UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE BIOLOGIE I GEOLOGIE

DEPARTAMENTUL DE BIOLOGIE EXPERIMENTAL

Miruna Georgiana Ghinia

Metode moleculare pentru studiul dezvoltrii i

organizrii reelelor neuronale din retin

Rezumatul tezei de doctorat

Coordonatori stiinifici:

Prof. Dr. Octavian Popescu

Dr. Tudor Badea
Cluj Napoca
2013
1

Cuprins
List de abrevieri ........................................................................................................................ 3
Capitolul I. Introducere ........................................................................................................... 8
Retina .................................................................................................................................. 9
Celulele retinale ganglionare ............................................................................................ 12
Diversitatea n retin ......................................................................................................... 15
Metode de studiu al celulelor retinale ganglionare ........................................................... 18
Strategii pentru generarea oarecilor mutani ................................................................... 20
Strategii condiionale ........................................................................................................ 22
Molecule reporter des folosite....................................................................................... 24
Optogenetic ..................................................................................................................... 25
Obiectivele tezei ....................................................................................................................... 27
Capitolul II. Materiale i metode .......................................................................................... 28
Metode generale ....................................................................................................................... 29
Immunohistochimie .................................................................................................................. 29
Prepararea esutului .......................................................................................................... 29
Protocolul pentru imunoflurescen dubl ........................................................................ 30
Metode de biologie molecular................................................................................................. 31
Izolarea acizilor nucleici i cuantificarea lor .................................................................... 31
Hibridizare In Situ............................................................................................................. 33
Southern blot .................................................................................................................... 39
Metode de clonare............................................................................................................. 42
Tehnici de culturi celulare......................................................................................................... 45
Cultura celulelor HEK 293 ............................................................................................... 45
Dezghearea i creterea celulelor HEK 293 ................................................................... 46
Pasajul celulelor HEK 293 ............................................................................................... 46
Crioprezervarea celulelor HEK 293................................................................................. 47
1. Analiza stratului plexiform intern a mutanilor Brn3bCKOAP/-..48
2. Analiza profilelor de exprimare a genelor n aval fa de Brn3a i Brn3b ntr-o
populaie purificat de celule retinale ganglionare............................................... ......50
Disecia i disocierea retinelor .......................................................................................... 50
Purificarea imunomagnetic a celulelor retinale ganglionare........................................... 53
3.. Strategia knock-in condiional folosind sistemul dublu de recombinare pentru studiul
dezvoltrii celulelor retinal ganglionare ..................................................................... 55
Descrierea general a strategiei folosite ..................................................................... 55
Elementele vectorului de nlocuit ............................................................................... 57
Braele de omologie i realizarea probelor ................................................................. 57
nlocuirea genelor Brn3a i Brn3b .............................................................................. 58
Markeri de selecie ...................................................................................................... 59
Tehnici de biologie molecular .................................................................................. 60
Pregtirea construtelor pentru electroporare ............................................................... 61
Manipulrile celulelor stem embrionare i electroporarea.......................................... 61
Screening pentru recombinarea omoloag.................................................................. 62
Producerea mutanilor, injecia blastocitilor i pregtirea himerelor ........................ 63
ncruciri pentru validarea sistemului ....................................................................... 63
2

4. Instrumente noi ce folosesc optogenetica pentru studiul circuitelor retinale.................. .65

Aspect general al strategiei de clonare.............................................................................. 65
Clonarea casetei CaPoChR2 n vectorul pcDNA5/FRT .................................................. 66
Clonarea genei ChR2 n vectorul pcDNA5/FRT .............................................................. 69
Linia gChR2 ....................................................................................................................70
Transfecia vectorilor n celulele HEK 293 ..................................................................... 71
Selecia pozitiv a clonelor ............................................................................................... 71
Validarea datelor ............................................................................................................... 72
Controale moleculare interne ............................................................................................ 73
Chapter III. Results and Discussion ..................................................................................... 74
1. Analiza stratului plexiform intern a mutanilor Brn3bCKOAP/-... ........75
Laminarea n stratul plexifom intern................................................................................. 75
Celule amacrine i bipolare............................................................................................... 77
Componente sinaptice n stratul plexiform intern............................................................. 79
2. Analiza profilelor de exprimare a genelor n aval fa de Brn3a i Brn3b ntr-o populaie
purificat de celule retinale ganglionare .................................................................................. 81
Populaii mbogite de celule retinale ganglionare .......................................................... 81
Controlul primar al secvenrii RNA citirile fosfatazei alcaline.................................... 82
Exprimarea genelor Brn3 .................................................................................................. 84
Analiza general a genelor................................................................................................ 86
Validri pe baza evidenelor din literatur ........................................................................ 87
Clasificarea genelor .......................................................................................................... 89
Seturi de gene care determina diferite subtipuri de celule retinale ganglionare ............... 94
Validarea datelor ............................................................................................................... 96
Gene specifice pentru celulele retinale ganglionare cu potenial efect n timpul dezvoltri
..................................................................................................................................... 99
3..Strategia knock-in condiional folosind sistemul dublu de recombinare pentru studiul
dezvoltrii celulelor retinal ganglionare ................................................................................. 102
Generarea liniilor mutante Brn3aCKOCre i Brn3bCKOCre ................................................. 102
Triplii mutani: CAG:Dre; Brn3CKOCre; ROSA26iAP/+ ..................................................... 104
Recombinarea Dre i Cre n oarecele adult ................................................................... 106
Recombinarea timpurie-ubicu a recombinazei Cre de la locusul endogen de Brn3a
i Brn3b108
4. Instrumente noi ce folosesc optogenetica pentru studiul circuitelor retinale ......................111
Introducerea genei pentru florescena YFP i exprimarea -galactosidazei n clonele
selectate ale liniei CaPoChR2....................................................................................111
Genotiparea diferitelor elemente din celule .....................................................................112
Florescena YFP a diferitelor linii celulare ......................................................................113
Analize Patch Clamp ale liniilor CaPoChR2 and ChR2..................................................116
Discuii generale ....................................................................................................................118
Concluzii................................................................................................................................ 126
Bibliografie..127

Cuvinte cheie

Retina
Celule retinale ganglionare
Brn3
Dezvoltare
Profile de exprimare genic
Channelrhodopsin

Introducere
Simul vizual reprezint cel mai important dintre simuri, furniznd aproximativ 80% din
informaii referitoare la elementele cu care relaionm. Cu toate c toate structurile ce alctuiesc
ochiul contribuie la realizarea funciei vizuale, retina reprezint structura esenial i, nu n
ultimul rnd, cea mai complex.

Retina
Asemenea altor structuri din Sistemul Nervos Central, retina este un circuit neuronal
complex, cu organizare laminar, responsabil pentru integrarea informaiei vizuale i
transmiterea acesteia ctre centrii creierului, prin transducia radiaiei optice n impulsuri
electrice specifice.
Partea neuronala a retinei este compus din cinci clase diferite de celule (fotoreceptori,
celule bipolar, celule amacrine i celule retinal ganglionare) organizate n trei straturi nucleare i
dou straturi plexiforme, locul unde diferite celule stabilesc conexiuni sinaptice (Fig. 1). n plus,
fotoreceptorii sunt protejai i se gsesc n interaciune cu un strat epitelial alctuit din epiteliul
pigmentat retinal, n timp ce suportul glial este asigurat prin intermediul celulelor gliale Muller, a
astrocitelor i celulelor microgliale.

Figure 1. Structura retinei la mamifere (Wilkinson-Berka, 2004).

Celulele retinale ganglionare, principalul interes al acestei teze, reprezint neuronii care
colectez informaia primit de la partenerii pre sinaptici (celulele amacrine i bipolare) i o
transmit creierului prin intermediul proieciilor axonale, care se fasciculeaz si formeaz nervul
optic. Axonii celulelor retinale ganglionare provenind de la ambii ochi se ntlnesc la chiasma
5

optic, segreg n traturi optice de aceeai parte (ipsi-) sau de partea opus (contralateral) a
creierului. Precum alte categorii de celule retinale, celulele retinale ganglionare se mpart n
diferite categorii, al cror numr este n continu schimbare.
Caracterizarea celulelor retinale ganglionare la mamifere a fost iniiat de studii pe
bovine i canine desfurate de Ramon y Cajal (Kolb, http://webvision.med.utah.edu), apoi
continuate de ctre alte grupuri de cercettori care au descris varietile de celule retinal
ganglionare in diferite specii: primate, (Rodieck and Watanabe, 1993), pisici (Boycott and
Wassle, 1974), iepuri (Rockhill i colab., 2002), obolani (Sun i colab., 2002) i oareci (Badea
and Nathans, 2004), acestea fiind doar cteva dintre numeroasele studii. n general,
caracterizarea morfologiei se bazeaz pe criterii de mrime a corpului celular, precum i pe cea a
arborilor dendritici i a laminrii acestora n stratul plexiform intern (Coombs i colab., 2006).
Douzeci i dou de subtipuri au fost observate de ctre Cajal n studiile lui iniiale n urm cu
200 de ani, 13 i, respectiv 15 n studii mai recente realizate de ctre Rockhill i colaboratorii,
precum i Badea i colaboratorii. n plus, studii recente desfurate pe oareci menioneaz
diferite numere de subtipuri ale celulelor retinal ganglionare, ntre 11 i 22 (revizuit de ctre
Masland, 2012).
Din punct de vedere funcional, este cert faptul c celulele retinale ganglionare sunt
diferite prin faptul c primesc informaii, i, n schimb, proiecteaz informaiile prelucrate diferit
unor structuri variate din creier. Fibrele care ajung la coliculul superior integreaz micrile
capului i ale ochilor, n timp ce acelea care proiecteaz fibrele n nucleul geniculat lateral, iar,
mai apoi cortexului vizual, sunt responsabile pentru transmiterea informaiilor legate de contrast,
componen cromatic, micare i form, ce apoi contribuie la formarea vederii contiiente.
Nuclei precum cel olivar pretectal i cel suprachismatic primesc fibre care transmit informaii
care nu sunt in legtura cu vederea propiu-zis, ci cele legate de reflexul pupilar i ritmul
circadian. Mai mult, nucleul medial, lateral i cel dorsal proceseaz informaii referitoare la
coordonarea vestibulo-ocular.
Cea mai mare parte a cunotiinelor legate de fiziologia diferitelor celule retinale
ganglionare provine din decursul ultimelor decade. Aceti neuroni sunt susceptibili diferitor
tipuri de stimuli precum direcia, viteza micrii, precum i mrime, luminozitate i culoare (R.
Nelson, webvision.med.utah.edu). n plus, o categorie distinct de celule retinale ganglionare
6

ndeplinesc funcii legate de reflexe precum cel pupilar i ciclul noapte-zi, numite celule retinale
ganglionare cu melanopsin (Hattar i colab., 2002).
Diferenele legate de morfologia i fiziologia celulelor retinale ganglionare sunt generate
de diferenele n progamul intrinsec, ct i de specificitatea la nivelul sinapselor. Cu siguran
aceast arhitectur complex este rezultatul parial al interaciunii dintre celulele retinale
ganglionare ntre ele, ns implic i interaciuni care sunt indepemdente de celule i stagii de
dezvoltare. Pe de alt parte, un program genetic activ n timpul dezvoltrii asigur faptul c
diferite molecule acioneaz specific dictnd celulelor indentitate i functionalitate.

Diversitatea n retin
n ceea ce privete programul genetic ce dicteaz formarea retinei mamiferelor, multiple
cascade de gene interacioneaz n decursul dezvoltrii. Un aspect interesant este faptul c toate
cele cinci clase neuronale au un progenitor comun celula retinala progenitoare (Turner and
Cepko, 1987). La oarece, principalul model de studiu n aceast tez, histogeneza are loc
ncepnd cu ziua a 11-a embrionar pn la ziua a 11-a postnatal. Primii neuroni formai sunt
celulele retinale ganglionare, urmai, n ordine, de ctre celulele orizontale, celulele cu conuri,
celulele amacrine, celulele bipolar i celulele cu bastonae.
Pentru ca toate elementele ochiului s se formeze, un set de factori de transcriere devin
activi ncepnd cu ziua a opta embrionar n tubul neural anterior. Acetia sunt adesea denumii
factori de transcriere a cmpului vizual. n general, ei sunt conservai n evoluie, ncepnd de la
Drosophila, la C. Elegans pn la oameni. Cei mai importani dintre ei, Otx2, Pax6, Rx, Lhx2 i
Six3 sunt strict necesari pentru formarea ochiului, lipsa lor cauznd defecte severe ca i
fenotipuri de ochi mici pn la lipsa complet a formrii ochiului (Marquardt i colab., 2001;
Porter i colab., 1997; Zuber i colab., 2003; Mawersik and Maas, 2000). Pe lng aceti factori
de transcriere, molecule de semnalizare precum Notch, Wnt and Shh joac un rol important n
formarea organului vizual.
n retin, diferenierea final a celulelor precursoare retinale n celule specializate ncepe
cu decizia unora dintre ele de a devein ceulule retinale ganglionare, acestea fiind primele celule
retinale formate. Pentru aceasta, primul factor de transcriere activ este Math5, un omolog al
genei Athonal de la Drosophila (Brown i colab., 1998). oarecii crora le lipsete aceast gen
7

au mai puin de 1% celule retinale ganglionare (Brown i colab., 2001; Wang i colab., 2001).
Mai mult, exprimarea lui Math5 se observ i n alte tipuri de celule (Yang i colab., 2003),
inclusiv n pecursori. Urmtorul factor de transcriere important, de data aceasta la momentul n
care precursorii devin celule post-mitotice, este Brn3b(Pou4f2) (Xiang i colab., 1995, Xiang i
colab., 1996, Erkman i colab., 1996), lipsa lui afectnd majoritatea celulelor retinale
ganglionare. Mai trziu, Brn3a i Brn3c, doi ali factori de transcriere din aceeai familie, sunt
exprimai n celulele retinale ganglionare selective. n timpul dezvoltrii, alte seturi de factori de
transcriere contribuie la generarea celulelor retinale ganglionare: membrii familiei de molecule
Iroquois - Irx1, Irx2, to Irx6, factrori de transcriere din categoria celor cu domeniu lim - Islet1
and Islet2, degete de zinc ca i Gfi1, Olf 1 i Olf2 (reviziut de ctre Mu and Klein, 2004),
precum i Dlx1 and Dlx2 (Eisenstat i colab., 1999).
Ca i n cazul celulelor retinale ganglionare, toate celelalte celule necesit activitatea unor
factori de transcriere pentru ndeplinirea deciziei asupra tipului de celul post-mitotic. Mash1
(omolog al fatorului Achete-Scute de la Drosophila) este important pentru formarea i
diferenierea corect a celulelor bipolare i orizontale, i, ntr-o oarecare msur, a
fotoreceptorilor (Tomita i colab., 2000). NeuroD influeneaz decizia asupra devenirii neuron
sau celul glial, precum i a dezvoltrii propice a celulelor amacrine i bipolare (Yan at al.,
2005). Nrl, Crx, Nr2E3 sunt factori de transcriere cheie pentru dezvolarea photoreceptorilor
(Swaroop i colab., 1992; Cheng i colab., 1997; Chen 1999).

Factorii de transcriere Brn3

n decursul ultimelor dou decade numrate infornmaii s-au adunat n legatur cu factorii
de transcriere Brn3, n special despre funcia exercitat in retin, prin intermediul liniilor de
oareci mutani create i analizate de ctre numroase grupuri de cercettori: Xiang, Nathans,
Erkman, Turner, Rosenfeld, Gan, Klein, Wang, Mu, Badea.
Factorii Brn3 joac un rol important n dezvolaarea unor organe senzitive la mamifere
(Xiang i colab., 1998), toi cei trei (Brn3a, Brn3b and Brn3c) fiind exprimai ntr-unul sau mai
multe dintre organe ca i retina, neuronii sistemulul acustico-vestibular precum i n ganglionii
trigeminal sau rahidian.

n retin, factorii Brn3 sunt exprimai n seturi de neuroni n diferite combinaii (Badea
and Nathans, 2011), fiind specifici pentru celulele retinale ganglionale. Din punct de vedere
cronologic, Brn3b este primul factor de transcriere din familia lui care este exprimat, exprimarea
ncepnd cu a 11-a zi embrionar, aproximativ cnd primul precursor devine post-mitotic,
devenind o celul retinal ganglionar. Pe msur ce se nainteaz n dezvoltare, exprimarea lui
Brn3b se propag spre periferia retinei, avnd cel mai nalt nivel de exprimare ntre a 12-a zi
embrionar i a 15-a, atunci cnd majoritatea celulelor retinale ganglionare se formeaz.
Exprimarea lui Brn3a ncepe o zi mai trziu, urmat de Brn3c, acesta fiind ultimul dintre cei trei
care se exprim n retin (Xiang i colab., 1995; Gan i colab., 1999).
Diferite linii de oareci ce poart mutaii n genele Brn3 prezint fenotipuri interesante, n
special mutanii de Brn3b. Eliminarea lui Brn3b are ca urmare pierderea a 70-80% dintre celulele
retinale ganglionare, cele 30% rmase suferind de efecte intra i extra retinale, majoritatea n
legtu cu integritatea axonilor i corectitudinea fasciculrii n nervul optic (Erkman i colab.,
1996; Gan i colab., 1996; Erkman i colab., 2000; Badea i colab., 2009a). n ceea ce privete
Brn3a, analiza mutanilor homozigoi este imposibil post-natal, acetia fiind letali datorit unor
mutaii severe la nivelul ganglionilor trigeminali i rahidiani (McEvilly i colab., 1996; Xiang i
colab., 1996; Eng i colab., 2001). Cu toate acestea, eliminarea lui Brn3a la nivelul retinei
rezult n defecte ale arborizrii celulelor retinale ganglionare i distribuia lor n stratul
plexiform intern (Badea i colab., 2009a). n contrast, aspectul general al retinei pare s fie
neafectat n urma eliminrii lui Brn3c, cel de-al treilea membru.

Obiectivele tezei
Din punct de vedere funcional retina este compus din trei pri generale: detectorii
informaiei luminoase (fotoreceptorii), circuitul care codific informaia furnizat de ctre
fotoreceptori (celulele orizontale, celulele bipolare i amacrine) precum i proiecia (celulele
retinale ganglionae). Principalul interes al acestei teze este reprezentat de ctre celulele retinale
ganglionare, considernd n special urmtoarele aspecte:

Se cunoate faptul c ntr-o retin creia i lipsesc fotoreceptorii neuronii de ordin

secundar se reorganizeaz suferind degenerare parial. Acest proces pare s fie evitat in cazul
celulelor retinale ganglionare, fapt ce sugereaz independena parial a acestor celule fa de
ceilali neuroni din retin. n aceast tez este testat situaia contrar, anume care sunt
modificrile suferite de retin n situaia n care o populaie major de celule retinale ganglionare
lipsete.

n al doilea rnd atenia a fost concentrat pe dezvoltarea celulelor retinale ganglionare,

ntrebnd care sunt diferitele seturi de gene care determin diferite atribuii ale celulelor retinale
ganglionare. Aceste molecule, dac sunt exprimate n condiii controlate pot, eventual,
reprezent soluii prentru regenerarea acestui tip de neuroni.

Cel de-al treilea obiectiv este generarea a dou linii mutante de oareci generate prin
strategia de nlocuire pe baza recombinrii omoloage n sperana facilitrii unor studii viitoare de
nalt rezoluie pentru analiza celulelor retinale ganglionare. Aceste experimente pot furniza
noiuni noi ce pot deveni ulterior instrumente utilizabile n tratarea diferitelor patologii ce
afecteaz aceste celule.

n final, cel de-al patrulea obiectiv este dezvoltarea unor linii celulare care utilizeaz un
intrument optogenetic canalul sensibil la lumin Channelrhodopsin. Aceste linii celulare pot
genera informaii utile pentru investigarea ciruitelor neuronale.
10

Materiale i metode
1. Analiza stratului plexiform intern a mutanilor Brn3bCKOAP/Retinele provenind de la oareci aduli cu genotipurile Pax6Cre;Brn3bCKOAP/- (KO) i
Pax6Cre;Brn3bCKOAP/+ (WT) au fost analizate prin studii de imunohistochimie. Mutanii ce
poart genotipul Pax6:Cre; Brn3bCKOAP/- prezint un aspect al recombinrii inedit, observant
prin exprimarea moleculii reporter, posfataza alcalin (AP). Retinele prezint o poriune n
care reombinarea se produce la o intensitate redus i o alta unde recombinarea se produce la
maxim, rezultnd fenotipul mutant complet (Marquardt i colab., 2001).

Diferite combinaii

dintre anticorpii prezentai n tabelul 1 au fost folosii pentru analiza prin iunoflorescen a
retinelor prezentate mai sus.

Tabelul 1. Anticorpi primari folosii pentru seciuni

Antigen
Antiser
Localizare
Brn3b
Cabp5
Calbindin
Calretinin
Choline acetyl
transferase
(ChAT)
Connexin36
CtBP2
Neurofilament
200
PKC
PSD95

Rabbit anti-Brn3b
Rabbit anti-Cabp5
Rabbit anti-calbindin
Rabbit anti- calretinin
Goat anti-ChAT

Ganglion cells
Bipolar cells
Horizontal cells
Cone bipolar cells
Cholinericamacri
ne cells

1:10
1:200
1:500
1:1000
1:1000

Numr de
catalog
Xiang et al., 1995
Haeseleeret al., 2004
Sigma
C2724
Swant
7699/4
Chemicon AB1144P

Rabbit anti-Cnx36
Mouse anti-Ctbp2
Mouse anti-NF200

Electric synapses
Ribbon synapses
GCs arborization

1:500
1:500
1:200

Invitrogen
BD
Sigma

364600
612044
N0142

Mouse anti- PKC

Mouse anti-PSD95

SantaCruz
Ab Cam

Sc-208
Ab13552

Synaptotagmin

Mouse anti- ZNP1

Rod bipolar cells 1:800

Post-synaptic
1:500
densities
Cone bipolar cells 1:1000

11

Diluie

Furnizor

ZIRC

2. Analiza profilelor de exprimare a genelor n aval fa de Brn3a i Brn3b ntro populaie purificat de celule retinale ganglionare
Retinele extrase din animale produs al ncrucirii Brn3WT/KO; Pax6:Cre cu
Brn3CKOAP/CKOAP au fost dissociate fie n a 15-a zi embrionar, fie n a treia zi postnatal. Prin
urmare, celulele retinale ganglionare sunt fie Brn3AP/WT (WT) or Brn3AP/KO (KO), prin urmare
fiind similare din punct de vedere fenotipic fie cu animale control (WT) fie cu mutani complei
(KO).
Pentru disocierea esutului a fost folosit un protocol pe baz de papain. Pentru a obine o
populaie purificat de celule retinale ganglionare, retinele disociate au fost procesate folosind un
protocol de purificare imunomagnetic, pe baza unor sfere Dynal TM Beads Pan Mouse IgG
(Invitrogen, USA). Din celulele izolate purtnd acelai genotip a fost extras RNA care a fost mai
apoi prelucrat pentru experimentul principal secvenare RNA (RNAseq).
Datele obinute au fost analizate urmnd anumite criterii de selecie. Pentru nceput,
probele WT au provenit mereu de la secvenarea RNA-ului extras de la celule ce poart
genotipul Brn3a/bAP/WT. Pe de alt parte, probele KO reprezint rezultatele secvenializrii RNAului extras de la animale ce poarta genotipul Brn3a/bAP/KO. Probele retin reprezint informaia
obinut n urma procesrii RNA-ului extras din supernatantul fie cu genotipul WT, fie KO. O
analiz adiional compar probele RGC (celule retinale ganglionare) care sunt fie WT fie KO,
cu cele retin (WT sau KO).
De la nceputul analizei toate probele care au avut valori de exprimare, exprimate n
unitatea FPKM, mai mici dect 2 au fost excluse din setul de date. n plus, pentru diferitele
comparaii expuse mai sus, diferenta dintre cele dou seturi comparate trebuie sa fie de cel putin
2 ori.

12

3. Strategia knock-in condiional folosind sistemul dublu de recombinare

pentru studiul dezvoltrii celulelor retinal ganglionare

Crearea unor noi linii mutante necesit o analiz prealabil extensiv a genei de nlocuit
ct i a strategiei urmate. n afara elementelor de baz care nlocuiesc o gen, componente
precum semnale aditionale de terminare sunt foarte importante. Mai mult, metodele de screening
pentru confirmarea integrarii mutaiei n celule stem embrionare necesit planificare. n vederea
generrii unor linii mutante pe baz de recombinare omoloag, urmtorii pai trebuie urmrii:
schia teoretic a vectorului de targeting, clonarea acestuia, transfecia lui n celule stem
embrionare, producerea himerelor i a homozigoilor mutani.

Figure 2. Strategia de introducere a mutaiei pentru linia Brn3aCKOCre. (A) Configuraia structurii
genei Brn3a, locusul WT. Regiunile codificatoare sunt marcate prin blocuri verzi, UTR-urile n
alb, n timp ce jonciunile de procesare sunt reprezentate prin linii subiri negre. Liniile negre de
dedesubt reprezint braele de omologie. Probele pentru Southern Blot sunt reprezentate prin
cutii negre. N-enzima de restricie NheI. (B) Vectorul Brn3a CKOCre. Primul situs RoxP a fost
inserat n regiunea netranscris de la captul (UTR) 5 al genei, nainte de ATG, iar cel de-al
doilea n UTR-ul de la 3, precedat de un semnal stop adiional -3xpA. Secvena codificatoare a
recombinazei Cre (caseta portocalie) urmeaz dup cel de-al doilea situs RoxP, apoi caseta
pentru selecia pozitiv Neo (albastru) flancat doua situsuri de recombinare FRT. Caseta
pentru selectia negativ MC1TK (roz) este plasat la captul braului de omologie de la 3. (C)
Brn3aCKOCre dup modificare i recombinare omoloag. (D) Brn3a CKOCre dup deleia casetei de
selecie pozitiv, n urma ncrucirii cu o linie ce poart recombinaza Flp. (E) Brn3a Cre. n urma
recombinrii celor dou situsuri RoxP, secvena recombinazei Cre este exprimat la locusul
Brn3a. Segmentele negre reprezint o kilobaz.
13

n Mus musculus gena Brn3a (Pou4f1) este compus din 3 exoni (cu lungimea de 358,
1186 i, respectiv 2224 perechi de baze), n timp ce Brn3b (Pou4f2) are doar 2 exoni (294 i 942
perechi de baze). n vectorul de poart mutaia, Brn3a CKOCre, respectiv Brn3bCKOCre, primul situs
de recombinare (RoxP) necesar pentru activitatea recombinazei Dre, este amplasat la 42,
respectiv, 98 perechi de baze n amonte fa de codonul de iniiere ATG. n aval fa de
poriunea netranscris de la captul 3 (3 UTR) trei structuri repetitive ale semnalului de
terminare a transcrierei SV40 au fost adaugate la 48 de perechi de baze n cazul mutaiei lui
Brn3a, i la 340 perechi de baze n cazul multaiei lui Brn3b, secvene urmate de cel de-al doilea
situs RoxP. Imediat dup secvena celui de-al doilea situs de recombinare se afl secvena ce
codific recombinaza Cre, care, dup recombinarea celor dou situsuri RoxP sub aciunea
recombinazei Dre, nlocuiete gena Brn3, fiind exprimat apoi sub controlul promoterului
respectiv.

Figure 3. Strategia de targeting pentru linia Brn3bCKOCre. (A) Configuraia structurii genei Brn3a,
locusul WT. Regiunile codificatoare sunt marcate prin blocuri verzi, UTR-urile n alb, n timp ce
jonciunile de procesare sunt reprezentate prin linii subiri negre. Liniile negre de dedesubt
reprezint braele de omologie. Probele pentru Southern Blot sunt reprezentate prin cutii negre.
K- enzima de restricie KpnI, B - BamHI. (B) Vectorul Brn3bCKOCre. Primul situs RoxP a fost
inserat n UTR-ul 5 al genei, nainte de ATG, iar cel de-al doilea n UTR-ul de la 3, precedat de
un semnal stop adiional -3xpA. Secvena codificatoare a recombinazei Cre (caseta portocalie)
urmeaz dup cel de-al doilea situs RoxP, apoi caseta pentru selecia pozitiv Neo (albastru)
14

flancat doua situsuri de recombinare FRT. Caseta pentru selectia negativ MC1TK (roz) este
plasat la captul braului de omologie de la 3. (C) Brn3a CKOCre dup modificare i recombinare
omoloag. (D) Brn3bCKOCre dup deleia casetei de selecie pozitiv, n urma ncrucirii cu o
linie ce poart recombinaza Flp. (E) Brn3b Cre. n urma recombinrii celor dou situsuri RoxP,
secvena recombinazei Cre este exprimat la locusul Brn3b. Segmentele negre reprezint o
kilobaz.
4. Instrumente noi ce folosesc optogenetica pentru studiul circuitelor retinale

Trei linii celulare au fost create pentru acest proiect. Prima, CaPoChR2 const n trei
elemente un canal de calciu, unul de potasiu i un al treilea, un canal cationic, sensibil la
lumin Channelrhodopsina (ChR2). Toate cele trei elemente au fost inserate la o anume locaie
n celulele HEK293 FlpIn, prin intermediul sistemului ce utilizeaz vectorul pcDNA5/FRT. n al
doilea rnd, doar secvena codificatoare a ChR2 a fost introdus n acelai tip de celule, utiliznd
aceeai strategie. n final, cea de-a treia linie celular este reprezentat de ctre prima, n care
secvena codificatoare a genei de ChR2 a fost supraexprimat prin inserie ntmpltoare.

15

Rezultate i discuii
1. Analiza stratului plexiform intern a mutanilor Brn3bCKOAP/-

Acest subcapitol prezint analiza neuronilor din retin, pre sinaptici celulelor retinal
ganglionare n stratul plexiform intern, n contextual unei absene severe a celulelor retinale
ganglionare. Utiliznd markeri celulari specifici s-a realizat o analiza cantitativ i calitativ a
diferitelor populaii celulare.
Iniial, au fost analizai diferii anticorpi ce marcheaz benzile fomate de arborii
dendritici, n stratul plexiform intern. Prima observaie general confirm rezultatul observat de
ctre Badea i colaboratorii (Badea i colab., 2009a), anume c exceptnd o minim micorare a
laimii stratului plexiform intern la mutani, nici o alt modificare nu are loc cu privire la
marcharea laminar (Fig. 4A).
Ulterior, s-a realizat o analiz cantitativ i calitativ a ntregii retine, urmrind celulele
cu care celulele retinale ganglionare au contact direct. Nu s-a observat nicio diferen
semnificativ ntre numrul de celule amacrine colinergice la mutani, comparativ cu animalele
control (Fig. 4B). Celulele bipolare au fost observate uilizndu-se anticopri precum Cabp5,
ZNP1 i PKC (Fig. 4C). Examinarea seciunilor verticale sugereaz c morfologia i
stratificarea acestor tipuri de neuroni, ct i poziia terinaiilor sinaptice nu au fost afectate de
absena celor 70% celule retinale ganglionare.
Mai mult, pentru a analiza integritatea componentelor sinaptice n stratul plexiform intern
doi markeri diferii au fost utilizai - CtBP2 (Ribeye), parte constitutiv din sinapsele n panglic,
i Cnx36, component a sinapselor electrice din stratul plexiform intern. Nici o diferen nu a
fost remarcat ntre punctele specifice pentru cei doi markeri la cele dou loturi comparate.

16

B
A

Figure 4. Analiza cantitativ i calitativ a laminrii stratului plexiform intern, a celulelor

amacrine si biploare n mutanii ce Brn3b. (A) Grosimea stratului plexiform intern nu este
afectat n mutant. Marcajul cu NF200 n cadranul din dreapta, sus arat c analiza a fost
realizat n zona de recombinare complet. Scala: 25m. (B) Celulele amacrine colinergice
analizate n ntreaga retin. Corpurile celulare au fost cuantificate att n stratul celulelor retinal
ganglionare ct i n stratul plexiform intern. Scala: 50m. (C) Markeri pentru celulele bipolar.
Nici o diferen nu se poate observa ntre mutani i control referitor la aceste tipuri de celule,
ns nici n cazul densitaii postsinaptice (PSD95) care marcheaz terminaiile din stratul
plexiform extern Scala: 25m.
2. Analiza profilelor de exprimare a genelor n aval fa de Brn3a i Brn3b ntr-o
populaie purificat de celule retinale ganglionare

Generarea populaiei purificate de celule retinale ganglionare

Cu scopul nelegerii reelelor reglatoare de gene care dirijeaz formarea i specificarea
anumitori tipuri de celule ntr-un esut este foarte important ca acea populaie de celule studiat
s fie ct mai pur cu putin pentru acel tip de celul. n retina oarecelui, celulele retinale
17

ganglionare reprezint mai puin de 1% din numrul total de celule, acest fapt ngreunnd
procesul de purificare.
Pentru a contrabalansa acest neajuns s-a folosit o metod imunomagnetic de purificare.
Datorit faptului c animalele experimentale au purtat genotipurile Brn3AP/WT si Brn3AP/KO a fost
posibil izolarea celulelor care exprim aceasta gen reporter. Fosfataza alcalin (AP) este o
protein fixat la membran prin glicosilfospfatidilinositol, fiind exprimat doar pe membrane
celular (Berger i colab., 1987). Un alt avantaj l reprezint faptul c acest model folosit, prin
gena de fosfataz alcalin, marcheaz doar celulele retinale ganglionare, fiind exprimat sub
controlul promoterului de Brn3a/b, factori de transcriere ce se exprim exclusiv n celulele
retinale ganglionare.
Aceast populaie cu puritate mbuntit de celule retinale ganglionare a fost apoi
procesat n vederea extragerii RNA-ului, urmnd ca acesta s fie prelucrat pentru experimentul
de secvenare RNA.

Exprimarea genelor Brn3

Una dintre validrile iniiale ale datelor obinute de la secveniator a fost analiza genelor
Brn3a i Brn3b n diferitele probe. Rezultatele analizei sunt prezentate n Figura 5. Valorile de
exprimare obinute pentru Brn3a/b n celulele retinale ganglionare versus probele retina n
cazul datelor provenite de la WT confirm nc o dat eficiena protocolului de purificare. Ambii
factori de transcriere au valori de exprimare ridicate n probele celule retinale ganglionare WT,
n timp ce valoarea lor n probele retina este mic. Comparaia exprimrii factorilor Brn3 n
WT versus mutant, n celulele retinale ganglionare indic fatul c, dup cum era de ateptat,
exprimarea n mutant este mult mai mic dect n WT. Interesant, exprimarea lui Brn3a pare s
fie reglat negativ n mutantul de Brn3b, n timp ce exprimarea lui Brn3b apare uor reglat
pozitiv n mutantul de Brn3a. Concluzia ce reiese din aceste descoperiri este c cei doi factori de
transcriere i influeneaz exprimarea unul altuia.

18

Figure 5. Analiza exprimrii lui Brn3a i a lui Brn3b n celulele retinale ganglionare i n
retina (supernatant). Prima jumtate a figurii reprezint citirile pentru probele provenite de la
celulele retinale ganglionare, iar partea de jos este reprezentat de probele retina. Valorile de
exprimare sunt redate n FPKM.
Validarea datelor de exprimare pe baza literaturii disponibile
Rezultatele obinute au fost comparate cu date provenind de la publicaii ce menioneaz
aceste tipuri de celule i unele gene exprimate la nivelul lor, subliniind genele care sunt nalt
exprimate n celulele retinale ganglionare la vrstele analizate.
Figura 6 menioneaz parte dintre aceste gene, mpreun cu valorile lor de exprimare n
celulele retinale ganglionare, prezentate n cadranul din stnga, i cele din supernatant (probele
retina) n partea dreapt. Nivelurile de exprimare ridicate sunt reprezentate de culori calde
(rou spre galben), iar cele sczute prin culori reci (nuane de albastru). Se poate remarca imediat
faptul c toate aceste gene care au fost selectate pentru exprimarea lor specifica n celulele
retinale ganglionare au niveluri de exprimare foarte sczute n probele retina att n WT ct i
n mutant.
n celulele retinale ganglionare cei doi factori de transcriere Brn3a (Pou4f1) i Brn3b
(Pou4f2) prezint niveluri foarte sczute n mutanii lor.
Chiar i din aceast parte general, genele par s se grupeze n cteva categorii. Gene
precum Snca, Sncg, Nefm, IslI, Pou6f2 prezint niveluri de exprimare ridicate la E15 (ziua a 15a embrionar) comparativ cu P3 (ziua a treia postnatal), sugernd faptul c activitatea lor este
necersar ndeosebi n timpul dezvoltrii n celulele care exprima factorul Brn3b. Pe de alt
parte, genele care sunt exprimate la un nivel ridicat la E15 n probele Brn3b, dar la unul mai
sczut la P3, se observ o cretere n probele de la celulele retinale ganglionare Brn3a, sugernd
o interaciune a celor doi factori de transcriere n vederea specificrii i a dezvoltrii corecte a
19

acestor celule. Mai mult, pentru acest set de gene Brn3b pare s fie factorul ce regleaz n
principal genele la P3, iar n unele cazuri ca Sncg i Nefm, chiar i la E15.

Figure 6. Profile de exprimare a unor gene specifice pentru celulele retinale ganglionare
n diferitele probe. Reprezentarea genelor specifice pentru celulele retinale ganglionare (stnga),
i a celor din probele retin (dreapta). Valorile de exprimare n unitatea FPKM sunt reprezentate
ca o hart de cldur, pe o scal colorat rou fiind exprimare ridicat, iar albastru exprimare
sczut. Valorile de exprimare sunt normalizate la nivelul maxim de exprimare pentru fiecare
gen.
Clasificarea genelor
n funcie de specificitatea probelor
Ulterior, ntregul set de gene exprimate fie la P3 fie la E15 n probele Brn3bAP/WT RGC
(celule retinale ganglionare, Brn3b WT) au fost analizate. Aceste gene ar putea eventual s fac
distincia dintre neuronii care exprim Brn3b i alte tipuri de celule n retin, n timpul
dezvoltrii. O analiz iniial sugereaz c, un numr similar de gene sunt exprimate n probele
Brn3b RGC la cele dou vrste analizate 1424 gene la E15 i 1348 de gene la P3 (cercurile
20

albastre i galbene, Fig. 7, cadranul din stnga). Cu toate acestea, mai puin de 50% dintre ele
(615) exercit acelai nivel de exprimare la cele dou vrste analizate (suprapunerea celor dou
cercuri n Fig. 7, stnga).
Mai departe, seturi de gene exprimate diferenial n Brn3b KO versus WT RGCs au fost
identificate. La E15 se gsesc 156 de gene care sunt expimate diferenial ntre WT i mutant
(cercuri albastre, Fig. 7, dreapta), n timp ce la P3, 540 de gene au fost identificate ca fiind
exprimate diferenial (cercuri galbene, Fig. 7, dreapta). Dintre cele 139 de gene exprimae
difereniat la ambele vrste analizate, marea majoritate par s fie reglate negativ n mutant.

Gene specifice pentru Brn3b la E15 i/sau P3

Gene reglate de Brn3b la E15 i/sau P3

B

Figure 7. Seturi de gene exprimate la E15 versus P3 (A) i seturi de gene potenial
reglate de Brn3b (B). Toate genele selectate au nivelul de exprimare mai mare sau egal cu 2
FPKM. Diferena dintre probele RGC i retina, ct i ntre Brnb AP/WT i Brn3bAP/KO este mai mare
sau egal cu 2.
Un alt aspect interesant urmrit n acest set de date este identificarea genelor care fac
distincia ntre neuronii care exprim fie Brn3a fie Brn3b, comparativ cu alte tipuri de celule din
retin la P3. Pentru aceasta, genele care sunt specifice pentru probele celulele retinal
ganglionare (RGC) au fost grupate pe baza specificitii lor pentru neuronii care exprim Brn3a
i/sau Brn3b. Genele exprimate n Brn3a AP/WT RGCs i the Brn3bAP/WT RGCs au fost comparate
cu cele din probele retin.

21

Gene specifice pentru Brn3a i/sau Brn3b RGC la P3

A

Gene reglate de Brn3a i/sau Brn3b RGC la P3

B

Figure 8. Seturi de gene exprimate la P3. Toate genele selectate au un nivel de exprimare mai
mare sau egal cu 2 FPKM. Diferena dintre probele celule retinale ganglionare (RGC) i retin, ca
i diferena dintre Brn3AP/WT i Brn3AP/KO este mai mare sau egal cu 2.
Aplicnd aceste criterii, 3913 gene au fost observate ca fiind exprimate specific n Brn3a
i n Brn3b RGC. Interesant, genele exprimate specific n Brn3a RGC (1380) sunt cu
aproximativ de 10 ori mai multe dect cele exprimate n Brn3b RGC (127), mare parte din ele
fiind exprimata att n celulele retinale ganglionare dublu pozitive pentru Brn3a/Brn3b
(supapunerea celor dou cercuri n Fig. 8).
Informaii importante reies din analiza genelor care sunt reglate fie de Brn3a sau de
Brn3b sau de amandoi factorii de transcriere la P3. Se poate presupune ca aceste gene mediaz
diferitele funcii ale celulelor retinal ganglionare Brn3a i Brn3b positive la P3. Cu acest scop,
genele exprimate n celulele retinale ganglionare au fost analizate pentru a clasifica genele
reglate fie pozitiv fie negativ de ctre Brn3a i/sau Brn3b, comparnd datele obinute de la
mutani (KO) i control (WT). Un aspect interesant este faptul c, dintre numeroasele gene
specifice pentru Brn3a sau Brn3a/Brn3b n celulele retinale ganglionare (RGC) 2583, doar 39
sunt reglate de acest factor de transcriere. Pe de alt parte, Brn3b pare sa fie responsabil pentru
reglarea unui numr mai mare de gene specifice celulelor retinale ganglionare. Genele care sunt
sub controlul lui Brn3b reprezint aproximativ jumtate din genele care sunt specifice pentru
celulele retinale ganglionare care sunt pozitive fie pentru Brn3a i Brn3a/Brn3b (676 versus
1330). Doar 14 gene sunt reglate de ctre ambii factori de transcriere la P3.

22

Dup funcia exercitat n esut

Dup analiza seturilor de gene bazat pe specificitatea lor, am desfurat o macro analiz
pentru a afla ce fel de categorii de molecule sunt codate de genele rezultate n urma screeningului. Am realizat o cutare extins n literatura de specialitate cutnd evidene care s atribuie
diferitelor molecule funcii fie n diferenierea celular a neuronilor, morfogenez, interaciuni
celul-celul, precum i referitoare la conexiunile sinaptice. Rezultatele sunt prezentate n
Tabelul 2.
Factorii de transcriptie sunt exprimai la nivel nalt n setul de gene exprimate specific n
populaiile de celule retinale ganglionare la E15 i la P3, fiind importani n specificarea celular
i localizarea corect la nivelul esutului.

Table 2. Gene cu funcii n dezvoltarea neuronal, morfogenez, interaciuni celulcelul, precum i n conetivitatea la nivelul sinapselor. Caracterizarea funcional este
bazat pe date obinute din liteatur.
Familii moleculare
Numr de
membrii
Factori de transcriptie
81
Integrine
48
Caderine
11
Protocaderine
18
Efrine (ligani sau receptori)
3
Semaforine-Plexine-Neuropiline
13
Robo-Slit
2
Domeniu Ig
115
GTPaze mici (GAP, GEF, GDI)
87
Adaptori de structur celular (actin, dinein, kinesin,
50
miosin)
Molecule sinaptice (receptori, transportori, canale ionice)
40

Validarea seturilor de gene obinute prin secvenare RNA

Pentru validarea informaiilor obinute referitoare la diferitele seturi de gene identificate
n urma screening-ului, n special pentru confirmarea faptului ca acele molecule se gsesc n
stratul celulelor retinale ganglionare s-a desfaurat un screening folosind metoda hibridizrii insitu.
23

Pentru confirmarea datelor obinute pentru E15 am profitat de baza de date Allen Brain
Atlas (ABA). 210 gene care sunt specifice sau regulate de ctre Brn3b din prezentul set de date
apar exprimate n stratul celulelor retinale ganglionare ale unui oarece normal de laborator
C57BL/6, conform ABA.
Referitor la datele obinute la vrsta P3, un screening folosind aceeai metod a fost
dezvoltat pentru confirmarea exprimrii genelor la acest moment al dezvoltrii, n retin.
Criteriile de selecie au fost legate de nivelul de exprimare a genelor respective n celulele
retinale ganglionare i/sau s fie reglate fie de Brn3a, fie de Brn3b.

Gene specifice pentru celulele retinal ganglionare cu potenial importan n

dezvolatrea neuronal
n plus fa de analiza general a genelor care cdeau sub criteriile de 2FPKM/2 ori
exprimarea setului de comparaie, am realizat o analiz utiliznd criterii mai severa. Astfel, au
fost alese 14 gene care nu fuseser analizate anterior ca markeri pentru celulele retinale
ganglionare, anume Slc11a1, Slc17a6, Dpp10, Chl1, Adap1, Clstn2, Htr1b, Epb4.9, Slc6a4, Igf1,
Kitl, Ctxn3, Synpr and Trhde. Analiza acestor gene scoate n eviden faptul c diferena dintre
probele RGC i retina este mai mare dect 10 ori. Majoritatea moleculelor selectate dup acest
criteriu au fost confirmate n baza de date a Allen Brain Atlas prin hibridizare in situ a retinelor
extrase din embrioni de E15, iar parte din ele au fost confirmate ca fiind prezente n stratul
celulelor retinale ganglionare i n cursul screeningului realizat pentru retinele extrase de la
animale aflate la ziua a treia postnatal.
Table 3. Gene selectate dup scriterii de selecie mai stringente
Brn3a P3
Brn3b E15
Diferena
0
Slc6a4,
dintre WT vs KO
Ctxn3,Synpr, Igf1,
>5
Trhde, Kitl, Slc17a6,
Chl1
Diferena
Slc11a1,
Ctxn3,
dintre RGC vs Ret
Slc17a6,Dpp10, Chl
Slc11a1
>10
1, Adap1, Clstn2,
Htr1b, Epb4.9, Slc6a4

24

Brn3b P3
Ctxn3, Clstn2,
Synpr

Ctxn3,
Slc11a1, Slc6a4

n final, aceste gene, dei nu au fost anterior analizate ca find markeri de celule retinale
ganglionare, sunt totui menionate n literatura de specialitate n contextual profilelor de
exprimare genic preluate de la celule retinale ganglionale sau de la diferite organe sensoriale, n
diferite stadia de dezvoltare (Engi colab., 2007; Ivanov i colab., 2008; Lu i colab., 2011; Qiu
i colab., 2008; Siegert i colab., 2012). Parte din aceste gene au fost analizate anterior n studii
referitoare la dezvoltarea neuronal (Matsuyoshi i colab., 2012; Moore i colab., 2007; La Torre
i colab., 2012; Rodriguez-de la Rosa i colab., 2012; Upton i colab., 1999; Upton i colab.,
2002; Venkateswarlui colab., 2007).

3. Strategia knock-in condiional folosind sistemul dublu de recombinare pentru

studiul dezvoltrii celulelor retinal ganglionare
Generarea liniilor mutante Brn3aCKOCre i Brn3bCKOCre
Confirmarea integrrii mutaiei n celulele stem embrionare

Probele de ADN extrase de la colonii individuale de celule embrionare stem cu genotipul

Brn3a/bCKOCre/+ au fost analizate pentru cele dou probe, cea de 5 i cea de 3. Primul test
Southernblot a fost desfurat pe 96 de clone diferite pentru fiecare linie, obinndu-se un
rezultat pozitiv n 68% din clone, fapt ce indic un randament ridicat al integrrii i seleciei.
Integrarea este reprezentat de prezena att a unei benzi WT (de 19 kb pentru Brn3a i de 6 kb
pentru Brn3b) i a uneia mutant (23.5 kb i, respectiv 10 kb).

25

Figure 9. Eliminarea casetei de

selecie pozitiv PGK-Neo. Rezultatul
testului Southerblot pentru probele 5 i 3
ale liniei Brn3bCKOCre/+. Pentru proba de la
captul 5 s-a realizat o digestie cu enzima
de restricie KpnI, generndu-se un
fragment de 14 kb dup pierderea casetei
Neo. Pentru captul 3digestia cu enzima
BamHI evideniaz o band mutant de 6
kb, care dup eliminarea casetei devine 7.6
kb (Ghinia i colab., submitted).

10 kb

8 kb

6 kb

Dup propagarea a 12 clone alese dintre cele pozitive la prima testare, un al doilea test
southerblot a fost desfurat pentru a reconfirma rezultatul. Mai mult, dup ncruciarea liniilor
cu o linie ce poart recombinaza Flp, probele de ADN extrase din prima generatie de mutani au
fost testate cu acelasi test pentru verificarea eliminrii casetei pentru selecie pozitiv, acesta
prezentnd un randament de 100%.
Mutani triplii: CAG:Dre; Brn3CKOCre; ROSA26iAP/+
Iniial, pentru a testa recombinarea Dre a celor dou situsuri RoxP, am profitat de
transgena CAG:Dre (Anastasiadis i colab., 2009), care exprim ubicuu recombinaza Dre. n
ceea ce privete linia reporter, ROSA26iAP (Badea i colab., 2003) a fost folosit pentru
exprimarea fosfatazei alcaline, dup recombinarea Cre. Secvena evenimentelor de recombinare
ncepe cu exprimarea recombinazei Dre devreme n timpul dezvoltrii sau n linia germinativ,
urmat de eliminarea conditionat a genei Brn3, care induce exprimarea recombinazei Cre sub
controlul promoterului de Brn3.
n linia ROSA26iAP cel de-al doilea exon urmat de semnale adiionale de terminare este
inversat i flancat de dou situsuri LoxP, prin urmare, n absena recombinrii transcriptia
26

fosfatazei alcaline este imposibil. Dup recombinarea celor dou situsuri LoxP sub aciunea
recombinazei Cre, componentele inversate se poziioneaz n orientare normal, permind
procesarea corect a celor doi exoni, i, prin urmare, transcrierea fosfatazei alcaline (AP) (Badea
i colab., 2009b).
Reacii PCR au fost realizate pentru genotiparea ADN-ului n vederea identificrii
diferitelor elemente: fosfataza alcalin (AP), recombinazele Cre i Dre (Fig. 10). Dup cum era
de ateptat, n combinaia CAG:Dre; ROSA26iAP/+ au rezultat produs perechile de amorse pentru
recombinaza Dre i pentru fosfataza alcalin. n combinaia Brn3a/b CKOCre/+; ROSA26iAP/+ au
prezentat produs de PCR amorsele pentru fosfataza alcalin i recombinaza Cre, n timp ce n
cazul tripului transgenic, toate cele trei perechi de amorse (1, 2, 3) au rezultat produs de PCR.

ROSA26-iAP/+
Pp 1
Dre
Pp 2
Cre
Pp 3
Figure 10. PCR de genotipare a animalelor mutante ce poart diferitele elmente. Analiza
ADN-ului de la CAG:Dre; ROSA26iAP/+ a prezentat produs de PCR pentru AP i Dre. Cele trei
perechi de amorse (1, 2 and 3) au rezultat produs PCR n CAG:Dre; Brn3a/bCKOCre/+;
ROSA26iAP/+ iar n cazul mutantului Brn3a/bCKOCre/+;ROSAiAP/+ nici o banda pentru perechea de
amorse 2 (Dre).

Recombinare Dre i Cre n oarecele adult

Att retinele ct i sectiunile din creierul celor trei tipuri de animale mutante au fost
analizate n vederea depistrii exprimrii genei reporter, fosfataza alcalin (AP). Surprinztor,
ambele tipuri de preparate n cazul mutantului triplu au prezentat reactivitate complet pentru
fosfataza alcalin, indicnd recombinare ubicu a recombinazei Cre.
27

esuturi procesate n condiii similare extrase de la animale purtnd genotipul CAG:Dre;

ROSA26iAP/+ au fost complet negative pentru reacia fosfatazei alcalin, confirmnd c
recombinaza Dre nu poate media recombinarea ntre dou situsuri LoxP.
n plus, retinele animalelor cu genotipul Brn3a/bCKOCre/+; ROSA26iAP/+ prezint puin
reactivitate a fosfatazei alcaline n celulele retinale ganglionare, sugernd exprimarea
independent a recombinazei Dre fa de Cre exprimat din alela Brn3a/bCKOCre , posibil datorat
unui fenomen de citire-prin (read through) secvena codificatare a recombinazei Cre, n ciuda
semnalulul de terminare adiional prezent n ambele constructe.

Figure 11. Analiza tesuturilor prelevate de la animale ce poart sistemul dublu de de

recombinare, sugernd exprimarea ubicu timpurie a recombinazei Cre. Preparate ntregi de
retin extrase din animale adulte (A-C, G-I), ct i emispere ale seciunilor coronare de creier
(D-F, J-L) au fost examinate pentru activitatea fosfatazei alcaline. n cazul mutantului
CAG:Dre; ROSA26iAP/+ (A, D, G, J),exprimarea recombinazei Dre n linia germinativ nu
rezult n exprimarea fosfatazei alcaline. esuturi cu genotipul Brn3 CKOCre/+; ROSA26iAP/+
prezint exprimarea fosfataei alcaline n background, n absena recombinazei Dre. n cazul
mutanilor triplii fosfataza alcalin este exprimat ubicuu ca rezultat al recombinrii Cre la
locusul ROSA26iAP/+ n ntregul esut sau marea majoritate a acestuia. A, C, D, F n=4, G, J
n=6, B, E n=9, H, I, K, L n=13 (Ghinia i colab., submis).
Recombinarea timpurie-ubicu a recombinazei Cre de la locusul endogen de Brn3a
i Brn3b
Pentru a analiza exprimarea recombinazei Cre de la alelele Brn3a/bCKOCre civa mutani
avnd cele trei elemente au fost analizai la a 9-a zi embrionar. Mutanii triplii CAG:Dre;
Brn3CKOCre/+; ROSA26iAP/+ prezint exprimarea omogen a genei reporter AP, indicnd
28

exprimarea ubiquitoas sau n linia germinativ a recombinazei Cre sub controlul promoterilor
de Brn3a/Brn3b.
n experimente anterioare, oareci cu genotipul ROSA26rtTACreER; Brn3bCKOAP (Badea i
colab., 2009b) au fost folosii pentru investigarea specificitii promoterului genei Brn3b n
diverse esuturi, n timpul dezvoltrii. n aceti oareci, inducerea recombinrii Cre de la locusul
ROSA 26 rezult n recombinarea la locusul Brn3, rezultnd o alel de unde AP este exprimat
sub controlul promoterului Brn3. Dup cum se poate observa n Fig. 12 (A), activitatea fosfatazei
alkaline n embrionii acestei linii mutante poate fi detectat n crestele germinative. Aceste
descoperiri sugereaz c promoterul genei Brn3 este activ n linia germinativ. Prin urmare, este
foarte posibi ca exprimarea omogen a genei reporter AP n transgenele triple CAG:Dre;
Brn3CKOCre/+; ROSA26iAP/+ s fie rezultatul recombinrii mediate de Cre n linia germinativ.
n cazul transgenelor duble (CAG:Dre; ROSA26iAP/+ i Brn3CKOCre/+; ROSA26iAP/+) se
pot observa tiparuri de exprimare asemntoare celor din adult, anume, nici un fel de exprimare
n prima, i exprimare pe alocuri n cea de-a doua. Toate ncrucirile, att la masculi ct i la
femele, au purtat alelele Brn3CKOCre.
Figure 12. Exprimarea timpurie a
recombinazei Cre n oarecii avnd
genotipul
CAG:Dre;
Brn3CKOCre;
ROSA26APi/WT. Marcarea ntregii retine
extras de la embrioni de E12.5 cu
genotipul ROSA26rtTACreER; Brn3bCKOAP
sugereaz exprimarea fosfatazei alkaline
n crestele germinative (A, stnga).
Embrioni cu vrsta E9.5 prezint
exprimarea fosfatazei alkaline n ntreg
esutul animalelor CAG:Dre; Brn3CKOCre;
ROSA26APi/WT i pe alocuri n cele
Brn3CKOCre; ROSA26iAP/WT. Ca i n
esuturile extrase de la adult, nu s-a
constatat exprimarea genei reporter n
animale
cu
genotipul
CAG:Dre;
ROSA26iAP/WT. B n=9, C n=6, D, E n=4,
F n=1 Ghinia i colab., submis).

29

4. Noi instrumente pentru viitorul studiu al circuitelor neuronale retinale

n acest proiect, trei linii de celule au fost create. Iniial, linia CaPoChR2 const n trei
elemente: un canal de calciu, unul de potasiu precum i un canal cationic, sensibil la lumin
Channelrhodopsin (ChR2). Toate cele trei elemente au fost inserate la o singur locatie n
gnomul celulelor HEK293 FlpIn prin intermediul vectorului pcDNA5/FRT. Ulterior, secvena
codificatoare a genei de ChR2 a fost clonat n acelai vector folosindu-se aceeai strategie. n
final, cea de-a treia linie de celule a pornit avnd la baz linia CaPoChR2, asupra creia cADNul genei de ChR2 a fost supra exprimat prin exprimare randomic.

Genotiparea diferentelor elemente din celule

Pentru a verifica prezena fiecrui element din diferitele linii celulare, mai multe clone au
fost disociate, ADN-ul genomic fiind extras i au fost efectuate reacii de PCR.
Pentru linia CaPoChR2 ct i pentru cea gChR2, integrarea corect a elementelor a fost
verificat folosind perechile de amrse P1-P2, respective R-C1. Prin folosirea acestor combinaii a
fost posibil verificarea captului 3 al secvenei canalului de Calciu i captul 5 al celei de
ROMK1, iar n cel de-al doilea caz, captul 3 al secveei genei ROMK1 i captul 5 al ChR2EYFP.

Figure 13. Constructul CaPoChR2. Cele trei elemente canalul de Ca, cel de K i
Channelrhodopsin au fost asamblate mpreun prin intermediul secvenelor peptidice 2A.
Perechile de amorse P1-P2 i R-C1 au fost folosite att pentru construcia secvenelor 2A ct i
pentru genotiparea diferitelor linii de celulare.

30

Pentru faptul c linia gChR2 a fost creat pe baza liniei HEK293-CaPoChR2, clonele au
fost testate pentru aceleai elemente, folosindu-se aceleai seturi de amorse. n plus, acestea au
mai fost testate i cu perechile Ca1 i Ca2, precum i C2-C3.
Pentru linia ce conine doar secvena codificatare a ChR2 singura validare prin reacie
PCR a fost pentru captul 3 a ChR2-EYFP.

Fluorescena YFP n diferitele linii celulare

Controlul iniial al integritii fluorescenei YFP n prima linie de celule CaPoChR2 a
scos n eviden faptul ca acestea prezint fluorescen n comparaie cu controlul negativ,
celulele HEK293 FlpIn. Cu toate acestea, un experiment pilot n care celule HEK293 FlpIn au
fost transfectate transient cu ChR2-EYFP, a scos n eviden faptul c nivelul de fluorescena
acestora este mult mai ridicat n comparaie cu cel obinut de la linia CaPoChR2.
Acest aspect a generat crearea liniei ChR2 n care secvena codificatoare a genei ChR2EYFP este exprimat unic n celulele HEK293 FlpIn prin intermediul sistemului de recombinare
FlpIn. Intensitatea fluorescenei EYFP n celulele acestei linii este de cel puin 10 ori mai mare
comparativ cu cea exprimat de linia CaPoChR2.
n ciuda acestui fapt, linia ce exprim doar ChR2 nu este suficient pentru a atinge scopul
iniial al proietului.
Prin urmare linia gChR a fost creat pentru a ndeplini scopul principal, acela de a
conine cele trei elemente CaV1.2, ROMK1 i ChR2-EYFP. n plus, prin supra exprimarea
secvenei codificatoare de ChR2-EYFP, nivelul de flourescen, deci nivelul de sensibilitate la
lumin a fost crescut. Fig. 14 prezint nivelele de intensitate ale fluorescenei ale tuturor celor 3
linii de celule.

31

Figure 14. Fluorescena YFP n diferite celule aparinnd diferitelor linii. CaPoChR2,
linie ce conine calciu, potasiu i ChR2. gChR2 linia CaPoChR2 n care este supra exprimat
secvena ChR2. DAPI marker nuclear.
Analiza Patch Clamp a liniilor CaPoChR2 i ChR2
Celule ce poart mutaia CaPoChR2 rspund la lumin cnd sunt supuse unor diferii
stimuli cu cureni care ajung la 150 pA cnd lumin constant a fost transmis prin stimuli lungi
de 0.2 s, de 10 ori. n schimb, prin transmiterea stimulului luminous constant i variat pentru 10
ori, 2s, curentul rezultat este mai sczut, cu toate c rspunsul este mai lung. n general, acelai
tipar a fost observant i n cazul celulelor cu ChR2 unic. Cu toate acestea, rspunsul de
depolarizare n acest caz este de 8 nA, similar n aceleai condiii testate, de 53 de ori mai mare
dect cea testat anterior.
Aceste descoperiri sugereaz ca proteina ChR2 nu este exprimat n linia CaPoChR2 att
de intens ca i n cea care conine doar secvena ChR2. Acest efect poate fi datorat imposibilitii
peptidelor de legtur 2A de a oferi o raie molara egal ntre cele dou proteine legate.
32

Discuii Generale
Este cunoscut faptul c sistemul nervos central posed plasticitate avnd capacitatea de a
se adapta i reo rganiza n cursul dezvoltrii, procesului de invaare iar de ase menea in condiii
patologice. Retina, parte a sistemului nervos central, este un esut foarte dinamic iar drept urmare
sufer diverse grade de reorganizare n decursul dezvoltrii sale. Celulele retinale ganglionare
trec prin diverse etape de dezvoltare, de la decizia de a deveni o clasa particular de celule, pna
la adoptarea unui tip specific de arbore dendritic i interactiunea cu celulele nvecinate.
Diverse modificri patologice la nivelul retinei au fost caracterizate n ultimii ani, n
special la nivelul fotoreceptorilor. Aa numitele remodelri la nivelul retinei, consecina a
degenerrii fotoreceptorilor, sunt caracterizate de modificri severe n ceea ce privete
integritatea diverselor tipuri de neuroni situai distal, uneori ducnd pn la moartea anumitor
tipuri de cellule, precum cele bipolare sau amacrine.Celulele retinale ganglionare, nsa, tind s
ramn neafectate, sugernd faptul c aceastea reprezint o populaie de neuroni intrinsic stabil.
n prima parte a acestei teze am luat n considerare situaia opus i anume care este
impactulunei reduceri drastice in numarul celulelor retinale ganglionare asupra structurii globale
aretinei. Pentru aceasta, am folosit un model experimental de soarece, la care am nlturat
factorul de transcripie Brn3b, o molecul strict specific pentru celulele retinale ganglionare de
la nivelul retinei de soarece, cu rol esenial pentru dezvoltarea normal a acestei clase de celule.
Diveri marcri utilizai pentru aprecierea modului de laminare a stratulu i plexiform
intern , au fost direcionai ctre identificarea celulelor presinaptice precum i a celulelor bipolar
i a moleculelor ce reflect densitatea sinapselor panglic i a celor electrice. Toi aceti markeri
nu au artat modificri la nivelul mutanilor de Brn3b comparativ cu lotul control.
Aceast dependen relativ a celulelor din straturile interne ale retinei a fost demonstrat
n cadrul mai multor studii. De exemplu, se cunoate faptul c celulele amacrine sunt n mare
parte independente de celulele retinale ganglionare, n ciuda faptului c aceastea din urm
reprezint un partener post-sinaptic major. Studiile n care nervul optic a fost lezat, ducnd la
moartea acestora au demonstrat faptul c celulele amacrine rmn intacte, meninndu-i
stratificarea lor normal la nivelul stratului plexiform intern (revizuit in Chalupa and Gunhan,
33

2004). Eliminarea genetic a unui numr mare de celule retinale ganglionare la animalele
mutante la nivelul genei Math5, au demonstrat rezultate similare (Brown et al., 2001; Wang et
al., 2001).
Rezultatele prezentate n prima parte a tezei ntresc cele menionate mai sus, sugernd
faptul c neuronii de la nivelul retinei prezint autonomie n timpul fazelor de arborizare,
laminare iar, mai trziu, supravieuire. Acest aspect prezint interes n patologia retinian din
doua puncte de vedere. n primul rnd, ofer noi posibilitai n poteniala tratare a bolilor care
afecteaz primar nervul optic, cum ar fi nevrita optic. Tratamentele cu celule stem care
urmresc regenerarea celulelor retinale ganglionare pot aduce beneficii doar n cazul n care
restul retinei rmne intact. n al doilea rand, n bolile degenerative care afecteaza primar
fotoreceptorii, implanturile prostetice pot beneficia de faptul ccelule retinale ganglionare rmn
n mare parte intacte.
Pentru a investiga n detaliu care sunt programele genetice care duc la dezvoltarea
celulelor retinale ganglionare, n cadrul acestei teze au fost investigate efectele nlocuirii genice
prin recombinare omoloag a genelor care codific factorii de transcriere Brn3a i Brn3b.
Analiza fenotipurilor Brn3 a/b dezvluit o parte din programele genetice care duc la dezvoltarea
celulelor retinale ganglionare. Folosind un tip particular de mutani Brn3a i Brn3b a fost
posibil izolarea unor populaii mbogite de celule retinale ganglionare la anumite momente
specifice n decursul dezvoltrii lor, urmat de studii de expresie genetic la nivelul acestora.
Gena reporter folosit, fosfataza alcalina (AP) care nlocuiete gena Brn3 n urma
procesului de recombinare genetic, permite vizulizarea i de asemenea purificarea acestor
celule, prin folosirea unor anticorpi directionati mpotriva AP exprimat la nivelule membranei
celulare. Rezultatul acestui proces este o populatie imbogatita n celule retinale ganglionare care
ARN-ul a fost izolat i utilizat n scopul secvenrii RNA (RNA -seq).
Acest screening a urmrit s identifice dac exist variai la nivelul tiparelor de exprimare
genetic n cursul dezvoltarii celulelor retinale ganglionare; drept urmare, populaiile de celule
care exprim Brn3b au fost analizate la doua momente cheie E15 i P3, iar cele care exprim
Brn3a doar la P3. Diferite etape de dezvoltare, precum dezvoltarea axonului, a arborelui
dendritic sau interaciunea cu celulele vecine, implic activarea unor seturi diferite molecule.

34

Datele obinute n acest fel permit analiza comparativ a genelor specifice pentru Brn3a i/sau
Brn3b la P3, iar, de asemenea, a celor specifice pentru Brn3b la E15.
n primul rand, aa cum am ilustrat n seciunea de Rezultate, exist de 10 ori mai multe
gene induse de ctre Brn3a faa de Brn3b atunci cnd comparm datele de exprimare genic
obinute de la celule retinale ganglionare care exprim unul sau celalat fa ctor de transcriere.
Marea majoritate a genelor care sunt induse de ctre Brn3b se suprapun cu cele induse de
ctre Brna, n proporie de 90%. Cu toate acestea, genele induse de ctre Brn3a se suprapun cu
cele induse de ctre Brn3b doar n proporie de 47%. Se cunoaste faptul c celulele retinale
ganglionare positive pentru Brnb prezint un arbore dendritic mai lat i mai putin arborizat. La
nivel functional, dimensiunea arborelui dendritic prezint o caracteristic important, deoarece
reflect dimensiunea campului dendritic (Masland, 2012).
n ceea ce priveste specificarea celulelor retinale ganglionare, exist cteva aspecte
diferite ntre cele positive pentru Brn3a comparativ cu cele positive pentru Brn3b. Mai multe
grupuri au dezvluit faptul c, pe lnga rolul lor de dicta diferenele dintre diverse tipuri de
celule, factorii de transcriere Brn3 au de asemenea functii generale. Brn3b joaca un rol important
n devzvoltarea axonilor, n timp ce Brn3a este necesar pentru dezvoltarea corect a arborilor
dendritici (Erkman et al., 1996; Gan et al., 1996; Erkman et al., 2000; Wang et al., 2000; Badea
et al., 2009a; Badea and Nathans, 2011). ntrebarea principala este cum ajung programele
genetice controlate de ctre diveri membrii ai familiei Brn3 s confere o anumit structura i
functie celulor care le exprim.
Experimentele realizate n aceast tez pe ofer un set enorm de date care pot fi explorate
pe viitor. Ideea general este de a identifica conexiuni funcionale ntre aceste gene, care n -au
fost descrise anterior, n special cele care determina ca diverse celule retinale ganglionare sa
adopte o anumita structur i funcie. Un alt aspect important este identificarea genelor care sunt
eseniale pentru acest proces i de a le utiliza, posibil, pentr u terapii genetice care vizeaz
restaurarea anumitor funcii.
n cadrul acestei teze am prezentat de asemenea dezvoltarea unor instrumente genetice
care s permit studierea cu nalta rezoluie rolului pe care aceste gene l joaca n cadrul
procesului de difereniere a celulelor retinale ganglionare. Au fost create dou linii mutante, n
care, prin folosirea sistemului de recombinare dubl, se poate asigura exprimarea unei anumite
35

gene doar la nivelul unui anumit tip de esut. Ca un exemplu teoretic, propu n gena X din setul de
gene care sunt specifice pentru i reglate de ctre Brn3b, situatin aval de Brn3b.Sa presupunem
c gena X conine o secven specific n promoterul su, de care factorul de transcriereBrn3b se
leag n mod direct. Se poate n felul aceasta proiecta un mutant n care gena reporter este
flancat de doua situsuri LoxP, urmat de secvena codificatoare a genei X, construct care poate
fi integrat prin transducie viral la nivelul retinei unei linii de oarece Brn3b CKOCre. Ca urmare a
recombinarii celor doua situsuri LoxP, gena reporter este eliminat iar gena X devine activ
sub controlul direct al promoterului de Brn3b, asigurand expresia acesteia doar n celulele
positive pentru Brn3b. n momentul de fa, aceasta reprezint singura posibilitate de a testa
influena genei X asupra unui subset de celule retinale ganglionare Cu toate acestea, aa cum am
aratat n capitolul III, acest sistem are anumite limitri. n primul rnd, pentru a ob ine rezultatul
dorit la sfaritul recombinarii, liniile necesit a fi incruci ate cu o recombinaz Dre care s se
exprime specific la nivelul retinei. ntr-adevar, cea folosita pn n momentul de fa, care
exprim Dre n linia germinativ, (CAG:Dre) duce la exprimarea genei reporter la nivelul
intregului organism. Ca i soluie, transgenele pot fi generate n aa fel ncat recombinaza Dre s
fie sub controlul unor gene specifice pentru retin (ca de exemplu, Pax6).
n final, trei linii celulare au fost generate, n care instrumentul optogenetic
Channelrhodopsin (ChR) a fost exprimat n mod diferit, mpreun cu canale adi ionale de calciu
i potasiu. Liniile celulare au fost generate n aa fel ncat s fie adecvate pentru studii de
electrofiziologie la nivel neuronal, far s fie necesar lezarea oricrui tip de esut neuronal.
n ceea ce privete elaborarea acestor linii celulare, n special linia CaPoChR2 care
contine toate cele trei elemente canalele de Ca i K, precum i ChR2 - s-a urmarit ca toate
acestea s fie exprimate la un locus unic n cadrul genomului celular. Studiile de fluorescen au
aratat, ns, c exprimarea de ChR-EYFP este mai redusa n liniile care exprim canalele de Ca
i K comparativ cu linia n care doar ChR2 este exprimat de ctre vectorul pcDNA5/FRT.
Aceasta sugereaz ca faptul c peptidele de legturp 2A prezint limitari n ceea ce privete rata
de exprimare a elementelor pe care le leag. O explicaie poate fi faptul c toate cele trei canale
sunt proteine complexe ce necesit diverse rearanjamente pentru a-i exercita funciile, mai ales
n cazul lui ChR2, care este o protein transmembranar.

36

Concluzii
Aceast tez furnizeaz noi informaii despre biologia celulelor retinale ganglionare, clarificnd
diferite aspecte.
n primul rand, n prezenta tez s-a artat faptul c diverse tipare de neuroni aparinnd retinei
(fotoreceptori, celule orizontale, bipolare i amacrine) i, de asemenea, densitatea sinapselor panglic i
cea a celor electrice nu sunt semnificativ afectate de reducerea drastic a numrului de celule retinale
ganglionare. Aceste evidene susin ipoteza c arhitectura general a retinei i conexiunile care se
stabilesc nivelul ei sunt dictate de programe genetice , care sunt n mare parte autonome la nivelul celulei
si nu pot fi afectate n mod specific prin manipularea acestor factori de transcriere.

n al doilea rnd, au fost investigate programele genetice care duc la dezvoltarea i diferentierea
normal a diferitelor seturi de celule retinale ganglionare. Folosind un protocol relativ rapid, am reuit sa
purificm o populaie de celule mbogit n celule retinale ganglionare, optim pentru experimente
subsecvente de exprimare genetic la nivel de ARN-ului. Analiza profilelor de exprimare genic a fost
realizat utiliznd metode de generaie nou (RNA-seq), ceea ce a furnizat informaii importante privind
diferite seturi de gene care determin trsturi distincte la nivelul celule retinale ganglionare; o mare parte
din date au fost confirmate prin hibridizare in situ.
Dou linii de oareci mutani au fost generate, n care genele Brn3a i Brn3b au fost nlocuite cu
recombinaza Cre. n cadrul aceastor linii, exprimarea recombinazei Cre este condiionat de recombinarea
celor doua situsuri RoxP care este mrginesc gena Brn3 respectiv i care sunt foarte specifice pentru
recombinaza Dre. Acest sistem de recombinare dubl permite analiza diverselor evenimente a caror int
sunt subseturi de celule retinale ganglionare.

n final, au fost generate linii stabile de celule HEK293, care exprim diferite combinaii dintre
un canal cationic sensibil la lumin (ChR2), un canal de calciu dependent de voltaj (CaV1.2) i un canal
de potasiu (ROMK1). Acest tip de linii celulare i vor gsi aplicaii largi n cadrul studiilor ce implica
procese de depolarizare cu temporizare precis la nivelul membranei.

37