Mtodos de precipitacin para limpieza de protenas

1. Precipitacin con sulfato de amonio (salting out).

Procedimiento general: La muestra de protena soluble debe de tener una
concentracin aproximada de 1 mg/ml en un buffer que contenga como mximo
50 mM de EDTA. Lentamente agregar la solucin de sulfato de amonio hasta
obtener el porcentaje de saturacin deseado, agitar de 10 a 30 min. Centrifugar
y desechar sobrenadante.
Limitaciones: Muchas protenas permanecen solubles a altas concentraciones
de sales, por lo que no se recomienda este mtodo cuando se requiere que el
total de las protenas este representado. Est mtodo puede ser empleado para
prefraccionamiento o enriquecimiento de alguna fraccin de inters. Las
cantidades residuales de sulfato de amonio pueden interferir con el
isoelectroenfoque y tiene que ser removido. Muchos contaminantes potenciales
(ej. cidos nuclicos) permanecern en solucin.
2. Precipitacin con TCA (cido tricloroactico).
Procedimiento general: Aadir el TCA necesario al extracto total de protenas
para obtener una concentracin final de 10-20 % de TCA. Dejar precipitar en
hielo for 30 min. Centrifugar y lavar la pastilla de protenas con acetona o etanol
preenfriado a -20 C para retirar el TCA residual.
Limitaciones: Las protenas precipitadas con TCA se pueden volver difciles de
resuspender o pueden no resuspenderse completamente. Los residuos de TCA
deben ser removidos con lavados exhaustivos con acetona o etanol. Una
exposicin prolongad a esta muy bajo pH puede causar cierta degradacin de
protenas o modificarlas.
3. Precipitacin con acetona:
Procedimiento general: Aadir al menos 3 volmenes de acetona preenfriada a
-20C al extracto. Dejar precipitar a -20C al menos 2 h. Recuperar las protenas
precipitadas por centrifugacin.
Limitaciones: Muchos compuestos que son solubles en solventes orgnicos (ej.
Detergentes, lpidos, etc.) pueden permanecer en solucin.
Av. Instituto Politcnico Nacional 2508 Col. San Pedro Zacatenco,
C.P.07360 Mxico, D.F. Apartado postal 14-740, 07000 Mxico, D.F.

4. Precipitacin con TCA en acetona.

Procedimiento general: Preparar una solucin de TCA al 30% en acetona.
Mezclar en partes iguales con la muestra. Para lisados de clulas, mezclar la
muestra con 10% de TCA en acetona; puede agregarse tanto 0.07% de 2mercaptoetanol o 20 mM de DTT. Dejar precipitar al menos 1 h a -20C.
Centrifugar para obtener las protenas precipitadas y lavar exhaustivamente con
acetona preenfriada a -20C. Eliminar restos de acetona dejando secar la pastilla
con aire o liofilizando.
Limitaciones: Aunque es un mtodo mas efectivo que el de acetona o TCA por
separado, presenta las mismas limitaciones que le mtodo de TCA puro.
5. Precipitacin metanol cloroformo:
Procedimiento general: En un tubo de centrfuga de 1.5 ml colocar una alcuota
de 150 l de muestra mas 600 l de metanol, mezclar con vortex. Aadir 150 l
de cloroformo, mezclar con vortex. Aadir 450 l de agua y mezclar con vortex.
Centrifugar a 12000 rpm por 5 min. Remover la fase acuosa (parte superior)
dejando intacto el disco de precipitado blanco que se forma entre las dos fases.
Aadir 450 l de metanol y mezclar con vortex. Centrifugar a 12000 rpm por 5
min. Descartar sobrenadante y secar la pastilla con aire o en centrfuga de vaco.
Limitaciones: Aunque este mtodo es muy efectivo para limpiar la muestra de
lpidos y plantas, puede causar cierta degradacin de ciertas protenas.

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