Sunteți pe pagina 1din 23

3.

Imobilizarea catalizatorilor
Imobilizarea poate fi definit ca o blocare a moleculelor de enzime sau a celulelor ntr-o
faz distinct ce permite schimburile de substane (substrat, produi, inhibitori, nutrieni) n
interiorul i exteriorul ei, dar care este separat de masa de soluie n care se gsesc dispersate
moleculele de substrat sau inhibitor. Faza n care se gsete enzima este de obicei insolubil n
ap i are o greutate molecular mare (un polimer hidrofil, de exemplu celuloz).
Enzimele imobilizate sunt definite ca enzime care sunt mrginite fizic sau localizate ntro regiune definit din spaiu, cu retenia aciunilor lor catalitice i care pot fi folosite n mod
repetat i continuu.
Termenul de enzime imobilizate include:
enzime modificate ntr-o form insolubil n H2O;
enzime solubile reinute de o membran de ultrafiltrare n interiorul unui bioreactor;
enzime a cror mobilitate este redus prin legarea de alte macromolecule, molecula
complex rezultat fiind solubil n ap.
Blocarea biocatalizatorilor se poate realiza prin diverse metode. Enzimele i celulele pot fi
legate covalent de suport, adsorbite la suprafaa lui sau entrapate fizic n suport.
+
adsorbtie
fizica

+
-

legare
ionica

legare
covalenta

reticulare

entrapare

microincapsulare

n schema urmtoare se face o clasificare a enzimelor imobilizate n funcie de natura


interaciunii responsabile de imobilizare i de natura suportului pe care se face imobilizarea.
Metode de imobilizare pentru enzime

Metode pentru enzime insolubilizate

legare

reticulare

Metode pentru enzime solubile

entrapare

n gel

de suport

adsorbie
fizic

legare
ionic

membrane
de ultrafilrare

fibre
perforate

microincapsulare

legare
covalent

Imobilizarea enzimelor sau a celulelor ntregi permite recuperarea i recircularea catalizatorilor,


de obicei scumpi. Mai mult, biocatalizatorii imobilizai sunt n general mai stabili i mai uor de
mnuit dect cei liberi, i mult mai potrivii pentru procesele continue.
Utilizarea celulelor imobilizate evit izolarea i purificarea, adesea laborioas i scump, a
enzimelor intracelulare. Mai mult, stabilitatea se mrete prin meninerea enzimelor n mediul lor
natural. Aceste avantaje sunt valabile mai ales n cazul sistemelor multienzimatice i/sau a
enzimelor cofactor dependente.

3.1. MATRICI PENTRU IMOBILIZAREA ENZIMELOR


Elementele de baz ale unei enzime imobilizate sunt enzima, matricea i modul de
interaciune al enzimei cu suportul. Cu o singur excepie, a enzimei, cel mai important
component care contribuie la performana enzimei imobilizate este suportul.
Caracteristicile unui suport sunt:
permeabilitate
domeniu larg de utilizare
caracter hidrofil
insolubilitate
stabilitate chimic, mecanic i termic
rigiditate mare
form potrivit
rezisten la atac microbian
regenerabilitate
Suporturile pot fi clasificate dup compoziia chimic sau morfologie.
3.1.1. CLASIFICARE MORFOLOGIC
MATRICI NEPOROASE
Matricile neporoase prezint, de obicei, un mare dezavantaj pentru imobilizarea
enzimelor. Suprafaa suportului neporos este extrem de mic i de aceea, suprafaa disponibil
pentru cuplarea enzimelor este foarte limitat.
Totui, matricile neporoase prezint cteva avantaje datorate caracteristicilor lor
morfologice. Limitrile difuzionale suferite de compuii solubili (substrat sau produs) pot fi
eliminate sau oarecum reduse, fie prin micorarea dimensiunilor particulelor, fie prin creterea
vitezei liniare a fluidului, ntruct enzima este imobilizat pe suprafaa extern a suportului i este
n contact imediat cu mediul nconjurtor.
MATRICI POROASE
Matricile poroase, att cele organice ct i cele anorganice, au o suprafa exterioar mare
per unitatea de mas, fapt care permite o ncrcare mare a enzimei i astfel enzimele imobilizate
pe suporturi poroase sunt ideale pentru a fi utilizate n reactoarele industriale.
Un dezavantaj major pentru matricile poroase este faptul c suprafaa disponibil pentru
legarea enzimelor este suprafaa intern. Suporturile poroase trebuie s aib o morfologie intern
care s permit nu doar cuplarea enzimelor ci i o uoar accesibilitate a moleculelor de substrat
i produs pentru a reduce efectele difuzionale. Pe de alt parte, enzima legat sau entrapat n
suprafaa intern, este protejat de mediul extern.
Matricile poroase pot avea sau nu o distribuie controlat a porilor. Un factor important n
alegerea matricii poroase este relaia invers dintre mrimea porului i suprafa, care face
posibil optimizarea diametrului porului pentru un sistem particular enzim-substrat.
Gelurile fac parte din categoria matricilor poroase i sunt utilizate la entraparea enzimelor
sau la imobilizarea acestora prin legare covalent i adsorbie.
Morfologia suportului influeneaz calitatea imobilizrii prin suprafaa disponibil pentru
catalizator (intern sau extern), capacitatea de ncrcare a suportului cu catalizatorul (mrimea
porilor), prin limitrile difuzionale impuse de structura suportului fa de compuii solubili
(substrat sau produs), prin felul n care structura suportului este protejat de factorii de mediu
externi i permite utilizarea preparatelor imobilizate n reactoare industriale (tabelul 1).

Tabel 1. Avantaje i dezavantaje ale suporturilor utilizate la imobilizarea biocatalizatorilor


Clasificare morfologic
Neporoase

Avantaje
Limitri difuzionale reduse

Poroase

Suprafa activ mare


ncrcare mare cu catalizator
Protecie fa de condiiile externe

Dezavantaje
Suprafa activ redus
ncrcare cu catalizator redus
La utilizarea de particule fine apar:
dificulti de manipulare
dificulti la utilizare n regim continuu
reduceri de debit
compactare important
Suprafa activ intern mare
Limitri difuzionale mari
Costuri crescute (suporturi cu pori controlai)
Compactare important (geluri)

3.1.2. CLASIFICAREA CHIMIC


Din punct de vedere chimic, suporturile pot fi clasificate n conformitate cu compoziia
lor organic sau anorganic (tabelul 2), iar suporturile organice pot fi clasificate, la rndul lor, n
matrici naturale i sintetice.
Tabelul 2. Clasificare chimic a suporturilor
Organice

Anorganice

Polimeri naturali
Polizaharide:
celuloza, amidonul, dextranul, agarul i
agaroza, alginatul, caragenanul, chitina
i chitosanul
Proteine:
colagenul, gelatina, albumina, mtasea
Polimeri sintetici
Polistiren
Poliacrilai
poliacrilai i polimetacrilai,
poliacrilamide, hidroxialchilmetacrilai,
glicidilmetacrilai, polimeri vinilici i
alilici, poliamide

Minerale
bentonit, hornblend, nisip, piatr ponce,
kieselgur, pmnturi de diatomee
Materiale fabricate
sticl neporoas, sticl cu porozitate
controlat, oxizi de metale cu porozitate
controlat, metale (titan poros, alumin
poroas), oel inoxidabil

Suporturile sunt clasificate ca macromolecule naturale sau ca polimeri sintetici, avnd


caracteristici hidrofobe sau hidrofile.
Suporturile anorganice, datorit proprietilor lor fizice, sunt preferate n industrie i
prezint cteva avantaje fa de suporturile organice: stabilitate mecanic i termic mare,
rezisten la atacul microbian i la aciunea solvenilor organici, regenerabilitate uoar, pot fi
uor manipulate. Mai mult dect att, materialele anorganice nu i modific structura la variaii
ale pH-ului, presiunii sau temperaturii.
Un suport solid anorganic foarte mult utilizat este sticla poroas cu pori controlai. Un
control foarte precis al tratamentelor fizice i chimice permite obinerea unor particule de sticl
cu diverse diametre, cu o distribuie a mrimii porilor cuprins ntre 4,5 - 400 nm. Sticla cu pori
controlai este compatibil cu un numr mare de solveni, dar nu este stabil n mediu bazic (pH
8), fiind cunoscut solubilitatea silicei n alcalii, ceea ce limiteaz aplicaiile ca suport pentru
imobilizarea enzimelor. Pentru a crete durabilitatea acestui suport se realizeaz depunerea de
oxizi de metale pe suprafaa acestuia, oxizi care sunt mai puin solubili n mediu bazic.
Alte suporturi cum sunt materialele ceramice cu pori controlai, silicea, alumina i
dioxidul de titan se folosesc mult deoarece sunt mai ieftine. Mineralele poroase naturale cum sunt

bentonita, piatra ponce, kieselgur sunt de asemenea utilizate ca suporturi pentru enzime, dar au o
distribuie a porilor larg.
Matricile neporoase cum sunt metalele pure sau oxizii de metale cu proprieti
feromagnetice cum este oxidul de fier, nichel i oelul inoxidabil sunt suporturi foarte avantajoase
pentru imobilizarea enzimelor avnd n vedere c ele pot fi foarte uor separate de masa de
reacie, iar densitatea lor le face utile n reactoarele cu pat fluidizat. Regenerarea acestor suporturi
se poate face foarte uor prin tratarea sistemului cu un acid pentru a indeparta enzima inactivat.
La suprafaa celor mai multe suporturi anorganice apar grupri hidroxil, cum sunt
gruprile silanol din sticle, grupri care asigur o suprafa slab reactiv ce urmeaz a fi activat
nainte de legarea enzimei.
Aceste suporturi pot fi folosite att la imobilizarea enzimelor ct i a celulelor ntregi.
3.2. METODE DE IMOBILIZARE A ENZIMELOR
3.2.1. METODE DE LEGARE A ENZIMELOR DE SUPORT

Metodele de legare de suport constau n cuplarea enzimelor pe suporturi solide i sunt cele
mai vechi tehnici de imobilizare aacestora. n funcie de modul de legare al enzimelor de suport,
aceste tehnici se mpart n:
adsorbie fizic,
legare ionic,
legare prin chelatare cu metale,
legare covalent.
Un rol foarte important n cadrul acestor metode de imobilizare l joac tipul suportului
folosit. Cantitatea de enzim legat de suport i activitatea enzimatic dup imobilizare depind n
mod semnificativ de tipul suportului. Dei selecia suportului se face n funcie de natura enzimei,
trebuie s se in cont de o serie de aspecte cum sunt:
mrimea particulelor,
suprafaa activ,
raportul molar dintre gruprile hidrofile i hidrofobe,
compoziia chimic.
n general, o cretere a numrului de grupri hidrofile i a suprafeei active determin o
cretere a cantitii de enzim imobilizat pe suport i o cretere a activitii enzimatice.

3.2.1.1. ADSORBIA FIZIC


Adsorbia fizic este cea mai veche i cea mai simpl metod de imobilizare a enzimelor.
Adsorbia este realizat prin interaciuni fizice cum sunt forele Van der Walls ntre enzim i
suprafaa suportului solid. Procedeul const n agitarea concomitent a enzimei cu suportul n
condiii corespunztoare, urmat de o perioad de contact ntre enzim i matrice, apoi separarea
preparatului enzimatic insolubil de masa de soluie prin centrifugare sau filtrare.
Avnd n vedere c nu au loc reacii chimice, modificrile conformaionale ale enzimei pe
durata imobilizrii sunt minime sau chiar inexistente. Adsorbia unei enzime este dependent de o
serie de variabile cum sunt:
- pH-ul,
- natura solventului,
- tria ionic,
- concentraia enzimei i adsorbantului,
- temperatura.
Se impune un control precis al acestor variabile pentru a obine o adsorbie optim i o
retenie mare a activitii enzimatice, avnd n vedere c forele care se stabilesc ntre protein i
adsorbant sunt relativ slabe (legturi de hidrogen, Van der Waals, interaciuni hidrofobe etc.).
O influen major asupra cantitii de enzim adsorbit pe suportul solid o are
concentraia enzimei pe unitatea de suprafa de suport de-a lungul procesului de imobilizare.
Activitatea crete cu creterea concentraiei enzimei, pn la valoarea de saturare, dup care se
observ o descretere a activitii specifice. Timpul i temperatura sunt parametri importani n
adsorbia enzimelor, n special n cazul suporturilor poroase, deoarece difuzia este un factor
determinant atunci cnd se folosesc enzime imobilizate, indiferent de natura suportului folosit.
Marele dezavantaj al acestei metode este dat de faptul c forele de legtur dintre enzime
i suport sunt n general slabe i poate s apar o pierdere de enzim prin desorbie n timpul
utilizrii lor. Modificrile condiiilor experimentale (pH, trie ionic, temperatur, tipul
solventului) pot determina desorbia enzimei de pe suport ca urmare a afectrii legturilor dintre
ele. Acest dezavantaj face ca multe enzime s nu fie active dect pe o perioad scurt de timp.
Adsorbanii cei mai folosii sunt: alumina, carbonul activ, argila, colagenul, sticla,
pmntul de diatomee i hidroxiapatita (tabel 3). Enzimele pot fi de asemena imobilizate prin
adsorbie fizic pe materiale ce prezint grupri de afinitate. Adsorbia fizic a enzimlor se poate
realiza i pe suporturi organice, ntre ele stabilindu-se interaciuni hidrofobe.
Tabel 3. Materiale utilizate la adsorbia enzimelor
alumina
bentonit
carbonat de calciu
gel de fosfat de calciu
carbon
celuloz
argil

colagen
agaroz
polimeri fenolici
sticl poroas
hidroxiapatit
gel de silice
kaolin

3.2.1.2. LEGAREA IONIC


Legarea ionic este o cale simpl de imobilizare a enzimelor. Metoda se bazeaz pe
stabilirea unor legturi ionice ntre proteina enzimatic i suportul solid care conine resturi
schimbtoare de ioni. Practic, la baza acestei metode stau att legturile ionice ct i cele Van der
Waals. Diferena dintre legarea ionic i adsorbia fizic const n tria legturii dintre enzim i
suport. Forele de legtur rezultante sunt interaciunile ion-ion, mai puternice dect n cazul

adsorbiei fizice. Ca i n cazul adsorbiei fizice, procesele de imobilizare sunt uor de realizat,
utiliznd aceleai metode, mult mai blnde ca cele utilizate la legarea covalent.
Avnd n vedere caracterul ionic al legturii i condiiile blnde de imobilizare,
modificrile conformaionale ale enzimei sunt foarte mici, obinndu-se preparate enzimatice cu
activitate mare. Desfacerea legturii dintre enzim i suport poate aprea n diverse cazuri ca de
exemplu la modificrile de pH sau de trie ionic.
Ca i suporturi enzimatice se utilizeaz schimbtorii de ioni. Cel mai frecvent se
utilizeaz suporturi organice cu resturi schimbtoare de ioni, sau suporturi anorganice, n special
compui cu siliciu, cu resturi similare de schimbtori de ioni (vezi purificarea enzimelor).
n cazul celulelor microbiene ncrcate electric, acestea pot interaciona electrostatic cu
ionii de la suprafaa suportului pentru a forma complexe stabile. Pot fi folosite ca suporturi
rinile sintetice schimbtoare de ioni, derivaii celulozici modificai sau materiale anorganice.
3.2.1.3. IMOBILIZAREA PRIN CHELATARE CU METALE
Enzime imobilizate pot fi obinute utiliznd compui ai metalelor tranziionale, mai ales
sruri de titan i zirconiu, pentru a activa suprafaa unor suporturi organice sau utiliznd chiar ca
suporturi hidroxizii acestor metale rezultai prin precipitare din sruri.
Aceast metod se bazeaz pe proprietile de chelatare ale metalelor tranziionale.
Interaciunea dintre un compus al unui metal tranziional i un biopolimer este prezentat n
figura 1, n cazul unui sistem simplu format din clorur de titan (IV) i celuloz.
lant carbohidrat
HO

OH2 HO
Ti

Ti

O
OH2

H2O

O
HO

O
O

HO

OH2 HO
Ti

O
OH2 H2O

O
O

OH2
Ti

HO

lant carbohidrat
H2O

Ti

OH2
Ti

OH2 HO

H2O

H2O
Ti

OH
Ti

HO

OH2
O
OH

Figura 1. Celuloza chelatat cu titan

lant carbohidrat

n soluia de clorur de titan (IV), ionii de titan sunt chelatai cu molecule sau ioni
specifici cu rol de liganzi eseniali. Gruprile nucleofile (hidroxi, amino, tiol etc.) sunt liganzi
efectivi pentru ionii metalelor tranziionale i de aceea este de ateptat ca aceti ioni s poat
complexa att suportul ct i enzima. Suporturile, cum sunt celuloza i silicea, conin grupri
hidroxil care pot funciona ca noi liganzi ce i pot nlocui pe cei preexisteni. De exemplu,
celuloza conine grupri diol vicinale neimplicate n legturile glicozidice, i care pot fi chelatate
cu ioni ai metalelor tranziionale; chelaii se obin prin nlocuirea a doi liganzi ai titanului cu
grupri hidroxil polizaharidice.
Din considerente sterice, este imposibil nlocuirea tuturor liganzilor titanului cu grupri
hidroxil de pe un singur lan polizaharidic. Chelatarea poate fi realizat de ctre orice molecul ce
conine grupri potrivite s nlocuiasc liganzii titanului. Enzimele au astfel de grupri care pot
funciona ca liganzi:
gruprile carboxil libere de la captul terminal al aminoacizilor acizi,
grupri hidroxil fenolice ale resturilor tirozil i alcoolice din resturile seril i treonil,
gruprile sulfhidril libere din resturile citeinil,

gruprile amino de la captul N-terminal din resturile lisil.


Stabilirea acetor legturi dintre polimerul chelatat cu titan i enzim, n vederea obinerii
unui preparat enzimatic activ, depinde de:
a) disponibilitatea gruprilor care funcioneaz ca ligand din molecula enzimatic,
b) factorii sterici care permit acestor grupri s vin n contact cu atomii de titan,
c) neimplicarea acestor grupri n situsul catalitic activ al enzimei,
d) apropierea moleculelor enzimatice deja legate de matricea polimeric.
n metoda chelatrii cu metale, suportul (ex. celuloza) este introdus ntr-o soluie de TiCl 4,
se obine un derivat oxiclorur, dup care se realizeaz uscarea la temperatur moderat (45C).
Solidul este splat cu soluie tampon pentru ndeprtarea excesului de soluie de sare, iar legarea
enzimei se realizeaz prin punerea ei n contact cu suportul activat, de obicei n prezen de
soluie tampon la pH-ul optim al enzimei.
Srurile metalelor tranziionale utilizate n aceste procese de activare sunt clorurile i
sulfaii de titan, fier, zirconiu, vanadiu i staniu, dar i cloruri de cobalt, cupru, mangan, zinc i
crom. Se pot utiliza att suporturi organice (celuloz, rumegu, chitin sau acid alginic), ct i
anorganice (suporturi bazate pe silice, celit, vat de sticl sau hornblend). Rezultatele obinute
arat o dependen net de concentraia soluiei de clorur a metalului tranziional utilizat.
n tabelul 6 este redat un exemplu de imobilizare folosind suporturi anorganice activate cu
sruri ale metalelor tranziionale.
Tabel 6 . Activarea suporturilor anorganice cu sruri de metale tranziionale
-------------------------------------------------------------------------------------------------------1. 10 g suport anorganic (hornblend, sticl poroas, alumin pororas, oel inoxidabil,
Ni-NiO) se introduc ntr-un recipient;
2. Recipientul se imerseaz parial ntr-o baie de ghea i se adaug 62,5 ml ap rcit;
3. Se adaug ncet sub agitare energic 6,3 ml clorur de titan (IV) pur;
4. Se scoate recipientul din baia de ghea i se nclzete la 80C, timp de o or;
5. Se separ suportul pe care s-a depus un strat de oxid de titan (IV) hidratat i se spal
cu ap pn cnd se obine un lichid de splare curat;
6. Se usuc suportul peste noapte la 110C;
7. Se adaug soluia enzimatic cu un coninut de 1 g/ml protein n ap deionizat i se
ine n contact cu suportul timp de 18 ore la 0-5C
8. Se ndeprteaz soluia de supernatant i se spal enzima imobilizat de ase ori cu
ap deionizat nainte de a-i determina activitatea.
-------------------------------------------------------------------------------------------------------Utilizarea acestei metode la imobilizarea unor enzime este prezentat n tabelul 7.
Tabel 7. Activitile specifice ale unor enzime chelatate de suporturi activate cu titan (IV)
Enzima
-Amilaz
Glucoamilaz
D-Glucozoxidaz
Papain
(activitate esterolitic)
(activitate proteolitic)
Tripsin
(activitate esterolitic)
(activitate proteolitic)

Suport
celuloz
celuloz
sticl
sticl poroas (dimensiunea porilor 100)
Celuloz
fibre de sticl

Activitate specific (%)


54,0
46-72,5
56,2
20,0
61,5
76,6
37,9

Spheron P 100000
19,0
0,46

Metoda de chelatare cu metale conduce la o retenie relativ mare a activitii specifice


(30-80%). Stabilitatea operaional este variabil. Metalele activatoare influeneaz pozitiv
stabilitatea enzimelor imobilizate.
3.2.1.4. LEGAREA COVALENT
Imobilizarea prin legare covalent pe polimeri activai este probabil cea mai utilizat
metod, cu toate c de multe ori obinerea unei enzime imobilizate pe aceast cale este dificil.
Un suport insolubil n ap poate fi legat covalent de enzim prin gruprile reactive ale resturilor
de aminoacizi care nu sunt implicate n situsul activ al enzimei sau n situsul de legare a
substratului. Legtura covalent este stabil i nu exist posibilitatea ca enzima s se desprind de
suport, dac concentraia substratului i tria ionic se schimb n timpul reaciei. Avantajul
acestei metode const n varietatea mare de suporturi care permit o flexibilitate mare n obinerea
diverselor tipuri de biocatalizatori cu proprieti fizice i chimice specifice. Tipul polimerilor i
procedeele chimice de cuplare sunt extrem de diverse, astfel c vor fi descrise doar cele mai
importante metode dezvoltate de-a lungul anilor.
Pentru a imobiliza enzime printr-o metod specific, trebuie luai n calcul 3 factori:
gruprile funcionale ale proteinei potrivite pentru legare n condiii ct mai blnde;
tipul reaciei de cuplare ntre enzim i suport;
funcionalizarea suporturilor corespunztoare pentru imobilizarea enzimei.
Gruprile funcionale ale enzimelor ce pot fi implicate n legturile covalente cu
suporturile sunt prezentate n tabelul 8. Din list lipsesc aminoacizii ce conin n catena lateral
grupri amidice, hidrocarbonat, precum i glicina deoarece se gsesc n concentraie redus pe
suprafaa extern a proteinelor i mai ales datorit faptului c sunt nereactive (caracter hidrofob).

Tabel 12. Resturile reactive ale enzimelor


NH2

gruparea amino din L-Lys i grupri amino terminale

SH

gruparea tiol din L-Cys

COOH

gruparea carboxil din L-Asp i L-Glu si gruprile carboxil


terminale

OH
H
N

NH
NH2

N NH
S

gruparea fenolic din L-Tyr


gruparea guanidino din L-Arg

restul imidazol din L-His

puntea disulfuric din L-Cys

N
H

restul indol din L-Trp

CH 3 S
CH 2OH

gruparea tioeter din L-Met


gruparea hidroxil din L-Ser i L-Thr

________________________________________________________________

Cele mai convenabile resturi de aminoacizi pentru imobilizare sunt: L-lizil, L-cistenil, Ltirozil, L-histidil, L-aspartil, L-glutamil, L-arginil, L-triptofanil, L-seril, L-treonil, L-metionil.
Legarea moleculelor enzimatice de suportul solid implic reacii ntre resturile de
aminoacizi ale enzimelor prezentate anterior i o serie de grupri funcionalizate ale suportului.
Gruprile funcionle reactive ale suporturilor capabile de reacie direct cu enzimele, cele mai
importante grupri reactive ale enzimelor i reaciile de cuplare covalent dintre acestea sunt
prezentate n tabelul 9.
Tabel 9. Metode de imobilizare prin legare covalent
Gruparea reactiv
a suportului
N2+Cl -

Gruparea reactiv
a enzimei
NH2
SH

sare de diazoniu
O
C
C

Reactia de cuplare
legturi diazo

OH
NH2

legturi peptidice

NH2
SH

legturi peptidice

O
anhidrid acid
CH 2CON3
acilazid

OH
O

C NH
O
imidocarbonat
NCO
izocianat
CH 2COCl
clorur de acil
O

C O
O
anhidrid
1
R

NH2

legturi peptidice

NH2

legturi peptidice

NH2

legturi peptidice

NH2

legturi peptidice

NH2

legturi peptidice

NH
COO C
+NH
R

O-acilizouree
F
NO2
NO2
5-fluoro-2,4-dinitroanilid

NH2

arilare

Tabel 9. Metode de imobilizare prin legare covalent (continuare)


Gruparea reactiv
a suportului

N
N

Gruparea reactiv
a enzimei

Reactia de cuplare

Cl
NH2

N
Cl

arilare

triazinil
NH2

CHO
aldehid
NH2
amin

NH2
COOH
NH2
COOH

CONHNH2
acilhidrazid
O
O
O

legturi peptidice
(n prezenta reactivilor
de condensare)
legturi peptidice
(n prezenta reactivilor
de condensare)

NH2
SH
OH

formare de baze
Schiff

CO 2H
NH2

reactie Ugi

NH2

formare de amide

NH2

formare de amide

SH

reacie de interschimb

R
+
NH C
2
R
imin
NH
C

OC2H5

imidoester
CN
cian
S

rest disulfuric

Cel mai simplu procedeu de obinere a conjugatelor insolubile enzim - suport const n
punerea n comun a soluiei enzimatice cu un suport reactiv potrivit. Doar cteva suporturi conin
grupri reactive capabile s reacioneze direct cu enzima. Cele mai utilizate suporturi nu conin
aceste grupri rective, dar conin grupri hidroxil, amino, amido i carboxil care pot fi activate n
vederea imobilizrii prin diverse reacii de diazotare, formare de legturi peptidice, reacii de
arilare, alchilare, formare de baze Schiff etc (tabel 9).
Imobilizarea enzimelor este cunoscut nc de la sfritul anilor 1940. n 1949 Michael i
Ewers au utilizat derivaii azidici ai carboximetilcelulozei pentru a imobiliza o serie de proteine.
Grubhofer i Schleith n 1954 au folosit derivaii diazo ai poli-p-aminostirenului la imobilizarea

pepsinei, amilazei i carboxipeptidazei. Cercetrile s-au izbit de lipsa polimerilor comerciali


potrivii pentru imobilizarea enzimelor (pe pia erau n special rini sintetice hidrofobe).
Manecke, n 1961, a observat c activitatea enzimei imobilizate depinde de gradul de
hidratare a matricii polimere. n 1963 Rimmon a utilizat un copolimer al L-leucin-p-amino-D,Lfenilalaninei pentru a imobiliza chimotripsin, papain, pepsin i streptochinaz. n 1962, el a
folosit un copolimer al acidului metacrilic pentru a imobiliza pepsina, amilaza, invertaza i
alcooldehidrogenaza. Aceast ultim enzim a fost prima oxidoreductaz imobilizat cu succes,
nainte de aceasta toate enzimele imobilizate au fost hidrolaze.
n paralel, s-au studiat derivaii celulozei ca suporturi pentru imobilizarea enzimelor.
Celuloza a prezentat un mare interes datorit calitilor pe care le are:
hidrofilicitate mare,
accesibilitate,
posibilitatea obinerii de diveri derivai,
uurina cu care polimerii bazai pe celuloz pot fi obinui sub form de pulbere
sau membrane (filme).
n 1961, Mitz i Summaria au legat tripsina i chimotripsina de p-aminobenzoil-celuloz
diazotat i de derivatul hidrazidic al carboximetilcelulozei. Metodele se mai utilizeaz i azi.
Legarea enzimei de celuloz se poate face prin intremediul unor "puni" chimice:
molecule mici care prezint grupri capabile s reacioneze att cu celuloza ct i cu enzima.
Un astfel de compus este triclortriazina care prezint trei legturi C-Cl reactive. Prima
grupare reacioneaz nti cu celuloza, urmtoarea cu enzima, iar cea de-a treia poate reaciona cu
un alt compus potrivit. Utiliznd aceast metod Kay i colab. au legat de celuloz (hrtie de
filtru) galactozidaza, lactat dehidrogenaza, piruvat kinaza i creatin kinaza.
O alt molecul foarte utilizat este glutaraldehida. Aceasta conine dou grupri
aldehidice care pot reaciona la pH neutru cu grupri amino libere. Una dintre gruprile
aldehidice poate reaciona cu suportul iar cealalt cu enzima.
Cea mai utilizat metod de activare implic reacia suportului cu bromcianul. El
reacioneaz cu gruprile hidroxil ale polizaharidelor i derivailor acestora pH ridicat, iar apoi
reacia cu gruprile amino libere din enzim se realizeaz n soluii uor alcaline.
Polizaharidele nu sunt suporturi ideale pentru imobilizarea enzimelor, ele prezentnd
dou neajunsuri: susceptibilitatea la atacul microbian i nespecificitatea n ceea ce privete
adsorbia proteinelor. Ca urmare, dup imobilizare se impune splarea n tampon cu trie ionic
mare, ceea ce poate inactiva enzima, mai ales dac forma sa activ este un dimer sau polimer.
Din aceast cauz s-a urmrit utilizarea unui suport cu un grad mare de hidrofilicitate i
nedegradabil microbian. Astfel s-au folosit ca suporturi copolimerul eten-anhidrida maleic,
sticla, nylonul, etc. Foarte utilizate sunt poliacrilamida i copolimerii ei comerciali. Gruprile
reactive coninute sunt diazo, aldehidice, carboximetil. Foarte utilizai sunt i derivaii polimerici
acrilici solubili, foarte potrivii pentru obinerea enzimelor imobilizate solubile.
Silicaii tratai cu sruri de aluminiu constituie suporturi pentru imobilizarea enzimelor
prin legare covalent folosind ca agent de cuplare glutaraldehida sau -aminopropiltrietoxisilanul.
Produsele astfel obinute prezint o stabilitate termic mai bun, sunt mai stabile n mediu alcalin
i sunt active o perioad mai lung de timp.
Vom prezenta cteva exemple de legare covalent.
A) METODA DE LEGARE DIAZO
Metoda de cuplare diazo se bazeaz pe reacia enzimei cu gruprile electrofile
arildiazoniu ale suportului. Derivaii de diazoniu ai suporturilor solide sunt preparai prin tratarea
suportului coninnd grupri amino aromatice cu nitrii n mediu acid:
NH2

NaNO2
HCl

N N Cl

(1)

Gruprile funcionale ale enzimei care particip n cuplarea covalent includ grupri
amino libere, gruprile imidazol din histidin i, n special, gruprile fenolice din tirozin.
E
HO

(2)

N N
HO
E

H
N

HN

+
N2 Cl

N N

E
(3)

H2N-E

N N
N E

(4)

N N
E = molecula de enzima

Suporturi pentru cuplarea diazo pot fi derivaii polizaharidici, copolimerii aminoacizilor,


derivaii poliacrilamidici, rinile stirenice, copolimerii eten-acid maleic, derivaii aminosilanici.
B) METODE PEPTIDICE DE IMOBILIZARE
Reprezint o aplicare practic a tehnicilor de sintez de peptide i se bazeaz pe formarea
legturilor peptidice ntre enzim i suportul insolubil. Procedeele utilizate sunt:
suportul insolubil coninnd grupri carboxil este transformat n derivai reactivi:
azide, izocianai, anhidride, care reacioneaz cu gruprile amino libere ale enzimei,
formnd legturi peptidice;
prin folosirea unor reactivi din sinteza de proteine cum sunt carbodiimida, reactivul K
al lui Woodward, se formeaz legturi peptidice fie ntre gruprile amino ale
enzimelor i carboxil ale suportului insolubil, fie ntre gruprile carboxil libere ale
enzimelor i gruprile amino ale suportului insolubil.
C) IMOBILIZAREA ENZIMELOR PRIN ALCHILARE
Se bazeaz pe alchilarea gruprilor amino, sulfhidril i fenolice ale enzimei cu grupri
reactive ale suportului.
Chibata descrie imobilizarea aminoacilazei pe cloracetil-celuloz i pe bromacetilceluloz i arat c atunci cnd enzima reacioneaz cu suportul reprezentat de bromacetilceluloz n prezena unui agent de precipitare, de exemplu sulfatul de amoniu, se obine un
preparat activ i stabil de enzim imobilizat. Chibata a preparat iodacetil-celuloza prin tratarea
bromacetil-celulozei cu NaI n alcool i a demonstrat c activitatea aminoacilazei imobilizate pe
iodacetil-celuloz a fost mai mare dect a aminoacilazei imobilizate pe bromacetil-celuloz.
Katchalski a reuit prima imobilizare a unei enzime (ureaza) prin alchilare. Gruprile OH
terminale din polietilenglicol (PEG) au fost esterificate cu acid monoiodacetic. Prin reacia
acestui compus cu fosgenul, se formeaz cloroformiatul care reacioneaz apoi cu celuloza,
rezultnd un derivat iodacetil-celulozic al PEG, care poate fi folosit la imobilizarea ureazei.

Suportul folosit pentru imobilizare poate fi un derivat halogenat, de exemplu cloracetilceluloza, bromacetil-celuloza, polietilenglicol-iodacetil-celuloza, sau un derivat triazinic de tipul
diclor--triazinil-celuloz, diclor--triazinil-Sephadex sau diveri polimetacrilai.
3.2.2. IMOBILIZAREA ENZIMELOR PRIN NREELARE
Aceast metod se bazeaz pe formarea unor legturi chimice, la fel ca cele care se
formeaz n cazul metodei de imobilizare prin legare covalent, dar nu utilizeaz suporturi
insolubile n ap. Imobilizarea enzimelor se realizeaz prin formarea unor reele intermoleculare
tridimensionale ntre moleculele de enzime i o serie de reactivi bi- sau multifuncionali.
Cel mai utilizat agent de nreelare este glutaraldehida, dar pe lng aceasta se mai
- O S SO folosesc:
3
3
- Cl + N

N2+Cl -

- Cl+ N

N2+Cl

,
acid diazobenzidin-2,2 -disulfonic

diazobenzidin

HO2C CO2H

CH3O OCH3
- Cl+ N

N2+Cl -

- Cl+ N

N 2+Cl -

,
acid diazobenzidin-3,3 -dicarboxilic

,
diazobenzidin-3,3 -dianisidin
- O S SO 3
3
SCN

NCS

O2N

NO2

O
,
,
4,4 -difluoro-3,3 -dinitrofenil sulfat

,
acid 4,4 -diizotiocianato-bifenil
,
-2,2 -disulfonic

Cl

F
NO2
Cl

CH3
NCS

Cl

NO2

NCS
triclortriazin

1,5-difluoro-2,4dinitrobenzen
O
HC

O
(CH2 ) 3CH

glutaraldehid

O
ICH 2CNH

2,4-diizotiocianatotoluen
toluen-2,4-ditiocianat
O

(CH2 )6

NHC CH2I

OCN

N,N'-hexametilenbisiodoacetamid

(CH2 )6

NCO

hexametilendiizocianat

Aceti reactivi sunt compui ce conin grupri carbonil care pot reaciona cu restrile
reactive de aminoacizi. Legturile ce se stabilesc ntre enzim i glutaraldehid sunt ireversibile
i stabile la valori extreme de pH i temperatur:
CH

Enzim

CH (CH2)3 CH

CH(CH2)3 CH

N
CH
OHC(CH2)3CHO + H2N

Enzim

(CH 2 ) 3

NH 2

CH
N
CH

Enzim

Carboxipeptidaza A a fost imobilizat prin aceast reacie (Quiocho i Richards, 1964,


probabil prima aplicaie descris n literatur a acestei metode). Chimotripsina a fost imobilizat
folosind ca agent de reticulare hexametilendiizocianat sau hexametilendiizotiocianat, iar papaina
prin diazocuplarea bis-diazobenzidinei cu gruprile fenolice din tirozin, gruprile imidazol din
histidin sau cu grupri amino libere din molecula enzimei.
Dei metoda de imobilizare a enzimelor prin nreelare este simpl, stabilirea condiiilor n
care se face legarea agentului de reticulare de gruprile funcionale specifice neimplicate n
situsul activ al enzimei este foarte dificil i de cele mai multe ori se face empiric. Condiiile
optime care asigur obinerea unui produs insolubil cu o activitate enzimatic remanent bun
depind de o serie de factori cum sunt concentraia enzimei i a agentului de reticulare, pH, trie
ionic, temperatur i timpul de reacie. Imobilizarea depinde i de natura enzimei utilizate;
proteinele bogate n L-lizin sunt insolubilizate foarte uor.
Utilizarea unor concentraii crescnde de glutaraldehid determin obinerea de enzime
imobilizate a cror activitate crete pn la un maxim apoi scade.
Reacia de reticulare este de asemenea dependent de temparatur i timp. La temperatura
camerei, reticularea se produce ntr-un interval de timp de 1-3 ore, gelifierea fiind observat dup
10-30 de minute. La temperaturi sczute (4C), temperaturi preferate n cazul moleculelor mai
labile, imobilizarea necesit o perioad de timp mai ndelungat (16-24 de ore).
Reactivii multifuncionali pot fi utilizai nu numai pentru a lega moleculele de enzim de
glutaraldehid, celuloz sau ali polimeri, ci i pentru a lega moleculele de enzim de alte
molecule. Dei este indicat ca astfel de matrici s conin doar molecule enzimatice, prezint
interes din punct de vedere economic copolimerizarea enzimei cu o protein inert, cum este
albumina, n vederea creterii ncrcrii produsului final.
Din glutaraldehid pot fi obinute membrane cu pori controlai utilizate la nreelarea
enzimelor. Enzima este adsorbit pe membrane performante de nitroceluloz i apoi se introduce
glutaraldehida pentru nreelarea moleculelor de enzim n jurul fibrelor de nitrat de celuloz.
Marea problem a acestor metode este c reactivii bifuncionali pot adesea ataca
preferenial situsul activ al enzimei i astfel aceasta devine inactiv. Din aceast cauz se poate
recurge la blocarea reversibil a situsului activ al enzimei.
Cel mai important avantaj al metodei de imobilizare prin reticulare este posibilitatea de
utilizare a unui agent bi- sau multifuncional pentru obinerea unui preparat enzimatic ntr-o
singur etap, preparat care aproape c poate fi considerat o protein pur.
Principalele dezavantaje ale acestei metode sunt: dificultatea n controlul reaciilor de
reticulare intermoleculare n vederea obinerii unor agregate enzimatice mari cu o mare retenie
de activitate i proprietile mecanice legate de natura gelatinoas a acestor derivate enzimatice,
care confer proprieti de curgere reduse. Ca urmare a acestui ultim dezavantaj, metoda de
imobilizare prin reticulare este mult utilizat n combinaie cu alte metode, ex. cu adsorbia fizic.
3.2.3. IMOBILIZAREA ENZIMELOR PRIN ENTRAPARE / INCLUZIUNE
Entraparea unei molecule enzimatice se poate realiza pe una din cele trei ci:
Incluziunea n interiorul reelei unui polimer cu grad mare de nreelare
Separarea de masa de soluie prin "microcapsule" semipermeabile
Solubilizarea ntr-o faz distinct, neapoas.
O caracteristic important a acestor metode este faptul c enzima nu este legat de
reeaua matricii polimerice. Astfel nu apar probleme sterice ca n cazul legrii covalente sau
legrii electrostatice a enzimei de polimer, cum este obstrucia situsului activ al enzimei de ctre

o poriune de reea polimeric. Metoda are aplicaii mult mai generale, pot fi imobilizate diferite
tipuri de enzime sau ali biocatalizatori, celule ntregi sau organite celulare de diferite mrimi i
cu diferite proprieti; dezactivarea enzimei este mult mai redus dect n cazul metodelor care
necesit formare de legturi chimice cu suportul. n unele cazuri poate fi observat chiar o mrire
a activitii enzimatice (ex. chimotripsina entrapat n particule de politetrafluoroetilen prezint
o activitate catalitic cu 14% mai mare decat enzima liber).
3.2.3.1. ENTRAPARE N GELURI
Prin metoda de entrapare n geluri, enzima este inclus n ochiurile de reea din matricea
polimeric a acestora. Polimerul se poate obine din precursori monomeri, oligomeri sau
polimeri, modificnd o serie de parametri n reacia de polimerizare, cum sunt solventul,
temperatura, tria ionic sau pH-ul.
A) ENTRAPAREA N GEL FOLOSIND PRECURSORI MONOMERI
Primele tehnici de entrapare n gel s-au dezvoltat utiliznd gelul de poliacrilamid, n
ochiurile cruia s-au imobilizat enzime cum sunt tripsina, chimotripsina, papaina, -amilaza etc.
Procedeul de obinere a poliacrilamidei const n polimerizarea radicalic a acrilamidei
ntr-o soluie apoas ce conine enzima solubil i agentul de reticulare, de obicei N,N'metilenbisacrilamid (BIS). Polimerizarea se realizeaz de obicei n absena oxigenului i la
temparaturi mai sczute (10-25C) pentru a praveni denaturarea temic a enzimei. Ca iniiatori n
reacia de polimerizare se folosesc persulfatul de potasiu (K 2S2O8) sau riboflavina, iar drept
catalizatori ai reaciei de polimerizare se folosesc -dimetilaminopropionitril sau N,N,N',N'tetrametiletilendiamin. Blocul de gel obinut poate fi dispersat mecanic n particule de gel de
mrimi bine definite.
Gelurile prezint o rezisten mecanic redus i o distribuie larg a mrimii porilor.
Aceste dezavantaje pot fi eliminate printr-o optimizare a condiiilor reaciei de polimerizare,
pentru a obine un preparat ce conine o enzim imobilizat cu activitate catalitic mare, stabil i
o rezisten mecanic bun, ntr-un gel de poliacrilamid cu dimensiunea porilor de 1-4 nm, care
permite transportul substraturilor i produilor de reacie mici, dar nu permite pierderea
moleculelor enzimatice mari.
B) ENTRAPAREA N GEL FOLOSIND PRECURSORI OLIGOMERI
Prepararea unui polimer din precursori oligomeri are o serie de avantaje:
numrul de molecule din sistem este mai mic;
mrimea moleculelor este mai mare;
temperatura de reacie este mai redus avnd n vedere gradul de polimerizare al
precursorilor.
Pe de alt parte ns reacia de condensare necesit prezena unor grupri funcionale cum
sunt epoxi, carbonil sau izocianat, care pot reciona cu moleculele de enzim, obinndu-se un
preparat enzimatic imobilizat printr-o metod combinat entrapare n gel - legare covalent.
S-au dezvoltat metode de entrapare n gel a unor enzime i celule ntregi folosind
prepolimeri ai unor rini fotopolimerizabile i prepolimeri de rini uretanice, avnd caracter
hidrofil i/sau hidrofob. Aceti oligomeri sunt derivai de polietilenglicol, polipropilenglicol i
polibutadien, cu diferite lungimi de lan. Polimerizarea este indus prin adugare de
fotosensibilizator (ex. benzoinetileter) i iluminare cu lumin UV (360 nm). Lungimea lanului
oligomerilor poate asigura un control al porozitii gelului, iar compoziia chimic a precursorilor

poliglicolici determin hidrofilicitatea matricii polimere. Avantajul acestei tehnici este c duce la
obinerea unei matrici cu stabilitate chimic i mecanic bun.
C) ENTRAPAREA N GEL PORNIND DE LA POLIMERI CU LAN LUNG
Enzimele pot fi imobilizate nu numai n polimeri sintetici ci i n geluri naturale cum sunt
o serie de proteine (colagen, gelatin) i polizaharide (agar, alginat de calciu, -caragenan,
chitosan). Reeaua n care va fi entrapat enzima se poate forma prin gelatinizare ionic sau prin
precipitare prin metoda separrii fazelor.
Entraparea prin gelatinizare ionic este o metod foarte elastic (uor adaptabil),
utilizeaz compui netoxici i se utilizeaz de obicei la imobilizarea celulelor viabile i celulelor
foarte sensibile, iar ca matrice se utilizeaz n special alginatul de calciu.
Entraparea enzimei n gel se realizeaz prin amestecarea enzimei cu o soluie apoas a
unui polielectrolit potrivit, iar apoi acest amestec este adugat n picturi, sub agitare, ntr-o
soluie a unui ion de semn opus. Rezultatul este formarea unei structuri uniforme, sferice,
poroase, care poate reine celule, organite sau molecule enzimatice de dimensiuni mai mari dect
ale porilor. Porozitatea gelului depinde de concentraia electrolitului i a ionului de semn contrar.
Electroliii utilizai i ionii lor de semn opus sunt prezentai n tabelul 10.
Tabel 10. Polielectrolii i ionii lor de semn contrar utilizai la entraparea n gel
Polielectrolii
Polianioni
alginat de sodiu
CM - celuloz
copolimer stiren-acid maleic
copolimer acetat de vinil-acid maleic
copolimer izobuten-acid maleic
Policationi
chitosan

Ioni de semn contrar


Ba2+
Ca2+
Fe2+
Zn2+
Co2+
Fe(CN)64-, Fe(CN)63-, polifosfai

Alginatul de sodiu este unul din cei mai utilizai polianioni n imobilizarea
biocatalizatorilor. El poate fi obinut n soluie la temperatura camerei, ceea ce permite amestecul
cu biocatalizatorul fr a exista riscul denaturrii acestuia. Ca furnizor de ioni de semn contrar se
folosete de obicei clorura de calciu, obinndu-se biocatalizatori entrapai n alginat de calciu.
Metoda este simpl, rapid, se desfoar n condiii blnde, dar are o serie de dezavantaje. Gelul
de alginat de calciu, n prezena agenilor de chelatare cum sunt fosfaii, precum i a o serie de
cationi de tipul Mg2+ sau K+ se rupe ca urmare a solubilizrii legturilor cu Ca2+. Pentru a elimina
acest dezavantaj se utilizeaz ali ioni multivaleni de semn contrar cum sunt Ba2+ i Al3+.
Entraparea prin precipitarea unor polimeri naturali i sintetici se realizeaz prin
schimbarea unor parametri din soluie ca temperatura, pH-ul, tria ionic sau solventul. Ex.:
imobilizarea enzimelor n colagen, gelatin, agar i -caragenan. Dezavantajul metodei este
schimbarea unor parametri de faz, la precipitarea gelului, care poate denatura enzima.
3.2.3.2. ENTRAPARE N FIBRE
Metoda de imobilizare a enzimelor n microcavitile din interiorul fibrelor sintetice a fost
dezvoltat de ctre Dinelli (1972). Entraparea fizic a unei enzime se realizeaz prin dizolvarea
polimerului formator de fibre (de exemplu triacetat de celuloz) ntr-un solvent organic imiscibil
cu apa (cloroform, clorur de metilen, tetraclorur de carbon) i emulsionarea acestei soluii cu
soluia apoas de enzim. Emulsia este pus n contact cu un lichid coagulant (toluen sau eter de
petrol) care determin precipitarea polimerului ntr-o form filamentos, iar n interiorul acestor
fibre se gsesc micropicturi de soluie enzimatic entrapate.

Aceast metod ofer o serie de avantaje. Fibrele sunt rezistente la acizi i baze slabe, la
soluii de trie ionic mare i la diferii solveni organici. Dar, aceste fibre pot fi utilizate la
imobilizarea enzimelor ce au substraturi cu mase moleculare mici, iar utilizarea solvenilor
imiscibili cu apa i a agenilor de precipitare poate determina n unele cazuri inactivarea enzimei.
Enzimele entrapate n fibre i-au gsit aplicabilitate n industria farmaceutic (penicilinacilaza) i
n industria alimentar (-D-galactozidaza).
3.2.3.3. MICROINCAPSULAREA
Enzimele pot fi imobilizate n interiorul unor microcapsule formate din polimeri organici.
Microincapsularea creeaz celule artificiale cu o membran care, la fel ca i cea natural, asigur
un control al moleculelor ce intr i ies din celul n funcie de mrimea lor. Moleculele mari cum
sunt enzimele sau alte proteinele pot fi reinute n interiorul capsulelor, n timp ce moleculele
mici de substrat i produi pot trece prin difuzie liber prin membrana sintetic. Diametrul
microsferelor este de ordinul micronilor pn la sute de microni, iar grosimea membranei este de
sute de Angstromi pn la civa microni.
O serie de enzime mpreun cu cofactorii corespunztori pot fi microincapsulate n
interiorul membranelor polimerice i prezint activitate fa de substraturile care pot difuza n
interiorul capsulei. Activitatea remanent este n general mai mic dect cea a enzimei libere. n
timpul procedeului de microincapsulare enzima vine n contact cu solvenii organici i precursorii
polimerici, care pot avea efect denaturant asupra enzimei. Pentru a proteja enzima mpotriva
dezactivrii se utilizeaz o serie de substane cum sunt albumina seric bovin (BSA),
hemoglobin, alcool polivinilic (PVA), polietilenglicol (PEG), sau polietilenimin (PEI) care se
adaug ntr-o etap anterioar microincapsulrii.
Lipozomii, sfere concentrice de fosfolipide bistratificate, pot fi utilizai pentru
ncapsularea enzimelor dizolvate n compartimentul apos dintre cele dou straturi. Acest tip de
imobilizare este potrivit doar enzimelor care n mod normal sunt ncorporate n interiorul unor
membrane biologice i utilizarea acestei tehnici este limitat.
Avantajele acestei metode de imobilizare rezid din suprafaa mare per unitatea de enzim
imobilizat, n timp ce volumul n care este cuprins soluia enzimatic, de concentraie iniial
mare, este relativ mic, precum i din posibilitatea de a realiza imobilizarea simultan a mai
multor enzime diferite, solubile sau imobilizate anterior printr-o alt metod, dar i de celule sau
diverse biomolecule, ntr-o singur etap.
Cele mai importante dezavantaje sunt: metoda nu poate fi aplicat n cazul substraturilor
cu mase moleculare mari, n timpul procedeului de imobilizare pot aprea fenomene de inactivare
enzimatic, enzima poate fi incorporat n peretele membranar. Ca i n cazul altor metode de
imobilizare, pot aprea pierderi de enzim din microcapsule.
Tehnicile utilizate pentru obinerea enzimelor microincapsulate sunt:
A). Metoda de separare a fazelor
Metoda, care se bazeaz pe coacervare, implic dizolvarea polimerului ntr-un solvent
organic urmat de reprecipitarea acestuia prin adugarea unui alt solvent miscibil cu primul, dar
care nu dizolv polimerul. Pentru a imobiliza enzime prin aceast tehnic, se obine nti o
emulsie din soluia apoas a unei enzime i soluia polimerului ntr-un solvent organic nemiscibil
cu apa, iar apoi la faza organic ce conine microsfere apoase se adaug ncet i sub agitare un alt
solvent organic n care polimerul nu este solubil (tabel 11) i precipit, formnd membrane n
jurul microsferelor de soluie apoas enzimatic.
Tabel 11. Componentele metodei de separare a fazelor
Polimer

Primul solvent organic

Al doilea solvent organic

etilceluloz
nitroceluloz
polistiren
poliacetat de vinil

tetraclorur de carbon
eter
xilen
cloroform

eter
benzoat de butil
eter
eter

B). Metoda de polimerizare interfacial


Aceast metod se bazeaz pe un proces chimic, sinteza copolimerului insolubil n ap la
interfaa micropicturilor. Monomerul hidrofil este parial solubil att n faza apoas ct i n cea
organic, iar monomerul hidrofob este solubil doar n faza organic (tabel 12). Cei doi monomeri
polimerizeaz la interfa, obinndu-se o membran copolimeric semipermeabil.
Tehnica care st la baza acestei metode este foarte asemntoare cu cea de la metoda de
separare a fazelor. Se realizeaz o emulsie ntre soluia apoas a enzimei i un solvent organic
insolubil n ap. Monomerul hidrofil se adaug sub agitare. Polimerizarea prin condensare sau
adugarea celor doi monomeri are loc la interfaa dintre faza apoas i faza organic n emulsie.
Prin aceast tehnic, enzima, care se gsete n faz apoas, este nconjurat de membrana
semipermeabil a polimerului. Mrimea capsulelor poate fi controlat prin modificarea vitezei de
emulsionare i a concentraiei agentului de emulsionare (un surfactant organic solubil).
Tabel 12. Componentele metodei de polimerizare interfacial
Monomerul hidrofil
Poliamine
Glicol

Monomerul hidrofob
Clorura unui acid polibazic
Poliizocianat
Clorura unui acid polibazic
Poliizocianai

Polimerul
Poliamid
Poliuretan
Poliester
Poliuree

C). Metoda membranelor lichide


Aceast metod se bazeaz pe "membrane lichide", concept dezvoltat de ctre Li (1971).
Spre deosebire de alte metode de microincapsulare, unde se utilizeaz o membran
semipermeabil insolubil n ap, aici incapsularea enzimelor se face prin formarea unei
membrane lichide. Soluiile de substrat, respectiv produs sunt separate de soluia enzimatic
printr-o faz organic, membrana lichid, care mpiedic amestecarea celor dou soluii (apoase)
miscibile. Transportul prin membran se realizeaz prin solubilitate sau prin mecanisme de
transport. Membrana lichid formeaz o barier selelctiv pentru substraturi i produi.
Soluia enzimatic se prepar n dou etape. n prima faz se realizeaz o emulsie din
soluia apoas de enzim i faza organic (membrana lichid), sub agitare puternic. Stabilitatea
emulsiei este asigurat prin adugarea la faza organic a unui surfactant (Span 80, Adogen 464).
n a doua etap, emulsia stabil este dispersat ntr-o faz apoas continu, sub agitare redus.
Prin aceast metod s-a reuit conversia enzimatic a substraturilor puternic lipofile,
insolubile n ap, ex. steroizii, fr a se utiliza sisteme multifazice. Enzima este coninut ntr-o
micropictur n soluia organic a substratului lipofil. Faza organic este soluia de substrat, iar
enzima este entrapat n micelii inverse determinate de surfactantul adugat la solvenii organici.
Miceliile inverse sunt agregate formate de surfactani dizolvai n solveni apolari; capetele polare
ale surfactanilor au tendina de a respinge solventul i formeaz un miez polar care reine apa.
Moleculele hidrofile pot fi solubilizate n aceste micropicturi apoase fr a-i pierde activitatea.
Un sistem conine ca solvent izooctan, iar ca surfactant bis(2-etilhexil)sulfosuccinat de sodiu.
D). Metoda prin evaporarea solventului
Metoda se bazeaz pe microincapsularea enzimelor prin dispersie ntr-o soluie de polimer
n solvent organic nemiscibil cu apa, urmat de dispersie ntr-o soluie apoas i uscare. Iniial se
obine o emulsie ntre soluia apoas de enzim i un solvent organic cu punct de fierbere mai mic
dect al apei (benzen, ciclohexan, cloroform etc.) ce conine polimerul care va forma membrana,
utiliznd un surfactant solubil n faza uleioas. Emulsia, n care soluia apoas enzimatic se

gsete sub form de microsphere, este dispersat ntr-un mediu apos ce conine substane
coloidale cu rol de protecie (gelatin, policlorur de vinil i surfactani), formndu-se o a doua
emulsie. Enzimele microincapsulate se obin prin ndeprtarea solventului organic.
3.2.4. ENZIME SOLUBILE IMOBILIZATE
3.2.4.1. ENZIME SOLUBILE FR DERIVATIZARE
Pentru a putea utiliza enzimele n stare nativ, n mod continuu o perioad mai lung de
timp, ele au fost imobilizate prin limitare fizic prin intermediul unor membrane semipermeabile.
Metoda este foarte simpl i const doar n plasarea soluiei enzimatice pe o parte a
membranei semipermeabile. Aceast metod de imobilizare ofer o serie de avantaje fa de alte
tehnici de imobilizare prezentate. Ea permite imobilizarea simultan a mai multor enzime,
controlul selelctivitii membranare pentru substrat i produi, protecia enzimei mpotriva
contaminrii microbiene, mpiedic pierderile enzimatice. Metoda este foarte potrivit n cazul
conversiei substraturilor cu mase moleculare mari, deoarece permite contactul enzimei cu
substratul i astfel o bun conversie a acestuia. Nu are loc modificarea chimic a moleculei de
enzim. La aceste avantaje se adaug uurina cu care membrana poate fi ncrcat cu enzim,
manipulat, curat i regenerat.
Metoda prezint i o serie de dezavantaje inerente:
rezistena impus de membran la transferul de mas a unor specii din soluie;
adsorbia acestor specii la suprafaa membranei, ceea ce duce la impurificarea ei;
posibilitatea de inactivare a enzimei de ctre forele de forfecare care apar ca
urmare a unei agitri foarte puternice;
controlul riguros al timpului de sedimentare pentru substraturile cu mase
moleculare mici, n vederea obinerii unei conversii ct mai bune.
Pentru a elimina unele dintre aceste dezavantaje metoda poate fi combinat cu alte
metode de imobilizare (adsobia fizic).
Se utilizeaz bioreactoare tip membran n care biocatalizatorul este fie legat de/entrapat
ntr-o astfel de membran fie separat de mediu de ctre membran:
(R,S) - RCOOR'

(R) - RCOOR'

Enz H2O
(S) - RCOOH

(S) - RCOOH

+
R'OH

(S) - RCOOR'
in solvent organic

E
N
Z
I
M
A

(S) - RCOOH
in apa

+
(R) - RCOOR'
membrana permeabila selectiv pentru RCOOH

3.2.4.2. ENZIME SOLUBILE DERIVATIZATE


Enzimele pot fi modificate chimic fr a fi insolubilizate utiliznd substane modificatoare
cu mas molecular mare sau mic. Compuii cu mas molecular mic au utilitate limitat. n
obinerea preparatelor ce conin conjugate enzim-polimer solubile n ap au loc reacii similare
cu cele ce apar n metodele de cuplare chimic a enzimelor. Legarea enzimelor de polimeri
solubili poate fi realizat prin una din urmtoarele proceduri:
reacia enzimei cu un polimer solubil activat;
reacia enzimei cu un polimer activat insolubil urmat de solubilizarea
conjugatului enzim-polimer,

copolimerizarea monomerilor cu enzima.

Derivaii enzimatici solubili n ap se prepar n vederea creterii masei moleculare a


enzimei, ceea ce previne deblocarea ei de la suprafaa membranei i/sau mbuntirea
proprietilor mecanice i a stabilitii mecanice a enzimelor. Aceast metod permite utilizarea
membranelor de ultrafiltrare cu poroziti mari care asigur difuzia rapid a produilor, reducnd
astfel inhibiia prin produs final. Stabilizarea enzimei se poate realiza i prin legarea ei de un
polizaharid (dextran) sau prin obinerea unui mediu electrostatic stabil n jurul enzimei.
Problema esenial n obinerea acestor conjugate solubile n ap o constituie procesele
laborioase de purificare utilizate dup activarea polimerului i reacia acestuia cu enzima, precum
i separarea reactivilor n exces i a enzimei nereacionate.
3.2.5. COMPARAIE NTRE TEHNICILE DE IMOBILIZARE A ENZIMELOR
Dei se cunosc i se utilizeaz un numr mare de metode pentru imobilizarea multor
enzime, nu exist o tehnic particular ce poate fi considerat o metod ideal universal de
imobilizare, deoarece exist o diferen foarte mare ntre compoziia i caracteristicile chimice ale
diferitelor enzime, ale proprietilor substraturilor i produilor lor. Fiecare metod de imobilizare
are limitrile ei specifice, pentru orice aplicaie practic este necesar gsirea unei metode de
imobilizare simple i ieftine, pentru a obine o enzim imobilizat cu o activitate remanent bun
i o stabilitate operaional potrivit. De multe ori, o imobilizare eficient se obine dintr-o
combinare a metodelor, cum ar fi o adsorbie fizic a enzimei urmat de nreelare.
O comparaie general ntre metodele de imobilizare se poate face dac inem cont de
caracteristicile principale ale acestor metode i de suporturile folosite. n tabelul 14 sunt cuprinse
o serie de avantaje ale metodelor de imobilizare.
Imobilizarea enzimelor prin metode chimice ca nreelarea intermolecular i legarea
covalent implic modificarea chimic a enzimelor care poate duce la modificri conformaionale
i inactivarea parial a acesteia. Pentru a reduce aceste inconveniente, procesele trebuie conduse
n condiii ct mai blnde. Stabilitatea operaional a acestor preparate de enzime imobilizate este
mare, i este determinat de legturile puternice enzim-enzim i enzim-suport. nreelarea are
dezavantajul c proprietile mecanice ale preparatelor enzimatice sunt mai reduse.
Enzimele imobilizate obinute prin adsorbie fizic, legare ionic i legare de metale sunt
uor de obinut n condiii blnde. Desprinderea enzimei de pe matrice se poate produce uor n
timpul manoperelor prin modificri ale triei ionice sau pH-ului soluiei, forele de legare dintre
enzim i suport fiind slabe. Aceasta duce la obinerea unor preparate enzimatice cu activitate
remanent iniial mare, dar cu stabilitate operaional redus. Regenerarea suporturilor organice
sau anorganice este uor de realizat.
Metodele de entrapare permit obinerea unor preparate enzimatice cu o mare retenie a
activitii specifice, avnd n vedere c nu se formeaz legturi ntre enzim i suport. Aceast
tehnic este indicat s se utilizeze ns n cazul substraturilor cu mase moleculare mici.
Tabel 13. Comparaie ntre diversele metode de imobilizare
Caracteristici

nreelare

Adsorbie
fizic

Legare
ionic

Preparare
Fore de legare
Activitate enzimatic
Regenerarea
suportului
Costuri
Stabilitate

intermediar
puternice
redus

simpl
slabe
intermediar

simpl
intermediar
mare

imposibil
intermediare
mare

posibil
reduse
redus

posibil
reduse
intermediar

Legare
de metal

Legare
covalent

Entrapare

simpl
intermediare
mare

dificil
puternice
mare

dificil
intermediare
redus

posibil
intermediare
intermediare

rar
mari
mare

imposibil
intermediare
mare

Aplicaii generale
Protecia
enzimei
la atac microbian

fr
redus

da
nu

da
nu

da
nu

nu
nu

da
da

3.3. EFECTELE METODELOR DE IMOBILIZARE ASUPRA CINETICII I


PROPRIETILOR ENZIMELOR I CELULELOR IMOBILIZATE
Imobilizarea poate determina modificri ale cineticii i proprietii enzimelor i celulelor,
de cele mai multe ori concretizat printr-o scdere a activitii specifice a enzimelor. Modificarea
proprietilor enzimatice se consider a fi cauza mai multor factori:
Efectele conformaionale - cnd se produce modificarea conformaional a moleculei
enzimatice ca urmare a modificrii aminoacizilor din centrul activ al enzimei, modificrilor
conformaionale ale proteinei enzimatice i modificrii ncrcrii electrostatice a moleculei.
Efectele sterice - apar atunci cnd interaciunea dintre substrat i enzim este afectat de
mpiedicrile sterice.
Efectele de partiie - sunt legate de natura chimic a suportului; pot aprea ca urmare a
interaciunilor electrostatice sau hidrofobe ntre matrice i speciile cu greutate molecular mic
prezente n soluie, conducnd la modificarea micromediului.
Transferul de mas sau efectele difuzionale - apar ca urmare a rezistenei difuzionale la
transportul substratului din masa de soluie la situsul catalitic al enzimei i a produilor de reacie
napoi n masa de soluie. Aceast rezisten difuzional poate fi clasificat n efecte de transfer
de mas ntre i n particule, atunci cnd enzima este localizat ntr-un mediu poros, sau efecte de
transfer de mas externe sau ntre particule, care apar ntre masa de soluie i suprafaa
particulelor formate de suport i enzim.
3.3.1. SPECIFICITATEA DE SUBSTRAT
Imobilizarea enzimelor i celulelor determin modificri ale specificitii de substrat.
La imobilizarea enzimelor pe suporturi polimere insolubile n ap sau prin entrapare,
apare o scdere a activitii enzimatice fa de substraturi cu mase moleculare mari, cauzat de
mpiedicrile sterice care nu permit substratului s se apropie de moleculele de enzim. Exist
excepii, datorate probabil forelor de atracie dintre substrat i suport.
3.3.2. PARAMETRII CINETICI
Parametrii cinetici ai enzimelor imobilizate difer de cei ai enzimei native datorit
modificrilor conformaionale, mpiedicrilor sterice i efectelor de partiie i difuzie la nivelul
enzimei imobilizate. Aceste modificri pot afecta i afinitatea dintre enzim i substrat.
Constanta Michaelis, Km, poate fi sau nu modificat dup imobilizare. K m d informaii
despre afinitatea enzimei fa de substrat. Ea poate crete sau descrete. O scdere a valorii lui K m
indic o vitez mai mare a reaciei catalizate de enzima imobilizat fa de viteza reaciei n
prezena enzimei native. O cretere a valorii Km prin imobilizare indic necesitatea creterii
concentraiei de substrat pentru a obine aceeai vitez de reacie ca n cazul enzimei libere.
Atunci cnd apar efecte de difuzie interne i externe, valorile aparente ale lui Km scad,
particulele fiind nconjurate de un strat de solvent n care concentraia substratului este mai mic
dect n masa de soluie. Efectul poate fi redus prin scderea dimensiunilor particulelor
imobilizate sau prin creterea vitezei fluidului. Efectele de difuzie intern au o importan mare n
cazul suporturilor cu structuri poroase, n special n metodele de legare de suport i n entrapare.
Modificrile conformaionale ale moleculei de enzim i mpiedicrile sterice conduc de
obicei la o cretere a valorii lui K m ca urmare a scderii afinitii dintre enzim i substrat, mai
ales n tehnicile de legare covalent, cnd enzima sufer modificri chimice.

Viteza maxim de reacie (Vmax) este un alt parametru foarte important care trebuie
determinat ntr-o reacie enzimatic. Pot fi observate modificri ale vitezei maxime de reacie a
enzimelor imobilizate n sensul creterii sau scderii acesteia comparativ cu reacia catalizat de
enzime libere, dar sunt i situaii n care ea rmne aceeai.
3.3.3. DEPENDENA pH - ACTIVITATE
n foarte multe cazuri s-au observat modificri ale pH-ului optim i ale curbei de variaie
pH-activitate cauzate de imobilizarea enzimelor i celulelor microbiene.
3.3.4. DEPENDENA ACTIVITII ENZIMATICE DE TEMPERATUR
Temperatura are aceeai influen asupra activitii catalitice a enzimelor ca i asupra
catalizatorilor chimici obinuii, cu deosebirea c enzimele au activitate maxim la o anumit
valoare a temperaturii numit temperatur optim, iar temperaturile mai mari dect temperatura
optim determin scderea activitii ca urmare a denturrii structurii proteice a enzimei.
n cele mai multe cazuri dup imobilizarea enzimelor se produce o modificare a
temperaturii optime a reaciei enzimatice. Temperatura optim la imobilizarea prin entrapare n
gel i n unele cazuri prin legare ionic i covalent este mai mare dect temperatura optim a
enzimei native. Acest fenomen apare datorit efectelor de difuzie n cazul entraprii i legrii de
suporturi poroase, efecte care protejeaz enzima de denaturare termic. Temperatura real n
micromediul din jurul enzimei imobilizate este mai mic dect n masa de soluie. Aceast
diferen de temperatur poate s apar i la legarea ionic sau covalent a enzimelor de suport.
n acest caz modificrile conformaionale i mpiedicrile sterice pot juca un rol important n
creterea rezistenei la denaturarea termic.
S-au observat i situaii n care temperatura optim a enzimei imobilizate este mai mic
sau egal cu cea a enzimei libere. Au fost de asemenea determinate temperaturile optime ale
celulelor imobilizate i comparate cu cele ale celulelor libere. S-au observat att creteri ale
temperaturii optime ct i lipsa unei modificri a acesteia.
3.3.5. STABILITATEA ENZIMELOR IMOBILIZATE
Creterea stabilitii enzimelor dup imobilizare a fost observat n foarte multe cazuri i
constituie un avantaj major al enzimelor imobilizate.
Este foarte important ca dup imobilizare enzimele s-i menin o activitate maxim, att
cea iniial dar mai ales activitatea pe o perioad mai lung de timp, denumit stabilitate, pentru
a putea obine enzime imobilizate cu constante ale vitezei de incativare sczute. Este vorba de
stabilitatea enzimelor la variaii de pH, temperatur i la condiiile de mediu.
Stabilitatea la temperatur poate crete, scdea sau poate rmne nemodificat dup
imobilizare. Foarte frecvent s-a putut observa o cretere a stabilitii la temperatur a enzimelor
imobilizate comparativ cu stabilitatea enzimelor libere. Factorii care contribuie la mrirea acestei
stabiliti sunt diferii, dar efectele de difuzie intern probabil au cea mai important contribuie.
Aceste efecte sunt de asemenea responsabile de creterea stabilitii enzimelor imobilizate la pH
i la prezena agenilor denaturani (ex. EDTA). Se pare c i dimensiunile porilor influeneaz
stabilitatea enzimelor, de aceea pentru a obine enzime imobilizate cu stabilitate ct mai mare
trebuie gsite suporturi cu o dimensiune optim a porilor.
Dei nu s-a putut stabili o corelaie ntre stabilitate i metoda de imobilizare, s-a observat
c prin metodele de legare covalent i entrapare se obin preparate de enzime imobilizate cu
stabilitate termic mare. Pe de alt parte, cele mai multe enzime imobilizate prin adsorbie fizic
i legare ionic prezint o scdere a stabilitii la temperatur i de aceea nu se folosesc n situaii
care necesit o stabilitate termic mare.

Stabilitatea la temperaturi sczute (4C) cunoscut sub numele de stabilitate la


depozitare este de asemenea un parametru foarte important determinat de structura preparatului
enzimatic imobilizat. n cazul celor mai multe enzime imobilizate prin metode de legare
covalent s-a observat o cretere a stabilitii la depozitare, determinat probabil de legturile
covalente puternice ce se stabilesc ntre enzim i suport. Enzimele legate de suport prin legturi
mai slabe prezint o stabilitate mai sczut la depozitare, stabilitate ce depinde de natura soluiei
n care sunt pstrate. Studiile asupra stabilitii n timp au demonstrat c materialele anorganice,
cum este sticla poroas, sunt superioare materialelor organice (celuloza).
Stabilitatea operaional a enzimelor imobilizate este cel mai important factor de care
depinde utilizarea sistemelor de enzime imobilizate (tabel 14). n condiii de operare care n mod
normal duc la denaturarea enzimelor are loc o pierdere de activitate a enzimei imobilizate i se
produce o desprindere fizic a enzimei de suport. n cazul suporturilor poroase poate aprea
ocazional i o blocare reversibil a porilor.
Pierderi de enzim de pe suport apar n cazul eroziunii suporturilor, ruperii legturilor
dintre enzim i suport sau a reelei gelului. Metodele de legare de suport prin legturi covalente
duc la obinerea de preparate enzimatice imobilizate foarte stabile, deoarece legturile covalente
sunt mai greu de distrus. n cazul n care legturile prin care se realizeaz prinderea enzimei de
suport sunt mai slabe, se produce o pierdere de activitate enzimatic n soluie, pierdere ce
depinde de temperatur, pH, trie ionic i condiiile fizice de operare (ex. viteza de curgere).
Tabel 14. Stabilitatea operaional a enzimelor imobilizate
Enzima
Pepsin
Papain
Aspartaz

Metoda de imobilizare
legare covalent
(sticl
poroas
+
carbodiimid) nreelare
(sticl
poroas
+
glutaraldehid) entrapare
(poliacrilamid gel)

Aplicaie
hidroliza
hemoglobinei
hidroliza
cazeinei
obinere
de
acid L-aspartic

Operare
Temperatura Perioada
(C)
(zile)
23
25

Activitatea
remanent
(%)
100

45

35

50

37

20

50

Tipul reactorului utilizat (reactor cu agitare mecanic sau tip coloan) este un factor
determinat n meninerea activitii enzimatice.
Contaminarea microbian poate duce de asemenea la pierderea activitii enzimelor
imobilizate. n condiii de operare la temperaturi ridicate aceste factor nu prezint importan.
Imobilizarea enzimelor induce de asemenea stabilitate fa de reactivii chimici.
Stabilitatea fa de reactivii chimici este foarte important n aplicaiile ce utilizeaz enzime
imobilizate. Problema nu este nc rezolvat, dar s-au obinut enzime imobilizate rezistente la
aciunea unor reactivi chimici n care enzimele native sunt instabile.
Astfel crete posibilitatea conducerii reaciilor enzimatice n solveni organici, ceea ce
favorizeaz utilizarea enzimelor imobilizate n chimia organic sintetic.