostat [6], n melanoame [7] i n tumorile gliale [8].
Activarea receptorului IGF-1R determin activarea cii de semnalizare subadiacente,
avnd ca rezultat transformarea i creterea proliferrii i supravieuirii celulelor maligne.
Gradul de exprimare al genei Igf-1r este determinat n mare msur la nivel de
transcriere ADN. Caracterizarea molecular a genei Igf-1r a artat c ambele regiuni 5 sunt
bogate n dinucleotidele CG [9, 10].
Mecanismul molecular responsabil pentru activitatea crescut a genei nu este pe deplin
elucidat. Amplificri ale locusului Igf-1r au fost ntlnite doar n cteva cazuri de melanom i
cancer de sn [1].

A.3. Genele supresoare tumorale p16/Rb1


Proteina P16 este un inhibitor al Ciclinei D1 i este implicat n oprirea ciclului celular
n faz G1 [11]. Inactivarea genei p16 determin activarea Ciclinei D1 i a proteinei
retinoblastoma (RB1), avnd ca rezultat accelerarea creterii necontrolate. Inactivarea genei p16
prin deleii sau mutaii punctiforme este adesea ntlnit n cancer. ns un mecanism alternativ
de inactivare al genei p16 este metilarea regiunii promotoare i a primului exon [12, 13].
Astfel metilarea ADN, pe lng modificarile genetice reprezint o cale alternativ de inactivare a
genelor p16 i Rb1 n cancer.

B. Obiectivele studiului

identificarea profilului de metilare al genei Igf-1r n liniile celulare de NSCLC i


GB.
evaluarea posibilitii c metilarea genei Igf-1r este mecanismul rspunztor de
supraexprimarea genei n cancer
descoperirea unor noi strategi de inhibare a funcionalitii Igf-1r prin utilizarea
unor ageni de metilare ca i poteniali ageni terapeutici
identificarea profilului de metilare al genelor p16/Rb1 implicate n reglarea
ciclului celular n diferite subtipuri de NSCLC i GB.
evaluarea eficacitii agenilor de demetilare n reactivarea genei supresoare a
tumorilor p16 i efectul asupra viabilitii celulare in vitro.

C. Materiale i metode
C.1. Linii celulare i reactivi
n acest studiu au fost folosite 6 linii celulare de NSCLC: U1810, U1752 (stabilizate la
Universitatea din Uppsala [14]), H157, H125, H23 and A549 (achiziionate de la American Type
Culture Collection) i 2 linii celulare de GB (18, 38) (stabilizate din tumori la Spitalul Academic
Universitar din Uppsala i au fost descrise anterior [15]).
Toate celulele n cultur au fost mentinute n condiii specificate n studii anterioare.

C.2. Testul de viabiliate celular- MTT


Acest test se bazeaz pe conversia srii galbene de tetrazoliu (MTT) la cristale mov de formazan
n prezena enzimelor reductoare mitocondriale prezente n celulele metabolic active. n cazul
studiului Igf-1r, celulele au fost cultivate i incubate pentru 7 zile n mediu de cultur continnd
concentraii crescatoare SAM (New England Bio-labs) variind ntre 0.1M-200M.
n cazul studiului p16/Rb1, celulele au fost cultivate pentru 5 zile n mediu de cultur continnd
concentraii cresctoare de 5Aza-dC (Sigma-Aldrich), variind ntre 500nM-10M.

Rezultatele au fost analizate ca i curbe de cretere a celulelor tratate, comparativ cu celulele


netratate.

C.3. Tratamentul celular


Celulele in cultur au fost tratate cu concentraii cresctoare de SAM (50M-200M) pentru
studiul Igf-1r sau cu 0.5-5M 5Aza-dC pentru studiul p16/Rb1.

C.4. PCR-ul specific metilrii (MSP)


Profilul de metilare al probelor ADN a fost investigat prin reacia de PCR specific metilrii
(MSP) n acelai mod cu cel descris n literatur [16]. ADN-ul extras a fost modificat cu ajutorul
kitului CpGenome DNA modification kit (Chemicon, Sweden) urmnd instruciunile din kit,
urmat de PCR. Conditiile de PCR sunt descriese n amnunt in tez.

C.5. Reacia Western Blot


Cuantificarea proteinelor din soluia de liz s-a realizat cu metoda Bradford [17].
Pentru detecia expresiei proteice s-au folosit urmtorii anticorpii primari: anticorp policlonal
reactiv pentru subunitatea a IGF-1R, anticorp policlonal reactiv pentru P16 and RB1 (Santa
Cruz Biotechnology) i un anticorp monoclonal produs in oarece reactiv pentru -Actin (Santa
Cruz Biotechnology), iar anticorpii secundari au fost produi n oarece sau iepure i conjugai
cu HRP. Proteinele au fost apoi vizualizate folosind sistemul ECL (Amersham Biosciences AB,
Uppsala, Suedia).

D. Rezultate
D.I. Profilul de metilare al genei Igf-1r n linii de NSCLC i GB
D.I.1. Identificarea regiunii promotoare a genei Igf-1r
1060 perechi de baze situate n regiunea 5coninnd regiunea promotoare a genei Igf-1r
a fost scanat pentru insule CpG folosind softul MethPrimer [18]. Au fost identificate 2 insule
CpG n regiunea promotoare, prima corespunztoare nucleotidelor 49-278, iar cea de-a doua a
fost regsit ntre nucleotidele 711 i 937.

D.I.2. Metilarea genei Igf-1r i expresia de protein IGF-1R n liniile de


NSCLC i GB
Metilarea regiunii promotoare a genei Igf-1r a fost analizat n 6 linii celulare de
NSCLC i 2 linii celulare primare de GB.

ADN-ul extras din liniile celulare a fost modificat cu bisulfit de sodium. i amplificat cu ambele
perechi de amorse. n toate liniile celulare s-a obinut amplificarea regiunii genice cu ambele
perechi de amorse (Figura 1).

Figura 1. Profilul de metilare al genei Igf-1r n liniile de NSCLC. Produii PCR cu amorsele metilate
(165nt), cu amorsele nemetilate (160nt); M-DNAADN-ul genomic total metilat (control pozitiv al
fragmentului metilat); bloodADN extras din snge (control pozitiv al fragmentului nemetilat).

n acest studiu, nu a fost identificat nici o diferen n profilul de metilare al genei Igf-1r ntre
diferitele subtipuri de cancer de NSCLC.
Amplificare att cu amorsele metilate ct si cu cele nemetilate a fost obinut i n cazul liniilor
primare de GB (Figura 2).

Figura 2. Profilul de metilare al genei Igf-1r n liniile de GB. Produii PCR cu amorsele metilate
(165nt), cu amorsele nemetilate (160nt); M-DNAADN-ul genomic total metilat (control pozitiv al
fragmentului metilat); bloodADN-extras din sange (control pozitiv al fragmentului nemetilat).

Pentru determinarea corelaiei dintre expresia de gen i de protein, nivelul proteic al


IGF-1R s-a determinat prin metoda Western Blot n toate liniile celulare luate n studiu.
Rezultatele obinute au artat c toate liniile celulare luate n studiu exprim proteina IGF-1R
(Figura 3, Figura 4).

Figura 3. Nivelul de expresie proteic n liniile de NSCLC. Expresia proteinei IGF-1R n liniile de
NSCLC: U1752, U1810, H23, H157, H125 i A549 prin metoda Western Blot. -Actina controlul de
ncarcare a gelului.

Figura 4. Nivelul de expresie proteic n liniile de GB. Expresia proteinei IGF-1R n liniile 18 i 38
prin metoda Western Blot. -Actina controlul de ncrcare a gelului.

D.I.3. Efectul SAM asupra viabilitii celulare a liniilor de NSCLC i GB


SAM este principalul donor de grupri metil n multe reacii biologice de metilare
incluznd metilarea ADN la nivelul citozinelor din dinucleotidele CpG. Administrarea exogen a
SAM determin moartea celulelor maligne prin modificri produse la nivel de metilare ADN.
Pentru a determina efectul SAM asupra viabilitii celulare, celulele n cultur au fost
tratate cu diferite concentraii de SAM (0.1-200M). Viabilitatea celular a fost msurat dup 7
zile prin testul MTT. La concentraia maxim folosit (200M), tratamentul cu SAM a indus
reducerea viabilitii celulare: 36% n linia U1810 (Fig. 5A), 18% n linia U1752 (Fig. 5B), 15%
n linia H23 (Fig. 5C), 41% n linia H157 (Fig. 5D), 29% n linia H125 (Fig. 5E), i 22% n linia
A549 (Fig. 5F) comparativ cu celulele netratate.

Figura 5. Testul de toxicitate celular dup tratamentul cu diferite concentraii de SAM n liniile de
NSCLC. Acelai numr de celule au fost cultivate n triplicat i expuse la concentraii cresctoare de
SAM (0.1-200M). Testul MTT pentru liniile: U1810 (A), U1752 (B), H23 (C), H157 (D), H125 (E) i
A549 (F).

Pentru liniile de GB, profilul de inhibare al creterii este descris n Figura 7. Linia celular 38 a
fost mai sensibil la tratamentul cu SAM comparativ cu linia celular 18. La concentraia de
200M, moartea celular indus de SAM a fost de 52% n comparaie cu linia celular 18
(Figura 6A, 6B).

Figura 6. Testul de toxicitate celular dup tratamentul cu diferite concentraii de SAM n liniile de
GB. Acelai numr de celule au fost cultivate n triplicat i expuse la concentraii cresctoare de SAM
(0.1-200M). Testul MTT pentru liniile: 18 (A) i 38 (B).

D.I.4. Efectul SAM asupra profilului de metilare al genei Igf-1r


Pentru a investiga dac efectul SAM asupra viabilitii celulare n liniile de NSCLC i
GB se datoreaz hipermetilrii regiunii promotoare al genei Igf-1r, ADN-ul extras din celulele
tratate a fost amplificat prin MSP cu ambele perechi de amorse iar profilul de metilare a fost
comparat cu ADN-ul netratat. n mod neateptat, SAM nu a determinat schimbri n profilul de
metilare al genei Igf-1r n nici una din liniile celulare de NSCLC (Figura 7) sau de GB studiate
(Figura 8).

Figura 7. Profilul de metilare al genei Igf-1r dup tratamentul cu SAM n liniile de NSCLC. Liniile
celulare au fost tratate cu diferite concentraii de SAM (50-200AM). ADN-ul extras a fost tratat cu
bisulfit de sodiu i amplificat prin metoda MSP. Metilarea parial a genei Igf-1r a fost meninut n toate
liniile celulare de NSCLC: U1810 (A), U1752 (B), H23 (C), H157 (D), H125 (E), A549 (F).

Figura 8. Profilul de metilare al genei Igf-1r dup tratamentul cu SAM n liniile de GB. Liniile
celulare au fost tratate cu diferite concentraii de SAM (50-200M). ADN-ul extras a fost tratat cu bisulfit
de sodiu i amplificat prin metoda MSP. Metilarea parial a genei Igf-1r a fost obinut n ambele linii
celulare de GB: 18 (A), 38 (B).

D.I.5. Efectul SAM asupra expresiei de protein IGF-1R


Pornind de la ipoteza c SAM nu a avut effect asupra profilului de metilare al genei Igf1r, n continuare nivelul de exprimare proteic a fost analizat in celulele in cultur tratate cu
diferite concentraii de SAM. SAM nu a avut nici un effect asupra nivelului de expresie proteic
al IGF-1R n nici una din liniile celulare de NSCLC (Figura 9) sau de GB (Figura 10).

Figura 9. Expresia de protein IGF-1Rdup tratamentul cu SAM n NSCLC. Expresia de


IGF-1R n lizatele celulelor tratate n comparaie cu cele netratate n liniile: U1810 (A), U1752 (B), H23
(C), H157 (D), H125 (E), A549 (F) ilustrata prin Western blot dup tratamentul cu SAM pentru 7 zile.
-Actina a fost folosit ca i control de ncrcare al gelului.
.

Figura 10. Expresia de protein IGF-1R dup tratamentul cu SAM n liniile de GB. Western blot al
lizaturilor celulare dup tratamentul cu SAM pentru 7 zile. Expresia de IGF-1R n celulele tratate
comparativ cu cele netratate n liniile: 18 (A) i 38 (B).

D.II. Profilul de metilare al genelor p16 i Rb1 n liniile de NSCLC i GB


D.II.1. Metilarea genelor p16/Rb1 n liniile de NSCLC i GB
In a doua parte a studiului, profilul de metilare al genelor tumorale supresoare p16 i
Rb1 a fost investigat n aceleai linii celulare folosite n prima parte a studiului.
Dup tratamentul cu bisulfit, amplificarea cu amorsele metilate n cazul genei p16 a fost
obinut n 2 linii celulare de NSCLC: H23 i U1810 (Figura 11A) i n una din liniile celulare de
GB: linia 18 (Figura 11B).
Amplificare cu amorsele care recunosc fragmentul nemetilat pentru p16 a fost obinut n liniile
celulare de NSCLC: U1752 i H157 (Figura 11A) i respectiv n linia 38 de GB (Figura 11B).
Linia celular A549 a fost caracterizat anterior prin deleia genei p16 [19].
n cazul genei tumorale supresoare Rb1, s-a obinut amplificare numai cu amorsele care recunosc
fragmentul nemetilat, att n liniile de NSCLC, ct i n liniile de GB (Figura 11A,B).

Figura 11. Profilul de metilare al genelor p16 i Rb1 n liniile celulare de NSCLC i GB. Amplificare
obinut cu amorsele nemetilate (U) i metilate (M) n liniile de NSCLC: (A) U1810, U1752, H23, H157,
A549, i n (B) liniile de GB: 38 and 18; Ly (controlul pozitiv al reaciei de nemetilare); CpG: ADN-ul
genomic universal metilat, (controlul pozitiv al reaciei de metilare).

D.II.2. Expresia de proteine P16 i RB1 n liniile de NSCLC i GB.


Expresia de proteine P16 i RB1 a fost determinat prin metoda Western Blot n toate
liniile celulare luate n studiu: n liniile de NSCLC: U1752, U1810, H23, H157, A549 i n cele 2
linii de GB: 18 i 38. Rezultatele obinute arat c proteina P16 a fost exprimat de liniile
celulare unde s-a obinut amplificare cu amorsele nemetilate: n liniile de NSCLC: U1752 i
H157 (Figura 12A) i n linia de GB 38 (Figura 12B). n liniile celulare, U1810, H23 (Figura
12A) i n linia celular de GB 18 (Figura 12B) unde s-a obinut amplificare cu amorsele
metilate, proteina P16 a fost absent.
Proteina RB1 a fost exprimat endogen de ctre toate liniile celulare luate n studiu (Figura
12A,B).

Figura 12. Determinarea expresiei de proteine P16 i RB1 prin metoda Western Blot. (A) n liniile
de NSCLC U1752, U1810, H23, H157, H125, A549 i (B) n liniile de GB 18, 38; -Actina - control
pozitiv al ncrcrii gelului.

D.II.3. Efectul 5Aza-dC asupra viabilitii celulare


Administrarea exogen a 5Aza-dC induce moartea celulelor maligne prin efectul indus
asupra metilrii ADN. Pentru a determina efectul 5Aza-dC n supravieuirea celular, liniile de
NSCLC i de GB au fost tratate cu diferite concentraii de 5Aza-dC (0.5-5M) pentru 5 zile, iar
viabilitatea celular a fost masurat prin testul MTT.
Tratamentul cu 5Aza-dC a indus scderea viabilitii celulare n funcie de concentraia folosit
n liniile de NSCLC (Figura 13). n cazul liniilor celulare de GB, n linia 18, tratamentul cu
5Aza-dC a avut un effect mai proeminent n inhibarea creterii celulare comparativ cu linia de
GB 38 (Figura 13B).

Figura 13. Efectul 5Aza-dC asupra viabilitii celulare. Celulele au fost cultivate n triplicat i tratate
timp de 5 zile cu concentraii cresctoare (0.5-10M) de 5Aza-dC. Mediul de cultur a fost schimbat la
fiecare 24 de ore. Toxicitatea celular pentru (A) liniile de NSCLC: U1752, U1810, H23, H157, H125 i
A549 pentru (B) liniile de GB: 18 i 38 GB.

D.II.4. Efectul tratamentului cu 5Aza-dC asupra expresiei de gen i protein


P16
Pentru a investiga o posibil legtur ntre inhibarea creterii celulare n urma
tratamentului cu 5Aza-dC i reexprimarea genei/proteinei P16, ADN-ul celulelor tratate a fost
amplificat i comparat cu ADN-ul extras din celulele netratate.
Re-exprimarea genei/proteinei P16 a fost obinut n liniile celulare unde iniial gena
p16 a fost metilat (n liniile celulare U1810 i H23 la o concentraie de 5M 5Aza-dC (Figura
14B,D) i n linia de GB 18 la o concentraie de 2M 5Aza-dC (Figura 14F). Amplificare cu
amorsele nemetilate s-a obinut la aceleai concentraii de 5Aza-dC folosite pentru identificarea

proteinei P16: 5M n cazul liniei U1810 i H23 NSCLC cells (Figura 14A,C) i 2M 5Aza-dC
n cazul liniei de GB 18 (Figura 14E).

Figura 14. Efectul 5Aza-dC asupra reexprimrii genei/proteinei P16. Celulele n cultur au fost
tratate cu diferite concentraii de 5Aza-dC (0.5-5M) pentru 5 zile. MSP a fost realizat comparativ cu
celulele netratate. n U1810 i H23 s-a obinut amplificare cu amorsele nemetilate (A,C) i reexprimarea
proteinei P16 dup tratamentul cu 5M 5Aza-dC (B,D); n linia 18, amplificarea a fost obinut cu
amorsele nemetilate (E) i proteina exprimat la o concentraie de 2M 5Aza-dC (F).

E. Discuii
Metilarea ADN, modificarea histonelor i microARN-urile sunt trei mecanisme
epigenetice implicate n dezvolaterea cancerului.
Hipometilarea global determin supraexprimarea oncogenelor, activarea
retrotranspozonilor i instabilitate cromozomial avnd astfel un rol important n iniierea i
meninerea fenotipului malign.
Mecanismul care determin hipometilarea n cancer nu este pe deplin elucidat, dar se
cunoate faptul c hipometilarea caracterizeaz majoritatea carcinoamelor.
Studii anterioare sugereaz utilizarea metilrii ADN ca i marker molecular n
identificarea precoce a cancerului de plmn i n diagnosticul i prognosticul bolii maligne [20].
Profilul de metilare poate varia de la un tip celular la altul [21]. Astfel, n acest studiu au fost
folosite 6 linii celulare de NSCLC aparinnd la diferite subtipuri: cancer de plmn cu celule
largi (U1810), de tip carcinoma scuamos (U1752, H125 and H157) i adenocarcinom (H23,
A549) precum i 2 linii celulare primare de GB (18 and 38).
n liniile celulare de GB, gena Igf-1r a fost identificat ca i potenial marker genetic
[22], iar n cazul cancerului pulmonar funcionalitatea genei este asociat cu un prognostic
nefavorabil.
Dei mecanismele care conduc la exprimarea de protein IGF-1R se cunosc, cele
raspunztoare de supraexprimarea oncogenei Igf-1r nu sunt pe deplin elicidate. Spre deosebire de
ali receptori tirozin kinazici, n cazul genei Igf-1r nu au fost descrise mutaii n cancer, cu
excepia amplificrii locusului Igf-1r la nivelul 15q2, n cteva cazuri de cancer de sn i
melanoma [1].
Nivelul de exprimare al genei Igf-1r este determinat n mare msura la nivel de
transcriere. Posibilitatea ca metilarea aberant a genei s fie mecanismul responsabil de nivelul
crescut de expresie genic n cancer a fost principalul obiectiv al acestui studiu. Aceast ipotez
este ncurajat de alte studii care demonstreaz importana hipometilrii ADN n acumularea
fenotipului malign. Hipometilarea este unul din mecanismele rspunzatoare pentru activitatea
crescut a altor proto-oncogene: membrii ai familiei Eph de receptori tirozin kinazici (RTK), i
oncogenele c-fms, erbB2/neu, c-myc, hox11, h-ras i c-ros.
Prin utilizarea programului MethPrimer, la nivelul regiunii promotoare al oncogenei
Igf-1r au fost identificate dou insule CpG cu un coninut ridicat de dinucleotide CpG. Prin
reacia de PCR specific metilarii s-a obinut un profil de metilare parial al genei n toate cele 3
subgrupuri de NSCLC i n cele 2 linii celulare primare de GB. Metilarea parial este definit
prin prezena att a produilor de amplificare cu amorsele metilate ct i a celor cu amorsele
nemetilate.
Dar, semnificaia acestei metilri pariale nu este pe deplin neleas. Studii anterioare au
identificat un profil de metilare parial al genei hTert n mai multe linii celulare, dar toate aceste
linii celulare au exprimat proteina- telomeraza. Metilarea parial n acest caz nu a putut fi
corelat cu nivelul de expresie al ARNm sau al proteinei hTERT, indicnd faptul c metilarea
parial exist i nu afecteaz expresia de gen.

Un profil de metilare parial a fost identificat i pentru gena Aprt care codific proteina adenina
fosforibiziltransferaz, iar acest profil este meninut att in vitro ct i in vivo.
Legtura dintre profilul de metilare i expresia proteic corespunztoare genelor metilate este
bine stabilit. Expresia de protein IGF-1R a fost analizat prin metoda Western Blot. In mod
surprinzator, toate liniile celulare de NSCLC i de GB au exprimat proteina IGF-1R.
Profilului de hemimetilare al oncogenei Igf-1r ar putea avea o semnificaie major avnd in
vedere faptul c metilarea parial nu a fost obinut pentru ADN-ul genomic total metilat
(control pozitiv al fragmentului metilat) sau pentru ADN extras din snge (control pozitiv al
fragmentului nemetilat).
Pentru a identifica funcionalitatea acestui mecanism de metilare parial al oncogenei
Igf-1r, celulele in cultur au fost tratate cu SAM, principalul donor de grupri metil in reaciile
biochimice.
Mai multe studii au sugerat c administrarea exogen a SAM determin scderea
viabilitii celulelor canceroase prin hipermetilarea ADN la nivelul genelor implicate n creterea
celular [23] iar SAM induce apoptoza n celulele canceroase din ficat [24].
n acest studiu a fost luat n considerare posibilitatea ca SAM s induc hipermetilarea
receptorului avnd drept consecin scderea viabilitii celulare prin inactivarea nivelului de
protein IGF-1R.
Rspunsul liniilor celulare la tratamentul cu SAM a fost diferenial, si nu a putut fi corelat cu
subtipul celular n NSCLC. n cazul liniilor de GB, linia celular 38 a fost mai senzitiv la
tratamentul cu SAM dect linia 18.
Observnd efectul antiproliferativ indus de SAM n toate liniile celulare, s-a analizat posibilitatea
ca aceast citotoxicitate sa fie rezultatul hipermetilrii oncogenei Igf-1r.
n urma tratamentului cu SAM nu s-au observat modificri n profilul de metilare al genei sau n
nivelul de exprimare al proteinei IGF-1R, astfel nct efectul citotoxic al tratamentului cu SAM
este independent de metilarea ADN la nivelul genei Igf-1r. Dar alte gene iniial hipometilate ar
putea fi rspunztoare de efectul citotoxic indus de SAM. Rezultatele obinute indic faptul c
metilarea parial al genei Igf-1r nu influeneaz nivelul de expresie al genei sau al proteinei
IGF-1R. Astfel metilarea ADN nu este mecanismul rspunztor pentru supraexprimarea
oncogenei/proteinei Igf-1r n cancerul de NSCLC i de GB.
n a doua parte a studiului, a fost investigat profilul de metilare al genelor tumorale
supresoare p16 i Rb1 n aceleai culturi celulare de NSCLC i GB.
Prin reacia de PCR specific metilrii s-a obinut metilarea genei p16 n 2 linii celulare de
NSCLC, U1810 i H23 i n linia de GB, 18. n cazul liniilor celulare U1752 i H157 precum i
n linia de GB 38, gena p16 a fost nemetilat.
Studiul prezent poate fi considerat primul care i-a propus s identifice metilarea genei
p16 n liniile de NSCLC U1810 i H23 i n linia celular primar de GB, 18.
Metilarea genei Rb1 nu a fost observat n nici una din liniile celulare analizate, chiar dac exist
studii care indic inactivarea genei Rb1 in multe tipuri de cancer de plmn [25].

Liniile celulare de NSCLC, U1810 i H23 precum i linia de GB, 18 caracterizate prin metilarea
genei p16 nu conin proteina P16, n timp ce liniile celulare de NSCLC, U1752 i H157 precum
i linia de GB 38 sunt caracterizate prin expresia endogen a proteinei P16, iar n urma reaciei
MSP s-a obinut amplificare cu amorsele nemetilate.
Pentru a determina posibilitatea reversibilitii reaciei de metilare n liniile celulare cu
gena p16 iniial metilat, celulele in cultur au fost tratate cu concentraii cresctoare de 5AzadC. n celulele unde gena p16 a fost iniial metilat, iar proteina P16 absent, s-a obinut
reversibilitatea reaciei de metilare, 5Aza-dC inducnd re-exprimarea proteinei P16 si
amplificare cu amorsele nemetilate. Astfel in cazul liniilor U1810 si H23, gena-proteina P16 au
fost reactivate la o concentraie de 5M 5Aza-dC, iar in linia de GB 18, reactivarea
genei/proteinei P16 a fost indus la o concentraie de 2M 5Aza-dC. Pentru a determina efectul
reversibilitii reaciei de metilare al genei p16 asupra viabilitii celulare, n acest scop a fost
folosit testul MTT.
Deoarece rspunsul celular la tratamentul cu 5Aza-dC a fost similar n toate liniile celulare de
NSCLC, se poate presupune c rezultatul se datoreaz numai parial re-exprimrii genei tumorale
supresoare p16. O explicaie alternativ a acestui fenomen este activitatea citotoxic a agentului
folosit sau inducerea unor modificri, care pot induce deasemenea moartea celular.
n doar 2 din liniile celulare de NSCLC, gena tumoral supresoare p16 a fost inactivat prin
mecanismul de metilare ADN, sugernd posibilitatea c inactivarea genei p16 este rezultatul
metilrii de novo datorat pasajelor celulare successive.
De asemenea, lipsa metilrii genei in celelalte 3 linii celulare de NSCLC, sugereaz
faptul ca ali factori de cretere controlai prin mecanismul de metilare ADN pot induce scaderea
viabilitii celulare i pot fi utilizai ca i poteniali ageni terapeutici. Pe de alta parte, n cancerul
de GB, n linia celular 18 cu gena p16 iniial metilat s-a obinut o scdere considerabil a
viabilitii celulare dup tratamentul cu 5Aza-dC n comparaie cu linia celulara 38, sugernd
importana genei p16 n cancerul de GB.

F. Concluzii

n regiunea promotoare a oncogenei Igf-1r au fost identificate 2 insule CpG


analiza prin reacia de PCR-ul specific metilrii a evideniat un profil de metilare
parial al genei Igf-1r n liniile celulare de NSCLC i GB
expunerea celulelor n cultur la agentul de metilare SAM nu a determinat modificri n
profilul de metilare parial al genei/proteinei Igf-1r
viabilitatea celular redus n urma tratamentului cu SAM este datorat unui alt
mecanism dect hipermetilarea oncogenei Igf-1r
metilarea ADN nu este mecanismul rspunztor pentru supraexprimarea genei/proteinei
Igf-1r n cancerul de NSCLC i GB in vitro.
gena tumoral supresoare p16 este hipermetilat n 2 linii celulare de NSCLC: H23 i
U1810 i n linia de GB 18

tratamentul cu un agent de demetilare - 5Aza-dC determin reversibilitatea reaciei de


metilare ADN la nivelul genei p16 i reexprimarea de protein P16 n liniile celulare cu
gena iniial metilat.
viabilitatea celular sczut observat dupa tratamentul cu 5Aza-dC este datorat cel
puin paial reexprimrii genei/proteinei P16.
Rb1 nu este metilat n nici una din linile celulare luate n studiu.

Alte studii sunt necesare pentru determinarea importanei biologice a profilului de metilare
parial a oncogenei Igf-1r si n alte tipuri de cancer.
Reactivarea genelor de control al creterii celulare reprimate iniial prin metilare de novo
sugereaz posibilitatea aplicaiei clinice a agenilor de demetilare/hipermetilare n tratamentul
cancerului. Profilul de metilare al oncogenelor i al genelor tumorale supresoare mpreun cu ali
markeri moleculari pot fi folosii n elaborarea unei terapii personalizate i evaluarea
prognosticului individualizat.

H. Bibliografie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.

Almeida, A., et al., The insulin-like growth factor I receptor gene is the target for the 15q26 amplicon in
breast cancer. Genes Chromosomes Cancer, 1994. 11(1): p. 63-5.
Dricu, A., et al., Expression of the insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) in breast cancer cells:
evidence for a regulatory role of dolichyl phosphate in the transition from an intracellular to an
extracellular IGF-1 pathway. Glycobiology, 1999. 9(6): p. 571-9.
Cosaceanu, D., et al., Comparison of three approaches for inhibiting insulin-like growth factor I receptor
and their effects on NSCLC cell lines in vitro. Growth Factors, 2007. 25(1): p. 1-8.
Kiaris, H., et al., Growth hormone-releasing hormone: an autocrine growth factor for small cell lung
carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(26): p. 14894-8.
Xiao, X.Y., et al., Chromosomal alteration in Chinese sporadic colorectal carcinomas detected by
comparative genomic hybridization. Diagn Mol Pathol, 2007. 16(2): p. 96-103.
Figueroa, J.A., et al., Proliferation of cultured human prostate cancer cells is inhibited by insulin-like
growth factor (IGF) binding protein-1: evidence for an IGF-II autocrine growth loop. J Clin Endocrinol
Metab, 1995. 80(12): p. 3476-82.
Xie, Y., et al., Expression of insulin-like growth factor-1 receptor in synovial sarcoma: association with an
aggressive phenotype. Cancer Res, 1999. 59(15): p. 3588-91.
Chakravarti, A., J.S. Loeffler, and N.J. Dyson, Insulin-like growth factor receptor I mediates resistance to
anti-epidermal growth factor receptor therapy in primary human glioblastoma cells through continued
activation of phosphoinositide 3-kinase signaling. Cancer Res, 2002. 62(1): p. 200-7.
Cooke, D.W., et al., Analysis of the human type I insulin-like growth factor receptor promoter region.
Biochem Biophys Res Commun, 1991. 177(3): p. 1113-20.
Werner, H., et al., Structural and functional analysis of the insulin-like growth factor I receptor gene
promoter. Mol Endocrinol, 1992. 6(10): p. 1545-58.
Serrano, M., G.J. Hannon, and D. Beach, A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific
inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993. 366(6456): p. 704-7.
Herman, J.G., et al., Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant
DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res, 1995. 55(20): p. 4525-30.
Merlo, A., et al., 5' CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumour
suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancers. Nat Med, 1995. 1(7): p. 686-92.
Brodin, O., L. Lennartsson, and S. Nilsson, Single-dose and fractionated irradiation of four human lung
cancer cell lines in vitro. Acta Oncol, 1991. 30(8): p. 967-74.

15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.

Hagerstrand, D., et al., Characterization of an imatinib-sensitive subset of high-grade human glioma


cultures. Oncogene, 2006. 25(35): p. 4913-22.
Herman, J.G., et al., Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.
Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(18): p. 9821-6.
Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-54.
Li, L.C. and R. Dahiya, MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics, 2002.
18(11): p. 1427-31.
Bai, M., Y. Jin, and X. Zhang, [Effect of exogenous p16 gene on biological behaviors of human lung
cancer]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi, 2001. 24(8): p. 465-8.
Tomizawa, Y., et al., Clinicopathological significance of epigenetic inactivation of RASSF1A at 3p21.3 in
stage I lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res, 2002. 8(7): p. 2362-8.
Costello, J.F., et al., Aberrant CpG-island methylation has non-random and tumour-type-specific patterns.
Nat Genet, 2000. 24(2): p. 132-8.
Hui, A.B., et al., Detection of multiple gene amplifications in glioblastoma multiforme using array-based
comparative genomic hybridization. Lab Invest, 2001. 81(5): p. 717-23.
Shukeir, N., et al., Alteration of the methylation status of tumor-promoting genes decreases prostate cancer
cell invasiveness and tumorigenesis in vitro and in vivo. Cancer Res, 2006. 66(18): p. 9202-10.
Lu, S.C. and J.M. Mato, S-Adenosylmethionine in cell growth, apoptosis and liver cancer. J Gastroenterol
Hepatol, 2008. 23 Suppl 1: p. S73-7.
Kelley, M.J., et al., Differential inactivation of CDKN2 and Rb protein in non-small-cell and small-cell
lung cancer cell lines. J Natl Cancer Inst, 1995. 87(10): p. 756-61.