PRCTICA DE LABORATORIO NRO.

01:
NUMERACINDE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS
VIABLES

I.

INTRODUCCION:
El anlisis de los alimentos est catalogado por diversas tcnicas y
mtodos para determinar microorganismos que se encuentran viables en
los alimentos ya sean slidos como las carnes, verduras y frutas, o lquidos
ya sea leche y jugos de frutas; entre estos mtodos tenemos la numeracin
de microorganismos aerobios mesfilos, la cual nos permite determinar
cuntos microorganismos contaminantes presenta un alimento sobre su
superficie o en su interior. Segn la norma tcnica Peruana para la leche
cruda (NTP 202.086:2001) y la norma tcnica Peruana para jugos de frutas
(NTP 203.002:1979) establecen que el numero de microorganismos
aerobios mesfilos y facultativos deben ser hasta un mximo de 1000000
ufc/ml, para que puedan ser consumidos por la poblacin. Por otro lado las
tcnicas para poder encontrar la numeracin de aerobios mesfilos viables
son: el recuento de colonias en placa por profundidad, superficie o por
goteo; otro el Mtodo del nmero ms probable (MPN) de grmenes como
clculo estadstico del nmero de clulas viables.El recuento total de
bacterias en placa es un mtodo til para obtener una
idea del grado de frescura o pronta alteracin de los alimentos,
dependiendo de la cantidad de bacterias presentes. La mayora de los
alimentos deben ser considerados como inadecuados para el consumo
cuando contienen un gran nmero de microorganismos, aun cuando
estos microorganismos no sean conocidos como patgenos y no
hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolpticos del
alimento. (Thatcher y Clark, 1973).

II.

OBJETIVO:
Conocer el mtodo para determinar el nmero de microorganismos
aerobios mesfilos viables.

III.

FUNDAMENTO TERICO:

La aceptabilidad de un proceso es frecuentemente el aspecto ms difcil del

anlisis de alimentos. Los anlisis microbiolgicos de los alimentos son una
herramienta eficaz en esta evaluacin, pero la interpretacin de los resultados de
laboratorio obtenidos en microbiologa es, frecuentemente, el ms difcil y
complejo aspecto de todo el proceso de evaluacin, donde entran en juego el
criterio profesional y las circunstancias que rodean al hecho (brote, control de
rutina, toma de muestra en lnea de proceso o en punto de venta, producto listo
para consumo, etc.). Para una adecuada interpretacin de estos resultados es
importante establecer qu resultados son alcanzables y/ o esperables.
Este indicador el RTBAMV es el ms importante para calificar la correcta
manipulacin de la materia prima durante todo el proceso de produccin y el buen
uso de la BPM hasta obtener el producto alimenticio final.
El anlisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y nmero
de microorganismos es bsico para la microbiologa de alimentos. Sin embargo
ninguno de los mtodos utilizados habitualmente permite determinar el nmero
exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento Son cuatro los
mtodos bsicos utilizados para investigar el nmero total de microorganismos:
1. Recuento en placa (SPC) para la determinacin del nmero de clulas
viables
2. Mtodo del nmero ms probable (MPN) de grmenes como clculo estadstico del
nmero de clulas viables
3. Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de clulas
viables con capacidad reductora
4. Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como para
las no viables.

El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin del nmero

de clulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento.
Los recuentos totales deben hacerse en funcin de uno de los siguientes factores:

mtodo de muestreo utilizado

distribucin de los microorganismos en la muestra
naturaleza de la microflora del alimento
naturaleza del alimento
antecedentes del alimento
adecuacin nutricional del medio de cultivo
temperatura y medio de incubacin
pH, aw potencial de oxidacin reduccin del medio
tipo de diluyente utilizado
nmero relativo de microorganismos en la muestra

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que

se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de
alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos
recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son
susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las
condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones
variando la temperatura, la atmsfera, la composicin del medio y el tiempo de
incubacin.
El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio:
de 34 C a > 90 C. En funcin de esto se encuadra a los microorganismos en
tres grupos:
a. Los que crecen bien a 7 C o por debajo de esta temperatura cuya
temperatura: psicrtofos
b. Los que crecen entre 20 30 C, con una temperatura ptima de
crecimiento est entre 30 40 C: mesfilos
c. Los que crecen por encima de los 45 C: termfilos
Recuento de aerobios mesfilos

En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces

de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas. En este recuento
se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos.
Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin,
las condiciones higinicas de la materia prima. Un recuento bajo de
aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de patgenos o sus
toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de
flora patgena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentacin,
no son recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar:

Excesiva contaminacin de la materia prima

Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin
La posibilidad de que existan patgenos, pues estos son mesfilos
La inmediata alteracin del producto El recuento de mesfilos nos
indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos

Mtodos normalizados
ISO 4833
Directiva general para el recuento de microorganismos. Mtodo por recuento
de colonias a 30 C Este mtodo se basa en la siembra en profundidad en un medio de
cultivo definido, vertido en dos placas de Petri, con una cantidad determinada
de muestra si el producto a examinar es lquido, o con una cantidad
determinada de suspensin madre en el caso de otros productos. En las
mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la
muestra o de la suspensin madre. Incubacin a 30 C, en aerobios durante 72
horas. A partir del nmero de colonias obtenidas en las placas de Petri, calcular
el nmero de microorganismos por mililitro o por gramo demuestra.
AF V 08-051
Mtodo de rutina para el recuento de microorganismos. Mtodo de recuento de
las colonias a 30 C Este mtodo se basa en la siembra en profundidad en un medio de
cultivo definido, vertido en una placa de Petri, con una cantidad determinada de
muestra si el producto a examinar es lquido, o con una cantidad determinada

de suspensin madre en el caso de otros productos. En las mismas

condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de
la suspensin madre. El recuento podr ser realizado utilizando un sembrador
espiral (NF V08-100) Incubacin a 30 C, en aerobiosis durante 72horas. A
partir del nmero de colonias obtenidas en las placas de Petri escogidas,
calcular el nmero de microorganismos por mililitro o por gramo demuestra

http://w w w .scrib

IV.

http://w w w .scrib

EQUIPOS Y MATERIALES:
-Placas Petri

Probetas graduadas esteriles

Agua peptonada

Balanza analtica

-Pipetas bacteriolgicas de 1 y 10ml

-matraz erlenmeyer

- mortero

- mechero de bunsen

Muestra (sndwich de pollo)

Bao de agua regulado a 44- 46C

V.

- Agar Plate Count.

- contador de colonias

PROCEDIMIENTO :
1. Preparar la muestra
2. Pipetear por duplicado a placas de Petri estriles alcuotas de 1ml a
partir de dilucin

101 102 103 103 104 105 106 .

Se sugiere esta serie

de diluciones cuando no se conoce el rango

aproximado del nmero de bacterias.

3. Agregar rpidamente a las placas de Petri 15ml de agar licuado y

temperatura entre la preparacin de la dilucin y la dilucin del agar no
debe transcurrir ms de 10 minutos.

4. Mezclar inmediatamente la alcuota con el agar mediante movimientos

de vaivn y rotacin de las placas Petri. Una secuencia satisfactoria de
paso es la siguiente:
a. Mover la placa de arriba abajo 5 veces en una direccin
b. Rotar 5veces la placa en sentido de las agujas del reloj.
c. Mover la placa 5 veces en la direccin que haga ngulo recto al
usado en el primer tiempo
d. Rotar la placa en sentido inverso al de las agujas del reloj.

5. Como control de esterilidad, adicionar a placas Petri, agar sin inocular y

agar inoculado con el diluyente.

6. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29-311C

durante 48 +/-3 horas.
Computo

del

en placas
a. Seleccionar

recuento

estndar

2placas
correspondientes a

una

dilucin

30

300

un

contador

que contenga entre

colonias

utilizando

de colonias.

b. Si las placas de diluciones consecutivas presentan menores que 30 y

mayores que 300, tomar el promedio de los 2 recuentos.
c. Si el nmero de colonias de las placas de 2 diluciones consecutivas
estn dentro del rango de 30-300, computar el recuento para cada una
de las diluciones y establecer la relacin de los 2 recuentos. Si el
cociente es menor que 2, reportar el promedio de los 2 valores, pero,
si el recuento mayor cociente 2 veces o ms que al menor, en este
caso se reportara en recuento del menor.
Multiplicar por

el factor de

dilucin

reciproco de la

dilucin

utilizada. Reportar

el resultado

como nmero de
microorganismos

aerobios

mesfilos por

gramo o mililitro segn el caso.

7. Cmputo del estimado de recuentos estndar en placas.

a. Si la placa de las diluciones muestran ms de 300 colonias, dividir

cada duplicado de las placas de la dilucin ms alta en secciones
radiales convenientes (2, 4, 8.) y contar todas las colonias en una o
ms secciones. Multiplicar el total en cada caso por el factor apropiado
para obtener el nmero de colonias por cada placa. Promediar los
estimados de las 2 placas duplicadas y multiplicar por la dilucin
correspondiente. Reportar el resultado como estimado del nmero.
Si no hubiese colonias en placas de mayor concentracin, reportar el
estimado como menor que la inversa de la dilucin.
Ejemplo:

101 = 0 colonias.

Se reporta como
este caso se reporta

10ufc /g o ml .

Si se hubiese sembrado, 0.1ml en

100ufc /g o ml .

Expresin de resultados:
a. Se deber reportar nicamente 2 dgitos significativos, ellos son el
primero y el segundo (comenzando por la izquierda) del promedio de
los recuentos. Los dems dgitos se reemplazaran por cero.
Ejemplo:
4
523.000 se reportara 520.000 = 52 x 10 ufc/ g o ml de alimento segn
sea el caso.
Si el tercer digito de la izquierda es 5 o mayor que 5, adicionar una
unidad al segundo dgito (redondear)
b. Si el recuento en placa se utiliza para determinar la aceptacin o
rechazo de un lote de alimentos, nicamente se considera el recuento
estndar en placa, nunca el estimado del recuento, ste es til
solamente como una aproximacin primaria en la determinacin de la
calidad microbiolgica de un alimento.
VI.

RESULTADOS:

Muestra

RTBAMV

1.- sndwich de pollo

40,000 ufc/gr

2.- sndwich de pollo

1,800,000 ufc/gr

3.- sndwich de hamburguesa

140,000 ufc/gr

VII.

CONCLUSIONES:

Cuando se realiza ms de una dilucin para cada uno de los parmetros se

garantiza los resultados obtenidos.
Este mtodo disminuye el margen de error y abaliza la calidad de las
pruebas
El recuento estndar en placa, permite determinar el numero de
microorganismos contaminantes encontrados en la muestra.

VIII.

RECOMENDACIONES:

Antes de comenzar con la prctica debemos de limpiar el espacio que

utilizaremos con alcohol y fuego para eliminar bacterias.
Se debe desinfectar las manos antes de comenzar la prctica y al
concluirla.

IX.

CUESTIONARIO:

1. Cmo se utiliza este indicador para evaluar la calidad de las

materias primas?

Permite estimar de forma general la carga microbiana presente en

una muestra, si bien no aporta datos concretos sobre el tipo de

especies predominantes. No obstante, su conocimiento siempre es

interesante, ya que su valor es reflejo de la calidad sanitaria y,
adicionalmente, suele proporcionar informacin con respecto a la
existencia de prcticas incorrectas, tales como vertidos o
manipulacin inadecuada.

2. Qu valores son aceptables para productos lcteos y crnicos

pasteurizados?

En productos lcteos:

En productos crnicos:

3. Grafique el procedimiento de preparacin de diluciones de

muestras.
-

Rotular los tubos de ensayo

Preparamos las diluciones:

- aadimos agua peptonada

4. Por qu no se puede utilizar este indicador para productos

fermentados?

Porque en los productos fermentados como embutidos fermentados,

queso, yogurt y otros derivados lcteos hay una gran multiplicacin
bacteriana y los microorganismos impropios no pueden diferenciarse de
la microflora propia o normal.
5. Cul es la composicin del medio de cultivo Plate Count?

X.

Formula:
Casena enzimtica hidrolizada 5.0 gr
Extracto de levadura 2.5 gr
Dextrosa 1.0 gr
Agar 15.0 gr
pH final 7.0 +/- 0.2 gr

BIBLIOGRAFA:
1.-Bourgeois

C.

M.

Microbiologa

Alimentaria.

Editorial

Continental

S.A.1995.
2.-Frazier ,W.C. Microbiologa de los alimentos .Ed. Acribia . Espaa 2000.
3.- Mossel.D.Microbiologa de los alimentos. Ed. Acribia. Espaa 2000.
4.-DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco.
5.-MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania.
6.-Ministerio de Salud DIGESA . Manual de Anlisis Microbiolgico de
Alimentos.
7.-FAO-ONU- Manuales para el control de calidad de Alimentos para la
agricultura y la Alimentacin. Roma.