Extraccin de Material gentico procariota (plasmdico y cromosmico) de una

cepa de Bacillus thuringiensis y eucariota de tejido (hgado y corazn) de gallo

domstico (Gallus gallus domesticus) y su cuantificacin por medio de
electroforesis y espectrofotmetro Nanodrop 100.
Ospina Leyton Valentina 1 y Rubio Robledo Juanita 2
Estudiantes de Biologa Marina 1 y Ambiental 2 Universidad Jorge Tadeo Lozano1, 2
valentina.ospinal@utadeo.edu.co1 juanita.rubior@utadeo.edu.co2

Resumen
Se realiz una extraccin de material gentico (ADN ARN) de clulas eucariotas de
tejido heptico y coronario de pollo y de clulas procariotas (cromosmico y
plasmdico) de Bacillus thuringensis que se separ y cuantifico por medio de
electroforesis en gel de agarosa y espectrofotometra por Nanodrop 1000. Se extrajo un
total de 43 muestras (dos por cada estudiante del curso) 11 resultado de la extraccin de
cidos Nucleicos (AN) plasmdico y 11 cromosmico, y 21 muestras de AN de clulas
eucariotas, 11 de corazn y 10 de hgado, obteniendo desplazamiento de ADN y ARN
en las muestras corridas en la electroforesis y un promedio de concentracin de AN de
144,67 ng/L para AN plasmdico, 316,75 ng/L para AN cromosmicos bacterianos,
3007,43 ng/L para AN de clulas coronarias y 3901,85 para AN de clulas hepticas,
los anteriores resultados con ndices de pureza que sobrepasan o estn por debajo de los
valores ptimos recomendados por la literatura en un 56%. Los valores de
concentracin ms ptimos para las primeras extracciones fueron los obtenidos LA (394
ng /L con una pureza de 1,99) para las extracciones de AN plasmdico fue GB (266,5
ng /L con pureza de 1,95), para las de tejido coronario fueron ML (3302 ng /L con
pureza de 1,9) y SM (3873,3 con pureza de 1,82) y para las extracciones de tejido
heptico, DM (2439,4 ng /L con pureza de 1,8). Se pudo observar la importancia de la
tcnica, destreza o experiencia de quienes realicen estos procedimientos para obtener
valores optimos y coherentes.
Palabras Claves: Extraccin, Cuantificacin de ADN, Electroforesis en Gel de
Agarosa, espectrofotometra, Nanodrop, concentracin, pureza.

Extraction of genetic material (DNA - RNA) of prokaryotic cells (chromosomal and

plasmid) and of Bacillus thuringiensis and Eukaryotic cells of liver and coronary
tissue of chicken (Gallus gallus domesticus) and their separation and quantified by
electrophoresis in agarose gel and spectrophotometry Nanodrop UN 1000.
total aid of 43 samples (two per student Course) 11m result of nucleic acid extraction
(AN) plasmid and chromosomal was extracted 11, 21 and AN samples of eukaryotic
cells, Heart 11 and 10 liver, obtaining displacement of DNA and RNA in the samples
run in electrophoresis and average concentration NA of 144.67 ng / l for a plasmid,
316.75 ng / l bacterial chromosome paragraph AN, 3007.43 ng / l a coronary paragraph

of paragraph 3901.85 an cells and liver cells, the above results with purity rates are
exceeding or below the recommended literature 56% optimal values. Concentration
Values More OPTIMOS for First Extractions Were those obtained LA (394 ng / l with a
purity of 1.99) for extractions WAS A plasmid GB (266.5 ng / l with a purity of 1.95),
the tissue for coronary Were ML (3302 ng / l with a purity of 1.9) and SM (purity
3873.3 1.82) for extractions and liver tissue, DM (2439.4 ng / l with purity 1.8). One
could observe the importance of technique, skill or experience of those who made
THESE PROCEDURES para Get Values are optimal and consistent.
Keywords: Extraction, quantification of DNA Gel Electrophoresis Agarose,
spectrophotometry, Nanodrop, concentration, purity.

Introduccin
La extraccin de material gentico es rutinaria y fundamental para la biologa
molecular, en muchos procedimientos biotecnolgicos representan el primer paso para
el anlisis molecular y si este no se realiza exitosamente, posteriores trabajos no podran
realizarse; existen mtodos muy sencillos y econmicos que permiten obtenerlo con un
alto grado de pureza (Saunders et al, 1999; Rodrguez, 2003). Este proceso consiste en
tres pasos principales, (1) la lisis celular, donde se rompen las membranas de las clulas
por medio de enzimas y/o detergentes, (2) la desproteinizacin, que consiste en
desnaturalizar las protenas utilizando enzimas proteolticas o compuestos qumicos que
las degradan y por ultimo (3) la separacin o precipitacin por medio de sales y
alcoholes para obtener un pellet que representa el material gentico de la clula (Zavala,
2005). Igualmente tambin existen kits que emplean diferentes tcnicas, incluyendo
tratamiento con calor, procedimientos de columna de centrifugacin, latidos de grano y
perlas magnticas que suelen optimizar la extraccin en tiempo y volumen de muestra
(Molsa et al, 2016).
Una vez extrado el material, se realiza la cuantificacin y anlisis de la calidad de las
molculas obtenidas, la calidad, se analiza por electroforesis en gel de agarosa que
consiste en la separacin de fragmentos del material obtenido en la muestra y su
visualizacin para as analizar caractersticas como el tamao de los fragmentos, la
concentracin, la entereza y otros, adems los fragmentos de inters se pueden purificar
a partir del gel y utilizarse para diferentes propsitos posteriores (clonacin,
secuenciacin, mutagnesis, fusin con otros fragmentos, utilizacin como sondas, etc.)
(UNQ, 2010; Fierro, 2010). Otro mtodo, tambin muy utilizado es el anlisis de la
absorcin UV por espectrofotometra, ya que los nucletidos poseen mximos de
absorcin alrededor de 260 nm. Por medio de ste se obtiene una estimacin simple y
precisa de la concentracin de una muestra, pero slo si sta se encuentra pura, sin
contaminacin significativa de protenas o solventes orgnicos que absorben a
longitudes de onda cercanas ya que se alterarian los resultados (UNQ, 2010), el
espectro- fotmetro NanoDrop 1000 (ND) es una forma optimizada de
espectrofotometra en la que solo se necesitan 1 1,5 l de muestra ya que se pipetea

directamente sobre la superficie de medida, mientras que el espectrofotmetro

convencional necesita entre 1 y 2 ml de muestra para ocupar el volumen mnimo de la
celda y analizarla (Rodriguez, 2014).
El objetivo de estas prcticas fue introducir a los estudiantes del curso de biologa
molecular de la universidad Jorge Tadeo Lozano a los procedimientos bsicos del curso:
extraccin de material gentico de clulas eucariotas y procariotas, su posterior
cuantificacin y anlisis.
Metodologa
Se extrajo material gentico bacteriano cromosmico y plasmidico de Bacillus
thuringiensis y de tejido animal (hgado y corazn), se corri por eectroforesis en gel
de agarosa y se determin la concetracion de AN por espectro-fotometra Nanodrop
1000. Estas prcticas se realizaron en el laboratorio de biologa molecular de la
universidad Jorge Tadeo lozano siguiendo la gua propuesta en el curso.

Extraccin de ADN bacteriano cromosmico de Bacillus thuringiensis

En un tubo eppendorf de 1.5 ml, se adiciono 400 l de solucin buffer TE y un inoculo

de la bacteria, se homogenizo con vortex y se agreg 38 l de SDS. Luego para
realizaar la desproteinizacion se aadi 10 l de proteinasa K y se calent en bao
mara a 60C durante 10 minutos, seguido de una centrifugacin a 14.000 rpm durante 5
minutos, el sobrenadante obtenido fue transferido a otro tubo, y posterior a esto se
adiciono 400 l de cloroformo isoamlico (24-1) homogenizando las fases formadas
(orgnica e inorgnica) usando de nuevo vortex por 5 minutos, se centrifugo a 14.000
rpm durante 5 minutos, con una pipeta de 100-1000 l se extrajo la fase acuosa y se
transfiri a otro tubo, posterior a esto se le adiciono 20 l de NaCl 5 M,
La precipitacin de ADN se realiz adicionando 800 l de etanol absoluto (resuspendi
4 veces) y se centrifugo a 14.000 rpm durante 10 minutos, se desech el pellet, y al
sobrenadante se le adiciono 400 l de etanol 70%, nuevamente se centrifugo durante 10
minutos a 14.000 rpm. Finalmente, se retir el etanol y se dej secar a temperatura
ambiente, ya seco el pllet de ADN, se rehidrato en 50 l de agua destilada desionizada
y se almaceno a 20C.

Extraccin de ADN Plasmdico de Bacillus thuringiensis

Se realiz una lisis alcalina la cual consisti en resuspender el pellet en 100 l de la

solucin I (50 mM de Glucosa, 25 mM de TrisHCl pH 8.0 y 10 mM de EDTA pH 8.0) y
homogenizar por inversin (tres o cuatro veces), se le adiciono 200 l de la solucin II (
0,2 N NaOH y SDS al 1% (W/V)) mezclando por inversin (5 veces) se mantuvo en frio
por tres minutos y se adiciono 150 l de la solucin III (5 M de acetato de potasio, 11.5
ml de cido actico glacial y 28,5 ml de agua) dispersndola por inversin. El tubo se
dispuso en hielo 5 minutos y se centrifugo a mxima velocidad por 5 minutos a 4C,
luego se transfiri el sobrenadante a un tubo nuevo y se prosigui adicionando un

volumen de 400 l de cloroformo alcohol isoamlico, se mezclaron las fases (orgnica y

acuosa) por vortex y se centrifugo la emulsin a 14.000 rpm por dos minutos a 4C. Se
transfiri la capa superior acuosa a un tubo nuevo, y se le adiciono 2 volmenes de
etanol absoluto a temperatura ambiente, se dej reposar la mezcla por 2 minutos, se
realiz una centrifugacin a mxima velocidad durante 5 minutos a 4C para recoger el
precipitado de cidos nucleicos, se removi el sobrenadante por aspiracin y se dej
invertido el tubo sobre el papel.
Posterior a esto se le adiciono al pellet 1 ml de etanol al 70% y se homogenizo por
inversin, se centrifugo por 2 minutos a 4C y se removi el sobrenadante, dejando
secar el pellet a temperatura ambiente (5-10 minutos). Se disolvieron los cidos
nucleicos en 30 l de agua (pH 8.0) y se realiz vortex suave por 10 segundos para
almacenar el producto de ADN a 20C.

Extraccin de ADN de tejido (hgado y corazn de pollo)

Se pesaron 5 gr de tejido y se depositaron en un mortero con nitrgeno lquido,

macerando hasta pulverizar la muestra, posteriormente en un tubo eppendorf de 1.5 ml
se mezcl 600 l de solucin de lisis (10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA y 0,1 (W/S)
de SDS) con 50 mg de la muestra y se realiz vrtex durante 20 s, se adicionaron 5 l
de proteinasa K y se incubo en bao mara durante 30 minutos a 80C. Una vez
finalizado el tiempo de incubacin se dej enfriar a temperatura ambiente y se
centrifugo durante 3 minutos a 14.000 rpm, se transfiri el sobrenadante a un tubo
nuevo y se prosigui, adicionando un volumen de fenol-cloroformo alcohol isoamlico
(24:1) homogenizando por inversin, nuevamente se centrifugo por 3 minutos a 14.000
rpm,
Se sac cuidadosamente el tubo de la microcentrfuga y en otro tubo se adiciono la fase
acuosa. Se agregaron 200 l de acetato de amonio 10 M y homogenizo por inversin,
seguidamente, se centrifugo por 1 minuto a 14.000 rpm y se adicionaron 600 l de
etanol absoluto, mezclando por inversin 8 veces y nuevamente se realiz una
centrifugacin a 14.000 rpm por 10 minutos. Luego se elimin el sobrenadante y se
agreg sobre el pllet 600 l de etanol al 70%, homogenizndolo por inversin 5 veces.
Por ltimo se centrifugo a 14.000 rpm durante 5 minutos, descartando el sobrenadante
y permitiendo que el pellet se secara por 5 minutos a temperatura ambiente; se disolvi
el pellet de ADN en 30 l de agua destilada y se almaceno a 20C

Electroforesis en geles de Agarosa

Se pesaron 0.4 gr de agarosa y se mezcl en un erlemeyer con 40 ml de buffer TBE 0,5

X, posteriormente se calent en el microondas por 20 s. Una vez disuelta la agarosa se
aadieron 2 l de bromuro de etidio y se mezclaron, luego se ensamblo en la cmara
para el corrido, incluyendo el peine dejando gelificar la mezcla a temperatura ambiente.
Una vez gelificado, se extrajo el peine cuidadosamente y se deposit en la cmara
electrofortica y se cubri el gel por completo con buffer TBE 0.5 X. Luego se mezcl

en un pedazo de parafilm 8 l de ADN extrado con 2 l de azul de bromofenol (tampn

de carga) y se recogi con la pipeta los 10 l de la mezcla para servirlo en uno de los
pozos del gel. Se prendio la cmara de electroforesis y se corri por 20 minutos a una
corriente continua de 100 V, se observaron las bandas con luz UV.

Cuantificacin de ADN por Nanodrop 1000.

Se realiz una dilucin del DNA obtenido disolviendo 1 l de ADN en 4 l de agua

destilada. Una vez realizada la dilucin, se conect el Nanodrop para cuantificar el
ADN con el programa ND-1000 V3.7.1. Se seleccion la opcin Nucleid Acid, y se
limpi el lector. Se deposit 1 l de agua destilada en el centro del lente y se oprimi el
botn Blank, el cual dio el punto de partida para el anlisis de las muestras. Para realizar
la toma de datos se debe homogenizar la muestra pipeteando varias veces, y se debe
adicionar en el centro del lente 1 l de la muestra, procediendo a leer el resultado,
dando inicio a la medicin. Finalizada la medicin, el programa mostro diferentes
valores de absorbancia (A260-A280) y de concentracin de ADN en ng/l.
Resultados
La cuantificacin de ADN total bacteriano de cepas de Bacillus thuringensis y de tejido
heptico y coronario de pollo, se realiz mediante electroforesis en gel de agarosa, y
espectrofotometra por Nanodrop 1000.
TM

Electroforesis con gel Agarosa del ADN cromosmico y Plasmdico

Se obtuvo un total de 43 muestras (dos por cada estudiante del curso) 11, resultado de
la extraccin de (AN) plasmdico y 11 cromosmico. Al correr las muestras en gel de
agarosa se evidencio desplazamiento de ADN y ARN como se puede observar en las
figuras 1 y 2. En cuanto al ADN cromosmico (figura 1) cualitativamente MA y LA
obtuvieron las mayores concertaciones, mientras que SZ tambin obtuvo una fuerte
concentracin pero de ARN y DS la obtuvo de ADN plasmdico ya que como tiene
mayor peso molecular se desplaz ms rpido. En cuanto a las muestras de ADN
plasmdico (figura 2), cualitativamente DS, PA y LA obtuvieron la extraccin ms
concentrada de ADN plasmidico.

Figura 1. Electrofofresis en gel de Agarosa de ADN cromosomico bacteriano de Bacillus thuringensis

Figura 2. Electrofofresis en gel de Agarosa de ADN plasmidico bacteriano de Bacillus thuringensis

Electroforesis con gel de Agarosa de ADN de Tejido animal (Hgado y Corazn de
Pollo)
De las 43 muestras 11 fueron de de hgado (figura 3) y 10 de corazn (figura 4) en
donde se observa que todos los individuos obtuvieron ADN, en la figura 3 se observa la
alta concentracin de arn en las muestras de hgado, mientras en cuanto a ADN , DM,
DS y LR son los que aparentemente obtuvieron ms concentracin mientras en la figura
4 se puede observar la baja concentracion de ARN pero la notoria presencia de ADN en
todas las muestras siendo ML y LA los que tienen concentraciones aparentemente mas
altas.

Figura 3 . Electroforesis en gel de Agarosa ADN de Tejido de higado.

Figura 4 . Electroforesis en gel de Agarosa ADN de Tejido de corazn.

Cuantificacin de ADN cromosmico y plasmidico de Bacillus thuringensis, y de

tejido eucariota por NanoDrop 1000.
En las grficas 1 y el anexo 1 se muestran los datos obtenidos por medio de NanoDrop
1000 en cuanto a la concentracin de AN y la pureza del ADN. Podemos observar como
las concentraciones de AN aumentan segn la complejidad, de un plsmido a un
cromosoma bacteriano, al material gentico de clulas eucariotas.
Se obtuvo un promedio de concentracin de AN de 144,67 ng/L para AN plasmdico,
316,75 ng/L para AN cromosmicos bacterianos, 3007,43 ng/L para AN de clulas
coronarias y 3901,85 para AN de clulas hepticas, los anteriores resultados con ndices

de pureza que sobrepasan o estn por debajo de los valores ptimos recomendados por
la literatura (Desjardins, 2010) en un 56%.

Grafica 1. Relacin de la concentracin de ADN bacteriano (cromosmico y plsmido de Bacillus

thuringiensis) y eucarionte (hgado y corazn de pollo)

Conce ntracin de
AN (ng /L)

Concentracin (ng /L)

12000
10000
8000
6000
4000
2000
0

Plasmidico

Cromosomico

Higado

Corazon

Discusin de resultados
Los datos obtenidos por el anlisis cualitativo de la prueba de electroforesis en cuanto a
la concentracin del material gentico, son coherentes con los obtenidos con Nanodrop
ya que las extracciones con ms concentracin (grafica 1) son las que cualitativamente
parecan tener ms material en la electroforesis. No se pudieron obtener datos
numricos con esta tcnica ya que no se us un control de concentracin en el gel de

agarosa. Las muestras con material de estructura ms simple tienen valores menores de
concentracin a diferencia las ms complejas (Tejidos) (Harwood, 1996),, siendo el
hgado el que presento mayor concentracin de cidos nucleicos y como se puede
observar en la figura 4 esta concentracin de debe tambin al ARN debido a la gran
cantidad de procesos metablicos en los que este rgano est involucrado (Mamani et
al, 1999).
En la extraccin del material gentico, AN, no se obtuvo solamente ADN, lo cual se
debe a que en el procedimiento no se utiliz ninguna enzima ni producto que degradara
las molculas de ARN, de este modo se present un porcentaje significativo de este que
intervino en los valores de concentracin. Esto se sabe ya que los acidos nucleicos
absorben a una longitud de onda de 260 nm; por lo que al realizar la medicin de la
absorbancia de las muestras, probablemente se obtuvo datos de la concentracin del
ARN (Delvin, 2004).
Las concentraciones del ADN obtenido por la cepa bacteriana se pudo ver influenciada
por la inoculacion ya que no todos los estudiantes tuvieron las mismas cantidades de
esta a la hora realizar la extraccin.
Este tipo de procedimientos requieren de mucha tcnica y destreza debido a que la falta
de experiencia puede alterar mucho los datos, como en este caso los estudiantes no
tenan experiencia con este tipo de procedimientos, los resultados obtenido en la pureza,
determinan que tan bien tomada estuvo la muestra y se obtuvo que el 56% de los datos
sobrepasan o disminuyen el rango de pureza, donde valores menores a 1,8 indican
contaminacin por protenas y valores superiores a 2 ARN , si se hubiese querido
evitar esto se hubiera aplicado a las muestras una ARNasa (Okuda,2013).

Bibliografa
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Zavala, 2005 Manual de Tcnicas Bsicas

de Biologa Molecular. Volumen 7 de Serie
manuales / Universidad Autnoma de
Yucatn. Pag 100-1004

Anexo 1.
Tabla Resultados obtenidos por cuantificacin con Nanodrop 1000 de la extraccin de
cidos Nucleicos (AN) plasmdicos y cromosmicos de Bacillus thuringiensis y AN de
clulas eucariotas de tejido de corazn e Hgado

MUESTRA
PLASMIDICO

CROMOSOMICO

CORAZON

HIGADO

EXTRACCION

EM

LB

CS

AO

SM

LA

SS

PA

ML

DS

LH

Pureza

1,94

2,05

2,21

2,05

2,01

1,99

2,07

2,1

1,92

1,76

1,9

Concentracin
ADN (ng /L)

13,1

333,65

21,25

41,11

129,9

394

421,9

118,25

43,35

209,75

EXTRACCION

JP

JR

MR

GB

LR

DM

CC

SZ

MA

Pureza

2,14

2,06

2,02

1,95

2,12

2,17

2,01

2,1

2,06

Concentracin
ADN (ng/L)

46,55

148,65

343,95

266,5

878,6

12,6

151,7
5

849,5

152,7

EXTRACCION

EM

LB

CS

GB

SM

LA

SS

SZ

ML

Pureza

1,88

1,8

1,16

1,82

1,7

0,95

1,7

1,9

Concentracin
ADN (ng/L)

3559,8

2866,7

355,8

111,9

2944,25

3302

EXTRACCION

JP

JR

CS

AO

LR

DM

CC

PA

MA

DS

LH

Pureza

1,25

1,65

1,5

1,54

1,46

1,8

1,43

1,06

1,87

1,0

2856

5380,2
5

47,7

3330,9

2439,4

5387

Concentracin
AN (ng/L)

5424,05

5561,45 3873,3 4491,75

5304,05 5487,95 1868,7 5394