Trabajo Completo

Bioqumica
Mdica
GUIA DE PRACTICA
ALUMNO (a):
MEDICINA - 2011
PRESENTACION
Los profesores de Bioqumica de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional
de Trujillo, han actualizado la Gua de Prctica, donde el estudiante encontrar una
breve introduccin de la importancia bioqumica y correlato medico de cada prctica,
as como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de
ampliar o concretar la aplicacin de lo tratado.
La Bioqumica es sin duda la ciencia que ms ha aportado al desarrollo de la Medicina,
basada en una rigurosa aplicacin del mtodo cientfico de la investigacin
experimental. En la prctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en
los dilogos, seminarios y casos clnicos, tienen la oportunidad de plantear
interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obteniendo
resultados que al final se discutirn en grupo con el docente. Tambin podrn conocer
algunos mtodos aplicados al diagnstico clnico o al estudio nutricional. La prctica en
Bioqumica, constituye un estmulo importante en el desarrollo de la investigacin
experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas
en trabajos de investigacin y as obtener logros a nivel nacional para nuestra
Facultad.
Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual gua de
prctica como el Dr. Hugo Alpaca Muoz, el
Dr. Jorge Garca Ventura y un
agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus
conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiar a los alumnos de
nuestra Facultad.
Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO
Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN
Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA
Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA
Dr. WALTER OBESO TERRONES
Dr. ALFREDO LARIOS CANTO
Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ
Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA
I UNIDAD
SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA
REUNION DE LABORATORIO N 01
PRACTICA N 01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I.
INTRODUCCION:
La vida depende de una serie ordenada de reacciones qumicas que son catalizadas por enzimas formadas para
este fin. Las enzimas son protenas relativamente frgiles con tendencia a sufrir desnaturalizacin e inactivacin,
es decir alteraciones en su conformacin, por efecto de diversos agentes fsicos y qumicos como: temperatura,
cidos, lcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc.
Las enzimas se encuentran en pequeas concentraciones en los materiales biolgicos, resultando complicada su
individualizacin o purificacin. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la
naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores
especficos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir stas cuando son
sometidas a la accin de diferentes agentes fsicos y qumicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o
purificar una determinada enzima se pueden verificar cmo los agentes fsicos y qumicos afectan la naturaleza
proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad.
La finalidad de la presente prctica, es evidenciar las caractersticas proteicas de las enzimas y que expuestas a
la accin de diversos agentes fsicos y qumicos hacen variar su comportamiento y actividad cataltica.
II.
REACTIVOS A UTILIZAR:
III.
NaOH 1N
SO4 Cu 20%
NaCl 0.15M
Amilasa salival 1.0% Solucin iodada

-
Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6

cido tricloro actico (A.T.C.A.) al 20%
HCl 3N y 0.05N
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Preparar:
SISTEMA A
TUBOS
COMPONENTES (en ml)
Amilasa al 1%
NaOH 1N
HCl 3N
cido Tricloro actico 20%
I
II
III
IV V
VI
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
2.4
2.4
2.4
-
Sulfato de Cobre al 20%

Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6
a.
b.
c.
d.
2.4
2.4
-
2.4
Observar el aspecto y color producido e interpretar.

Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente.
Colocar el tubo VI en un bao de agua hirviendo por 10 minutos.
Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B:
SISTEMA B:
TUBOS
COMPONENTES (en ml)
Almidn al 1.0% en solucin acuosa
Buffer fosfato 0.1 M / pH 6.6
NaCl 0.15 M
Agua Destilada
I
1.0
5.0
1.4
2.0
II
1.0
5.0
1.4
2.0
III
1.0
5.0
1.4
2.0
IV
1.0
5.0
1.4
2.0
V
1.0
5.0
1.4
2.0
VI
1.0
5.0
1.4
2.0
a. Pre incubar por dos minutos a 37 C.

b. Agregar 0.6 ml. de la enzima tratada, de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente
tubo del ltimo sistema (B).
c. Dejar en incubacin a 37 C por 20 minutos.
d. A continuacin armar el siguiente sistema:
TUBOS
COMPONENTES (en ml)
HCl 0.05N
De los tubos de reaccin del sistema
I
5
0.5
II
5
0.5
III
5
0.5
IV
5
0.5
V
5
0.5
VI
5
0.5
(B), agregar:
Solucin yodada
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
e. Observar el color producido e interpretar los resultados.
IV.
CUESTIONARIO:
1. Interprete y explique bioqumicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de
la prctica
2. Esquematice el procedimiento de la prctica.
3. Explique los tipos de enlaces fuertes y dbiles que existen entre los aminocidos para conformar
una determinada protena.
4. Explique la teora de la accin molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos.
PRACTICA N 02
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
INTRODUCCION:
Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biolgico que tienen un alto grado de
especificidad y eficiencia; permitiendo que las reacciones qumicas dentro de la clula ocurran rpidamente a
travs de vas bien definidas. Sin estas protenas especializadas, la vida tal como es no podra existir.
Para poder mostrar la actividad enzimtica se debe tener presente fundamentalmente que cada reaccin qumica
debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia qumica que reacciona para dar un
producto en un sistema enzimtico se llama sustrato, entonces en un organismo vivo habra tantos sistemas
enzimticos como sustratos reaccionantes.
Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reaccin dada, solo muy pocas
enzimas pueden medirse directamente.
En general, la actividad de cualquier sistema enzimtico puede ser demostrada de dos maneras:
1. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) despus de un tiempo determinado de
incubacin en condiciones especificas de pH y temperatura.
2. Verificando los productos liberados despus de un tiempo determinado de incubacin en condiciones
especificas de pH y temperatura.
La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimtica, utilizando la enzima amilasa
salival que tiene la capacidad de degradar el almidn en maltosa (disacrido reductor) y algo de glucosa;
verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reaccin.
- Solucin de almidn pH 6.0 al 1%.
- Cloruro de sodio solucin 0.1M
- Enzima al 1% (amilasa salival).
- cido Clorhdrico 0.05N
- Solucin yodada.
- Reactivo Folin Wu:
a. Solucin Cprica alcalina.
b. Solucin fosfomolbdica.
Armar el siguiente sistema:

ETAPA A:
TUBOS
COMPONENTES
II
Solucin de almidn pH 6.0 al 1%
5 ml.
5 ml.
Solucin de cloruro de sodio 0.1M
1 ml.
1 ml.
Agua destilada
4 ml.
3 ml.
Colocar los tubos al bao de agua a 37 C por 5 minutos.
Agregar 1 ml. de enzima al tubo II.
Volverlos a colocar al bao de agua a 37 C durante 10 minutos.

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL.
Inmediatamente cumplidos los 10 minutos. De cada uno de los tubos del sistema anterior, transferir 0.5
ml. a este nuevo sistema.
TUBOS
COMPONENTES
cido clorhdrico 0.05 N
De los tubos I y II: Etapa A
Solucin yodada
I
5 ml.
0.5 ml.
0.5 ml.
II
5 ml.
0.5 ml.
0.5 ml.
Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante.
CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU)

TUBOS
COMPONENTES
De los tubos I y II: etapa A
Solucin Cprica alcalina
Hervir 8 minutos
Enfriar
Solucin fosfomolbdica
Agua destilada
III.
I
1ml.
1ml.
II
1ml.
1ml.
1ml.
2ml.
1ml.
2ml.
Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante
CUESTIONARIO:
1.
2.
Qu mtodos conoce para determinar la actividad enzimtica?

Explique la accin bioqumica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para
determinar la actividad enzimtica.
3. Elabore un grfica para demostrar la accin de una enzima sobre su sustrato, donde se observe la
energa de activacin y el estado de transicin.
4.
Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimtico y defnalos.
PRACTICA N 03
DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS
INTRODUCCION:
El punto isoelctrico es la concentracin de iones hidrgeno en el cual la protena es elctricamente neutra,
porque el nmero total de cargas positivas es igual al nmero total de cargas negativas contenidas en la protena.
Por tanto, cada protena posee un determinado punto isoelctrico (PI).
Cuando una protena se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores, iguales o mayores
al PI, la protena sufre variaciones en la constitucin de sus grupos qumicos, producindose en consecuencia
variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su funcin biolgica
Aparte de otras propiedades que presentan las protenas, cuando se encuentran en una solucin que tienen pH
igual al PI, algunas protenas son muy dficilmente solubles y precipitan. Aprovechando este comportamiento, se
puede determinar el PI de una protena observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la
protena se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos.
La presente prctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoelctrico de las enzimas es una
caracterstica fsico qumica comn de estas molculas, que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones
disminuye al mnimo.
- NaOH al 10%.
- cido actico 1N
- Indicador de pH: Papel Indicador pHmetro.
- Solucin de casena en Acetato de Sodio 0.1N

Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9
TUBOS
REACTIVOS (en ml.)
cido Actico 1N
Agua Destilada
I
3.2
6.8
II
5
III
5
IV
5
V
5
VI
5
VII
5
VIII
5
IX
5
Mezclar el tubo N 1
Extraer 5ml. de solucin del tubo N 1 y agregarlo al tubo N 2. Mezclar
Extraer 5ml. del tubo N 2 y transferir al tubo N 3. Completando del mismo modo hasta completar la serie.
En el tubo N 9 una vez efectuada la mezcla, se extrae 5 ml. de solucin y se elimina.
Al contenido anterior del sistema agregar rpidamente 1 ml. de casena en acetato de sodio 0.1N en cada tubo.
TUBOS
CONTENIDO ( en ml.)
Contenido Anterior
I
5.0
II
5.0
III
5.0
IV
5.0
V
5.0
VI
5.0
VII
5.0
VIII
5.0
IX
5.0
Casena 0.1N (sal)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Mezclar al instante por inversin.

Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la protena en los diferentes tubos.
Anotar en el cuadro que se da a continuacin
Observar despus de 30 minutos de reposo y anotar tambin en el cuadro respectivo.
TUBOS
EFECTO
EFECTO DESPUS DE 30
CLCULO
N.
INMEDIATO
MINUTOS
DEL pH
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
Emplear los smbolos siguientes :
O = no cambia
+ = opalescencia,
x = precipitado
Determinar el tubo que presenta el mximo de precipitacin, lo cual se producir en el tubo que tiene pH
prximo a la solubilidad mnima de la protena.
Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo, verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador
de pH. Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior.
Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuacin de Henderson Hasselbach. Ver ejemplo.
Ecuacin de Henderson Hasselbach
[ sal ]
pH = pK + log.
[ cido ]
pK del cido Actico = 4.7
Ejemplo :
Si la concentracin de la sal es de 1 ml. de acetato de sodio 0.1 N en todos los casos, la concentracin de
cido actico vara. As en el tubo N 1 es de 1.6 ml. de cido 1 N (16 ml. 0.1N). En el tubo N2 la
concentracin de cido actico es de 8 ml. al 0.1 N. En el tubo N 3 la concentracin de cido actico es de
4.0 ml. 0.1 N. Etc.
Clculo de pH para el tubo N 3:
pH = pK + log. 1 = 4.7 0.6 = 4.1
TUBO N 3 = pH 4.1
4
NOTA: De la manera indicada en el ejemplo, debe calcularse el pH de cada uno de los tubos
CUESTIONARIO:
1. Indique el punto isoelctrico aproximado a la protena, que encontr en su experimento.
10
2. Cmo interpreta el resultado obtenido del punto isoelctrico?

3. Qu es el pK?
4. El pH neutro del medio es igual al pH isoelctrico? De sus razones.
5. Si la concentracin de cido actico en el tubo II es 8 ml a 0.1 N Cul es el pH de la solucin en 1
ml?
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PRACTICA N 04
CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD
ESPECFICA DE LAS ENZIMAS
I.
INTRODUCCION:
Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biolgicas, se recurre a la medida de
la velocidad de la reaccin que cataliza. Esto es posible debido a que la velocidad de la reaccin es directamente
proporcional a la cantidad de enzima. De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en trminos
de unidades enzimaticas, entendindose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta
velocidad de reaccin bajo determinadas condiciones. Esa velocidad de reaccin se expresa como la cantidad de
sustrato transformado en cierto tiempo.
A fin de evitar ambigedades surgidas de la utilizacin de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato
y el tiempo se ha definido por convencin una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que
permite comparar las actividades de enzimas diferentes.
La definicin recomendada por la Unin Internacional de Bioqumica a travs de su comisin de enzimas es la
siguiente: Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la
transformacin de un micromol (mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida.
Dos casos merecen aclaracin especial:
- Cuando el sustrato es una protena, o un polisacrido, o cualquier otra molcula en la cual son atacados
ms de una unin, se debe reemplazar la definicin de un mol de sustrato por un microequivalente
(eq) del grupo involucrado. Es decir en los ejemplos mencionados ms que el numero de molculas
completamente hidrolizados, se toma como medida de la reaccin el nmero de uniones peptdicas o
glicosdicas atacadas respectivamente.
- En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----- B + C en que dos molculas reaccionan entre si,
una Unidad ser la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de dos Moles de sustrato por
minuto.
En cuanto a las mencionadas condiciones de medida, deben establecerse:
- La temperatura a la cual se define la Unidad.
- El pH.
- La concentracin del sustrato o los sustratos y cofactores, y en general de todos aquellos factores que
de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima.
ACTIVIDAD ESPECFICA.
Se denomina Actividad Especfica a la cantidad de una enzima expresada en trminos del contenido de
protena de la preparacin, y se expresa como el nmero de unidades de la enzima por miligramo de protena.
Esta aumenta durante el proceso de purificacin de la enzima en los homogenizados biolgicos y llega a ser
mxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. Entonces la actividad especfica adems de
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cuantificar la enzima, constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de
purificacin.
En ste ltimo caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad LA ACTIVIDAD
MOLECULAR O MOLAR O NMERO DE RECAMBIO (NDICE CATALTICO), definible como el nmero de
molculas de sustrato transformado por minuto y por molcula de enzima ( por un solo centro activo) en
condicionales experimentales tales que se est midiendo la velocidad mxima (concentracin saturante del
sustrato).
Actualmente la Unin Internacional de Bioqumica, recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat)
que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo.
Su relacin con la Unidad Internacional es la siguiente:
Un Katal es igual a 6 x 107 Unidades Internacionales.
Una Unidad Internacional es igual a 0.01667 microkatales = 16.67 nanokatales
La Actividad Especfica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de protena (
Microkatales por miligramo de protena) y la actividad molar en Katales por mol de enzima.
La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimtica determinando la actividad
especfica.
II.
III.
Preparado enzimtico (homogenizado celular de Fusarium moniliforme)
Buffer de acetato 0.02M pH 5.0
Sacarosa 0.17M
Hidrxido de bario 0.3 N
Sulfato de Zinc al 5 %
solucin cprico alcalina
Reactivo de Biuret
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES:
SISTEMA DE INCUBACIN
COMPONENTES
Sacarosa 0.17 M
Buffer acetato 0.02 M pH 5.0
Incubar a 37C. (Pre incubacin)
Preparado enzimtico
Mezclar e incubar a 37C.
Detener la reaccin empleando:
Hidrxido de bario 0.3 N
Sulfato de Zinc 5 %
Sacarosa 0.17 M
Agua destilada
TUBOS DE ENSAYO
I
II
0.3 ml.
0.5 ml.
0.5 ml.
2 minutos
0.2 ml.
0.2 ml.
20 minutos
0.5 ml.
0.5 ml.
0.3 ml.
8.0 ml.
0.5 ml.
0.5 ml.
8.0 ml.
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Mezclar: Separar el precipitado de protenas filtrando o centrifugando por 10 minutos.
DETERMINACIN DE PRODUCTOS DE LA REACCIN (azcar reductor)

Se emplear los filtrados libres de protenas del paso anterior y se determinar azcar reductor
mediante el siguiente procedimiento:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES
I
II
Filtrado I
0.5 ml.
Filtrado II
0.5 ml.
Agua destilada
0.5 ml.
0.5 ml.
Solucin cprica alcalina
0.5 ml.
0.5 ml.
Colocar en un bao de agua hirviendo durante 8 minutos
Enfriara al chorro de agua
1.0 ml.
1.0 ml.
III
1.0 ml.
0.5 ml.
1.0 ml.
Mezclar, agregar 7.0 ml. de agua destilada.

Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos.
Leer a 420 nm.
Factor = 0.045 uM/ml.
Clculos de la concentracin de los productos (hexosas)

[(Lect. II Lect. del blanco) (Lect. I Lect. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml.
Clculo de las Unidades (U)

(U) = uM de sustrato transformado x ml. = Micromoles de Hexosas / 2
Minutos
Tiempo de incubacin en minutos (20 min).
CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Determinacin de la concentracin de protenas en el preparado enzimtico: (Reaccin de Biuret)
COMPONENTES
Preparado enzimtico
Agua destilada
Reactivo de Biuret
I
1.0 ml.
4.0 ml.
Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos. Leer a 540 nm
II
0.2 ml.
0.8 ml.
4.0 ml.
14
Para el espectrofotmetro, el factor es.....................

CLCULO:
(Lect. II Lect. I) x Factor = mg. de protenas por ml.
CLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECFICA
U
A.E. =
mg. de Protenas
IV.
CUESTIONARIO:
1. Cundo determina el azcar reductor de una reaccin. Cmo explica la aparicin de la coloracin al
final del sistema?
2. Por qu es necesario conocer previamente la concentracin de protenas del preparado enzimtico y
determinar la unidad de enzima (U), para calcular la Actividad Especfica?
3. Por qu se utiliza el reactivo de Biuret?
4. Por qu una enzima se cuantifica en funcin de su actividad enzimtica y no por el peso de la
protena (enzima)?
5. Si en dos preparados biolgicos A y B la actividad especfica de una determinada enzima es: (en
uM/mg. protena)
a. A = 1 x 10-3 y B = 1.5 x 10-4
6. En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima?
15
PRACTICA N 05
FACTORES FSICOS-QUMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE
LAS REACCIONES ENZIMTICAS PARTE I: EFECTO DE LA
CONCENTRACIN DE ENZIMAS, PH, TIEMPO TEMPERATURA, IONES
INORGNICOS
I.
INTRODUCCION:
En general, todas las enzimas, independientemente del tipo de reaccin que catalizan, presentan caractersticas
comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo, retardando o impidiendo su actividad. Estos
factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reaccin enzimtica sobre un sustrato adecuado y en
determinadas condiciones. Tomando una determinada enzima como patrn es posible tener una idea ms o
menos clara de la influencia de los factores (Tiempo, temperatura, concentracin de enzima, concentracin de
sustrato, pH, iones, etc), sobre la serie infinita de enzimas que se conoce. Este patrn general, como se
comprender, varia en forma caracterstica para cada enzima en particular. Para estudiar cada uno de estos
factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigacin del factor
variable no se vea afectada por la variacin que pudieran sufrir los otros.
La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores, pH, concentracin de enzima,
concentracin de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reaccin enzimtica, tomando como
ejemplo la hidrlisis enzimtica del almidn y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los
productos de la reaccin enzimtica.
II.
III.
REACTIVOS A UTILIZAR
Solucin de almidn al 1 %
Buffer fosfato 0.1M pH 6.6
Buffer acetato 0.1M pH 4.6
Buffer borato 0.1M pH 9.0
Solucin de cloruro de sodio al 2 %
Amilasa salival dializada al 0.25 %
cido clorhdrico 0.05N
Solucin yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio)
Solucin cprico alcalina.
Solucin fosfomolbdica.
COMPONENTES (en ml.)

Solucin de almidn al 1 %
Buffer acetato 0.1M pH 4.6
Buffer borato 0.1M pH 9.0
Solucin de ClNa al 2 %
Agua destilada
I
1.0
5.0
1.4
2.6
II
1.0
5.0
3.4
III
2.0
5.0
1.4
1.0
TUBOS DE ENSAYO
IV
V
1.0
1.0
5.0
5.0
1.4
1.4
2.0
2.0
VI
1.0
5.0
1.4
2.0
VII
1.0
5.0
1.4
2.4
VIII
1.0
5.0
1.4
2.0
16
Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al bao de agua a 37 C, por cinco minutos, para el equilibrio de la
temperatura.
El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 C y 4 C durante cinco minutos.
Agregar el preparado enzimtico a los tubos: II al VIII, segn se indica y tomar el tiempo.
-

Preparado enzimtico (en ml.
I
0.0
II
0.6
III
0.6
TUBOS DE ENSAYO
IV
V
VI
0.6
0.6
0.6
VII
0.2
VIII
0.6
(Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimtico fue agregado a cada tubo)
Mezclar y continuar la incubacin por 20 minutos.

Realizar controles de la actividad enzimtica, de acuerdo a los sistemas que a continuacin se presentan:
CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL

- El control del sustrato no transformado se realiza por la reaccin del yodo, de la siguiente manera:
Cumplidos los 20 minutos de incubacin sacar los tubos del bao mara y luego armar una serie paralela de
tubos marcados del I al VIII, agregando a cada tubo marcado, 0.5 ml. del incubado de su correspondiente
tubo.
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en
ml.)
Incubado
correspondiente de
cada uno de los tubos
HCl 0.05N
Solucin iodada
II
III
IV
VI
VII
VIII
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
5.0
0.5
5.0
0.5
5.0
0.5
5.0
0.5
5.0
0.5
5.0
0.5
5.0
0.5
5.0
0.5
Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos; valorando los cambios de
coloracin (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final.
CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS

- El Control de los productos formados se har en base a la capacidad reductora de estos (glucosa, maltosa)
de la siguiente manera:
Esta determinacin slo se har en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos.
COMPONENTES
Incubado correspondientemente a los tubos III y V
Solucin cprico alcalina
TUBOS
III
V
1.0 ml. 1.0 ml.
1.0 ml. 1.0 ml.
17
Mezclar y poner en bao mara hirviendo por 8 minutos. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar
con agua corriente y AGREGAR:
COMPONENTES
Agua destilada
TUBOS
III
IV
1.0 ml. 1.0 ml.
5.0 ml. 5.0 ml.
Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de
coloracin (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final.
CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA POR EL
SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color)
A los 20 minutos:
I
II
III
IV
V
VI
VII
CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIN ENZIMTICA POR LOS

PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color)
A los 20 minutos
III
V
IV.
CUESTIONARIO:
1. Cules son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimticas?
2. Cmo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidn como
sustrato?
3. Cmo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones
enzimticas?
4. Cmo puede demostrar el efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la
reaccin enzimtica?
5. Cmo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas?
6. Cmo puede demostrar el efecto de la presencia de un in activador sobre la velocidad de las
reacciones enzimticas?
VIII
18
19
PRACTICA N 06
FACTORES FSICO-QUMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS
REACCIONES ENZIMTICAS. PARTE II: EFECTO DE LA
CONCENTRACIN DEL SUSTRATO. DETERMINACIN DE LA
VELOCIDAD MXIMA Y KM.
I. INTRODUCCION:
En las reacciones no catalizadas, la velocidad de reaccin siempre es proporcional a la concentracin de cada uno de
los reactantes, debido a que la velocidad de colisin entre los reactantes es proporcional a la concentracin de cada
uno de ellos.
Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes. A baja concentracin de sustrato la velocidad inicial de la
reaccin es directamente proporcional a la concentracin del sustrato y la reaccin es de primer orden con respecto al
sustrato. Sin embargo, cuando la concentracin del sustrato es incrementada, la velocidad inicial se incrementa con
menor intensidad, de modo que no es tan directamente proporcional a la concentracin del sustrato; en esta zona la
reaccin es de orden mixto. Con un incremento ulterior en la concentracin de sustrato, la velocidad de la reaccin
llega a ser esencialmente independiente de la concentracin del sustrato y asintticamente alcanza una velocidad
constante. En este rango de concentracin de sustrato la reaccin es esencialmente de orden cero con respecto al
sustrato, y se dice que la enzima est siendo saturada con su sustrato.
Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km), se define mejor en trminos de la concentracin
de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reaccin igual a la mitad de la velocidad mxima.
La finalidad de la presente prctica es demostrar el efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de la
reaccin enzimtica y hallar la velocidad mxima y el Km de la reaccin.
II. REACTIVOS A UTILIZAR

-
Buffer fosfato 0.1 M pH EDTA 0.005 M

Urea 0.075 M
Solucin de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0.1 M pH 6.6
Tungstato de sodio al 10 %
cido sulfrico 2/3 N
III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

COMPONENTES
II
III
IV
VI
VII
20
Buffer fosfato pH 6.6

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
Urea 0.075 M
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Pre incubar a 37 C durante cinco minutos
Ureasa 0.05 %
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
0.5
3.0
0.5
3.0
0.5
Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37C

ES FUNDAMENTAL:
Medir exactamente el tiempo de incubacin para cada tubo. Para ello se medir el tiempo de incubacin
inmediatamente despus de agregar la enzima, sta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada
tubo de tal manera que permita un fcil manejo de los mismos al final de cada tiempo.
Transcurridos los 15 minutos agregar rpidamente:
COMPONENTES
H2SO4 2/3 N
Tungstato de sodio 10%
Ureasa
I
0.5
0.5
-
II
0.5
0.5
-
III
0.5
0.5
-
IV
0.5
0.5
-
V
0.5
0.5
-
VI
0.5
0.5
-
VII
0.5
0.5
0.5
- MEZCLAR
Transferir 1ml. de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo
el siguiente esquema:
COMPONENTES
Del incubado anterior
Agua destilada
Reactivo de Nessler
I
1.0
8.0
1.0
II
1.0
8.0
1.0
III
1.0
8.0
1.0
IV
1.0
8.0
1.0
V
1.0
8.0
1.0
VI
1.0
8.0
1.0
VII
1.0
8.0
1.0
21
MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos. Luego:
Realizar las lecturas en el espectrofotmtero a 540 nm en cada uno de los tubos.
Hallar la diferencia de cada uno de los tubos, con respecto al tubo blanco (tubo VII).
Encontrar la concentracin de amonaco producido por ml. Para ello multiplicar la diferencia anterior por el
factor de calibracin empleado (1660) = moles de NH3 /ml.
Calcular la velocidad de reaccin para cada uno de los sistemas enzimticos preparados; empleando la
concentracin de amonaco producido por ml, dividido entre el tiempo de incubacin (15 minutos).
Calcular la concentracin de sustrato (concentracin molar) en cada tubo de incubacin empleando la

siguiente frmula:
V.M. = V.M
Ejemplo: Concentracin de rea en el tubo I.
Datos:
V = 0.5 ml.
V = 4 ml.
M = 0.075 M
M = ?
M = 0.5 ml x 0.075 M = 0.0093 M
4ml.
Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentracin del sustrato y velocidad de la reaccin).
Construir una grfica en el sistema de coordenadas teniendo como parmetros :

La concentracin del sustrato (abscisa) en funcin de la velocidad de la reaccin (ordenada).
En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax.
Utilizando papel milimetrado, aplicar la ecuacin de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos.
Construir una grfica en un sistema de coordenadas teniendo como parmetros la inversa de la
concentracin del sustrato (1/S) (abscisas) en funcin de la inversa de la velocidad inicial de la reaccin
(ordenada).
Calcular en la grfica obtenida la velocidad mxima y la Km.
IV. CUESTIONARIO:
1. Cmo afecta la concentracin del sustrato la velocidad de la reaccin?
2. Qu establece la ecuacin de Micahelis Menten?
3. Qu es el Km?
4. Qu importancia tien el Km?
22
5.
Para que sirve la ecuacin de Lineweaver?
6.
Qu mtodos conoce para determinar el Km?
23
PRACTICA N 07
ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
I.
INTRODUCCION:
Existen sustancias cuya accin sobre una enzima es la disminucin de su actividad. Estas sustancias se conocen
como los inhibidores enzimticos. Excluyndose de sta categora aquellos agentes como los cidos fuertes,
alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molcula proteica que conduce a la
desnaturalizacin. Los inhibidores enzimticos se clasifican en reversibles e irreversibles, que se pueden distinguir
en base a un criterio experimental. Si despus de hacer actuar el inhidor sobre la enzima, eliminamos por algn
mtodo, el exceso de inhibidor, y la enzima recupera su actividad original, se dice que el inhibidor es reversible. A
la inversa, si la enzima contina inhibida despus de la reaccin del inhibidor, se dice que el inhibidor es
irreversible.
Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interaccin entre inhibidor y enzima se
traduce en varios tipos de inhibicin perfectamente diferenciados experimentalmente. Los dos tipos ms comunes
son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas, a las que se pueden
agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas.
En la inhibicin competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su accin inhibidora se revierte al
aumentar la concentracin de sustrato. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el
cual se debera unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formacin del complejo activo-enzima-sustrato. De all el
nombre de competitivo, por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y
tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. Un ejemplo clsico, de este tipo de inhibicin es el que presenta
la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias
estructuralmente parecidas a dicho cido como son el malato, cido oxlico y glutarato.
La inhibicin no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentracin del
sustrato ya que este ltimo no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Aqu el inhibidor se une a la enzima
en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. Por esta razn la unin de este ltimo con la enzima no
es afectada por la presencia del inhibidor, pudindose formar entonces un complejo ternario enzima-sustratoinhibidor, que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reaccin y complejo-enzimainhibidor. Ejemplos de este tipo de inhibicin son los causados por el N-etilamida, cloruro de mercurio, EDTA; los
cuale enlazan iones metlicos necesarios para la actividad enzimtica, NO y CO; inhiben metaloenzimas por
enlazarse al in metlico.
La inhibicin acompetitiva, es otro tipo de inhibicin reversible, comn en sistemas ms complejos en el que el
inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima-sustrato para dar un complejo enzima-sustrato-inhibidor
incapaz de transformarse en otro producto. Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o
no competitivo. Por ejemplo, si el sistema deshidrogenasa succnica+succinato, se agrega malonato como
24
inhibidor. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentracin del sustrato (succinato) entonces se
podr afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. Si la inhibicin no se revierte al agregar sustrato (succinato),
entonces la inhibicin ser de tipo no competitiva. Quedando por demostrar si este tipo de inhibicin es reversible
o no.
II.
III.
La siguiente prctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimtico Deshidrogenasa succnica+succinato:
que el malonato y el cloruro mercrico producen inhibicin de este sistema; que el malonato es un inhibidor
competitivo y que el cloruro mercrico es un inhibidor no competitivo.
- Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2
- Succinato de sodio 0.1 M
- Succinato de sodio 0.5 M
- 2 6 Diclorofenolindofenol
- Malonato de sodio 0.1 M
- Cloruro de mercurio
- Homogenizado heptico 10 %

ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA:
TUBOS
COMPONENTES (ml)
Succinato de sodio 0.1 M
Cloruro de mercurio 0.1 M
Malonato de sodio 0.1 M
2 6 diclorofenolindofenol
Homogenizado 10 %
I
2.0
1.0
1.0
II
1.8
0.2
1.0
1.0
Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente.

Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).
III
1.3
0.2
0.5
1.0
1.0
IV
1.3
0.2
0.5
1.0
1.0
V
1.0
0.5
0.5
1.0
1.0
25
COMPONENTES
II
0.5
III
0.5
-
IV
0.5
-
Anotar y luego agregar a los tubos II, III, IV.

Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar.
IV.
CUESTIONARIO:
1.
Por qu el malonato es inhibidor competitivo?
2.
Por qu el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo?

3. Cmo podra usted demostrar que la inhibicin producida por el cloruro mercrico es o no
reversible?
4. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibicin competitiva en el sistema
Deshidrogenasa succnica succinato, adems del malonato utilizado en el presente experimento.
5. Seale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibicin no competitiva
reversible, sin considerar el cloruro de mercurio.
6. Qu diferencias puede usted establecer entre la inhibicin competitiva y la inhibicin alostrica?
7. De por los menos dos semejanzas entre la inhibicin no competitiva reversible e inhibicin alostrica.
26
PRACTICA N 08
EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE XIDO-REDUCCIN
I. INTRODUCCION:
Los equivalentes de reduccin, tomos de hidrgeno o electrones, provenientes de la deshidrogenacin de los
sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxgeno por un sistema multienzimtico
denominado cadena respiratoria. Este sistema est localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza
por la cohesin fsica con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. Este
mismo sistema multienzimtico es tambin conocido como cadena de transporte de electrones, denominacin que
pone nfasis en que las oxidaciones reducciones son fenmenos caracterizados por la prdida o ganancia de
electrones.
Existen diversas sustancias que actan como inhibidores de la cadena respiratoria. Los inhibidores ms comnmente
usados pueden reunirse en tres grupos principales segn el sitio de la cadena respiratoria donde actan.
Un primer grupo de inhibidores acta sobre la NADH-deshidrogenasa, bloqueando el transporte de electrones entre la
flavina y la ubiquinona. Los ms representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. Inhibidores de
localizacin son: el amital, los esteroides, los detergentes, algunos anestsicos voltiles como el halotano, etc. Por su
accin cercana en el primer sitio de la desfosforilacin se les suele denominar inhibidores del sitio I. Un segundo
grupo de sustancias actan bloqueando la transferencia de electrones entre los citocromos b y c. El ejemplo clsico
de este grupo es la antimicina, inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-xido, el BAL y barbiturato de sdio, se
les denomina inhibidores del sitio II. Un grupo de inhibidores acta sobre el Hemo a 3 de la citocromo oxidasa
impidiendo su interaccin con el oxgeno, comprenden el cianuro, el monxido de carbono, la azida, etc. A estos se les
denomina inhibidores del sitio III.
Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreduccin al paso o no de electrones, se utilizan
sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen; as por ejemplo el 2-6
diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado, que al
reducirse (recibir electrones) se decoloran. Como hay flujo de electrones en la cadena, sta cede sus electrones a los
indicadores entre la FMN y la CoQ.
Si al administrar un inhibidor de la cadena, ste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore),
quiere decir que dicho inhibidor estar actuando en alguna regin anterior a la FMN, inclusive de la cadena (regin
que incluye el sitio I), pero si el indicador se decolora, entonces podemos deducir que el sitio de inhibicin estar en
algun sitio posterior a la CoQ inclusive.
La p-fenilendiamina, es otro indicador que acta como sustrato; es decir que es capaz de ceder electrones. Cuando
se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrn oscuro). En la cadena REDOX, el citocromo C actuar como
primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. De esta manera se puede verificar si la cadena
comprendida entre el citocromo C y el oxgeno, es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador.
Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algn punto de esta porcin de la cadena, la pfenilendiamina no se oxidar (no cambia de color). Si el inhibidor no impide la oxidacin del indicador, entonces
podemos deducir que el inhibidor acta en algn sitio anterior al citocromo o de la cadena. Si se administra un
inhibidor que no impide la oxidacin de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reduccin del 2-6
diclorofenolindofenol, entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuar en algn sitio comprendido
entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena).
La presente prctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona, barbital sdico y azida de sodio,
actan en las regiones cercanas al sitio I, sitio II y sitio III, respectivamente, mediante el uso de indicadores conocidos
como 2 6 diclorofenolindofenol y p fenilendiamina.
27

-
Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4

2,6-diclorofenolindofenol 0.02 %
p-fenilendiamina 1%
Malato de sodio 0.1M
Rotenona 0.1M
Barbiturato de sodio 0.1M
Azida de sodio
Fraccin mitocondrial 10% (hgado de rata)

En el sistema Deshidrogenasa mlica + malato + cadena rdox mitocondrial, verificar el efecto de los inhibidores:
rotenona, barbital sdico y azida de sodio.
ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA:
TUBOS
2, 6-diclorofenol indofenol 0.02 %
Malato 0.1M
Rotenona 0.1M
Barbiturato de sodio
Azida de sodio
Homogenizado mitocondrial 10%
I
1.2
1.0
0.5
II
1.5
1.0
0.2
-
III
1.0
1.0
0.2
0.5
IV
0.5
1.0
0.2
0.5
0.5
Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.

Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).
V
0.5
1.0
0.2
0.5
0.5
VI
0.5
1.0
0.2
0.5
0.5
28
En el sistema pfenilendiamina + cadena rdox mitocondrial, verificar el efecto de los inhibidores rotenona, barbital
sdico y azida de sodio.
TUBOS
Buffer fosfato de sodio 0.1M pH 7.4
Azida de sodio
Barbiturato de sodio 0.1M
Rotenona 0.1M
Pfenilendiamina 1%
Homogenizado de mitocondrias 10%
I
2.0
0.5
-
II
1.5
0.5
0.5
III
1.0
0.5
0.5
0.5
IV
1.0
0.5
0.5
0.5
V
1.0
0.5
0.5
0.5
Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.

Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).
IV. CUESTIONARIO:
1. Qu inhibidores de la cadena de xido reduccin conoce y a qu nivel actan?
2. Si utiliza el indicador rdox 2,6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria, que
cambios observara con la rotenona, barbiturato de sodio y azida de sodio?
3. Si utiliza el indicador pfenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria, que cambios
observara con la rotenona, barbiturato de sodio y azida de sodio?
4. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la prctica.
5. Grafique usted en una cadena de xido reduccin biolgica, la accin de los inhibidores e
indicadores utilizados en el experimento.
29
PRACTICA N 09
DISTRIBUCIN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE XIDOREDUCCIN
I. INTRODUCCION:
Los carbohidratos, cidos grasos, aminocidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo
mediante sistemas enzimticos simples o complejos. Estos sistemas estn constituidos por protenas, fosfolpidos,
grupos prostticos y tomos metlicos.
De acuerdo a su estructura y funcin, las enzimas que intervienen en estos procesos se encuentran clasificadas en
diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimolgica.
Las enzimas de xido - reduccin tienen una distribucin caracterstica intracelularmente, hallndolas de modo
fundamental en una subestructura celular en donde la energa derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma
del intermediario macrorgico ATP.
La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribucin intracelular de las enzimas de xido - reduccin usando
los indicadores redox 2 - 6 diclorofenilindofenol y p - fenilendiamina y los componentes celulares de un
homogeneizado de hgado de rata obtenidos por centrifugacin diferencial mediante el mtodo de Schreider y col.
-
Buffer fosfato de sodio 0.1M pH: 7.4

2,6-diclorofenolindofenol 0.02 %
Succinato 0.1M
pfenilendiamina 1%
Homogenizado total de hgado de rata en sucrosa 0.25 M
Fraccin nuclear del homogenizado.
Fraccin mitocondrial del homogenizado.
Fraccin microsomal soluble del homogenizado.
KCl 0.154 M

Fraccionamiento Celular
-
Cada grupo recibir una rata albina (Rattus rattus var. albicans). El animal ser sacrificado,
inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hgado.
Se coloca el hgado en un petri se elimina la cpsula del hgado y otros tejidos perifricos.
Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hgado y se corta en fragmentos pequeos y se coloca en el
homogenizador potter y se le agrega solucin de KCl 0.154 M. Se hace presin manualmente con el
embolo girando hacia el fondo. Todo debe trabajarse entre 0 y 4C.
El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocndolo en tubos de
polietileno, previa calibracin en la balanza, se emplea una centrfuga refrigerada. El sobrenadante
30
es separado en un beaker de 500ml. El sedimento constituye la fraccin nuclear y se coloca en un

beaker de 100ml.
El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrfuga
refrigerada. Se separa el sobrenadante en un beaker, constituyendo la fraccin microsomal con el
citosol. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fraccin mitocondrial.

COMPONENTES
Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4
2 6 diclorofenolindofenol
Succinato de sodio 0.1M
Fraccin nuclear
Fraccin mitocondrial
Fraccin microsomal -soluble
Homogenizado total
I
1.0
1.0
0.2
-
II
0.5
1.0
0.2
0.5
-
III
0.5
1.0
0.2
0.5
-
IV
0.5
1.0
0.2
0.5
-
V
0.5
1.0
0.2
0.5
Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.

Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados.
Armar otro sistema, empleando:
COMPONENTES
Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4
P fenilendiamina 1%
(sustrato + indicador)
Fraccin nuclear
Fraccin mitocondrial
1
1.5
2
1.0
3
1.0
4
1.0
5
1.0
0.5
-
0.5
0.5
-
0.5
0.5
0.5
-
0.5
-
0.5
-
0.5
Fraccin microsomal soluble

Homogenizado total
31
Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.

Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados.
IV. CUESTIONARIO:
1. Qu es el 2,6-diclorofenolindofenol y cmo acta en la cadena respiratoria?
2. Qu es el p-fenilendiamina y cmo acta en la cadena respiratoria?
3. Grafique usted en una cadena de xido reduccin biolgica la accin de los indicadores rdox 2,6
diclorofenolindofenol y pfenilendiamina.
4. Qu es un homogenizado de hgado y cmo se obtienen las fracciones celulares por centrifugacin
diferencial?
5. En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de xido reduccin?
6. Haga un esquema de la centrifugacin diferencial
32
PRACTICA N 10
DETERMINACION DE AMILASA SERICA
I. INTRODUCCION:
La amilasa es una enzima que hidroliza el almidn. Si liberan alfa o beta maltosa, se les clasifica en alfa y beta
amilasa. La amilasa salival y pancretica humana esta dentro del grupo de las primeras.
La alfa amilasa acta rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosdicos en la parte central de la amilasa formando una
mixtura de pequeas dextrinas + maltosa. La amilasa es un poliglucsido de configuracin lineal de unidades de
glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosdicos.
La amilasa comprende a slo el 20% del almidn y es soluble en agua; el resto es una fraccin inosoluble llamada
amilopectina, difiere de la amilasa porque contiene adems enlaces alfa 1-6 glucosdicos frecuentemente ramificados.
Ambas, amilasa y amilopectina producen slo B-glucosa por hidrlisis.
En el suero humano, as como en la orina existe actividad amilsica. Tambin ha sido informado en leche y en el
semen humano. En la bilis no hay actividad. El origen de la amilasa srica humana incluye al pncreas y glndulas
salivales, las cuales explicaran probablemente menos del 25% de la actividad srica normal. Otras fuentes incluyen
el hgado, msculo estriado, trompa de Falopio y tejido adiposo.
Los valores normales de amilasa por el mtodo de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. La
amilasa puede ser detectada en nios desde 1 a 2 meses de edad y los valores son ms bajos que en el adulto
normal, pero al ao de edad la actividad es igual a la del adulto. Entre 2 12 horas despus de producida la
pancreatitis aguda, la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente,
con frecuencia 2-3 das despus. Muy raramente permanece elevada 4-6 das. Si dentro de 24 horas no se eleva, no
es probable el diagnstico de pancreatitis aguda.
La elevacin puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glndulas salivales (pancreatitis),
lcera duodenal o gstrica penetrante o perforada, despus de colangiografa, enfermedad sptica aguda del
coledoco, trombosis mesentrica, obstruccin intestinal, peritonitis, uremia despus de la administracin de codena,
morfina, diurticos tiazdicos, encefalitis viral, cirrosis, despus de ruptura esplnica, carcinoma broncongeno y en
neumona. Se ha reportado incremento despus de la ingestin de alcohol.
En algunas de estas condiciones, edema y pancreatitis estn presentes indudablemente. En otros, la explicacin no
es clara. Para la mayor parte, las elevaciones son (con excepcin de los niveles obtenidos despus de la
administracin de opiceos) menos de 500 unidades. Es posible encontrar valores ms altos.
En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crnica y en
carcinoma pancretico cuando el dao es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. En los casos
sealados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa srica despus de la administracin de secretina y
morfina. En normales, despus de la administracin secretina, la amilisa srica se altera. En obstruccin de los
conductos puede elevarse. Despus de la administracin de morfina en normales se incrementa la amilasa srica; en
pacientes con insuficiencias pancretica.
33
Para la determinacin de amilasa usamos el mtodo de Caraway, en el que la cantidad de almidn y tiempo de
incubacin son ajustados de manera que slo una porcin de almidn es hidrolizado cuando la reaccin es parada
por la adicin de yodo. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco
incubado por la adicin de suero despus de la incubacin, mide la cantidad de almidn hidrolizado y por ende la
actividad de amilasa de la muestra.
El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa srica en personas normales y/o con alteraciones
patolgicas especialmente del pancreas.
II. REACTIVOS A UTILIZAR:

Sustrato de almidn Bufferado, pH 7.0 :
Solucin Stock de iodo :
Solucin iodada de trabajo:

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento):
(Utilizar dos frascos volumtricos Erlenmeyer de 50 ml.)
II
PROBLEMA
BLANCO
Sustrato de almidn Bufferado
5.0 ml.
5.0 ml.
Incubar a 37C durante cinco minutos ambos frascos
Retirar los frascos y agregar suero
0.1 ml.
Mezclar e incubar a 37C durante 7.5 minutos exactamente
Retirar los frascos y agregar suero
0.1 ml.
Agua destilada
35 ml.
35 ml.
Solucin iodada de trabajo. Mezclar bien.
5.0 ml.
5.0 ml.
Leer en espectrofotmetro a 660 nm.

CLCULO
Absorbancia del
_
Absorbancia del
blanco
problema
_______________________________________
Absorbancia del blanco
800
= Unidades de amilada por 100 ml
34
(Se requiere un blanco por cada muestra de suero, debido a que las protenas sricas disminuyen la
cantidad de color producido por el complejo yodo almidn y este podra ser diferente).
IV. CUESTIONARIO:
1. De qu manera el in cloruro activa a la amilasa
2. Qu semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada, en funcin de
la actividad enzimtica?
3. Cmo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa heptica y pancretica sometidas a
electroforesis?
4. Por qu la concentracin de amilasa srica es menor durante los primeros meses de vida lactante?
35
II UNIDAD
METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS
PRACTICA N 11
DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS
CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL.
I. INTRODUCCION:
La glucosa sangunea es una de las fuentes de energa ms importantes en el organismo y en algunos tejidos
altamente especializados. En el cerebro y los glbulos rojos es la nica fuente de energa. Por todo esto, el
organismo dispone de una compleja maquinaria metablica que permite asegurar la constancia de la concentracin
de glucosa en la sangre y, con ella, la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos.
La glucosa en sangre, proviene de dos orgenes: de origen exgeno de los alimentos, y de origen endgeno, que
proviene del hgado por glucogenlisis. Por otra parte, hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos
perifricos (para su consumo) y por excrecin renal por la orina, por lo tanto la concentracin de glucosa en sangre
depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo.
Diversos factores que inciden sobre la absorcin, produccin endgena de glucosa as como la utilizacin y
excrecin de la misma, contribuyen a mantener constante la concentracin de glucosa en sangre. En el caso del
hgado, el transporte de glucosa al interior de las clulas es por difusin pasiva, siendo el hepatocito permeable
para este metabolito. En casi todos los dems tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las clulas por
simple difusin, sino que lo hace por un mecanismo de difusin controlada, en particular en el tejido adiposo, el
corazn y el msculo esqueltico.
El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a travs de las clulas de la mucosa intestinal no
es muy conocido. Se cree que est ntimamente ligado al transporte de sodio. Este proceso, por ello, se llama
cotransporte, y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentracin de sodio en fludo extracelular.
En este caso la glucosa entra en la clula, posiblemente porque se une a la misma protena transportadora que lleva
el sodio. A su vez, el sodio, por la bomba de sodio y potasio, volvera a salir de la clula. Este mecanismo requiere
ATP como fuente de energa. La entrada de la glucosa en estas clulas est supeditada a que, al salir del Na+
mantenga alta concentracin en el lquido extracelular. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte
a travs de la membrana favorecera a otro.
Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al mtodo utilizado. Segn el mtodo de Folin
Wu. Vara entre los 80 120 mg%; con el mtodo de la glucosa oxidasa la concentracin vara entre 70 110 mg/dl.
El conocimiento de la glicemia es importante no slo porque permite tener una idea integral del mecanismo de
homeostasis metablica existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados
patolgicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento.
36
La finalidad de la siguiente prctica es demostrar la digestin y absorcin de la glucosa, cuantificando la glicemia pre
y postprandial, por el mtodo de Glucosa oxidasa; tanto en personas normales como en casos patolgicos.
- Estndar: Solucin de glucosa 1 g/l
- GOD/POD: Solucin de glucosa oxidasa (1,000 U/ml) y Perxidasa (120 U/ml).
- Reactivo 4- AF: Solucin de 4 aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92 mol/l.
- Reactivo Fenol: Solucin de Fenol 55 mmol/l.
- Preparacin del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada, 50 partes de Reactivo 4- AF, 50 partes de
Reactivo Fenol y llevar a 1,000 partes con agua destilada. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente
homogenizadas. Mezclar por inversin sin agitar. Rotular y fechar.
III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES :
Se tomarn dos muestras de sangre :
La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra.
La segunda: Esta muestra se tomar despus de una hora, como mximo, despus de la ingesta alimenticia.
En esos momentos, se extraern 5 ml. de sangre de la flexura del codo, con jeringa hipodrmica de 10 ml. y
con aguja N 20.
Colocar las muestras en tubos de ensayo, se deja reposar 10 minutos, luego se centrifuga a 3000 RPM por
10 minutos. Separar el suero.
La determinacin de la glicemia se realizar por el mtodo Enzimtico de la glucosa oxidasa. Utilizar 4 tubos
de ensayo:
B (Blanco), S (Standard), Dpre. (Desconocido preprandial) y Dpost. (Desconocido post prandial),
colocar:
COMPONENTES
Standard
Muestra (suero preprandial)
Muestra (suero postprandial)
Reactivo de trabajo
B
------------2 ml
S
20 ul
--------2 ml
Dpre.
----20 ul
----2 ml
Dpost.
--------20 ul
2 ml
Incubar todos los tubos 10 minutos en bao de agua a 37 C

Leer en Espectrofotmetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco.
Clculo de los resultados :
Glucosa (g/l) = D x f
donde
1.00 g/l
f = -----------
S
y D = Dpre. y Dpost.
Antes de multiplicar D x f, Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f.
IV. CUESTIONARIO:
1. Actualmente, cul es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los
valores, que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa.
2. Cmo esperara encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial?
Fundamente las variaciones que se pueden encontrar.
3. Conoce otros mtodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento
37
4. Cul son los criterios bioqumicos, relacionados con la glicemia, para el diagnstico de diabetes mellitus?
5. Qu variaciones fisiolgicas de glicemia puede usted sealar?
PRACTICA N 12
INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIN Y ALMACENAMIENTO DEL
GLUCGENO HEPTICO
I. INTRODUCCION:
El glucgeno est presente en el citosol en forma de grnulos los que contienen las enzimas glucgeno
fosforilasa, glucgeno sintetasa y algunas otras que regulan la sntesis y degradacin. La mayora de los
residuos de glucosa en el glucgeno estn ligados por enlaces glucosdicos alfa 1,4 y las ramificaciones se
forman por enlaces glucosidicos alfa 1,6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10
residuos. El glucgeno puede ser aislado de los tejidos por digestin con soluciones de hidrxido de potasio
caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1,4 y alfa 1,6 son estables. El glucgeno es tambin
fcilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente. La accin de la
beta amilasa tambin rinde una dextrina lmite.
El glucgeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fcil disponibilidad. Se encuentra glucgeno o se
puede sintetizar en cualquier clula del organismo, pero las concentraciones varan en los diferentes tejidos
correspondiendo las concentraciones ms altas del hgado y al msculo esqueltico, lugares principales de
almacenamiento. En el hgado el glucgeno se incrementa despus de la ingesta de alimentos (perodo post
prandial) llegando a los lmites mximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos. En cambio el
glucgeno post prandial es debido a que la glucognesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre
alcanzan valores de 150 mg/100 ml ms.
La finalidad de la siguiente prctica es cuantificar el glucgeno en ayunas y despus de la uingesta de alimentos
y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus sntesis y degradacin
KOH al 60 %
Na2S04 solucin saturada.
Alcohol absoluto.
Fenol al 80 %
H2S04 concentrado.
Homogenizado de hgado de rata al 10 % (pesar 10 g. de hgado y homogenizar con agua destilada.)
III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.
EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento)
COMPONENTES (ml)
I
Homogenizado de hgado en ayunas
0,5
Homogenizado de hgado post prandial
--KOH al 60 %
0,5
Calentar los tubos en bao mara a 100 C por 10 min.
Alcohol al 98 %
5,0
Na2 Na2SO4 solucin saturada.
0,1
Mezclar.
II
--0,5
0,5
5,0
0,1
38
Reposo por una hora.

Centrifugar a 3500 RPM por 10 min.
Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos.
Agregar agua destilada
5,0
5,0
Disolver el precipitado por agitacin.
CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO

COMPONENTES (ml))
I
II
BLANCO
Muestra del tubo I del
Sistema anterior
1,0
--Muestra del tubo II, del
Sistema anterior
-1,0
-Agua destilada
1,0
1,0
2,0
Fenol al 80 %
0,1
0,1
0,1
Mezclar.
Colocar los tubos en agua helada durante 5 min. y sin retirar los tubos del bao helado:
Agregar H2S04 cc. gota a gotaen el centro
de c/tubo
5,0
5,0
5,0
Mezclar y dejar en el bao de agua helada durante 5 minutos ms.
Leer en el fotocolormetro con filtro verde, 540 n m.
CALCULOS:
Factor Espectrofotmetro = 7
g % de glucgeno = (Lec.I Lect. Blanco) x Factor

IV. CUESTIONARIO:
1. Cmo espera encontrar las concentraciones de glucgeno en la muestra de hgado de rata en
condiciones de ayuno? D usted las razones metablicas que expliquen su resultado.
2.
Cmo espera encontrar las concentraciones de glucgeno en la muestra de hgado de rata en

condiciones post prandial?
3.
Qu relaciones metablicas puede usted establecer entre los valores de glucgeno obtenidos en ambas
muestras de hgado de rata, motivo del experimento?
4. Porqu mecanismo metablico el glucgeno incrementa cuando la concentracin de glucosa en
sangre es mayor de 150 mg/dl?
5. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucgeno durante el
ayuno prolongado.
39
40
PRACTICA N 13
REGULACIN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUNEA
ACCION DE LA HORMONA INSULINA
I. INTRODUCCION:
La glucosa sangunea proviene de: glucgeno heptico, aminocidos, otros carbohidratos y de glucosa absorbida
por el intestino.
En condiciones normales, en ayunas, la glicemia es muy constante. Siendo en la sangre arterial mayor que en la
venosa. La glicemia se eleva despus de la ingestin de un alimento rico en hidratos de carbono para luego
descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas despus de la ingestin vuelve al nivel de
ayunas. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos, pues es utilizada por todas las clulas para producir
energa y por algunas clulas para funciones ms especializadas por ejemplo glucognesis, lipognesis y otras
semejantes.
Los mecanismos reguladores de la concentracin de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los
primeros actan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glndulas de secrecin
interna, de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la produccin
y la utilizacin de la glucosa sangunea; cuya sensibilidad est regida en medida importante por el balance entre la
insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipfisis por el otro.
La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. Esta hormona es producida por las
clulas beta de los islotes de Langerhans del pncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de
glucosa en la sangre. El efecto ms importante de una deficiencia insulnica es el de un nivel sanguneo de glucosa
elevado (hiperglicemia), una excesiva excrecin de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de
glucgeno en el hgado. La administracin de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud
depende de la dosis administrada; el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formacin de
glucgeno en el hgado y en el msculo, a la vez que acelera la oxidacin de glucosa en diferentes tejidos. La
insulina tambin favorece la conversin de los hidratos de carbono en cidos grasos y por otro lado inhibe la
gluconeognesis a partir de los aminocidos. Se explica as que la falta de insulina determina una hiperglicemia que
es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes.
La secrecin de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia, de manera que
cada vez se eleva la glicemia, se produce ms insulina que tiende a aminorarla.
La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variacin de glicemia como
consecuencia de administracin de insulina.
41

Conejos adultos de ms de 2 kg. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas.
Solucin de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml.
Jeringas hipodrmicas de 1 cc.
Glucmetro.
Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de
insulina a inyectar.
Dosis de la solucin de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal.
Utilizar una jeringa hipodrmica de 1 ml, que facilita la medida de la dosis.
EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA.
Extraer una primera muestra de sangre del pabelln auricular del conejo. La que servir para establecer los
valores basales de glicemia.
Inyectar por va intraperitoneal la cantidad calculada de insulina.
Luego extraer muestras de sangre a los 15, 30 y 60 minutos despus de inyectada la insulina, lo que
hace un total de tres muestras en una hora.
Anotar los resultados en relacin al tiempo.
Hacer una grfica de glicemia vs tiempo
IV. CUESTIONARIO:
1.
Explique la naturaleza qumica y las acciones biolgicas de la insulina.
2.
Explique brevemente la regulacin de la glicemia, como resultado, en trminos generales, de la tasa

de llegada e ndice de salida de la glucosa de la sangre.
3.
Explique el mecanismo de accin de la insulina en la homeostasis de la glucosa.
4.
Cules son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de accin?
5.
Explique cmo y porqu se producen los signos y sntomas del cuadro clnico de hipoglicemia.
42
ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA

I. INTRODUCCION:
La adrenalina, hormona secretada por la mdula suprarrenal, tiene accin hiperglicemiante; ello se debe a que
favorece la conversin del glucgeno en glucosa (glucogenlisis) en el hgado, adems de actuar en el
msculo, por la ausencia en este de la glucosa 6- fosfatasa, la glucogenlisis se realiza con la formacin de
lactato el que va ha contribuir directamente a la formacin de glucosa y glucgeno en la clula heptica por los
mecanismos gluconeogenticos. El efecto glucogenoltico de la adrenalina es debido a que activa a la
fosforilasa.
La secrecin de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia, si aparece
hipoglicemia se segrega ms adrenalina y glucagn que aceleran la regulacin que espontneamente debe
realizar el hgado.
La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variacin de glicemia como
consecuencia de la administracin de adrenalina.
Conejos adultos de ms de 2 kg de peso corporal, sometidos a ayuno de 8 a 12 horas.
Solucin de adrenalina 0,1 mg por ml.
Jeringas hipodrmicas de 1 cc.
Glucmetro.
III. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento
Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de
adrenalina a inyectar.
Dosis de la solucin de adrenalina (0,1 mg/ml) inyectar 0,025 mg por cada kilogramo de peso corporal que
corresponde a 0,25 ml de la solucin a utilizar por kg de peso. Utilizar una jeringa hipodrmica de tuberculina
que facilita la medida de la dosis.
EXTRACCION DE
ADRENALINA.
1.
3.
LAS
MUESTRAS
DE
SANGRE
ADMINISTRACION
DE
Extraer una primera muestra de sangre, del pabelln auricular del conejo. Servir para establecer los valores
basales de glicemia.
2.
Inyectar por va intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina segn el peso del
animal.
Luego extraer muestras de sangre a los 15, 30 y 60 minutos despus de inyectada la adrenalina, lo que
hace un total de tres muestras en una hora.
4.
Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa segn el mtodo
de Glucocinta
5.
Con los resultados as obtenidos, construir una grfica, tomando las variaciones en
relacin al tiempo.
Anotar los resultados en relacin al tiempo.
43
IV. CUESTIONARIO:
1.
Explique la naturaleza qumica y las acciones fisiolgicas de la adrenalina.
2.
Cul es el mecanismo de accin hormonal de la adrenalina a nivel de sus rganos blanco?
3.
Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia; con especial referencia al
metabolismo de los carbohidratos.
4.
Cul es el efecto metablico de la adrenalina sobre el hgado y sobre el tejido muscular y que efecto
produce sobre la glicemia?
5.
Qu efectos tiene la adrenalina, sin tomar en cuenta su accin en el metabolismo hidrocarbonado?
PRACTICA N 14
DETERMINACIN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN
ORINAY SU DIFERENCIACIN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES
I. INTRODUCCION:
En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azcares en orina. Sin embargo, es posible
encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0,5 y 1,5 g/l. Los azcares
forman ms o menos la dcima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad est constituda
por glucosa.
La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales, y por
tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina, pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede
producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del rin
para reabsorverla (dintel renal).
Cuando la capacidad de reabsorcin renal disminuye, la orina en glucosa aparece aunque sta se encuentre en
concentraciones normales en la sangre (diabetes inspida). Por el contrario, cuando existe insuficiencia renal (menor
filtracin) no aparece glucosa en la orina aunque la concentracin de glucosa se encuentra elevada por encima de
180 mg %.
c)
En la orina, adems de glucosa, puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos
sealar:
a)
Otros azcares reductores: lactosa, fructuosa, galactosa y pentosas.
b)
Otros compuestos orgnicos: cido homogentsico, creatinina, cido rico, cido glucornico, cido ascrbico.
Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral, formaldehdo, etc.
Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para
determinar glucosa en orina, pero como anotamos ste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por
tanto es de carcter inespecfico.
44
La glucosa puede ser determinada de manera especfica utilizando como reactivo bsico la glucosa oxidasa
(mtodo enzimtico), de uso generalizado en clnica. La prueba est basada en que la glucosa urinaria en presencia
de oxgeno, por accin de la glucosa oxidasa produce cido glucornico ms perxido de hidrgeno. Este, en
presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) ms agua.
La glucosa oxidasa, en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de ste 2 iones hidrgeno (2H+)
formando gluconolactona), el cual es hidratado a cido glucnico. Los iones hidrgeno removidos se combinan con
el oxgeno atmosfrico y forman perxido de hidrgeno (H2O2). El perxido de hidrgeno en presencia de peroxidasa
oxida a la 0-tolidina y toma color azul.
La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias
reductoras, utilizando un mtodo especfico a base de glucosa oxidasa y otro inespecfico en base al reactivo de
Benedict.

Reactivo de Benedict.
Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly).

Determinacin de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict.
1.
2.
3.
Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml.

Llevar al bao de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que
hierva por 1 min.
Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del lquido contenido en el tubo.
Agitar para evitar que el lquido se proyecte hacia fuera del tubo.
Agregar orina problema: 5 gotas.
Colocar en bao de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullicin por 1
min.
Observar si hay cambio de color y precipitado. Si aparece un precipitado de
color rojo ladrillo, la reaccin demuestra la presencia de sustancias reductoras.
4.
Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, realizamos la siguiente
determinacin con la misma muestra de orina.
Determinacin enzimtica de la glucosa en orina (Mtodo de la glucosa oxidasa). Procedimiento:
1.
2.
Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recin emitida

contenida en un depsito de 5- 10 ml.
Observar si a los 60 segundos, despus de humedecida la cinta, adquiere o no color azul.
45
3.
Compare la intensidad de la coloracin azulada con una escala adjunta que representa
aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa.
IV. CUESTIONARIO:
1.
Fundamente la utilizacin del reactivo de Benedict para la deteccin de sustancias con capacidad
reductora, incluida la glucosa
2.
Que resultados podran obtenerse al tratar una muestra problema de orina, primero con el reactivo de
Benedict y luego por el mtodo de la glucosa oxidasa
3.
Que presunciones planteara si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da
resultado positivo y sin embargo, al ser tratada con el mtodo de la glucosa oxidasa, da negativo
4.
Ante una prueba positiva de glucosa en orina: Qu presunciones diagnsticas, en relacin a la glicemia
del paciente podra plantear?
5.
Explique el fundamento del mtodo de a glucosa oxidasa para la deteccin de glucosuria.
6.
Explique que es el umbral renal de la glucosa.
46
PRACTICA N 15
IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA
I. INTRODUCCION:
Determinar desrdenes genticos puede involucrar los sistemas enzimticos esenciales del metabolismo de los
mucopolisacridos.
Los mucopolisacridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo,
cartlago, cordn umbilical, aorta, vlvulas del corazn y son responsables de las caractersticas fsicas de estas
estructuras.
De acuerdo a su composicin qumica los mucopolisacridos estn agrupados en dermatn sulfato, heparn sulfato y
queratn sulfato, los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS).
Estas son subdividas en varios grupos tales como : Sndrome de Morquiolo, Sndrome de Hurler, Sndrome de Hunter,
Sndrome de Sanfilippo, llamados tambin MPS I, II, III y IV.
Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacridos, cerca de 100 mg/da, cantidad que es
bastante elevada si se compara con los 15 mg/da que excretan las personas normales.
La presencia de mucopolisacridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificacin de
Mucopolisacridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A, en contacto con
mucopolisacpridos forma un complejo de color prpura metacromtico, resultado obtenido cuando la excrecin est
sobre el lmite superior normal de 15 mg/da.
La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excrecin de mucopolisacridos.
- Papel Whatman I impregnado con Azure-A
Solucin de Lavado :
Metanol
Acido actico glacial
Agua destilada.
20 ml.
0,1 ml.
300 ml

-
Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeracin (no usar preservantes).

La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente.
Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. Dejar 3 min.
Transferir a una caja Petri llena de solucin de lavado.
Dejar por 20 min.
Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80 C o con aire caliente.
RESULTADOS
Positivo: aparicin de un color prpura.
Negativo: aparicin solamente de un color azul plido.
Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna
cromatogrfica utilizando la reaccin de precipitacin con cloruro de cetil piridium.
IV. CUESTIONARIO:
47
1.
Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacridos en orina ha sido positivo Porqu debe ser
confirmado y cuantificado por cromatografa o precipitacin?
2.
Cul es la constitucin qumica bsica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacridos)?
3.
Cul es la constitucin qumica bsica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de stos.
4.
Cul es la importancia biolgica del cido hialurnico, condroitina y heparina?
III UNIDAD
METABOLISMO DE LIPIDOS
PRACTICA N 16
DEMOSTRACIN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO.
ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS
GRASAS. ACCIN DE LA LIPASA PANCRETICA SOBRE LOS
TRIGLICRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES
I.
INTRODUCCION:
Los triglicridos son los principales lpidos de la dieta. En el estmago ocurre la accin de la lipasa gstrica y la
licuefaccin de la masa de lpidos de los alimentos por contracciones peristlticas. La principal digestin ocurre en
el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lpido y su velocidad depende del rea de superficie de la interfase, la
cual es grandemente incrementada por el movimiento peristltico del intestino combinado con la accin
emulsificante de los cidos biliares.
Los cidos biliares son molculas anfipticas sintetizados por el hgado a partir del colesterol y secretados como
conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancretica (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrlisis de los triglicridos
en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con cidos grasos. La
actividad enzimtica de la lipasa pancretica incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-lquido,
un fenmeno conocido como activacin interfacial. La unin a la interfase agua-lquido requiera la colipasa, una
protena de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancretica (449 residuos), con cambios
conformacionales que forma una superficie hidrofbica y deja libre el centro activo. La alteracin en la digestin o
absorcin de las grasas produce esteatorrea
La finalidad de la prctica es demostrar la accin emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando
su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la accin de la lipasa pancretica sobre los triglicridos y el efecto
de las sales biliares.
II.
-
Cloroformo
Aceite vegetal, de olivo
48
Solucin de sales biliares

Buffer fosfato 0.1M pH 8,0
Emulsificacin de aceite vegetal
Solucin de fenolftaleina (Solucin alcohlica)
Hidrxido de sodio (NaOH) 0.1N
III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento
Accin emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm.
COMPONENTES
Aceite de olivo(gotas)
Agua destilada (ml)
Cloroformo (ml)
Sales Biliares (ml)
Tubo 1
3
5
-
Tubo 2
3
3
2
Tubo 3
3
2
-
Agitar enrgicamente los tubos

Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos
Accin de la lipasa pancretica sobre los triglicridos y efecto de las sales biliares sobre la reaccin
enzimtica utilizando tubos de 20 25 x 150 mm.
COMPONENTES (ml) TUBOS
Emulsificacin de aceite vegetal
Solucin de sales biliares 1 %
Solucin de extracto pancretico 1 %
Agua destilada
I
2
2
2
3
II
3
2
2
2
III
3
2
2
2
IV
3
2
2
2
-
Mezclar los 4 tubos y llevar al bao mara a 37 C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando.
Al finalizar el tiempo de incubacin retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftalena. Mezclar bien
y luego realizar la titulacin.
TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada
tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparicin de un color rosado tenue persistente.
Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados.
Anotar los resultados para su interpretacin.
IV. CUESTIONARIO:
1.
Explique lo que son sustancias anfipticas.
2.
Diferenciar emulsin de solucin, accin de las sales biliares vs cloroformo.
3.
Cuntas clases de lipasa pancretica actun en el intestino?

4. Cul de los mtodos para medir la actividad enzimtica se ha empleado en esta prctica. Explique el
papel de la fenolftalena en la titulacin.
5.
Diferencie la absorcin de los cidos grasos segn su tamao.
49
50
PRACTICA N 17
DETERMINACIN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN
SUERO HUMANO
I.
INTRODUCCION:
Los lpidos de la dieta son principalmente triglicridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolpidos por los
quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoprotenas ms grandes, menos densas,
ricas en triglicridos, con la apoprotena apo B48.
Por el conducto torxico llegan a la circulacin general. El pico mximo de lipemia postprandial se observa entre
las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lpidos, especialmente de
los triglicridos. Los niveles de lpidos postprandiales, especialmente de los triglicridos dependen de la cantidad
de lpido de la dieta, de la digestin y absorcin, de los niveles basales sanguneos, de la accin de la lipasa
lipoproteica en los tejidos extrahepticos. La lipasa lipoproteica acta sobre los triglicridos de los quilomicrones,
liberando cidos grasos que son captados por los tejidos extrahepticos. Los quilomicrones son convertidos en
remanentes de quilomicrones y captados por el hgado. Se ha considerado al incremento de la lipemia
postprandial como un factor riesgo de aterognesis.
La finalidad de la prctica es demostra las variaciones de la concentracin de trigliceridos en suero despus de la
ingesta de alimentos de alto contenido de grasas
II.
Reactivo enzimtico para determinacin de Triglicridos
III.
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento
Un alumno por cada mesa vendr en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraer una muestra
basal. Ingerirn una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A
las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendr una segunda muestra. Se obtendr el suero y se har la
determinacin de triglicridos.
Armar el siguiente sistema.
COMPONENTE
BLANCO
STANDAR DESCONOCIDO
S
D
Muestra
--------10 ul
Standard
----10 ul
----Reactivo
1000 ul
1000 ul
1000 ul
Mezclar e incubar 10 minutos de 20 25 C por 5 minutos a 37 C.
Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de
reactivo antes de 60 minutos (A).
Clculos:
C 200
ADesconocido
mg / dl
AStandar
Valores Referenciales
Sospechoso:
sobre 150 mg/dl
Elevado:
sobre 200 mg/dl
C 2.28
1.71 mmol/l
2.28 mmol/l
ADesconocido
mmol / l
AStandar
51
IV. CUESTIONARIO:
1.
Cul es el efecto de la edad, el ejercicio y el gnero sobre la lipemia postprandial.
2.
Alteracin de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabticos.
3.
Destino de los productos de accin de la lipasa lipoproteica sobre los triglicridos.

4. Explique porqu el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo
coronario.
5.
Grafique los cambios de triglicridos postprandiales en funcin del tiempo.
52
PRACTICA N 18
IDENTIFICACIN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA.
DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN
ORINA
I.
INTRODUCCION:
La beta oxidacin de los cidos grasos en el hgado, a nivel mitocondrial, produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de
Krebs y en parte se utiliza en la sntesis de cuerpos cetnicos (cetognesis). Estos son el cido acetoactico, el
cido beta hidroxibutrico y la acetona. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energa en los tejidos
extrahepticos como el corazn y el msculo esqueltico, incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. Los
cuerpos cetnicos son eliminados por la orina y la acetona tambin por la respiracin.
Su concentracin normal en orina es de 125 mg/ 24 horas, y en sangre hasta 1mg/dl. Aumentan en sangre
(cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiolgicas como el ayuno prolongado, en la dieta pobre en
carbohidratos. En condiciones patolgicas como la Diabetes mellitus, el hiperinsulinismo, en la enfermedad de Von
Gierke y otras glucogenosis, en los vmitos, en el sndrome de Fanconi, en toda hipercatabolia como la fiebre,
hipertiroidismo. En la Diabetes mellitus, el aumento de la liplisis, de la beta oxidacin y de la cetognesis, al
superar la capacidad de oxidacin de los tejidos extrahepticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetnicos.
Dado que stos son cidos se produce acidosis metablica, la denominada cetoacidosis diabtica. El diagnstico y
monitoreo de su tratamiento se hace con su determinacin en sangre o/i orina.
II.
- Sulfato de amonio, cristales.
- Nitroprusiato de sodio, solucin al 10% en H2O
- Cloruro Frrico, solucin al 5% en H2O.
III.

-
INVESTIGACION DE ACETONA
Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patolgica.
Prueba de Legal
El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetnicos, especialmente de acetona, rinde un color
azul violeta. Procedimiento:
COMPONENTES
TUBO
Orina
3 ml
Cristales de sulfato de amonio
0.5 g
Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio.
Nitroprusiato de sodio 10%
3 gotas
Amonaco (agregar lentamente por las paredes del tubo,
sin mezclar)
1ml
_________________________________________________________________________
Anotar sus resultados.
Prueba de Rothera
Trabajar del tubo identificado como orina patolgica
Utilizar nitroprusiato en polvo, de la siguiente manera:
En una lmina de porcelana con excavaciones colocar 0.2 g de reactivo slido de nitroprusiato de
sodio en cada una de stas.
53
Diluir la orina al 1/10, 1/20, 1/30, etc; de la siguiente manera:

AGUA
0.9 cc
1.9 cc
2.9 cc
3.9 cc
4.9 cc
+
+
+
+
+
ORINA
0.1 cc
0.1 cc
0.1 cc
0.1 cc
0.1 cc
DILUCION
1/10
1/20
1/30
1/40
1/50
Agregar una gota de cada una de las diluciones, en cada una de las excavaciones que contiene el
reactivo.
Observar la mxima dilucin de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el
denominador de la dilucin alcanzada por 10 y se tendr la cantidad aproximada de acetona en
mg por 100ml.
Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reaccin positiva solo cuando en la orina sin diluir
alcanza la concentracin mnima de 10 mg% de acetona y por eso, para calcular la concentracin en orina
diluida, se debe multiplicar por 10 el nmero de veces que se ha diluido sta.
Este mtodo con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguneo, para investigar acetona y tener
una cifra aproximada en su cuanta.
Uso de tira reactiva. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. Esperar 20 segundos, leer en escala
colorimtrico, estimando la concentracin como negativo 5, 15, 50, 150 mg/dl.
-
INVESTIGACIN DE ACIDO ACETOACETICO

Armar dos sistemas que contengan orina normal y patolgica.
Prueba de Cloruro Frrico o de Gerhart. Se basa en que en presencia de cloruro frrico, el cido
acetoactico rinde una coloracin rojo burdeos.
Procedimiento (Se utiliza orina filtrada):
COMPONENTES
Orina filtrada
Cloruro Frrico, solucin 5% en agua
IV.
TUBO
5 ml
gota a gota hasta la aparicin del
Color rojo burdeos si existe cido
Acetoactico
CUESTIONARIO:
1. Realice una comparacin entre la sntesis de cuerpos cetnicos con la etapa inicial de la sntesis de
colesterol
Defina: cetonemia, cetonuria, cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos.
Compare los mtodos para determinar los cuerpos cetnicos.
Cul es la importancia de la cuantificacin de los cuerpos cetnicos en el monitoreo de la cetoacidosis.
5. Cul es el mecanismo fisiopatolgico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por
alcoholismo agudo
54
PRACTICA N 19
DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO
I.
INTRODUCCION:
El colesterol es un componente importante de las biomembranas, regulando su fluidez. A partir de l se forman los
cidos biliares y las hormonas esteroideas. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada
aterognica, y el resto en la VLDL y HDL. Los triglicridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de
energa para los tejidos; su incremento tambin es considerado factor de riesgo coronario. La HDL realiza el
transporte reverso del colesterol, de los tejidos hacia el hgado y es considerada antiaterognica .El III Panel de
Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol, el HDL, y el LDL. En el colesterol se considera
3 niveles: Deseable < 200 mg/dl, limtrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). El
HDL colesterol, 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40, normal a 40 a 59, alto o protector mayor o igual a 60. El LDL
colesterol, 5 niveles: ptimo < 100 mg/dl. En los triglicridos se considera: normal menos de 150mg/dl, limtrofe de
150 a 199, Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499, severa 500 o ms
La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. Entre las hipercolesterolemias
primarias se sealan: La hipercolesterolemia familiar, la hipercolesterolemia polignica, la hiperlipidemia familiar
combinada, la disbetalipoproteinemia. Entre las secundarias: La diabetes, el lipoteroidismo, el sndrome nefrtico,
ictericia obstructiva, cirrosis biliar.. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares, o
secundarias a otras enfermedades. Son hipertrigliceridemias primarias, la hiperlipidemia familiar combinada la
hiperkilomicronemia, la hipertrigliceridemia familiar. Son causas secundarias: la diabetes, el hipotiroidismo, la gota,
el alcoholismo, el uso de anticonceptivos orales, etc. La hipertrigliceridemia se asocia a disminucin de HDL,
obesidad central, resistencia a la insulina, hiperglicemia e hipertensin, en el denominado sndrome metablico.
En la presente prctica, se realizar la determinacin de colesterol sanguneo, por el mtodo enzimtico y la
determinacin de HDL, previa precipitacin de las otras lipoprotenas.
II.
III.
Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl.
Reactivo precipitante de HDL: cido fosfotungstico, clorhidrato de magnesio.
Precipitante para macro ensayos (PRECa)
Precipitante para semimicro ensayos (PRECb)
DETERMINACIN DE COLESTEROL SANGUNEO
COMPONENTE
BLANCO PROBLEMA ESTNDAR
Suero
----10 ul
----Estndar 200 mg/dl
--------10 ul
Reactivo enzimtico
1000 ul
1000 ul
1000 ul
Mezclar, incubar 10 minutos de 2025 C por 5 minutos a 37 C.
Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de
reactivo antes de 60 minutos (A)
55
CALCULOS
C 200
Amuestra
Astandard
mg/dl
VALORES REFERENCIALES:
Sospechoso:
sobre 220 mg/dl
Elevado:
sobre 260 mg/dl
C 5.17
Amuestra
Astandard
mmol/l
5.7 mmol/l
6.7 mmol/l
DETERMINACIN DE HDL-COLESTEROL:
Componente
Macro
Semi-micro
Suero
500 ul
200 ul
PRECa
1000 ul
----PRECb
----500 ul
Mezclar bien, incubar por 10 minutos a temperatura
ambiente. Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM,
alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM
Despus de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentracin de colesterol:
Componente
Blanco Standard Desconocido
Agua Destilada
100 ul
--------Standard
----100 ul
----HDL sobrenadante
--------100 ul
Reactivo de trabajo
1000 ul
1000 ul
1000 ul
Mezclar, incubar por 5 minutos a 37 C o 10 minutos a 2025 C. Leer
las absorbancias del desconocido y del Standard, respectivamente,
comparando con el blanco; dentro de 60 minutos (A).
CALCULOS:
Concentracin HDL-Colesterol:
Macro mtodo :
C 150
A Desconocido
A Standard
mg/dl
Semi micro mtodo :

C 175
A Desconocido
A Standard
mg/dl
Concentracin de LDL-Colesterol:
LDL C TC HDL C
VALORES DE REFERENCIA:
HDL-Colesterol:
Normal
Bajo riesgo
Riesgo elevado
Hombres
> 55
35-55
< 35
Mujeres (mg/dl)
> 65
45-65
< 45
TG
5
mg/dl
56
LDL-Colesterol:
Sospechoso:
Elevado:
IV.
150 mg/dl
190 mg/dl
CUESTIONARIO:
1. Seale la importancia fisiolgica del colesterol.
2. Seale la importancia clnica del colesterol.
3. Realice una breve descripcin de hipercolesterolemia familiar y su relacin con la cardiopata isqumica.
4. Alteraciones del perfil lipdico en la diabetes y en el hipotiroidismo.
5. Seale las principales causas de HDL disminuido.
6. Realice una breve explicacin del rol de la LDL en la aterognesis.
7. Cul es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis.
8. Cuals son las causas primarias de hipertrigliceridemia.
57
PRACTICA N 20
HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL
I. INTRODUCCION:
El aumento de los lpidos sanguneos o hiperlipidemia constituye una situacin metablica de riesgo, especialmente
coronario. Se considera aterognicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos. Las hiperlipidemias pueden ser
primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar, la hiperlipidemia familiar combinada, la
hipertrigliceridemia familiar etc. Y secundarias a otras patologas como la diabetes, hipotiroidismo, sidrome nefrotico,
etc.
La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia, como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y
control de peso. La ATP III, ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminucin de la
ingesta de colesterol, disminucin de las grasas saturadas, aumento de las grasas monoinsaturadas y
polinsaturadas. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo
coronario.
En el presente experimento, se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de
pollo por 3 semanas; puede producir el incremento de los lpidos sanguneos. Se determinar el perfil lipdico antes
y despus del tratamiento y se compararan los resultados.

Ratas de peso aproximado de 200gr.
Sebo de pollo.
Dieta standard para ratas a base de maz.
Set de determinacin de colesterol enzimtico.
Set de determinacin de triglicridos enzimtico.
Reactivo precipitante para HDL.
III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento
Tratamiento experimental. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas. Las cuales se dividirn en dos
grupos en forma aleatoria.
o Diez de ellas constituirn el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maz) ad
libitum.
o Las diez restantes conformaran el grupo experimental, las que recibiran adicionalmente 2 cc de
aceite preparado de sebo de pollo. El tratamiento ser por 21 das, 1-2 representantes de cada
mesa se encargarn del control de la dieta, bajo la supervisin del personal de la seccin.
Extraccin de las muestras. Con la ayuda del personal de la seccin, cada mesa obtendr de cada rata
control y experimental una muestra sangunea de la cola antes del tratamiento y otra al final.
58
Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipdico siguiendo el mtodo enzimtico empleado
en la prctica anterior.
Se compararn los valores de colesterol, HDL, LDL y triglicridos entre ambas ratas.
IV. CUESTIONARIO:
1. Seale en detalle la dieta recomendada por la ATP III, para el tratamiento de la hiperlipidemia.
2. Qu alimentos son ricos en grasas saturadas.
3. Qu alimentos son ricos en colesterol.
4. Qu alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas.
5. Qu alimentos son ricos en grasas polinsaturadas.
6. Qu alimentos son fuentes de omega 3.
7. Qu alimentos son fuentes de fibra.
59
IV UNIDAD
PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL
METABOLISMO
PRACTICA N 21
DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS
DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA
I.
INTRODUCCION:
La digestin de las protenas, o degradacin hasta aminocidos en el tubo digestivo, es un proceso complicado que
se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen
gstrico: pepsina y renina; b) de origen pancretico: tripsina, quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa; c) de
origen intestinal: aminopeptidasas, dipeptidasas. Son endopeptidasas: pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasas.
Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. La tripsina, es activada por la enterocinasa en el intestino, y
es especfica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxlico de residuos de aminocidos bsicos: lisina y
arginina solamente. La quimotripsina es especfica para los enlaces peptidicos de los aminocidos sin carga como
los aromticos: tirosina, triptofano y fenilalanina. La elastasa tiene una especificidad amplia, ataca a los residuos
pequeos, como la glicina, alanina y serina. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptdico carboxiterminal en las
cadenas polipeptidicas.
La falta de enzimas proteolticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces, que
provienen de la carne de los alimentos), y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). En el
lactante con ausencia congnita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activacin de quimotripsingeno y
procarboxipeptidasa, existe hipoproteinemia, con retardo marcado del crecimiento.
La presente prctica tiene como finalidad demostrar la accin hidroltica de las enzimas digestivas contenidas en el
pncreas sobre la casena o protena de la leche, determinado los productos (aminocidos) con ninhidrina
II.
- Casena al 1% en buffer fosfato 0,1 M pH 8.
- Buffer fosfato 0,1 M pH 8.
- Solucin de extracto pancretico.
- Solucin acuosa de ninhidrina al 0,25% saturada con butanol.
- Acido tricloroactico al 10%.
III.

COMPONENTES (ml)
II
III
Casena al 1%
Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0
Solucin de extracto pancretico
Agua destilada
1
1
1
---
1
1
--1
--1
1
1
60
Pasos:
IV.
Mezclar y colocar al bao de agua a 37 C por 30 minutos.
Despus del tiempo de incubado tomar 0,5 ml, de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema
numerado (I, II, III).
En este nuevo sistema, agregar 1 ml de solucin de ninhidrina.
Mezclar y llevar a un bao de agua hirviendo (franca ebullicin), durante 3 a 5 minutos.
Observa los cambios de color de cada tubo.
Luego a los tubos de incubacin del primer sistema, agregue gota a gota 1 ml de cido tricloroactico al
10% agitando continuamente.
Observe las variaciones que se produce en cada tubo.
CUESTIONARIO:
1.
Elabore un esquema con la digestin y absorcin de protenas y aminocidos.
2.
Explique el sitio de produccin y la accin de las hormonas que intervienen en el proceso de digestin
y absorcin de los aminocidos.
3.
Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminacin y dos de desaminacin con los
nombres de aminocidos y alfa cetocidos que participan.
4.
Interprete todos los resultados encontrados en la prctica y explquelos usando algunos dibujos.
61
PRACTICA N 22
INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA
HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA
I.
INTRODUCCION:
La tripsina acta como una endopeptidasa e hidroliza prcticamente toda clase de protenas. Digiere las protenas
desnaturalizadas y parcialemente digeridas, con mayor rapidez que las originales desdoblndose en polipptidos de
peso variable y algunos aminocidos.
Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutricin. Por ejemplo el frijol de soja
contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestin de las protenas. Esta sustancia de naturaleza
peptdica es inactivada por el calor, ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta
considerablemente si se coce a ebullicin por varios minutos.
El ovomucoide de la clara de huevo inhibe tambin de manera enrgica la tripsina. Es interesante tambin que el
aceite de semilla de algodn posea un pigmento, el gisipol, con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el
apetito y dificulta la digestin de las protenas.Los extractos de pncreas poseen tambin un pptido inhibidor de la
tripsina, la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoprotena, secretada a la luz intestinal.
La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto
proteoltico de la tripsina, efecto que desaparece cuando la soya es hervida.
II.
III.
REACTIVOS A UTILIZAR.
- Buffer fosfato 0,1 M pH 8,0.
- Solucin de ninhidrina 0,25% saturada con butanol.
- Solucin de tripsina 20 mg%.
- Protena de soya cruda 30%.
- Protena de soya hervida 30%.
- Etanol absoluto

COMPONENTES (ml)
Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0
Protena de soja cruda 30%
Protena de soja hervida 30%
Solucin de tripsina 20 mg%
II
III
IV
2,5
0.5
0,2
2,5
0,5
-
2,5
0,5
0,2
2,5
0,5
-
Pasos:
a. Incubar en bao mara a 37C durante 1 hora.
b. Despus del tiempo de incubacin: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto.
c. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min.
d. En otra serie de tubos numerados I , II, III, IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos
del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0,25%.
62
e. Someter los tubos a temperatura de ebullicin del agua utilizando bao mara durante 5 minutos.
f.
IV.
Anotar los resultados.
CUESTIONARIO:
1.
Explique con sus propias palabras cul cree que es el

objetivo de la prctica que realiz.
2.
Por qu razn el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la

accin de la tripsina.
3.
Qu es el gisipol y cmo acta en su accin antioxidante?
4.
Con dibujos represente la prctica realizada.
63
PRACTICA N 23
CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y
FRACCIONADAS
I.
INTRODUCCION:
Las protenas plasmticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulacin,
excrecin, conservacin del equilibrio cido bsico, regulacin del equilibrio hdrico, defensa contra las infecciones,
transporte, regulacin del metabolismo, etc.
El origen de las protenas plasmticas es heptico con excepcin de las globulinas gamma que se forman en las clulas
plasmticas. Las protenas plasmticas por mtodos qumicos se clasifican en albmina, globulina y fibringeno. En el
suero solo albmina y globulina - Las fracciones globulnicas contienen varias protenas especficas: inmunoglobulinas,
haptoglobina, la transferrina, ceruloplasmina, etc; que se pueden determinar por electroforesis, inmunodifusin o
inmunoelectroforesis.
La concentracin srica de las protenas totales es de 6.1 a 7.9 g/dl de las cuales albmina: 3.5 a 4.8 g/dl y globulinas:
2.6 a 3.1 g/dl.
Las cifras de protenas plasmticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la
hemoconcentracin; con inversin de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma mltiple, en la
macroglobulinemia de Waldenstrm, en el kala-azar, en las colagenopatas, etc. La disminucin de protenas totales
(hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez estn acompaadas con
pequeos cambios en las globulinas. Los bajos niveles de albmina pueden ser debidos a: incrementadas prdidas de
albmina en la orina, disminucin de la formacin en el hgado como en la cirrosis, insuficiente ingestin de protena.,
en la gastroenteropata exudativa con prdidas fecales de protenas. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son
cuadros demasiado raros.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Determinacin de Protenas Totales:
Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico, en medio alcalino, para dar un complejo
color violeta con mximo de absorcin a 540nm, cuya intensidad es provisional a la concentracin de protenas
totales en la muestra.
Determinacin de Albmina:
La albmina reacciona especficamente sin separacin previa con la forma aninica de la bromo Cresolsulfon
Ftaleina (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH3,8.
El aumento de absorbancia a 625 nm, respecto del Blanco del reactivo, es proporcional a la cantidad de
albmina presente en la muestra.
La presente prctica tiene por finalidad determinar las concentraciones sricas de protenas totales y
fraccionadas en personas normales y/o con procesos patolgicos, por el mtodo colorimtrico.
II.
- Reactivo EDTA/Cu
- Reactivo BCF
64
III.

Determinacin de Protenas Totales
PROCEDIMIENTO:
En tres tubos marcados B (Blanco). S (Standard) y D (Desconocido), colocar:
Componentes
Muestra (ml)
Standard (ml)
Reactivo (ml)
Blanco
--------1.0
Standard
----0.01
1.0
Desconocido
0.01
----1.0
Mezclar e incubar 10 minutos a 37C, 20 minutos a temperatura ambiente. Leer las absorbancias a 540
nm, llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por lo
menos 30 minutos.
CALCULOS:
FACTOR
Concentracin Standard
Absorbancia Standard
Proteina Total (g/dl) Factor Absorbancia desconocido
VALORES DE REFERENCIA: 6.0 a 8.0 g/dl

Determinacin de Albmina.
PROCEDIMIENTO:
En tres tubos de fotocolormetro marcados B(Blanco). S (Standard) y

D (Desconocido), colocar:
B
S
D
Suero Patrn
10 ul
Muestra
10 ul.
Reactivo BCF
1ml.
1 ml.
1 ml.
Mezclar con varilla. Mantener los tubos entre 15 y 28 C durante 10 minutos. Leer en
espectrofotmetro a 625 nm o en fotocolormetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero
con el blanco de reactivo
CALCULOS DE LOS RESULTADOS:
Alb. (g/dl)
Albmina (g/dl) D f
f
S
Relacin A/G
Albmina (g/dl)
PT. (g/dl) - Alb. (g/dl)
VALORES DE REFERENCIA: Albmina = 3.5 4.8 g/dl

Relacin A/G = 1.2 2.2
65
IV.
CUESTIONARIO:
1.
Cules son las principales caractersticas de las protenas plasmticas.
2.
Qu importancia clnica tiene la determinacin de las protenas sricas totales y las fracciones albmina y
globulinas?
3.
Qu importancia tiene determinar la relacin albmina/ globulina, en clnica?
4.
En qu se basa la determinacin de las protenas totales y fraccionadas en nuestro experimento?
5.
Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatolgico de un edema.
66
PRACTICA N 24
DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN
ORINA
I.
INTRODUCCION:
La orina normal contiene una pequea cantidad de protenas solubles (albminas, algunas enzimas, etc.); la
cantidad es pequea alcanzando mximo de 150 mg en orina de 24 horas, menos de 10 mg/dl. Las protenas son
casi completamente absorbidas en los tbulos.
Cuando el glomrulo es daado por alguna enfermedad; molculas proteicas de variado tamao incluyendo las ms
largas, escapan en el filtrado de forma que los tbulos son incapaces de captar la gran cantidad de protenas y
resulta una masiva proteinuria. Las protenas de peso molecular relativamente bajo y de pequeo tamao pasan
primero a travs de los glomrulos injuriados, por ejemplo la protena de Bence Jones, hemoglobina, albmina;
luego las globulinas. El fibringeno es una molcula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa.
La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa,
glomerulonefritis focales proliferativas, sndrome nefrtico, nefropata diabtica, nefropata lpica, nefropata txica,
en la eclampsia, tuberculosis renal, rin poliqustico etc. Extrarrenal: proteinuria ortosttica, gravdica, febril,
mieloma mltiple. La proteinuria fisiolgica (proteinuria ortstatica) se presenta despus de ejercicios y de
permanecer largo tiempo en posicin de pie, sin que exista evidencia de lesin renal. En el mieloma mltiple y
macroglubinemia de Waldestrom, aparece la protena de Bence Jones. La protena de Bence Jones est constituda
por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la protena monoclonal.
La presente prctica tiene por finalidad determinar la presencia de protenas en la orina y de cuantificarlas en caso
que estn presentes en casos normales y en estados patolgicos.
II.
- Acido tricloroactico, 12,5% (en agua destilada)
- Cloruro de sodio 0,85%.
- Standard de protena: Pueden usarse suero claro normal de concentracin conocido o un suero control
adquirido comercialmente. Se diluye con cloruro de sodio 0,85% a una concentracin final de 25 mg/ml. Esta
dilucin debe ser preparada el mismo da.
- Acido actico al 2%.
III.

DETERMINACIN CUALITATIVA DE LAS PROTENAS EN ORINA:
Coagulacin por el calor.
COMPONENTE (ml)
TUBO
Muestra de Orina
5,0
Someter a ebullicin por 1 minuto. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la
presencia de protenas o fosfatos. Aadir:
Solucin de cido actico al 2%
IV gotas
Si desaparece la turbidez, se trata de fosfatos que se han disuelto en medio cido. Si la turbidez
persiste, se ha hace ms intensa o se forma un precipitado, se trata de protenas.
67
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS EN LA ORINA:

Mtodo turbidimtrico de Heavy.
En tres tubos marcados previamente agregar:
COMPONENTES (ml)
Solucin standard de protena
Orina previamente filtrada
Agua destilada
Acido tricloroactico 12,5%
/TUBOS
I
4,0
4,0
1,0
II
1,0
III
4,0
1,0
Dejar reposar 5 a 10 min. y leer en fotocolormetro con filtro (420 um). Leer el standard (I) calibrando con
agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III).
NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan
interferir con la lectura.
CALCULO:
Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces:
Calcular de la siguiente manera:
Absorbancia problema Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml. orina
Absorbancia del standard
Volumen total en ml orina
------------------------------------ = protena total de orina de 24 H en mg.
mg/100 ml orina x 100
IV.
CUESTIONARIO:
1. Cmo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no corresponde a protenas en orina?
2.
Seale algunos tipos de protenas anormales que pueden ser

encontradas en la orina.
3.
En qu consiste el mtodo de Heavy para la determinacin

de protenas
4. Cul es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha protena por la
orina?
5.
Seale algunas causas de proteinuria fisiolgica y patolgica.
68
PRACTICA N 25
CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA
AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO
PIRUVICA (SGTP)
I. INTRODUCCION:
La transaminasa glutmica pirvica, llamada tambin alanina aminotransferasa cataliza la reaccin L-alanina + alfacetoglutarato - - - Piruvato + L - glutamato. Con la aspartato transaminasa, estas enzimas proveen un medio de
interconversin de protenas e intermediarios metablicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas
proteicas almacenadas en el hgado al ciclo del cido ctrico.
Las transaminasas estn normalmente presentes en la sangre, relativamente en bajas concentraciones pero en los
tejidos estn presentes en grandes cantidades, particularmente en el hgado y corazn. Cuando se produce
destruccin tisular de estos rganos como sucede por ejemplo, en la hepatitis o en el infarto de miocardio, estas
enzimas son liberadas dentro de la corriente sangunea y pueden elevar sus niveles.
En la presente prctica la glutmico pirvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solucin
bufferada conteniendo cido alfa cetoglutarato y L-alanina y el cido pirvico formado, producto resultante despus
de la incubacin, se mide colorimtricamente por reaccin con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino.
II. REACTIVOS A UTILIZAR.

- Reactivo para SGTP:
Buffer TRIS pH 7.5
a-cetoglutarato
L-alanina
LDH
NADH
Reactivo reconstituido (ml)
1.0
Volumen de muestra (ml)
0.1
Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotmetro. Incubar 60 segundos a
la temperatura de reaccin. Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm. Repetir
las lecturas a intervalos de 60 segundos, hasta por tres minutos.
CALCULOS:
Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768
Nota: de las absorbancias, sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor
determinado.
Hasta 29 U/l a 30 C
Hasta 45 U/l a 37 C
69
IV. CUESTIONARIO:
1. Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminacin.
2. Cul es la importancia metablica de la transaminasa glutmico pirvico?
3. Cules seran las razones para solicitar, TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas, en el
diagnstico diferencial clnico?
4. Cul es la ubicacin intercelular de las TGP y TGO?
5. Cul es la utilidad prctica de la utilizacin del dosaje de transaminasas.
6. Haga un esquema de una transaminacin, colocando los nombres de las molculas que participan.
70
CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO

AMINOTRANSFERASA (AST)
I.
INTRODUCCION:
En condiciones normales, las enzimas se sintetizan en las clulas y en la mayora de los casos ejercen su funcin
en su interior. Otras enzimas, una vez sintetizadas, salen de las clulas y funcionan fuera de ellas, como es el
caso de: Las enzimas del tubo digestivo; Las enzimas con actividad en el suero sanguneo (las que intervienen en
la coagulacin, por ejemplo) y las enzimas de escape, presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando
en ciertas enfermedades suben considerablemente.
En la clnica son importantes dos transaminasas; la glutmico pirvica (TGP) y la glutmico oxalactica (TGO) o
aspartato aminotransferasa (AST); stas, aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con
los procesos de escape de enzimas del miocardio o el hgado. En las lesiones hepticas aumentan ambas
transaminasas en el suero; cuando sobreviene la mejora clnica, descienden en forma paralela y, si aparece una
recada, las dos suben nuevamente. El tejido miocrdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima
acompaa a los procesos destructivos del corazn; sube al mximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo
normal a los 4 7 das. El ascenso es, en general, proporcional a la extensin del infarto; a veces proporciona
datos positivos en casos con datos electrocardiogrficos de difcil interpretacin, pero tiene el inconveniente de
elevarse en diversos cuadros, sobre todo en la cogestin heptica.
La finalidad del presente trabajo experimental, es la determinacin por mtodo colorimtrico de una de estas
transaminasas de importancia clnica como es la aspartato aminotransferasa.
II.
-
III.
Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7.4

Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina
Standard: Buffer piruvato pH 7.4
NaOH 0.4N
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento):

1) CURVA DE CALIBRACIN: Antes de usar los reactivos por primera vez, preparar una curva de calibracin
para AST.
Tubo
Agua Destilada (ml)
Sustrato AST (ml)
Standard
AST
1
0.1
0.50
0.0
0
2
0.1
0.45
0.05
22
3
0.1
0.40
0.10
55
4
0.1
0.35
0.15
96
5
0.1
0.30
0.20
150
6
0.1
0.25
0.25
212
71
Agregar 0.5 ml de reactivo de color.

Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente.
Agregar 5 ml de NaOH 0.4N (NaOH 0.4N diluido con agua destilada 1:10)
Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer.
Leer a 505 nm. El color es estable slo por 30 minutos.
Construir en papel semilogartmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de
AST
2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo):
- Colocar 0.5 ml de sustrato AST en cada tubo.
- Incubar a 37 C durante 5 minutos.
- Agregar 0.1 ml de suero. Inmediatamente empezar el control de tiempo.
- Incubar a 37 C durante 60 minutos, exactamente.
- Al cumplirse los 60 minutos, agregar 0.5 ml de reactivo de color. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a
temperatura ambiente.
- Agregar 5 ml de Na OH 0.4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura.
- Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibracin, segn instrucciones previas.
IV.
CUESTIONARIO:
1. Cul es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de
miocardio?
2. Interprete y explique todo lo actuado en la prctica.
3. Haga un resumen de seis lneas sobre AST.
72
PRACTICA N 26
CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA
INTRODUCCION:
La hemoglobina es una hemoprotena, tetramrica, con dos subunidades alfa y dos beta, cuya funcin es el
transporte de oxgeno. Se sintetiza en la mdula sea por una va comn a la sntesis de porfirinas, que termina
con la adicin del hierro por la ferroquelatasa.
La concentracin normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del
mar. El defecto enzimtico en algunas de las etapas de sntesis del grupo Hemo, da lugar a las diferentes tipos de
porfirias.
La disminucin de la sntesis de hemoglobina, por diferentes causas, produce disminucin de su concentracin
dando lugar a la anemia por menor produccin como en la anemia ferropnica, que tambin puede deberse a
problemas en la maduracin de los glbulos rojos como la deficiencia de cido flico. Pero la hemoglobina puede
tambin disminur por prdida de sangre como en las hemorragias o por hemlisis (anemias hemolticas). En este
ltimo grupo, una causa pueden ser las hemoglobinopatas por defecto en la sntesis de una de las cadenas
(talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminocido
por otro como en la hemoglobina S. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su sntesis
llevando a la
COMPONENTES
STANDARD
DESCONOCIDO
policitemia,
hemogloWiener Reactivo
5 ml
5 ml
que
puede
Con pipeta limpia y seca, agregar:
tener
tambin
hemogloWiener Standard
20 ul
----otras causas
Muestra (sangre total)
----20 ul
como
la
Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta, enjuagando tres veces en el propio
Policitemia
reactivo antes de agregar cada muestra. Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotmetro a
Vera
540 nm o en fotocolormetro con filtro verde (520-550), llevando el aparato a cero con Reactivo
La OMS basa su definicin de anemia en la concentracin de hemoglobina, de modo que en mujeres se considera
si esta es menor de 12 g/dl y en varones; menor de 13 g/dl, en nios existe variacin con la edad. En la prctica
mdica es por ello importante determinar la concentracin de la hemoglobina, que es sin duda uno de los
exmenes ms solicitados.
La finalidad de la presente prctica es determinar la concentracin de hemoglobina en sangre de personas
normales, utilizando el mtodo enzimtico de determinacin de hemoglobina.
REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS

- Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solucin estabilizada de tensioactivo/CNX.
- Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos.
- Standard de Hemoglobina.
- Hemoglowiener reactivo
Tubos de vidrio
Lancetas
Pipetas
ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES:
73
CALCULO DE RESULTADOS:
Hemoglobina (g/dl) D factor
factor
Standard (g/l)
S
- Hombres: 13.0 18.0 g/dl
- Mujeres: 11.0 16.0 g/dl
CUESTIONARIO:
1. Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina, indicando sus aminocidos importantes en cada
polipptido, el nmero de ellos y las interacciones del in Fe++ dentro del grupo hemo.
2. Interprete y explique el procedimiento de la prctica.
3. Qu es la anemia. Cul es la ms frecuente y cuntos tipos de anemia conoce.
4. Una anemia importante es la anemia de clulas falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiologa
y su patogena.
74
CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS

INTRODUCCION:
Los hemates tienen una vida media de 120 das, al cabo de la cual son destruidos en el sistema retculo endotelial.
La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem, ste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina.
Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albmina. La bilirrubina indirecta o no conjugada
llega al hepatocito y se separa de la albmina, despus de un proceso de captacin y conjugacin con dos
molculas de cido glucurnico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa, se convierte en una forma soluble,
denominada bilirrubina directa o conjugada, que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso
de transporte activo; da color a las heces y ultrafiltra el glomrulo. Cada gramo de hemoglobina degradada origina
35 mg de bilirrubina. La concentracin sangunea de bilirrubina total es de 1 mg / dl, siendo en su mayora
bilirrubina indirecta, que no se excreta por orina. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no
conjugada como en las anemias hemolticas o en los defectos congnitos de conjugacin, o de la bilirrubina
conjugada en las hepatopatas, donde el defecto limitante es la excrecin, o en las enfermedades extrahepticas
obstructivas.
La manifestacin clnica ms importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia, y el origen de esta alteracin
obedece a causas de origen pre heptico, heptico y post heptico, que varan con la edad de presentacin y
tambin en cuanto a su gravedad
La bilirrubina directa da una reaccin inmediata con el diazorreactivo; la indirecta, slo reacciona despus de
agregar alcohol a la mezcla. La finalidad de la presente prctica es determinar la concentracin total de las
fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia, por el mtodo de Malloy Evelyn,
que utiliza el diazorreactivo de Erlich.
La finalidad de la presente prctica es determinar la concentracin total y de las fracciones (bilirrubina directa e
indirecta) en el suero de personas normales, por el mtodo enzimtico de determinacin de bilirrubina.
REACTIVOS
- Desarrollador o solvente
- Reactivo sulfanlico
- Nitrito de Sodio
- Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanlico.
- Bilirrubina Standard.
ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento
Componentes
Blanco Bil. Directa Bil. Total
Muestra (suero)
200 ul
200 ul
200 ul
Agua destilada
2.5 ml
2.5 ml
----Desarrollador
--------2.5 ml
Reactivo Sulfanlico
200 ul
--------Diazorreactivo
----200 ul
200 ul
Mezclar de inmediato cada tubo por inversin. Luego de 5 minutos,
leer en espectrofotmetro a 530 nm o fotocolormtero con filtro
verde (520-550 nm), llevando el aparato a cero con agua destilada.
Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para
la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. Si lee
antes, habr subvaloracin de los resultados por reaccin
incompleta. Si se lee despus, habr sobrevaloracin porque
comienza a reaccionar la bilirrubina libre
75
CALCULOS:
Bilirrubina total (mg/l) = (Abs. Bil. total - Abs. Blanco) x F
Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs. B. Directa - Abs Blanco.) x F
Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total - Bilirrubina Directa
- Adultos:
o Directa: hasta 2 mg/l
o Total: hasta 10 mg/l
CUESTIONARIO:
1. Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la
bilirrubina.
2. Cules son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada?
3. Cules son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada?
4. Cul es la accin bioqumica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la prctica?
5. Cul es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recin nacido?
6. Cul es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia heptica. Por qu?
76
PRACTICA N 27
CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO
I. INTRODUCCION:
El cido rico es un producto de la degradacin heptica de las bases nitrogenadas purnicas adenina y guanina,
que circulan en la sangre (en el plasma y en los glbulos rojos humanos) y es la orina su va de excrecin. Un adulto
normal produce unos 500 mg de cido rico por da. Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por
orina, el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3, o urea.
En el plasma, el cido rico alcanza una concentracin de 4 a 6 mg/dl. Los varones tienen niveles 1 mg/dl ms altos
que las mujeres, diferencia que desaparece despus de los 45-50 aos de edad. Al pH sanguneo predomina la
forma desprotonada o urato; a pH menores predomina la forma protonada no disociada o cido rico. En orina, el
pH cido favorece la formacin de cido rico no disociado y puede precipitar; en alcalinidad, ocurre lo contrario. La
cantidad de uratos excretados vara normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs, cantidad que puede incrementarse con
una dieta rica en purinas.
En el hombre, la uricemia se incrementa despus de la ingestin de nucleoprotenas con los alimentos, los que se
degradan y en un primer momento liberan los cidos nucleicos de las protenas. Como sucede con otros
constituyentes sricos, la concentracin de cido rico en suero o plasma depende de un neto balance entre el
grado de sntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoprotenas por un lado y, por otro, del grado de eliminacin
de cido rico. En condiciones patolgicas, podemos encontrar concentraciones incrementadas de cido rico
srico en la gota, que es el ms comn de los desrdenes del metabolismo de las purinas, ms frecuente en
hombres. Tambin existe hiperuricemia proveniente de la destruccin excesiva de clulas (material nuclear) en
leucemias y linfomas, policitemias, etc. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de cido
rico como resultado de una excrecin disminuida.
La presente prctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones sricas de cido rico en personas adultas
normales y / o con alteraciones patolgicas mediante el procedimiento qumico de Folin-Dennis que se basa en la
accin reductora del cido rico en medio alcalino sobre el cido fosfotngstico.
-
Standar: solucin de cido rico 100 mg/dl

Uricasa: solucin de uricasa mayor o igual a 3U/I
Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo ms de 100 U de peroxidasa (POD).
Reactivo de fenol.
-
Muestra: suero o plasma heparinizado
En tres tubos de fotocolormetro o cubetas espectrofotomtricas marcadas B (Blanco), S (Standard) y D

(Desconocido), colocar:
B
S
D
Standard
50 ul
Muestra
50 ul
Reactivo de trabajo
2,5 ml
2,5 ml
2,5 ml
Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en bao de agua
a 37 C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 C).
Retirar, enfriar y leer en espectrofotmetro a 505 nm o en
fotocolormetro con filtro verde (490-530 nm), llevando el
aparato a cero con el blanco.
77
CALCULO DE RESULTADOS:
Acido Urico (mg/dl) D f
donde " f "
100 mg/dl
S
En adultos normales, con ingesta normal de protenas, se observan los siguientes rangos de valores:
Hombres: 26-60 mg/l
Mujeres: 20-50 mg/l
Los valores de cido rico varan de acuerdo a la edad, el sexo y las diferentes dietas; incluso se ha
observado una variacin estacional.
IV. CUESTIONARIO:
1. Cmo se sintetiza el cido rico. Y dnde se realiza esta sntesis.
2. Cul es la fisiopatologa de las hiperuricemias.
3. Seale la deficiencia parcial enzimtica que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota.
4. Cmo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota?
5. Cul es el proceso de la artritis y de la formacin de los tofos en la gota?
6. Explique por qu existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia.
78
PRACTICA N 28
DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y
NEFROPATAS
INTRODUCCION:
La creatina, precursora de la creatinina, aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por sntesis, aunque una
pequea cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un
compuesto importante como fuente de energa en la contraccin muscular. Aproximadamente 2% de la creatina
fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente; la cantidad total depende de la masa muscular. La
creatinina es fcilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal. Es excretada fundamentalmente
por el rin el cual clarifica el plasma de creatinina. La concentracin de creatinina en suero no es afectada por la
dieta, catabolismo de protenas, edad, sexo o ejercicios. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando
la funcin renal est muy alterada y aunque el mismo tipo de informacin acerca del diagnstico y pronstico se
obtiene por la determinacin de nitrgeno ureico o creatinina, esta ltima determinacin se prefiere porque
proporciona mayor informacin relacionada con el estado de la funcin renal, ya que los niveles de creatinina srica
dependen del grado de excrecin, siendo la produccin endgena constante.
El suero es depurado de creatinina en el rin por filtracin glomerular proporcionando una buena base para el test
de clearance. La concentracin normal en suero vara de 0,5 a 1,4 mg /100 ml. El clearence de creatinina normal es
mayor de 100 ml / min.
La determinacin de creatinina tiene utilidad en la prctica mdica para la evaluacin de la funcin renal, la cual
puede alterarse por diversas causas; las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia
cardaca; renal, como las glomerulonefritis o la nefropata diabtica o post renal, como las uropatas obstructivas
La creatinina en medio alcalino reacciona con el cido pcrico para dar un tautmero de picrato de creatinina de
color anaranjado (reaccin de Jaffe). La determinacin de hace de ordinario en un filtrado libre de protenas obtenido
a partir del suero. Usando mtodos enzimticos para determinar especficamente creatinina y comparando con los
valores obtenidos por la reaccin de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina
verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total, mientras que en eritrocitos slo corresponde a
un 40%. Esto, hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinacin de creatinina por
el mtodo colorimtrico.
La creatinina es un constituyente habitual de la orina, y es excretada en una cantidad casi constante, las
variaciones fluctan entre 0, 9 - 1,5 g/24hs. La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino
generalmente es ms grande que en las de sexo femenino. La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal
y es til para medir el grado de filtracin glomerular y lo poco que es transferido a travs de las clulas tubulares. La
creatininuria es determinada mediante el mtodo enzimtico.
Reactivo 1: Hidrxido de sodio 0.16 mmol/l
Reactivo 2: Acido pcrico 4.0 mol/l
Standard: Solucin de creatinina 2 mg/l.
79
PROCEDIMIENTO
En caso de que la muestra a utilizar sea en suero, En tubos de ensayo marcados B
(Blanco), S (Standard), M (Muestra)
Componentes
Blanco Standard
Muestra
Reactivo 1
1000 ul
1000 ul
1000 ul
Muestra
--------50 ul
Standard
----50 ul
----Mezclar. Incubar 5 minutos a 20-25 C/30 C/37 C, luego agregar:
Reactivo 2
250 ul
250 ul
250 ul
Llevar el espectrofotmetro a cero con el blanco. Mezclar. Incubar 1 minuto a 20-25
C y leer A1. Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2.
CALCULOS: A Muestra (A2-A1) y A Standard (A2-A1)
CALCULOS:
SUERO/PLASMA:
Mujeres
Varones
ORINA:
Mujeres
Varones
Clearance de Creatinina:
Mujeres
Varones
SUERO/PLASMA :
Creatinina(mg/dl)
0.6 1.1 mg/dl

0.9 1.3 mg/dl
11 20 mg/kg/d
14 26 mg/kg/d
95 160 ml/min/1.73 m2
98 156 ml/min/1.73 m2
A Muestra
A Standard
Standard(mg/dl)
ORINA :
Creatinina(mg/dl)
A Muestra
A Standard
Standard(mg/dl) 50
CLEARANCE DE CREATININA :
mg/min/1.73m2 mg creatinina/100 ml Orina ml orina/24h

mg creatinina/100 ml suero 1440
CUESTIONARIO:
Qu informacin o presuncin obtiene al dosar la creatinina srica?
Por qu se prefiere la determinacin de creatinina urinaria a la de nitrgeno ureico?
Interprete y explique el procedimiento de la prctica. Haga dibujos del procedimiento.
80
Explique por qu se incrementa la creatinina en tres estados patolgicos que conozca.

A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene, su determinacin.
81
PRACTICA N 29
CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE
I. INTRODUCCION:
La urea es sintetizada en el hgado, es el principal producto final del catabolismo de las protenas y se distribuye en
todos los tejidos. Normalmente no tiene funcin til en el organismo, es excretado casi enteramente por los riones.
La urea en el plasma es filtrada por los glomrulos renales, pero en condiciones normales aproximadamente el 40%
de este filtrado regresa por difusin a la sangre. La importancia clnica de la urea viene del hecho de una elevada
concentracin sangunea puede estar asociada con una mala funcin renal. El grado de azoemia depende de la
extensin y tipo de lesin renal.
La concentracin de la urea en la corriente sangunea es el resultado del balance entre el grado de degradacin de
las protenas y el grado de eliminacin por los riones.
Los valores normales de urea en suero (como nitrgeno ureico sanguneo o BUN) es de 9 19 mg/100 ml. Las
concentraciones de urea en sangre total, suero o plasma, son muy similares. La uremia es determinada
colorimtricamente por el uso de ureasa. Este mtodo es altamente especfico y aunque est basado en reacciones
de urea, es convencionalmente reportado como nitrgeno ureico. Los valores de urea se reportan siguiendo la
siguiente frmula:
Nitrgeno ureico sanguneo x 2,14 = UREA
En sentido inverso, conociendo los valores de urea, se informa el BUN segn la siguiente frmula: Urea x 0,4665 =
Nitrgeno ureico sanguneo
Los riones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea.
La ureasa descompone especficamente a la urea produciendo dixido de carbono y amoniaco; ste reacciona con
fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimtricamente.
Cuando el nitrgeno ureico es determinado por el mtodo de la ureasa, sta transforma a la urea en carbonato de
amonio y con la adicin del reactivo de Nessler el amonaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno
cuya intensidad se mide en fotocolormetro.
La finalidad de la presente prctica es cuantificar la uremia por el mtodo de la ureasa, en personas normales y / o
con procesos patolgicos.
- Suspensin de ureasa.
- Reactivo de salicilato.
- Reactivo hipoclorito.
- Solucin standard
PROCEDIMIENTO
Componentes
Blanco Standard
Desconocido
Muestra
(ml)
--------0.01
Standard
(ml)
----0.01
----Reactivo de trabajo (ml)
1.00
1.00
1.00
Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 C a 25 C), o 3 minutos a
37 C. Agregar a cada tubo:
Reactivo hipoclorito (ml)
1.00
1.00
1.00
Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 C) o 5
minutos a 37 C. Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora
82
CALCULOS:
FACTOR
66
Absorbancia Standard
Urea (mg/dl) Factor Absorbancia desconocido
SUERO/PLASMA:
Urea
:
Nitrgeno Ureico :
10 a 50 mg/dl
4.5 a 22.7 mg/dl
ORINA:
Urea
:
Nitrgeno Ureico :
15 a 30 g/24 hrs.
7 a 14 g/24 hrs.
IV. CUESTIONARIO:
1. Qu importancia clnica tiene para usted, conocer las concentraciones sricas de rea?
2. Qu influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentracin srica de rea?
3. En relacin a las concentraciones sricas de rea y NH4+. Seale las caractersticas comunes que se
encuentran en los efectos enzimticos hereditarios del ciclo de la rea.
4. Qu alteraciones en las concentraciones sricas de rea y NH4+ podran encontrarse en el coma
heptico?
5. Cul es la importancia metablica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hgado de los seres
humanos?
6. Cul es la importancia metablica que en el hgado humano exista una relacin entre el ciclo de los
cidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina?
83
PRACTICA N 30
DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA
DE LOS L--AMINOACIDOS
INTRODUCCION:
La remocin del grupo amino de las L-aminocidos es el primer paso en la degradacin metablica general de estos
compuestos (catabolismo). Dos sistemas enzimticos de transaminacin: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la
glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los
aminocidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato. Puesto que la
alanina es tambin sustrato para la reaccin de glutamato transaminasa, todo el nitrgeno amino proveniente de los
aminocidos que puede experimentar transaminacin se puede concentrar en el glutamato. Esto es importante
porque el L-glutamato es el nico aminocido en el hgado que experimentan desaminacin oxidativa a una tasa
apreciable y esta reaccin se cataliza por la L-glutamato deshidrogenasa,
Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hgado despus de un perodo de
incubacin (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminacin si encontramos determinada
cantidad de cetocidos (cido pirvico y cido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una
solucin de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino. La presencia de estos cetocidos se debe fundamentalmente a los
procesos de transdesaminacin y desaminacin del cido glutmico (transdesaminacin) que se estimula
fundamentalmente y en mucha menor proporcin por desaminacin de la L-Alanina por la accin de la Laminocido.
La finalidad de la prctica es demostrar los procesos de desaminacin (oxidativa o no) que sufren los L-aminocidos
en el hgado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de stos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los
cetocidos formados provenientes de la desaminacin.
- Buffer fosfato 0,1M pH 7,4
- L-alanina: solucin 0,2M
- Acido tricloroactico al 10%
- 2-4-Dinitrofenilhidrazina: solucin 0,1% en HCl 2 N.
- NaOH: solucin 2N
- Homogeneizado de hgado o rin de rata 10% y conservado en bao helado.
Armar el siguiente esquema de incubacin:
COMPONENTES (ml)
Buffer fosfato 0.1 M pH 7,4
Solucin L-alanina 0,2M
Agua destilada
Homogeneizado de hgado
Colocar en bao mara a 37C durante treinta minutos.
Aadir cido tricloroactico al 10%
Mezclar y aadir agua destilada
Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados:
I
4,0
0,5
1,0
1,0
3,5
TUBOS DE ENSAYO
II
4,0
0,5
1,0
1,0
3,5
III
4,0
0,5
1,0
1,0
3,5
84
COMPONENTES (ml)
Filtrado
2,4-Dinitrofenilhidrazina solucin al 1%
Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos.
NaOH 2N
I
4,0
1,0
TUBOS DE ENSAYO
II
4,0
1,0
4,0
4,0
III
4,0
1,0
4,0
Dejar en reposo durante 10 minutos.

Realizar las lecturas con el espectrofotmetro.
CUESTIONARIO:
1
Seale los sistemas enzimticos flavinodependientes que producen desaminacin oxidativa de los
aminocidos.
De un ejemplo de desaminacin oxidativa de un aminocido.
Cul es la razn por la que se utiliza 2,4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema?
Cmo explica usted los resultados fotocolorimtricos obtenidos en los tres diferentes tubos de
experimentacin del sistema?
Cul es la importancia biolgica de la desaminacin oxidativa de los aminocidos?
Qu conclusiones puede establecer usted, de los resultados de su prctica de laboratorio?
85
V UNIDAD
NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS, PROTEICOS,
VITAMINAS Y MINERALES
PRACTICA N 31
DOSAJE DE VITAMINA A
El instructivo de la presente prctica se les proporcionar durante la prctica respectiva.
PRACTICA N 32
DOSAJE DE VITAMINA C
I. INTRODUCCION:
La vitamina C o cido ascrbico es hidrosoluble y antiescorbtica. Se presenta en alimentos frescos y en
vegetales. La nica accin en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que
influye en los procesos de xido reduccin. Ciertas clulas sin vitamina C no son capaces de producir o mantener
sustancias de importancia intracelular.
Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metablicas precisas hay pruebas que sealan su
requerimiento para el metabolismo de la tirosina . Se necesita tambin para la produccin normal de fibrinas
del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el
escorbuto). Muchas de estas propiedades podran depender de las propiedades reversibles de xido reduccin
(redox) de esta vitamina (cido ascrbico - cido dehidroascrbico).
Las necesidades mnimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por da. Para ello es
necesario que los, alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C. Los nivelasplasmticos en una
poblacin bien alimentada varan entre 5,5 y 1,2 mg/100ml. En los leucocitos la concentracin es mucho mayor que
en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria. La corteza suprarrenal, la hipfisis y el ojo son espacialmente
ricos en vitamina C.
La vitamina C es destruida rpidamente por el calor de cocimiento o la pasteurizacin. En caso de alimentacin
deficiente, el escorbuto clnico tarda 6 meses en manifestarse. En el escorbuto no tratado, el nivel plasmtico de
cido ascrbico es inferior de 0,1 gm/100ml y en glbulos blancos menos de 2 mg/100 g. Las intervenciones
quirrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glbulos blancos. Antes de la
intervencin quirrgica las cifras plasmticas inferiores de 0,2 mg/100ml o en glbulos blancos a 8 mg/100 g
indican una deficiencia importante que puede significar cicatrizacin tarda o dehiscencia de las suturas.
Se estima que una ingestin diaria de 2,5 mg de cido ascrbico para nios y 7,5 mg para adultos es suficiente para
prevenir sntomas de deficiencia. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto, una enfermedad
caracterizada por debilidad, dolor de las extremidades, hemorragias subcutneas y sangrado de encas. Casos
subclnicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la poblacin pobre de las grandes ciudades. Los
sntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes, lesiones en las encas y
ligera anemia. Un excelente test clnico para la deficiencia de vitamina C es la determinacin del promedio de
resistencia capilar. Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presin sangunea con la cual la
presin dentro de los capilares se incrementa por la constriccin de la vena del brazo. Hemorragias que en la piel
aparecen con excesiva frecuencia podran indicar fragilidad capilar.
86
La excrecin normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg.

Para la determinacin del cido ascrbico en sangre, esta debe ser fresca (no despus de 30 min.). El cido
ascrbico es estable durante varias horas en el filtro. Se utilizar el mtodo de Roe y Kutcher modificado para la
cuantificacin del cido del cido ascrbico en sangre, total o plasma. Por 6'ste procedimiento el cido ascrbico
del plasma o sangre es oxidado a cido dehidroascrbico. En un pH cido, el acide dehisroascrbico se
transforma rpidamente en cido dicetoglucnico que se une a 2-4 dinitrofenilhidracina para formar una hidrazona de
color pardo. Esta sufre rearreglo molecular en cido fuerte dando un compuesto rojo. Absorbancia se compara con
patrones adecuados de cido ascrbico.
El propsito de la siguiente prctica es determinar la concentracin de cido ascrbico en el plasma de personas
adultas normales o carenciales, por el mtodo colorimtrico de Roe y Ructher modificado.
Acido tricloroactico al 10& (P/V).
Reactivos 2,4 dinitrifenilhidracina al 2% en cido sulfrico 9 N.
Solucin de tiorea al 10% en etanol al 50%.
Solucin de sulfato cprico al 1,5%.
Reactivo de color. Se prepara en el mismo dia de uso, mezclando: 5 ml del reactivo 2,4 dinitrofenilhidracina, 0,1 mil de la solucin de sulfato cprico, y 0,1 de la solucin tiorea.
Acido sulfrico al 85%.
Standard de cido ascrbico 2 ml/100ml.
Oxalato de litio al 6,5%
Extraer ms o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados.
Mezclar:
COMPONENTES (ml) TUBOS
Liquido sobrenadante de paso anterior
Acido tricloroactico al 10%
Standard de cido ascrbico.
Agua destilada
Reactivo de color combinado
I
1
0,4
II
0,5
0,5
0,4
III
0,5
0,5
0,4
Se mezclan los reactivos, se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en bao de agua a 56C durante
una hora. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en bao de hielo durante 5 minutos.
Agregar a cada tubo lentamente y mezclando, 2 mi de cido sulfrico al Q5o, enfriando el hielo.
Dejar los tubos en reposo por 30 min.
Agregar 1,6 ml de agua destilada.
Mezclar nuevamente.
Leer en fotocolorimetro (540 nm).
CLCULOS:
Abs. Del problema - Blanco x 2,5 = mg/dl
Abs. Del Standard - Blanco
NOTA:
El cido ascrbico es muy inestable. Por ello es indispensable separa el plasma de ids glbulos rojos y
realizar el anlisis sin tardar.
El cido ascrbico utilizado para preparar la solucin patrn debe ser de grado analtico.
Los valores inferiores a 0,2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparicin de un escorbuto clnico.
87
IV. CUESTIONARIO
1. Por qu las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal?
2. Qu relaciones metablicas podra mencionar entre el cido flico y Fe+++ en la produccin de anemia en
el escorbuto?
3. Desde el punto de vista metablico Cmo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el
curso de las enfermedades infecciosas, hipertiroidismo, neoplasias, embarazo, lactancia e intervenciones
quirrgicas?
4. Cmo explicara que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de
deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa?
5. Mencione algunas funciones metablicas importantes del cido ascrbico.
88
PRACTICA N 33
DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC
I. INTRODUCCION:
El hierro srico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina-encargada del
transporte de oxgeno, as como de otras hemoprotenas como los citocromos componentes de la cadena
respiratoria- y la mioglobina. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria. El hierro es
absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulacin ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina
para su transporte srico.
El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado, que se
encuentra dentro de las clulas; el hierro en uso, que se encuentra en la hemoglobina, enzimas y varios tipos de
protenas; y el circulante. Prcticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a protena, dado que no slo es
relativamente insoluble, sino que adems es txico.
La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:
Deficiencia de los depsitos de hierro, lo que lleva a la disminucin de la ferritina srica
Disminucin de hierro srico, aumento de Capacidad Total de Fijacin de Hierro y disminucin de la Saturacin
de Hierro
Anemia por deficiencia de hierro: microctica hipocrmica. El 90 % de anemias en las mujeres es por
deficiencia de Fe.
La evaluacin de la concentracin de hierro srico es de gran utilidad, dado que un aumento en sus niveles se
encuentra asociado a diversas patologas tales como destruccin aumentada de los glbulos rojos, defectos en el
mecanismo de almacenaje, etc. De la misma manera, su disminucin se asocia entre otras patologas a problemas
de absorcin y almacenaje, etc.
La capacidad de fijacin de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las
hemocromatosis, tumores, fiebre reumtica, etc.
-

Buffer cido: buffer acetato pH 4.0, hidroxilamina clorhidrato.
Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8.0
Reactivo color: ferrozina, hidroxilamina clorhidrato.
Solucin Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl
DETERMINACION DE HIERRO
Armar el siguiente sistema
Componentes
Blanco (suero)
Muestra
Buffer Acido
(ml)
2,5
2,5
Agua Destilada (ml)
--------Standard
(ml)
--------Muestra
(ml)
0,50
0,50
Reactivo color (ml)
----0,05
Mezclar e incubar a 37 C por 10 minutos. Leer las
absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm
89
Clculos:
Ferremia (ug/dl)
Abs.Muestra Abs.Bl. Muestra

Abs. Standard Abs.Bl. Reactivo
500
Valores de referencia:
Varones: 50 - 160 ug/dl
Mujeres : 40-150 ug/dl
DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijacin de hierro)
Componentes
Blanco Muestra Muestra
Buffer Alcalino (ml)
2,00
2,00
Agua Destilada (ml)
--------Standard
(ml)
0,50
0,50
Muestra
(ml)
0,50
0,50
Reactivo color (ml)
----0,05
Mezclar e incubar a 37 C por 10 minutos. Leer las
absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm
Calculos:
UIBC (ug/dl) 500
Abs. muestra Abs.Bl. muestra

Abs. standard Abs.Bl. reactivo
500
TIBC (ug/dl) Ferremia(ud/dl) UIBC (ug/dl)

% Saturacin
Ferremia (ug/dl)
Valores de Referencia:
TIBC:
Hasta 6 aos
Sobre 6 aos
% Saturacin
100
TIBC (ug/dl)
:
:
100 400 ug/dl

250 400 ug/dl
20 55 %
IV. CUESTIONARIO:
1.
Seale al menos 5 funciones del hierro
2.
Causas de deficiencia de hierro
3.
Informe sobre estructura de la ferritina
4.
Qu exmenes solicitara para evaluar la deficiencia de hierro?
5.
Qu importancia tiene medir la saturacin de hierro?
90
PRACTICA N 34
DETEMINACION DE CLORO, SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE
PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO
DETEMINACION DE CLORO
INTRODUCCION:
El in cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. De todos los aniones
es uno de los de ms baja concentracin en el lquido intracelular. En el suero normal el cloruro se encuentra en
concentraciones que varan entre 100 y 106 mEqL.
La concentracin de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del
dficit primario de C02. Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilacin que
puede ser causada a su vez por: a) drogas, b) enfermedades que producen estmulo del centro respiratorio como:
histeria, ansiedad, fiebre, tensin de oxgeno disminuida (altura), c) algunos tipos de enfermedad tubular
renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro srico, d) excesiva ingestin de ClNH4 (cloruro
de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro srico, igualmente sucede en el
ClK.
Se puede presentar concentracin de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilacin causada por: 1)
depresin del sistema nervioso central, 2) parlisis de los msculos respiratorios, 3) enfermedad pulmonar; todas
estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia), 4) enfermedad renal crnica, 5) en la
diabetes mellitus no controlada, 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los
cuerpos cetnicos por sobre produccin de estos, 7) en hiper o en hipofuncin de las glndulas adrenales
(corteza).
- Reactivo de Color 2,4,6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro
- Estndar de cloruro: 355 mg/dl
Antes de la determinacin el estndar y las muestras de suero deben ser diluidas en relacin 1/50 con agua
destilada (20 L de muestra/1 ml de agua).
COMPONENTES
ESTANDAR PROBLEMA
Estndar diluido
20 ul
--Suero diluido
--20 ul
Reactivo de color
1 ml
1 ml
Mezcla, despus de incubar 5 minutos a oscuras. Medir en
el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y
estndar. No exponer a la luz
CALCULOS
C 355
Lectura Muestra
Lectura Standard
mg/dl
91
VALORES NORMALES:
335 - 383 mg/dl. (Convertir en mEq/l dividiendo entre 3.55)
CUESTIONARIO:
1. Qu influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro?
2. Cmo explicara usted, la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison?
3. Puede sealar cinco causas de hipercloremia?
4. Puede sealar cinco causas de hipocloremia?
5 Cual es la relacin de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio cido bsico?
92
DETERMINACION DE SODIO
I.
INTRODUCCIN
Debido a la predominante concentracin del in sodio en el lquido extracelular ste influye sobre la presin
osmtica que juega un rol preponderante en la distribucin del agua entre el espacio extra o intra celular. El in
sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio cido bsico ya que constituye aproximadamente el 90%
del total de cationes extra celulares.
Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44% se encuentra en el lquido
extra celular y el 35% en los huesos. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en
los huesos, es aparentemente inerte (no ionizable), hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y
participa en las reacciones fisiolgicas.
En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. por peso corporal; en mujeres hay slo
39 mEq por kg. y en nios es mayor. Como sucede con el agua corporal los valores varan inversamente con la
grasa corporal.
El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinacin con el cloro fosfato, sulfato y otros aniones (sales). Son
ingeridos cerca de 3 gr. Diariamente y tiene acceso al suero por difusin a travs de la mucosa intestinal o sea que
cerca del 4% del sodio corporal total se recambia- diariamente. En el suero, el sodio esta en equilibrio con el del
lquido intersticial, con pequeas diferencias debido al equilibrio de Donnan. La concentracin srica es
representativa de toda la concentracin celular. La cantidad presente dentro de la clula no puede ser medida sin
biopsio del tejido.
El exceso de sodio se elimina por el rin. El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina. El rion puede
regular la excrecin de sodio y agua por lo tanto, es el principal factor de regulacin de este ion corporal y de sus
concentraciones. Pequeas cantidades aparecen tambin en las heces, sudor y saliva.
En condiciones anormales pueden ser muy considerables las prdidas de agua por el sudor u otros fluidos.
El suero o plasma contiene ms del 90% del sodio total de la sangre. La concentracin srica normal es de 135 a
145 mEq por L (310 A 340 mg%). Tales valores no dan informacin acerca del volumen y distribucin de la cantidad
total presente ni de la cantidad intracelular existente.
El estado clnico de hidratacin es importante para evaluar el significado de los niveles sricos de sodio.
Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua
corporal. Puede ocurrir deshidratacin con sodio srico elevado, si el lquido ingerido es insuficiente por razones
anormales, por ejemplo en pacientes con diabetes inspida no controlada, alimentacin nasogstrica con alto
contenido de protenas, cuando el lquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el
rin, como en el coma diabtico, tratado slo con insulina y solucin salina. Algunos pacientes con enfermedad
cerebral, pacientes con diarrea.
Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua; en pacientes con
diarrea, fstula intestinal, enfermedad renal con disfuncin tubular, en diabetes mellitus no controlada.
La determinacin del sodio de los fluidos biolgicos se realiza sea por electrodo in selectivo o menos
frecuentemente por mtodo colorimtrico
Reactivo precipitante: Acetato de uranilo ms acetato de magnesio
Reactivo de color: tioglicolatop de amonio
Standard de sodio: 50 mmol/l
93
III.
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO)

Componentes
Blanco de Reactivo Standard Problema
Standard
20 ul
Problema
20 ul
Precipitante
1 ml
1ml
Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente. Dejar reaccionar durante 5 minutos
Agitar fuertemente por 50 segundos. Dejar reaccionar durante 30 minutos
Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). Emplear el sobrenadante
Precipitante
20 ul
Sobrenadante Standard
20 ul
Sobrenadante Problema
20 ul
Reactivo de color
1 ml
1 ml
1 ml
Mezclar bien. Despus de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm
CALCULOS:
Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard
Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor
IV.
CUESTIONARIO:
1. Cul es la importancia biolgica del ion sodio?
2. Cul es el principal factor de regulacin del ion sodio corporal?
3. Qu semejanza existe en la absorcin intestinal de este ion y la glucosa?
4. Seale las concentraciones sricas normales.
5. Por qu la clasificacin de deshidratacin por alteracin de la osmolaridad, incluye bsicamente las
concentraciones de est ion?
94
DETERMINACION DE POTASIO
I.
INTRODUCCIN
El potasio es el principal catin intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presin osmtica que
determina la distribucin de agua entre las clulas y el lquido extracelular. Adems de este rol pasivo, influye
activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimticas intercelulares.
Existe aproximadamente 130 gr. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg. del cual el 98% es intracelular
mientras que el 2% est presente en el liquido extracelular.
El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido vara en los
diferentes rganos. El potasio del hueso, cerebro y de los glbulos rojos se recambia ms lentamente que en otros
rganos, en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio, en mujeres solamente
40 mEq por kilogramo de peso. Los nios tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de
peso debido a que la relacin de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. Aproximadamente
293 gr. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. Entonces el
2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. En los nios donde la ingestin de potasio es
relativamente ms grande, el recambio diario es de 14%.
El potasio es rpidamente removido del lquido extracelular despus que es ingerido. Del suero el potasio es
transferido el lquido intersticial antes de penetrar a las clulas o al filtrado glomerular a travs de la membrana de
los capilares glomerulares del rin.
La concentracin de potasio intracelular varia con los cambios del agua que generalmente acompaa a las
alteraciones de los niveles de sodio extracelular. Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la
disminucin de cloruros, se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular. El dficit de
potasio celular es reflejado en los hallazgos sricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia
debido a la elevada excrecin urinaria de cloruro de potasio. Con ingestin calrica inadecuada y la utilizacin de
protenas celular para propsitos calricos, el potasio es liberado de las clulas y excretado dando como resultado
hipopotasemia.
El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeas cantidades son perdidas en la
respiracin insensible. Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero
cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio, son perdidos a travs del
vmito, diarrea o fstula gastrointestinal segundo por excrecin urinaria incrementada en individuos con
anormalidades tubulares renales.
La concentracin de potasio en el suero de personas normales es de 3,5-5-3 mEq/L; en recin nacidos los niveles
son algo ms altos, varan entre 4-5,9 mEq/L. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque
el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. Existe tambin una prdida lenta de potasio de los glbulos
rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada.
Se produce hiperpotasemia con prdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular
est alterada por lesin tisular. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el rion no puede excretar esta
sobrecarga. Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa; en
hipoventilacin tanto central como perifrica cuyo incremento de potasio es frecuente; en la diabetes no
controlada, la excesiva destruccin de clulas del cuerpo y la utilizacin de protenas para propsitos calricos se
acompaara de prdida de potasio celular; en deshidratacin, en insuficiencia de la corteza adrenal, pues la falta
de esferoides adrenales provocan retencin de potasio srico; asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal
se encuentra elevada la concentracin de potasio.
Dficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestin de alimentos, en administracin continua de
glucosa endovenosa y terapia salina, esto es debido a que la excrecin de potasio por orina se mantiene constante;
en alcalosis con hiperventilacin; en intoxicacin temprana con salicilatos; en fstulas gastrointestinales y
vmitos; en leo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante; en hiperfuncin adrenocortical o
sobredosis de cortisona o ACTH; as mismo en algunos casos de insuficiencia renal crnica.
95
Reactivo precipitante :cido tricloroactico
Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio
NaOH
Estndar de Potasio
III.
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento):

1. Precipitacin: en un tubo de ensayo pequeo aadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante.
Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm).
2. Armar el siguiente sistema:
Componentes
Reactivo de trabajo
Standard
Sobrenadante
Standard
1 ml
100 ul
Problema
1 ml
100 ul
Para producir una turbidez homognea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser
agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo
Mezclar cuidadosamente
Dejar reposar por lo menos 5 minutos
Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos
CLCULOS:
Factor: 5/Lectura del Standard
Problema: lectura del problema x factor
VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l
IV.
CUESTIONARIO:
1. Cul es el principio o fundamento del mtodo de Hoffman para determinacin del potasio srico?
2. Cmo explica metablicamente la influencia sobre la concentracin srica de potasio producida por la
administracin de glucosa e insulina?
3. Explique usted los efectos metablicos de la aldosterona en la excrecin renal de potasio.
4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia
96
PRACTICA N 35
DETERMINACION DE CALCIO SERICO
INTRODUCCION:
El calcio srico se encuentra en dos formas: Una combinada con protenas sricas, inactivo e incapaz de
difundir a travs de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las protenas, es principalmente inico,
difusible y activo.
Varios factores influyen en la concentracin de calcio srico total. La hiperproteinemia est asociada con una
elevacin en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaa con disminucin de la
concentracin de calcio; sin embargo la concentracin de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se
altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH srico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la
acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestin de vitamina D aumenta el calcio ionizado a travs de la absorcin
de calcio y por la excrecin del fsforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor ms importante que controla
los niveles de calcio srico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma inica del calcio. La
concentracin del calcio srico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5
mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% est presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las
protenas.
El propsito de la presente prctica es determinar la concentracin srica de calcio total en personas
adultas normales y/o en estado patolgico por el mtodo colorimtrico directo
Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1
Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, cido clorhdrico
Solucin estndar de calcio: 8 mg/dl

Componentes
Blanco Standard Muestra
Muestra
--------20 ul
Standard
----20 ul
----Reactivo
1000 ul
1000 ul
1000 ul
Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (A muestra) y del
Standard (A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos
CALCULOS:
A muestra
mg/dl
C8
A standard
Suero o Plasma: 8,1 10,4 mg/dl
97
CUESTIONARIO:
1. Cul es la importancia biolgica del calcio en el ser humano?
2. Cules son las formas de calcio srico?
3. Cules son los factores que controlan los niveles de calcio srico?
4. Cul es la concentracin normal de calcio srico total?
5. Seale algunas alteraciones fisiolgicas y/o patolgicas que producen alteraciones de los niveles
sricos de calcio.
98
PRACTICA N 36
EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES
INTRODUCCION:
La membrana de los eritrocitos es semipermeable. Cuando stos son colocados en una solucin hipertnica
pierden lquido arrugndose y destruyndose hasta que se establece el equilibrio osmtico con el lquido
circulante. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solucin hipotnica aceptan lquido
(hinchndose) hasta que se alcanza el equilibrio osmtico o hasta que se rompen. Sin embargo en ciertas
anemias hemolticas adquiridas, la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotnicas disminuye. Aunque en
la prueba de la osmosis la ruptura de las clulas resulta de la alteracin de su forma y disminucin de su
resistencia a las fuerzas osmticas ms que a un cambio en la composicin de la clula o su osmolaridad, de all
que se emplee el trmino de fragilidad. Las clulas esferociticas se rompen ms rpidamente que las dems y de
hecho la prueba de la fragilidad osmtica puede ser considerada como un ndice ms sensible que la de la
magnitud de eritrocitos a la lisis en solucin hipotnica, es observada en la talasemia, anemia falciforme y en la
anemia hipocrnica ordinaria (ferropnica).
Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar
que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad, lo que se conoce
con el nombre de fragilidad osmtica de los eritrocitos (0,5 - 0,3%).
La presente prctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular
hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos, cuando estos son puestos en soluciones
hipertnica e hipotnica respectivamente.
Demostrar la fragilidad osmtica de los eritrocitos cuando stos son colocados en diversas soluciones de
CINa de diversas concentraciones.
EXPERIMENTO N1
- NaCl al 4,5%
- NaCl al 15%.
- NaCl al 8,5%
EXPERIMENTO N2
- Solucin salina amortiguada concentrada 10%.
- Cloruro de sodio (180 g).
- Na2P04 (27,31 g).
- NaH2 PO4.2H2O (4,86 g).
Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0 C (dura varios meses).
- Heparina
FRAGILIDAD OSMTICA DE LOS ERITROCITOS:
PRECAUCIONES:
1. La muestra de sangre debe ser obtenida con un mnimo de estancamiento y de trauma.
2. La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible despus de tomada.
3. Utilizar heparina como anticoagulante de eleccin. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos
que comprende la adicin de sales osmticamente activas son indeseables.
4. Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas, no deben hacer
contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar hemlisis.
99
PREPARACIN DE LAS DILUCIONES

Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba:
1. Conviene preparar una solucin al 1% a partir de la solucin concentrada al 10% y armar la siguiente serie
de tubos:
N de
NaCl al 1%
Agua destilada
% de NaCl
tubo
(ml)
(ml)
1
0.50
4.50
0.10
2
1.00
4.00
0.20
3
1.50
3.50
0.30
4
1.75
3.25
0.35
5
2.00
3.00
0.40
6
2.25
2.75
0.45
7
2.50
2.50
0.50
8
2.75
2.25
0.55
9
3.00
2.00
0.60
10
3.25
1.75
0.65
11
3.50
1.50
0.70
12
4.00
1.00
0.80
2. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre.
3. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas, con las precauciones sealadas, en tubos
heparinizados. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante
(plenamente oxidado).
4. Utilizando con precisin una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada, aadir 0,02 ml de
sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera. (Se sugiere que esta actividad
debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo).
5. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una
segunda hilera. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa
de trabajo).
6. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos.
Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.
7. LECTURA:
Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemlisis, objetivado por el color
rojizo plido que toma el lquido sobrenadante en los tubos centrifugados. Marcar el tubo donde la
hemlisis es completa (color rojo intenso).
Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0,40 y 0,45%
de NaCl).
EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA
INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS:
(Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular, por accin de soluciones
salinas de diferente concentracin).
Procedimiento:
Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano, con un algodn empapado en alcohol yodado.
Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estril pinchar el dedo.
Depositar una gota de sangre en cada una de las tres lminas porta-objeto.
Proceder de la siguiente manera:
Lminas (gotas)
Sangre del pulpejo de dedo
Solucin isotnica de CINa 8,5%
Solucin hipertnica de CINa 15%
Solucin hipotnica de CINa 4,5%
I
1
2
-
II
1
2
-
III
1
2
100
Mezclar bien.
Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las lminas.
Establecer las comparaciones morfolgicas y/o lisis de los glbulos rojos en relacin a cada tipo de soluciones
empleadas en cada caso.
IV.
CUESTIONARIO:
1. Si el test de fragilidad osmtica de los eritrocitos de un modo general evala la relacin entre el rea
superficial y el volumen de la clula, diga:
A. Cul es la relacin normal existente que permite la forma de disco bicncavo del eritrocito?
B. Cules son las relaciones normales existentes para la formacin de los esferocitos y de las clulas
tipo tiro al blanco? (target cell).
2. Segn observacin cuidadosa, seale la concentracin o porcentaje de NaCl del tubo en el cual
empez la hemlisis; as mismo el tubo en donde la hemlisis fue completa.
3. De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmtica de los eritrocitos, seale los porcentajes
de inicio y finalizacin (total) de la hemlisis.
4. Seale causas de alteraciones en la fragilidad osmtica.
101
PRACTICA N 37
EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES
INTRODUCCION:
Frecuentemente los antgenos se asocian con partculas que son demasiado grandes para formar soluciones o
suspensiones coloidales en los medios acuosos. Estas partculas (bacterias, eritrocitos, partculas de ltex, etc.),
pueden quedar suspendidas en una solucin salina y mezclarse con antisueros especficos.
Se denomina reaccin de aglutinacin al fenmeno en que la mezcla de las partculas de antgeno con los
antisueros especficos provoca una agrupacin de dichas partculas antignicas. Por lo general la aglutinacin
puede observarse a simple vista, pero en algunos casos se necesita el examen microscpico de la preparacin
estudiada.
Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de
aglutinacin. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijacin del antgeno en las
diversas clases de los anticuerpos. Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM, con cinco sitios
eficaces de fijacin de antgeno por cada molculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los
anticuerpos IgG con dos sitios de fijacin de antgeno por cada molcula, dirigidos contra el mismo antgeno. En
otras palabras, una baja concentracin de anticuerpos IgM produce una reaccin de aglutinacin cuya intensidad
es igual a la que se produce con una elevada concentracin de anticuerpos IgG.
El mecanismo de una reaccin de aglutinacin es semejante al de las reacciones de precipitacin; ambos tipos de
reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partculas de antgeno
formando complejos de antgeno anticuerpos.
La nica diferencia entre una reaccin de precipitacin y otro de aglutinacin es que los antgenos son molculas
pequeas en tanto que los antgenos aglutinantes estn asociados con partculas de mayor tamao. Al igual que
las reacciones de precipitacin las pruebas de aglutinacin requieren de un pH apropiado y de la moralidad de
amortiguadores salinos y debe existir una proporcin adecuada de antgeno respecto del anticuerpo.
Las pruebas de aglutinacin tienen muchos usos en el laboratorio clnico, tanto para medir antgenos como para
determinar las concentraciones de los anticuerpos. La concentracin del anticuerpo aglutinante se define como la
mayor dilucin de antisuero que aglutina el antgeno examinado, en las condiciones empleadas en la prueba. En
general las pruebas de aglutinacin son fciles de practicar, bastante reproducibles y sumamente sensibles. En
efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0.1 Ugr de anticuerpos/ml de suero
Las pruebas de aglutinacin se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar
transfusiones endovenosas en pacientes, para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor, en la superficie
de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs), en el diagnstico de las anemias hemolticas por
autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos), en
la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinacin en pacientes con mononucleosis infecciosa), en la Prueba de
Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella, Brucella, Pasteurella), en la
Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias, como el tifus endmico), en la
prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides), en pruebas inmunitarias del embarazo, etc.
En la membrana de los glbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antgenos
(antgeno de superficie o determinantes antgenos). Algunas personas son poseedoras de un antgeno de
superficie designado en forma arbitraria como antgeno A (eritrocitos tipo A); otras personas tienen otro tipo de
antgeno de superficie que se llama antgeno B (eritrocitos tipo B). Algunas personas pueden tener ambos
antgenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antgenos mencionados
(eritrocitos tipo 0 o H).
Los antgenos de superficie A y B son llamados tambin aglutingenos y se ha estimado que pueden haber hasta
un milln de sitios antignicos A o B en un solo hemate, aunque quiz sea ms realista una cifra de 5000,000. Los
antgenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos .
102
Por otra parte, en el suero existe tambin normalmente anticuerpos contra los antgenos A y B, llamados
isoaglutininas, porque producen aglutinacin de los glbulos rojos que poseen el correspondiente antgeno y
porque los antgenos son de origen humano (iso=de una misma especie). Estos anticuerpos (isoaglutininas) son
del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recin nacidos, pero aumentan con rapidez su titulacin
en los primeros meses de vida. Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas, se ha sugerido que las
inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niez pueden ser responsables de la
produccin de anti A o anti B. Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y
shigellas) tienen antgenos que reaccionan en forma cruzada con los antgenos humanos AB0 (H). De acuerdo con
esta hiptesis todos los recin nacidos estn expuestos a los antgenos A y B. Pero una persona del grupo A forma
slo anti B y no anti A, ya que su propio antgeno A, le ha conferido una tolerancia inmunolgica especfica hacia
l. La misma lgica explicara que una persona del grupo B forma slo anti A y no anti B.
Kit para identificar grupos sanguneos (Diagnstica).
Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B, previamente identificadas, con hepsrina como anticoagulante.
Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma.
Llevar los glbulos rojos sedimentados con suero fisiolgico por tres veces, para eliminar los anticuerpos
inespecficos adicionados a la superficie de los glbulos rojos.
Preparar una suspensin al 5% de glbulos rojos lavados, del tipo A y B en solucin salina fisiolgica.
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.
Identificacin de isoaglutininas en suero:
De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo, tomar una muestra de sangre sin
anticoagulante y obtener el suero por centrifugacin.
En cada extremo de una lmina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y
marcar 1 y 2 respectivamente.
Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y
mezclar.
Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y
mezclar.
Observar si hay o no aglutinacin de los glbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero

problema del estudiante y deducir el grupo sanguneo que posee.
CUESTIONARIO:
1. Utilizando los smbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinacin de los grupos
sanguneos ABO:
SUERO DEL GRUPO
O
B
A
AB
AB
(
(
(
(
)
)
)
)
ERITROCITOS DEL GRUPO

A
B
( )
( )
( )
( )
( )
( )
( )
( )
C
(
(
(
(
)
)
)
)
103
2. Diga usted Por qu ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como donadores universales
y personas de tipo AB como receptores universales?
3. En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero:
GRUPOS SANGUNEOS ABO
ANTIGENOS
EN LOS POS
ERITROCI.
(G. SANG)
A
B
O
AB
ANTICUER.
EN EL
SUERO
Anti
Anti
Anti
Anti
POSIBILIDADES DE TRANSFUSIN
Puede recibir
Puede donar
De
A
AyO
ByO
O
Todos (receptor
Universal)
4. Qu aplicaciones de las reacciones antgeno anticuerpo puede sealar?

5. Cul es el fundamento de las reacciones antgeno-anticuerpo?
A y AB
B y AB
Todos (donador
Universal)
AB

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Bioqumica

Dr. Jorge Garca Ventura y un

Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA

Amilasa salival 1.0% Solucin iodada

Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Sulfato de Cobre al 20%

Observar el aspecto y color producido e interpretar.

a. Pre incubar por dos minutos a 37 C.

e. Observar el color producido e interpretar los resultados.

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Armar el siguiente sistema:

Solucin de almidn pH 6.0 al 1%

Solucin de cloruro de sodio 0.1M

Colocar los tubos al bao de agua a 37 C por 5 minutos.

Agregar 1 ml. de enzima al tubo II.

Volverlos a colocar al bao de agua a 37 C durante 10 minutos.

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU)

Qu mtodos conoce para determinar la actividad enzimtica?

Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimtico y defnalos.

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Casena 0.1N (sal)

Mezclar al instante por inversin.

pK del cido Actico = 4.7

2. Cmo interpreta el resultado obtenido del punto isoelctrico?

Buffer de acetato 0.02M pH 5.0

Hidrxido de bario 0.3 N

solucin cprico alcalina

Mezclar: Separar el precipitado de protenas filtrando o centrifugando por 10 minutos.

DETERMINACIN DE PRODUCTOS DE LA REACCIN (azcar reductor)

Mezclar, agregar 7.0 ml. de agua destilada.

Clculos de la concentracin de los productos (hexosas)

Clculo de las Unidades (U)

CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos. Leer a 540 nm

Para el espectrofotmetro, el factor es.....................

COMPONENTES (en ml.)

COMPONENTES (en ml.)

Mezclar y continuar la incubacin por 20 minutos.

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS

CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIN ENZIMTICA POR LOS

II. REACTIVOS A UTILIZAR

Buffer fosfato 0.1 M pH EDTA 0.005 M

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Buffer fosfato pH 6.6

Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37C

MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos. Luego:

Realizar las lecturas en el espectrofotmtero a 540 nm en cada uno de los tubos.

Calcular la concentracin de sustrato (concentracin molar) en cada tubo de incubacin empleando la

Construir una grfica en el sistema de coordenadas teniendo como parmetros :

Para que sirve la ecuacin de Lineweaver?

Qu mtodos conoce para determinar el Km?

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente.

Anotar y luego agregar a los tubos II, III, IV.

Por qu el malonato es inhibidor competitivo?

Por qu el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo?

II. REACTIVOS A UTILIZAR

Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.

Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.

Buffer fosfato de sodio 0.1M pH: 7.4