Un mtodo mejorado para la extraccin y en capa fina

Cromatografa de clorofila a y b de la espinaca

La separacin cromatogrfica de los pigmentos de las plantas tiene tanto

histricos (1) y prctica (2) la importancia y como resultado se ha mantenido
un experimento popular y bien estudiado en el plan de estudios de laboratorio
qumico. Por otra parte, este experimento sigue siendo popular porque los
estudiantes pueden relacionarse fcilmente con los materiales utilizados y los
pigmentos involucrados, incluida la clorofila A y B, as como -caroteno, que se
observan fcilmente sin la necesidad de lmparas UV o qumica o fsica de
tratamiento post-cromatogrfico de las placas de TLC. Varias mejoras han sido
reportados en la literatura que aborda las dificultades tanto con la preparacin
de la muestra (3-5) y las condiciones cromatogrficas (6-8) usados. Por
ejemplo, la extraccin de pigmentos relativamente no polares en un disolvente
orgnico adecuado se complica por la presencia de agua en la hoja de espinaca
cruda (u otra fuente de pigmento). Tambin muchos de los sistemas de
disolventes cromatogrficos reportados para esta separacin no resuelven
adecuadamente la clorofila a y la clorofila b el uno del otro o de otros
pigmentos presentes en la muestra. Existe una complicacin adicional en que
los pigmentos para ser aislados son susceptibles a la degradacin (7-11) dando
como resultado la observacin de los materiales que no son representativos de
los pigmentos en la planta. Presentamos mejoras significativas tanto en la
preparacin de la muestra y la fase mvil para la extraccin y la separacin de
los pigmentos de las plantas. Este mtodo simple y rpido resuelve claramente
la clorofila a y b de las hojas de espinaca sobre placas de TLC analticas y
reducir al mnimo la aparicin de productos de degradacin de la clorofila.
Procedimiento experimental
General
Disolventes y muestras de referencia fueron adquiridos de Aldrich Chemical
Company y se utilizaron sin purificacin adicional. Las placas de TLC tambin
se adquirieron de Aldrich y estos experimentos se optimizaron utilizando placas
de gel de slice sobre un soporte de polister que contiene un indicador
fluorescente.
Se obtuvieron resultados comparables en placas de TLC sin el indicador
fluorescente. Las placas de TLC Merck aluminio respaldo pueden ser sustituidos
pero dan valores de Rf de aproximadamente 15% menor que las placas de
polister respaldado correspondientes. La arena utilizada se obtuvo a partir de
Ward (Ottawa Sand) y es mucho ms grande en tamao de partcula que la
arena utilizada para aplicaciones cromatogrficas. Una descripcin completa de
los nmeros de catlogo y nmeros de registro CAS de todos los materiales
utilizados, as como el material de laboratorio utilizado por los estudiantes est
disponible en el material complementario.

Preparacin de la muestra
espinacas frescas o congeladas (0,5 gramos) se combin con 0,5 gramos de
sulfato de magnesio anhidro y 1,0 gramo de arena. La mezcla se moli en un
mortero hasta obtener un polvo de color verde claro (5-10 minutos). El slido
de color verde claro se transfiri a un tubo de ensayo pequeo que contiene
2,0 ml de acetona. Esta mezcla heterognea se agita para asegurar una mezcla
completa de la acetona y el slido. Esta mezcla se dej en reposo durante 10
minutos y la solucin de acetona verde se elimin mediante una pipeta y se
transfiere a un tubo de microcentrfuga. El extracto de acetona se mantuvo
cerrado cuando no se est utilizando activamente. Alternativamente un
molinillo de caf se utiliz para preparar mayores cantidades de material slido
para la extraccin de acetona posterior. En este caso 5,0 gramos de espinaca
fresca o congelada se combin con 5,0 gramos de sulfato de magnesio anhidro
y 10 gramos de arena en un molino de caf comercial y se moli durante 5
segundos. La pulpa de la hoja de la parte superior y los lados del contenedor
de molino se rasp de nuevo a la parte inferior del molino y la masa durante 30
segundos adicionales.
Se extrajo el polvo resultante como se describe anteriormente (2,0 gramos de
slido con 2,0 ml de acetona).

La separacin de TLC
placas de TLC (3,5 cm x 9,0 cm) se cortaron de las hojas disponibles
comercialmente. El extracto de acetona fue transferida de la manera estndar
y las placas se eluyeron en una cmara cerrada con la siguiente fase mvil:
60% de ter de petrleo (pe 35-60 C?) 16% de ciclohexano 10% de acetato de
etilo al 10% de acetona???? 4% de metanol. El orden de elucin de usar este
sistema de disolventes de elucin fue -caroteno (Rf = 0,95), clorofila a (Rf =
0,44), clorofila b (Rf = 0,32), y la xantofila (Rf = 0,16). muestras purificadas
comerciales de -caroteno, clorofila a, clorofila b y se utilizaron como controles.

Desmetalizacin del extracto de espinaca

resina Dowex 50WX8 H + (100 mg) se combin con 100 l de extracto de
acetona espinacas descrito anteriormente. Esta mezcla se dej reposar durante
3 minutos y una pequea muestra se retir usando un aplicador de TLC. Esta
muestra se someti a cromatografa como se describe anteriormente. Este
breve tratamiento con resina de intercambio inico result en la prdida
completa de la clorofila de una banda y la aparicin de tanto feofitina a (Rf = 0
0,60) y feofitina b (Rf = 0,49).

Peligros

No hay riesgos inusuales asociados con este experimento.

Se deben observar la correcta manipulacin y eliminacin de los disolventes
utilizados. Los disolventes orgnicos utilizados en este experimento son
inflamables y deben ser aislados de fuentes de ignicin, tales como el molinillo
de caf descrito en el experimento.
Resultados y discusin
La extraccin y la separacin de pigmentos de las plantas es una introduccin
comn a cromatografa y se encuentra en muchos manuales de laboratorio
(12-14). La extraccin directa de los pigmentos de las plantas de espinaca se
complica por la presencia de agua. Dado que la separacin cromatogrfica se
ver afectada por incluso pequeas cantidades de agua, a menudo se requiere
una separacin mayor del extracto utilizando un embudo de separacin (o
tcnicas de microescala comparables) seguido de secado de la capa orgnica
con un agente de secado adecuado (2, 3, 6, 11-14). Una complicacin adicional
surge en esta separacin, debido a la estabilidad limitada bien documentado
de los pigmentos de clorofila (7-10). Esto puede ser confuso para el estudiante
ya que la muestra puede producir tanto los pigmentos esperados y productos
de degradacin de colores con valores de Rf similares. Uno de los productos de
degradacin ms comunes es la prdida del ion magnesio de la clorofila que
resulta en la formacin de la feofitina de color en un Rf mayor que la clorofila
originales. Feofitina a y b se observan a Rf valores coherentes con los informes
de la literatura (7), adems de la correspondiente clorofila A y B cuando se
seca o espinacas congeladas se utiliz para preparar el extracto (Figura 1).
Estos productos de degradacin tambin se encuentran en las muestras de la
clorofila A y B purificadas disponibles en el mercado. La desmetalizacin de la
clorofila usando cidos fuertes se ha descrito previamente (7-10) y hemos
encontrado que puede efectuarse fcilmente por un breve tratamiento del
extracto de pigmento con una resina de intercambio inico fuerte.
El tratamiento del extracto de espinacas con la resina de intercambio inico
result en la conversin completa de la clorofila A a feofitina a y la
desmetalizacin parcial de la clorofila b, como se muestra en la Figura 1C. Este
procedimiento se puede usar para confirmar la presencia del pigmento
desmetalizado en muestras parcialmente degradados.
mtodos de extraccin que se basan en el secado de las hojas de espinaca o el
almacenamiento de la solucin del extracto orgnico por perodos prolongados
resultado en cierta degradacin pigmento que complica el anlisis de TLC.
Adems, estos procedimientos requieren una cantidad sustancial de tiempo
asignado a la extraccin de pigmentos antes del anlisis cromatogrfico. En
contraste, el mtodo descrito aqu es rpido, fiable y no requiere una etapa de
extraccin o secado separado. El estudiante muele la hoja de espinaca fresca
con arena y secado agente seguido por extraccin directamente en acetona. La
arena ayuda a lisar las clulas y acta como un material inerte, que mejora el
proceso de extraccin. El sulfato de magnesio anhidro, en las cantidades
utilizadas, es suficiente para eliminar toda el agua presente (0,5 gramos de

MgSO4 puede quitar una masa igual de agua, produciendo el heptahidratado).

Esto resulta en una extraccin rpida en un disolvente seco, que es deseable
para el anlisis cromatogrfico.
sulfato de sodio anhidro tambin puede ser utilizado con resultados
comparables. El anlisis por TLC usando este procedimiento muestra los puntos
observados primaria correspondiente a -caroteno, clorofila a, clorofila b, y
xantofila como se muestra en la Figura 1A y B. Cabe sealar que algunos
pigmentos, especialmente el beta caroteno, desaparecen con el tiempo y que
la los estudiantes deben registrar sus observaciones poco despus de la
separacin es completa. La observacin de los productos de degradacin
comunes de las clorofilas (extirpacin del Mg de iones para formar las feofitinas
o productos de hidrlisis posteriores) se reduce al mnimo con este mtodo.
Adems, este mtodo slo requiere 30 minutos de tiempo de preparacin por
parte del alumno para preparar un extracto de acetona de los pigmentos
adecuados para su anlisis. Hemos encontrado que el uso de un molinillo de
caf comercial es una excelente manera de preparar cantidades mayores del
agente de secado arena? Espinacas? Slida para la extraccin de acetona. Una
cantidad diez veces mayor (suficiente para 15-20 alumnos trabajan en parejas)
se puede preparar en pocos minutos. Adems este slido se puede preparar
antes de la sesin de laboratorio, lo que reduce el tiempo total para el
experimento a aproximadamente 45 minutos, que corresponde a los
estudiantes que realizan slo la extraccin con acetona y el anlisis TLC. Si el
instructor desea que los estudiantes para llevar a cabo slo el anlisis de TLC
que resulta en un experimento de 30 minutos, a continuacin, el instructor
justo antes de la sesin de laboratorio se puede realizar la extraccin. De estas
opciones hemos favorecido la molienda manual de los materiales en un
mortero y mano de mortero para dar a los estudiantes una apreciacin de
cmo los pigmentos estn aisladas directamente de la planta.
Con este procedimiento hemos tenido estudiantes realizan la extraccin y el
anlisis cromatogrfico, utilizando muestras comerciales purificados de los
pigmentos como estndares, en menos de dos horas.
Los sistemas de disolventes descritos en la literatura a menudo dan una
resolucin aceptable entre la clorofila A y B, pero una pobre resolucin entre la
clorofila b y xantofila (Figura 2). Muchos de los sistemas de disolventes
descritos en la literatura muestran la clorofila b y la xantofila (una banda
amarilla de menor Rf) en forma de bandas superpuestas. Se evaluaron varios
disolventes de elucin y se encontr que la separacin de la xantofila amarillo
de la clorofila b se mejor por la adicin de pequeas cantidades de alcoholes
para que se encontr metanol para ser superior a etanol o isopropanol. Esto dio
lugar a nuestra adopcin de la fase mvil de cinco disolvente descrito en la
seccin experimental. Los resultados se muestran en la Figura 2A, donde esta
fase mvil muestra la resolucin completa y reproducible de la clorofila a,
clorofila b, y xantofila sin el uso de ter. Hemos utilizado este sistema de
disolvente durante dos aos en el laboratorio de grado y estudiantes hemos
observado con xito la separacin de estos tres pigmentos.

El mtodo de extraccin que describimos parece ser general y podra utilizarse

para realizar otras extracciones de productos naturales donde el agua se
elimina normalmente por un tratamiento separado. El uso de la espinaca est
destinado a ser representativa y este mtodo tambin se podra aplicar a otras
extracciones tales como la separacin de caroteno a partir de pasta de tomate,
que es otro experimento de grado comn. Hemos llevado a cabo esta
extraccin con otras plantas verdes y se han obtenido excelentes resultados
utilizando la col rizada (Brassica oleracea acephala), aunque la espinaca es una
fuente barata y conveniente de estos pigmentos.