Hidroxilamina como agente mutagnico para NeurosporaCrassa

Resumen
La mutagenicidad de Hidroxilamina (HA) ha sido probada en 8 diferentes mutantes de
Neurosporacrassa, auxtrofas a Adenina (ad-3B):
4 mutantes de este set de prueba se revirtieron despus del tratamiento con cido nitroso y
metanosulfonato de etilo, indicando que estos se revirtieron por una substitucin de un par de
bases;2 mutantes se revirtieron solo despus del tratamiento con ICR-170, indicando que estos
se revirtieron por una insercin o delecin de un par de bases; y 2 mutantes se revirtieron solo
espontneamente.
La HA indujo reversiones en 3 de los 4 mutantes, los cuales se revirtieron por la sustitucin de un
par de bases y en ningn otro. La especificidad de accin de HA en los mutantes en el presente
set de prueba es consistente con la hiptesis de que la clase predominante de las alteraciones
genticas inducidas por HA en Neurosporacrassaes la transicin de un par de bases, de GuaninaCitosina a AdeninaTimina. Adems se encontr que la frecuencia de reversin despus del
tratamiento con HA aument en proporcin al cuadrado del tiempo del tratamiento.

Introduccin
HA induce una sustitucin de un par de bases en fagos y el tipo de alteracin gentica es
preferentemente de G-C a A-T. La reaccin qumica entre HA y DNA ha sido analizada por FREESE
et al, quien encontr que HA reacciona solo con citosina y HMC. El tratamiento de RNA con HA
altera ambos: Uracilo y Citosina; a pH=6.1 la reaccin es mucho ms rpida con Citosina que con
Uracilo, mientras ms alto el pH, la relacin es a la inversa. HA ha mostrado inducir dao
cromosomal en clulas de mamferos, pero ningn ensayo previo ha sido exitoso en identificar
las alteraciones genticas inducidas por HA en eucariotes a nivel molecular. La caracterizacin
de mutaciones en Neurospora inducidas por HA es particularmente importante porque podra ser
tan especfico en eucariotes como en fagos, produciendo mutaciones por sustitucin de par de
bases, resultando en transiciones de GC a AT. Tal especificidad podra hacer a HA especialmente
idnea para la caracterizacin de alteraciones genticas inducidas por mutgenos menos
especficos a nivel molecular por el significado de las pruebas para reversibilidad especfica. La
prueba para la induccin de reversiones en mutantes resultantes de alteraciones genticas
conocidas es un mtodo ms simple para caracterizar los efectos genticos de mutgenos que
ninguna tcnica conocida que se aplique despus de la mutacin en Neurospora. La
caracterizacin estlimitada por la coleccin de alteraciones genticas en el mutante que
comprende este set de prueba. Sin embargo, seleccionando el revertimiento de mutantes por las
alteraciones genticas ms comunes es posible obtener una aproximacin del espectro de
alteraciones genticas producidas por un mutgeno dado.
En este documento un set de prueba de mutantes ad-3B formado por 4 mutantes los cuales se
reviertieron solo por la sustitucin de un par de bases, 2 mutantes que se revirtieron solo por la
insercin o delecin de un par de bases, y 2 mutantes los cuales se revirtieron solo
espontneamente donde estos se trataron con HA y despus proyectados para detercar
reversiones al tipo solvestre. Los resultados de esta prueba muestran claramente que en HA
produce reversin en aquellas cepas de Neurospora que se revirtieron por una sustitucin de un
par de bases. La especificidad de accin de HA en los mutantes en el presente set de prueba es

consistente con la hiptesis de que la clase predominante de alteraciones genticas inducidas

por HA en Neurospora es una transicin de un par de bases, de GC a AT.

Materialesy mtodos
(a)

Cepas

Los mutantes con el prefijo 2-17 fueron inducidos por cido Nitroso en la cepa de Neurospora del
tipo silvestre 74 A. El mutante No. 5-4-I es de origen espontneo. Los mutantes han sido aislados
por el mtodo directo.

(b)

Preparacin del cultivo

En todos los experimentos el tratamiento mutagnico fue llevado a cabo en suspensin de

cosecha de conidios, de matraces Erlenmeyer de 125ml con 20ml demedio completo de glicerol
(10ml
glicerol/l
en
lugar
de
20ml)
mas
Sulfato
de
Adenina
(25mg/L).
Los matraces fueron inoculados y despus incubados por 1 da a 30 C y despus de 6-9 das a
25 C, los conidios fueron cosechados primero agitndolos con perlas de vidrio (4mm de diam)
para romper las cadenas de conidios, despus fueron suspendidos en solucin salina (0.9%)
filtradas a travs de un colador de platino, lavados 2 veces por centrifugacin y luego
resuspendidos en solucin salina, los mutantes Ad-3 difieren entre ellos con respecto al
desarrollo del pigmento purpura en el micelio y conidios cuando crece en medio completado con
glicerol, pero al aadir 250 mg de Sulfato de Adenina/L la acumulacin de pigmento purpura es
eliminado.
La densidad de la suspensin de conidios fue medida en un colormetro en el pico de absorcin
de 750m.

(c)

Tratamiento

Todos los tratamientos fueron llevados a cabo con suspensin de conidios en matraces
Erlenmeyer en un agitador rotatorio en bao de agua a 25 C para mantener a los conidios en
suspensin durante el tratamiento. 5 minutos antes de finalizar el tratamiento los conidios fueron
centrifugados y el sobrenadante fue decantado. Al momento del enfriamiento despus del
tratamiento con cualquiera de los agentes: NA, EMS o ICR-170, los conidios fueron resuspendidos
en una solucin salina (minimo de Fries) ajustado a pH 8 con NaOH.
Este procedimiento se realiz por duplicado.
La solucin de sal mnimo de FRIEs ajustado a pH se ha usado para determinar inmediatamente
la reaccin entre clulas y compuestos alquilantes y NA.

(d)

Tratamiento con NA

Los conidios fueron suspendidos en Acetato de sodio 0.05M buffer a pH 4.5. Un volumen de
preparado fresco de solucin de Nitrato de sodio a 0.02M fue aadido a 3 volmenes de conidios.
La concentracin final de NaNO 2 fue de 0.005M y el tratamiento fue finalizado como se describe
anteriormente 40 min despus de iniciar el tratamiento

(e)

Tratamiento con EMS

Los conidios fueron suspendidos en buffer de Fosfato a 0.067M a pH de 7. El tratamiento se

comenz aadiendo suficiente EMS para llegar a la concentracin final 0.1M, el tratamiento
suspendido 300 min despus

(f)
ICR-170

Tratamiento con ICR-170

es

el

cdigo

numrico

asignado

Metoxi-6

cloro-9-(3-

[ etil2cloroetil ] -

aminopropilamino)
Clorhidrato
de
acridina.
Los conidios fueron suspendidos en un buffer de Fosfatos a 0.067 M pH de 7. El tratamiento se
comenz adicionando 1 volumen de Solucin de ICR-170 (250mg/L H 2O) recin preparada a 49
volmenes de la suspensin de conidios, que da una concentracin final de 10.5M. El
tratamiento fue terminado como se describi anteriormente 130 min despus del comienzo del
tratamiento. El tratamiento y otras manipulaciones incluyendo ICR-170 y conidios fueron
realizadas bajo luz roja para eliminar los efectos fotodinmicos asociados con el anillo de
acridina, las placas tambin fueron incubadas en la oscuridad por lo menos 24 h para dar tiempo
a los conidios de crecer a pequeas colonias.

(g)

Tratamiento con HA

Antes del tratamiento con HA, los conidios fueron suspendidos en NaCL 3M y a continuacin
diluidos 5 veces en la reaccin de HA, dando una concentracin final de HA de 1M . 5min despus
el tratamiento fue terminado, los conidios fueron centrifugados y decantados, y al momento de
terminar los conidios fueron resuspendidos en NaCl 3M. Este procedimiento de lavado se realiz
2 veces y despus los conidios fueron suspendidos en la solucin de sal del medio mnimo de
FRIES ajustado a pH 8.

(h)

Medio en placa

Para estimar la viabilidad del tratamiento y de los conidios sin tratar, fueron sembrados en un
medio de Westergaard suplementado con Sorbosa, glucosa, fructosa, cido casamnico, una
solucin de vitamina como en el completado de glicerol y Sulfato de Adenina.
Para estimar el nmero de reversiones los conidios fueron sembrados en el mismo substrato
usado para conteo de sobrevivientes pero suplementado con 0.2mg/L de Sulfato deAdenina en
lugar
de
25
mg/L.
6
5
Los conidios fueron colocados en placas a una densidad de 10 /mL y 2x10 conidios/mL. Para el
conteo de reversiones despus de los tratamientos con NA, EMS o ICR-170 la densidad de los
conidios fue de 2x108 en un volumen total de 500mL
Para el conteo de las reversiones despus del tratamiento con HA la densidad de los conidios fue
de 2x105/ml en un volumen total de 500ml.

(i)

Prueba estadstica

La prueba para significancia est hecha de acuerdo a BIRNBAUM. EL nmero de reversiones es

considerado como tener una distribucin de Poisson. La probabilidad es calculada asumiendo
que las sig 2 relaciones pertenecen a la misma poblacin.

tratar
que sobrevivi desp .del tratamiento

sin + poblacin total

poblacintotal
poblacin total (que sobrevivi despus deltratamiento)

Nmero total de reversiones enla poblacin tratada

Nmero total de reversiones en la poblacin sin tratar+ nmero total de reversiones en la pob .tratada
Una probabilidad menos a 5% indica una diferencia significativa entre el nmero de reversiones
en el control y las series tratadas.

Resultados y Discusin
(a) Supresores
La identificacin de la alteracin gentica por mutante determinando la especificidad en la
induccin de reversiones despus del tratamiento con agentes diferentes se puede distorsionar
por la aparicin de mutaciones por supresin junto con mutaciones por reversin. Los que se
revirtieron de 20 mutantes diferentes inducidos en el Loci ad-3, han sido analizados por la
ocurrencia de supresores extragenticos, y ninguno fue encontrado, por lo tanto nosotros
podramos asumir que las ocurrencias de supresores fuera de los locus ad-3A o ad-3B son raros o
que no ocurren.
La influencia de los supresores en la identificacin de las alteraciones genticas en mutantes ad3 ser discutido a continuacin en otro documento. Adems se est haciendo un anlisis
detallado de reversiones inducidas de mutantes ad-3P para proveer ms informacin en este
punto. Sin embargo, desde las reversiones de los mutantes en el presente set de prueba
aparecieron antes y estn en la parte principal sin acumular pigmentos purpuras usualmente
producidos por mutantes ad-3, probablemente parece que la frecuencia de supresores extra
gnicos en el anlisis presente es baja.

(b) Alteraciones genticas inducidas por HA

La mutagenicidad de HA ha sido estudiada para determinar si hay especificidad en su actividad
de accin por inducir reversiones con un set de prueba de 8 mutantes (Tabla 1). Basndose en
los datos presentes, 4 de estas cepas parecen ser revertidas solo por sustitucin de un par de
bases (reversible por NA y EMS), 2 cepas parecen ser revertidas por la insercin o delecin de un
par de bases (solo reversible por ICR-170), y 2 cepas se revirtieron solo espontneamente.
ICR-170 es un gas de mostaza de acridina monofuncional; mutaciones adelantadas inducidas por
ICR-170 en Neurosporacrassa principalmente parecen ser inserciones o deleciones de un par de
bases. Por lo tanto es posible asumir que los mutantes que se revierten despus del tratamiento
con ICR-170 y no despus del tratamiento con NA y EMS, que predominantemente inducen
sustitucin en un par de bases, se revierten por una insercin o delecin de un par de bases. Sin
embargo se encontr que los mutantes que se revirtieron por una sustitucin en un par de bases
tambin
se
revirtieron
despus
del
tratamiento
con
ICR-170.
Esto puede explicarse por el hecho de que ICR-170 es un gas de mostaza monofuncional y

adems capaz de alquilar, el resultado de una alquilacin en el DNA es usualmente una

sustitucin
de
un
par
de
bases.
Las frecuencias de reversin despus del tratamiento con HA son bajas comparadas con las
frecuencias de reversin despus del tratamiento con NA y EMS en frecuencia comparables de
sobrevivencia. La cepa 2-A-ISS ha sido tratada con HA a pH 6.2 por varios periodos de tiempo.
Una expresin directa para mostrar que HA tiene un efecto mutagnico en Neurospora puede
obtenerse calculando la relacin (M/Mo) donde M= nmero de las reversiones x10 6 conidios
despus del tratamiento con HA y Mo= Nmero de reversiones espontneas x10 6 conidios. En la
figura 1 se puede ver que nosotros obtuvimos 8 tiempos de muchos mutantes en las series
tratadas con HA como en el control. Nosotros podemos adems concluir que HA es mutagnico
en Neurospora. La sobrevivencia no fue ms baja que un 42% aun para los tratamientos ms
largos (fig 2). Se encontr que HA indce reversiones en 3 de las 4 cepas, las cuales se revirtieron
por la sustitucin de un par de bases (Tabla 1).
La falla de la sustitucin de mutantes de cierto par de bases para revertir con HA puede ser
explicada si asumimos que este induce predominantemente transiciones de GC a AT en
Neurospora
como
lo
hace
en
fagos.
Si este fuera el caso, entonces podramos esperar que existen mutantes por sustitucin de un
par de bases, que no pueden ser revertidos por HA.

(c) La cintica de reversiones por induccin.

La frecuencia de reversiones inducidas por HA no son proporcionales al tiempo en Neurospora
pero siguen una cintica de 2do orden (Fig 3). Sin embargo las mutaciones hacia adelante y en
reversa inducidas por HA en fagos siguen una cintica de 1er. Esta inconsistencia podra resultar
de muchos mecanismos: (1) que una reversin inducida en Neurospora debe expresarse por si
sola en un conidio, el cual tiene un promedio de 2 ncleos. (2) Que el tratamiento con HA
promover una penetracin ms rpida de HA dentro de la clula, o ms probable (3) que la
reaccin de HA con citosina ocurre en 2 pasos, y que la velocidad de la reaccin de los 2 pasos
son
casi
iguales
en
Neurospora
que
en
fagos.
La velocidad de reaccin en citosina con HA depende del pH; al incrementar el pH hay un
descenso en la velocidad de reaccin. Experimentos para investigar la relacin entre el
mecanismo de mutagnesis de HA en virus y Neurospora estudiando el efecto del pH en las
velocidades de mutacin estn en progreso.

(d) Promocin de mutaciones inducidas por HA

Los experimentos se han llevado a cabo para obtener informacin ms detallada de los efectos
genticos de HA en Neurospora por tratamiento de un dicarionte balanceado genticamente
marcado.
Las frecuencias de mutaciones adelantadas despus de las 6 h de trataiento bajo las condiciones
fueron de 600 mutantes de conidios sobrevivientes x10 8 . Las mutaciones obtenidas en este
sistema de prueba estn en proceso de ser analizadas con respecto al genotipo (1 o multiples
mutaciones de locus), la complementacin allica (% de mutantes complementarios as como los
tipos de patrones de complementacin) y reversibilidad especfica despus del tratamiento con
NA, EMS, ICR-170 u otros agentes y ser reportado en otra parte.

Investigacin soportada por Institutos Nacionales de Salud y por la comisin de energa atmica
de EU bajo el contrato con la UnionCorbideCorporation.