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DEPARTAMENTO DE INGENIERA
BIOQUMICA
LABORATORIO DE BIOINGENIERA I
EQUIPO: 4
PROFESORES:
- Dra. Nora Ruz Ordaz
- M. en C. Alejandro Hernndez Esteves
- M. en C. Mara Elena Mondragn Parada
Mxico, D.F
1. OBJETIVOS
2. MEMORIA DE CLCULO
Determinacin de masa celular
Mtodo espectrofotomtrico
Se procedi a realizar la medicin de masa celular mediante el empleo de un
espectrofotmetro aplicando la siguiente formula:
Biomasa= Absorbancia600 nmFactor de Dilucin0.7
Ejemplo
Para el grupo 7IM2 en cultivo por lote, se tienen los siguientes datos:
Muestra 1
A600nm =0.2
Factor de Dilucin= 1
Biomasa en muestra 1
gcel
=( 0.2 ) x ( 1 ) x ( 0.7 )=0.14
( g cel
)
L
L
Empleo de filtros
Se procedi a realizar la cuantificacin de masa en cierto volumen de filtrado
empleando las siguientes formulas:
Masa Celular ( g ) =
Biomasa
( g )1000
( gL )= masacelular
volumen ( mL )
Ejemplo
Para el mismo grupo (7IM2), se tienen los siguientes datos:
Peso de filtro + masa celular= 24.5 mg
Peso de filtro=23.4 mg
Volumen empleado= 5 mL
Biomasa muestra 1=
( 24.523.4 mg )1 g
=0.0011 g
1000 mg
0.0011 g1000 mL
gcel
=0.22
1 L5 mL
L
Mtodo espectrofotomtrico
Se procedi a calcular la concentracin de sustrato mediante el empleo de la
siguiente formula:
Concentracin de sustrato
muestra
x Factor de Dilucin x Concentracin del conrol
( gL )= Absorbanciade
Absorbancia del control
Ejemplo
Para el mismo grupo (7IM2) se tienen los siguientes datos:
Absorbancia de muestra=0.37
Absorbancia de control=0.05
Factor de Dilucin=10
Concentracin de control=0.1 g/L
concentracin de sustrato
g
g
x 10 x 0.1 =7.4
( gL )= 0.37
0.05
L
L
Clculo de mx
Ejemplo:
g cel
x x 8x 1
L
g cel
Y =
=
=2.8
s S1 S8
gs
g sust
(7.46.6)
L
( 2.380.14 )
s
Ejemplo
g sus
(1.22371.0)L
L
g sus
g sus
0.0278
1.2237 L 0.0063
1.0 L +
L
L
x ( 9.85072.8 ) g cel
Y =
s
60
)(
Ejemplo:
Rx=
x 8x 1
=
( 70 ) h
( 2.380.14 )
7h
g cel
L
=0.32
g cel
Lh
Ejemplo
Rx=
( 9.85072.8 ) g cel
X edad 4X edad 1
g cel
=
=1.4404
Edad 4 Volumen edad 5
4 h 1,2237 L
L
3. RESULTADOS
4.
5. Determinacin de biomasa
6.
7.
8. Tabla 1. Determinacin de biomasa en cultivo por lote del grupo 7IM2.
9.
10.
M
11.
H
12.
E
13.
A
14.
F
15. P
e
s
o
16.
V
17. P
e
s
o
18. M
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s
a
d
e
d
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m
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m
b
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m
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m
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n
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l
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m
p
+
b
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o
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i
f
20.
Bi
21.
(g
22. Bi
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m
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po
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so
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an
cia
ex
pr
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s
a
(
m
g
)
(
m
g
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c
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de
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23. (g
cel
/L)
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s
24.
1
25.
1
26.
0
27.
0
28.
1
29. 2
3
.
4
30.
5
31. 2
4
.
5
35.
2
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1
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1
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0
39.
1
40. 2
3
.
7
41.
4
42. 2
4
.
7
19. (
g
)
32. 0
.
0
0
1
1
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.
0
0
33.
0.
34. 0.
14
44.
0.
45. 0.
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2
46.
3
47.
1
48.
2
49.
0
50.
1
51. 2
3
.
7
52.
5
53. 2
5
.
6
57.
4
58.
1
59.
3
60.
0
61.
1
62. 2
3
.
2
63.
5
64. 2
6
.
3
68.
5
69.
1
70.
4
71.
0
72.
1
73. 2
2
.
5
74.
5
75. 2
6
.
5
79.
6
80.
1
81.
5
82.
0
83.
1
84. 2
2
.
9
85.
5
86. 2
8
.
6
90.
7
91.
1
92.
6
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0
94.
1
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2
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5
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.
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76. 0
.
0
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87. 0
.
0
0
5
7
98. 0
.
0
0
8
3
55.
0.
56. 0.
35
66.
0.
67. 0.
45
5
77.
0.
78. 0.
65
8
88.
1.
89. 1.
03
6
99.
1.
100.
1.68
101.
8
112.
113.
114.
115.
116.
117.
102.
1
103.
7
104.
0
105.
1
106.
23.
1
107.
5
108.
34.
9
109.
0.0
1
1
8
110.
2.
127.
Ma
s
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129.
Bi
111.
2.38
118.
119.
M
120.
H
121.
E
122.
A
123.
F
124.
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m
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125.
V
126.
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b
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130.
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131.
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g
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m
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132.
(g cel
/L)
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c
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o
s
133.
1
144.
2
134.
1
145.
1
135.
0
146.
0
136.
0
147.
0
137.
1:
148.
1:
138.
23.0
149.
23.5
139.
5
150.
5
140.
30.6
151.
33.7
128.
(g)
141.
0.0
0
7
6
152.
0.0
142.
1.
153.
2.
143.
1.645
154.
2.1
155.
3
166.
4
177.
5
156.
1
167.
1
178.
1
157.
1
168.
1
179.
2
158.
0
169.
0
180.
0
159.
1:
170.
1:
181.
1:
160.
23.4
171.
23.6
182.
22.7
161.
5
172.
5
183.
5
162.
36.4
173.
38.8
184.
39.4
1
0
2
163.
0.0
1
3
174.
0.0
1
5
2
185.
0.0
1
6
7
164.
2.
175.
3.
186.
3.
165.
2.66
176.
2.8
187.
2.8
188.
189.
190. Tabla 3. Determinacin de biomasa en cultivo por lote alimentado del grupo 7IM1.
191.
192.
M
193.
H
194.
E
195.
A
196.
F
197.
Pes
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d
e
m
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198.
V
199.
Pes
o
d
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m
e
200.
Ma
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c
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202.
Bi
203.
(g
204.
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205.
(g cel
/L)
201.
(g)
206.
1
207.
1
208.
0
209.
0
210.
1:
211.
22.7
212.
5
213.
39.4
217.
2
218.
1
219.
1
220.
0
221.
1:
222.
22.9
223.
3
224.
36.2
228.
3
229.
1
230.
2
231.
0
232.
1:
233.
23.2
234.
3
235.
40.4
239.
4
240.
1
241.
3
242.
0
243.
1:
244.
22.8
245.
3
246.
45.4
250.
5
251.
1
252.
4
253.
0
254.
1:
255.
22.8
256.
3
257.
49.8
214.
0.0
1
6
7
225.
0.0
1
3
3
236.
0.0
1
7
2
247.
0.0
2
2
6
258.
0.0
2
7
215.
3.
226.
4.
237.
5.
248.
7.
259.
9
216.
2.8
227.
4.287
5
238.
5.04
249.
7.175
260.
8.05
262.
263. Tabla 4. Determinacin de la concentracin de sustrato residual en cultivo por lote del grupo 7IM2.
264.
M
265.
V
266.
D
267.
A
268.
A5
275.
0.
269. C
onc
entr
aci
n de
cont
rol
(g/L
)
276. 0
.1
270. C
onc
entr
aci
n de
sust
rato
(g/L
)
277. 7
.4
271.
1
272.
2
273.
1
274.
0
278.
2
279.
2
280.
1
281.
0
282.
0.
283. 0
.1
284. 7
285.
3
286.
2
287.
1
288.
0
289.
0.
290. 0
.1
291. 7
.4
292.
4
293.
2
294.
1
295.
0
296.
0.
297. 0
.1
298. 8
299.
5
300.
2
301.
1
302.
0
303.
0.
304. 0
.1
305. 7
.3
306.
6
307.
2
308.
1
309.
0
310.
0.
311.
312. 1
.38
0
.1
313.
7
314.
2
315.
1
316.
0
317.
0.
318. 0
.1
319. 4
.2
320.
8
321.
2
322.
1
323.
0
324.
0.
325. 0
.1
326. 6
.6
327.
328.
329. Tabla 5. Determinacin de la concentracin de sustrato residual en cultivo por lote del grupo 7IM1.
330.
331.
M
332.
V
333.
D
334.
A
335.
A5
338.
1
339.
2
340.
1
341.
0
342.
0.
336. C
onc
entr
aci
n de
cont
rol
(g/L
)
343. 0
.1
345.
2
346.
2
347.
1
348.
0
349.
0.
350. 0
.1
352.
3
353.
2
354.
1
355.
0
356.
0.
357. 0
.1
359.
360.
361.
362.
363.
364. 0
337. C
onc
entr
aci
n de
sust
rato
(g/L
)
344. 3
.797
351. 2
.689
358. 2
.056
365. 0
4
366.
5
2
367.
2
1
368.
1
0
369.
0
0.
370.
0.
.1
371. 0
.1
.949
372. 0
.006
3
373.
374.
375.
376. Tabla 6. Determinacin de la concentracin de sustrato residual en cultivo por lote alimentado del grupo
7IM1.
377.
M
378.
V
379.
D
380.
A
381.
A5
384.
1
385.
2
386.
1
387.
0
388.
0.
382. C
onc
entr
aci
n de
cont
rol
(g/L
)
389. 0
.1
391.
2
392.
2
393.
1
394.
0
395.
0.
396. 0
.1
398.
3
399.
2
400.
1
401.
0
402.
0.
403. 0
.1
405.
406.
407.
408.
409.
410. 0
383. C
onc
entr
aci
n de
sust
rato
(g/L
)
390. 0
.006
3
397. 0
.003
7
404. 0
.022
7
411. 0
0.
412.
5
413.
2
414.
1
415.
0
416.
0.
.1
417. 0
.1
.025
3
418. 0
.027
8
419.
420.
421.
422. Tabla 7. Logaritmos de la biomasa obtenidos a intervalos de una hora por diferencia de pesos y por
absorbancia.
423. T
iem
po
424. (
h)
429. 0
432. 1
435. 2
425. L
nX
426. (
Pes
os)
430. 1.5
141
277
3
433. 1.3
862
943
6
436. 0.9
675
840
427. L
nX
428. (
Abs
)
431. 1.9
661
128
6
434. 1.7
037
485
9
437. 1.0
498
221
438. 3
441. 4
444. 5
447. 6
450. 7
453.
454.
3
439. 0.4
780
358
442. 0.2
231
435
5
445. 0
.13
102
826
448. 0
.50
681
76
451. 0
.85
866
162
2
440. 0.7
874
578
6
443. 0.4
185
503
5
446. 0
.03
536
714
449. 0
.51
879
379
452. 0
.86
710
049
f(x) = 0.41x - 2
R = 0.99
Tabla 8. Parmetros cinticos del cultivo por lote del grupo 7IM2.
Muestra
N
Edad (h)
x (gcel/L)
s (g s/L)
mx (h-1)
YX/S
(g cel/g
sus)
Rx (g/L h)
1
2
3
4
5
6
7
8
0
1
2
3
4
5
6
7
X
promedio
0.14
0.182
0.35
0.455
0.658
1.036
1.68
2.38
0.860
7.4
7
7.4
8
7.3
1.38
6.2
6.6
0.352
2,8
0,32
Tabla 9. Parmetros cinticos del cultivo por lote del grupo 7IM1.
Muestra
N
1
2
3
4
5
Edad (h)
x (gcel/L)
s (g s/L)
mx (h-1)
YX/S
(g cel/g
sus)
Rx [g/L h]
0
0.5
1
1.5
2
X promedio
1.645
2.1
2.66
2.8
2.8
2.401
3.7974
2.6898
2.0569
0.94
0.0063
0.451
0.3046
0.5775
Tabla 10. Valores obtenidos de biomasa de forma experimental y terica del lote
alimentado del grupo 7IM1.
Edad (h)
x (gcel/L)
experimental
(turbiedad)
x (gcel/L)
(terico)
0
1
2
2.8
4.28
5.04
2.8
3.656
4.727
7.125
6.037
8.05
7.596
Experimental
Terica
9
8
7
6
5
x (g cel/L)
4
3
2
1
0
1
1.0337
1.0666
1.1408
1.2237
Edad
(h)
0
1
2
3
4
X (g cel)
Experimenta
l
(Turbiedad)
2.8
4.4242
5.3756
8.1282
9.8507
X (g cel)
(Teorico)
2.8
3.78
5.102
6.887
9.296
Terica
Edad (h)
0
1
2
3
4
Sustrato
(g sus /L)
Experimental
Sustrato
(g sus /L)
Terico
0.0063
0.0037
0.0227
0.0253
0.0278
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
Experimental
Terica
X ( g cel )
2.8
3.78
5.102
6.887
9.296
Y x/s
(g cel/g sus)
terica
Rx (g /h L)
terica
0.484
1.3271
X ( g cel )
2.8
4.4242
5.3756
8.1282
9.8507
Y x/s
Rx (g /h L)
(g cel/g sus) Experimental
Experimental
0.5242
1.4404
Biomasa
Concentracin de sustrato
El bioreactor fed batch generalmente es utilizado para obtener mayores
rendimientos de biomasa celular y un mayor consumo de sustrato (Johnson,
1987). En la tabla 5, se muestra el consumo de sustrato en el reactor por lote y en
la tabla 6 el consumo de sustrato cuando se incia el cultivo por lote alimentado,
ambas tablas son datos experimentales del grupo 7IM1. Se observ que en el
cultivo por lote, el consumo de sustrato lleg casi a cero (0.0063 g/L) y que a partir
de ese momento, cuando se alimento el sustrato a flujo constante, ste
inicialmente vari su concentracin debido al estado de transcicin que ocurre
antes de que el reactor alcance el equilibrio dinmico y despus de cierto tiempo,
el valor alcanzado del sustrato fue alrededor 0.02 g/L, con lo que se comprobo
que realmente su flujo era constante.
En la tabla 4, se muestra el perfil de consumo de sustrato (glucosa) obtenido por el
grupo 7IM2 en el reactor por lote. A diferencia de los resultados experimentales
obtenidos por el grupo 7IM1, se observ que la concentracin de sustrato en las
primeras 5 muestras prcticamente era constante y disminuy ligeramente en las
muestras 6, 7 y 8. Ferreira et al. (2003) indican que muchos gneros de levaduras
se ven afectadas por el efecto Crabtree, el cual indica que a altas concentraciones
de glucosa y en condiciones aorobicas, las condiciones de degradacin de
glucosa son nicamente por vas fermentativas. Esta situacin resulta de una
represin de la de la sntesis de enzimas respiratorias por las altas tasas de
fermentacin y consta en realidad de un la represin de una fuente de energa
(respiracin ) por otra fuente de energa (De Deken, 1966). De acuerdo con
Johnson (1987) un sistema de fermentacin fed-batch con alimentacin
exponencial evita el efecto Crabtree, ya que la alimentacin del sustrato es
constante y se mantiene a bajas concentraciones. Con base en lo anterior, es
posible que durante la preparacin del inculo de la levadura Candida utilis Y-900,
se haya presentado el efecto Crabtree por lo que toda la glucosa administrada se
dirigi a la produccin de etanol a travs de vas fermentativas tal y como lo
indican Melchy et al. (2001). Al ocurrir dicha situacin y montar el sistema por lote,
la levadura Candida utilis Y-900 inicialmente no utiliz a la glucosa como fuente de
carbono, ya que al pasar el inculo al medio de cultivo, ste contena etanol
producido por el efecto antes descrito y por lo tanto la concentracin de glucosa se
mantuvo constante. Johnson (1987) indica que la utilizacin de etanol como fuente
de carbono de algunas levaduras, es una ventaja competitiva ya que ste debido a
su constante dielctrica alta ejerce un efecto antimicrobiano. Como se observ en
la tabla 4, despus de cierto tiempo, el etanol que pudiera haber estado presente
se consumi, y por lo tanto la levadura comenz a utilizar a la glucosa como
fuente de carbono y energa, pero debido a la falta de tiempo, ya no se mont el
cultivo por lote alimentado.
mx en cultivo por lote
Fue posible observar en el grfico 1 y 2 que las velocidades especficas de
crecimiento mximas (mx) resultantes con la biomasa obtenida por diferencia
de pesos y absorbancia fue de 0.3527h -1 y 0.4115h-1 respectivamente, sin
diferencias significativas entre ambas determinaciones.
Se observa que los valores de mx obtenidos en el cultivo por lote fueron bajos
comparados con otras velocidades de crecimiento reportadas para levaduras de
Candida utilis como es Candida utilis ATCC 22023T en medios de cultivo con
etanol y en caldo Sabouraud, las cuales son de 0.99 h -1 y 0.87h-1 respectivamente.
Lo anterior se debe a que la levadura Candida utilis Y-900 no utiliz como fuente
de carbono el sustrato suministrado en el cultivo por lote en la prctica (glucosa),
teniendo por consecuencia que la levadura se viera limitada a utilizar posibles
metabolitos residuales de la preparacin del inculo y con ello tuviera menor
concentracin de sustrato disponible para el crecimiento del microorganismo
(Palmern et al., 2011).
Productividades
Respecto a la productividad obtenida para un cultivo por lote fue de 0.32 gcel/Lh
para los equipos del 7IM2 y de 0.5775 gcel/Lh para los equipos del 7IM1. Lo cual
muestra que el consumo de glucosa presentado en el cultivo por lote de los
equipos del 7IM1 influy en la obtencin de una productividad mayor de levadura,
siendo sta de casi el doble respecto a la obtenida por los equipos del 7IM2 donde
no hubo consumo de glucosa.
Por otra parte, la productividad media obtenida de forma experimental en el cultivo
por lote alimentado fue de 1.4404 gcel/Lh y de forma terica se obtuvo una valor
de 1.3271 gcel/Lh, lo cual muestra que la utilizacin del simulador permite obtener
valores muy aproximados a las productividades que se obtendran de forma
experimental, con mayor ahorro de materiales y de tiempo.
Realizando la comparacin de las productividades obtenidas en ambos cultivos, se
hace evidente que se obtuvieron mayores productividades en el cultivo por lote
alimentado, lo cual se debe al suministro constante de sustrato que permiti que
se produjera un efecto Crabtree, el cual ante las condiciones aerbicas del
sistema, inhibi el metabolismo fermentativo de la levadura Candida utilis (y la
formacin de productos como el etanol) favoreciendo la produccin de la biomasa,
siendo por ello el cultivo fedbatch muy utilizado a escala industrial para la
produccin industrial de levaduras de gran inters como Saccharomyces
cerevisiae (Melchy et al., 2001).
Rendimientos
Los rendimientos obtenidos por el grupo 7IM2 fueron 2.8 g cel/g de sustrato y
para el grupo 7IM1 los rendimientos fueron de 0.3046 g cel/g sus . Lo que nos
muestra que el consumo de glucosa fue menor o no hubiera consumo para los
equipos del 7IM2 que para los del 7IM1 provocando que la produccin de
biomasa sea menor para el grupo 7IM2. Por otra parte los rendimientos de un
cultivo por lote alimentado tericos a partir de la clula fue de 0.484 g cel/g sus
tericas y de forma experimental 0.5242 g cel/g sus Experimental los cuales son
valores muy aproximados y nos dice que el comportamiento y el rendimiento de
una clula si se pueden predecir por medio de un simulador.
Las grficas realizadas del sistema alimentado en cuanto a la edad de las clulas
podemos observar que con el transcurso del tiempo o el aumento de su edad el
comportamiento experimental va en aumento y es un comportamiento muy similar
al terico , con respecto a biomasa el comportamiento es casi el mismo
experimentalmente como en el terico va en aumento hasta llegar a 4 horas
dndonos una biomasa experimental de 9.8507 g de clula y tericamente 9.296 g
de clula , por otra parte la concentracin de sustrato
es un poco distinta
tericamente el sustrato no tiene que tener variaciones pero experimentalmente
las hubo lo que nos indica que la clula no est consumiendo el sustrato y se est
acumulando iniciando de 0.0063 g sus /L hasta llegar a 0.0278 g sus /L y
tericamente se tendra que mantener en 0.01 g sus /L. esto nos muestra que las
clulas no se alimentaban del sustrato proporcionado esto puede ser debido a las
condiciones en las que se encontraban las clulas durante la fase experimental.
456. CONCLUSIONES