INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BITICOS

INDUCCIN DE ALGUNOS MECANISMOS DE RESISTENCIA EN

TOMATE POR LA APLICACIN DE Trichoderma asperellum Tc74 PARA
EL MANEJO DE Fusarium oxysporum
f. sp. lycopersici raza 3

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRA EN CIENCIAS
EN
MANEJO AGROECOLGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES
PRESENTA
MIGUEL FELIPE MEDELLIN MUOZ

YAUTEPEC, MORELOS, DICIEMBRE DEL 2015

El presente trabajo se realiz en el Laboratorio de Cultivo de Clulas Vegetales del

Departamento de Biotecnologa contando con la colaboracin de la Dra. Gabriela
Seplveda Jimnez y en el Laboratorio de Fitopatologa del Departamento de Interacciones
Planta-Insecto del Centro de Desarrollo de Productos Biticos del Instituto Politcnico
Nacional bajo la direccin de la Maestra en Ciencias Leticia Bravo Luna. Para la
realizacin de los estudios se cont con el apoyo econmico de CONACyT (becario No.
553916) la beca tesis y del Programa Institucional de Formacin de Investigadores de la
Secretara de Investigacin y Posgrado (SIP) del IPN. La investigacin fue realizada con el
financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (20140902, 20150068, 20150081).

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa por la beca otorgada para la realizacin de

esta investigacin.
A la Maestra en Ciencias Leticia Bravo Luna, por permitirme formar parte de su equipo de
trabajo, por ser mi directora de tesis, por esas plticas informales llenas de conocimiento,
por toda la paciencia y dedicacin, por estos dos aos de formacin y amistad.

A la Doctora Gabriela Seplveda Jimnez por toda la paciencia y dedicacin para que este
trabajo se llevara a cabo, gracias por compartir su conocimiento.

A los miembros de mi comit tutorial y revisor de tesis

Dra. Kalina Bermdez Torres
Dr. Csar Guign Lopz
Dr. Roberto Montes Belmont
Dr. Federico Castrejn Ayala

Por compartir su experiencia y por todas las observaciones sugerencias y crticas para la
culminacin de este trabajo.

A la comunidad de la MAPE, a los profesores, administrativos y a todas las personas que

han contribuido con este trabajo de tesis, gracias.
DEDICATORIAS

A mis padres, abuelos y tos por todo el apoyo, amor y cuidado.

A doa Marys por mostrarme el valor del trabajo y de la familia por los regaos y consejos
la quiero mucho.
A don Roga por ser mi padre y por cuidarme gracias, lo quiero mucho
A mi hermanita Laura que siempre me aconseja y apoya gracias a ti estoy hoy en este lugar,
te quiero mucho mija chale ganas.
A mis sobrinos mi Sal y mi Carlitos, los quiero muchsimo.
A mi amada esposita, Gaby te amo, gracias por el aguante, gracias por estos dos aos de
felicidad, por aconsejarme, aguantarme, esperarme y amarme tanto.
A mis suegros Don Luis y Doa Ester a mis cuados Eli y Luis, gracias por aceptarme y
considerarme parte de su familia.
A los MAPES 2013, Mitzi y Lalo, Yuris, Paty, Lidia, Gil, Lucerito, Lul, Carlos y Miguel
gracias por su amistad, apoyo y conocimientos compartidos, se les extraa.
A Marcia y a la maestra Eli por alegrarnos los das en CEPROBI, por compartir sus
conocimientos y ancdotas las quiero mucho.
A los otros amigos de la MAPE, Maritza, Vale, Tere, Jaqueline, Katia, ngel, Hctor,
Gustavo, Miguel, Lau y sus compaeros.

NDICE
Pgina
ndice de cuadros
ndice de figuras
Resumen
Abstract

IV
V
VII
VIII

1. INTRODUCCIN

2. REVISIN DE LITERATURA

2.1 Origen, clasificacin taxonmica y caractersticas botnicas del tomate

2.2 Importancia econmica del cultivo de tomate

2.3 Plagas y enfermedades del tomate en el estado de Morelos

2.4 Clasificacin taxonmica, formas especiales y razas de Fusarium

oxysporum
2.5 Sntomas de la enfermedad marchitez vascular en plantas de tomate

2.6 Manejo de la marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum f. sp.

10

lycopersici raza 3
2.7 Los hongos del gnero Trichoderma en el control biolgico de fitopatgenos

11

2.8 Actividad de promocin de crecimiento por Trichoderma spp.

13

2.9 Induccin de resistencia en la planta por Trichoderma spp.

14

3. OBJETIVOS

18

3.1. Objetivo general

18

3.1 Objetivos especficos

18

4. MATERIALES Y MTODOS

19

4.1. Cepas de hongos y semillas de tomate

19
I

4.2. Reactivacin y propagacin de Trichoderma asperellum Tc74

19

4.3. Reactivacin de la patogenicidad y propagacin de Fusarium oxysporum f.

20

sp. lycopersici raza 3 (FOLR3)

4.4 Evaluacin de la germinacin de semilla de tomate inoculadas con

21

Trichoderma asperellum Tc74

4.4.1 Deteccin de la presencia de Trichoderma asperellum Tc74 en la planta y

22

en el sustrato
4.5 Inoculacin y siembra de semillas de tomate con Trichoderma asperellum

23

Tc74 y/o con Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3

4.6 Evaluacin de la actividad de las enzimas glucanasas y quitinasas

24

4.6.1 Colecta de muestras

24

4.6.2 Obtencin de extractos enzimticos

25

4.6.3 Elaboracin de curvas patrn para determinar la actividad de glucanasas y

25

quitinasas
4.6.4 Evaluacin de la actividad de glucanasas y quitinasas

27

4.6.5 Anlisis estadstico de la actividad de glucanasas y quitinasas

29

4.7 Evaluacin de la severidad de la marchitez vascular en plantas de tomate

29

4.7.1 Evaluacin de variables de crecimiento y desarrollo

30

4.7.2 Determinacin del contenido de clorofilas y carotenoides totales

31

4.7.3 Anlisis estadstico

32

5. RESULTADOS

33

II

5.1 Evaluacin del efecto de Trichoderma asperellum Tc74 sobre la germinacin

33

de semillas de tomate
5.2 Establecimiento de Trichoderma asperellum Tc74 en raz de tomate y en

34

sustrato
5.3 Evaluacin del efecto de Trichoderma asperellum Tc74 sobre la actividad de

35

glucanasas y quitinasas en raz y hojas de plantas de tomate infectadas con

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (FOLR3)
5.3.1 Experimento 1. Actividad enzimtica a los 5 das posteriores a la infeccin

35

con FOLR3
5.3.2 Experimento 2. Actividad enzimtica a los 3, 5 y 7 das posteriores a la

37

infeccin con FOLR3

5.4 Sintomatologa y severidad de la enfermedad marchitez vascular en plantas

41

de tomate inoculadas y sin inocular con Trichoderma asperellum Tc74

5.5 Crecimiento y desarrollo de plantas de tomate inoculadas con Trichoderma

43

asperellum Tc74 e infectadas con Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3

5.6 Cuantificacin de clorofilas y carotenoides totales en hojas de plantas de

46

tomate inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74 e infectadas con Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici raza 3
6. DISCUSIN

48

7. CONCLUSIONES

56

8. LITERATURA CITADA

57

Anexo 1

68

III

NDICE DE CUADROS
Pgina
Cuadro 1.

Escala de severidad de la enfermedad marchitez vascular.

30

Cuadro 2.

Actividad de glucanasas y quitinasas en raz de plantas de

36

tomate, inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74, a los

cinco das posteriores a la infeccin con Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici raza 3 (FOLR3).
Cuadro 3.

Actividad de glucanasas y quitinasas en hojas de plntulas de

36

tomate, inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74, a los

cinco das posteriores a la infeccin con Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici raza 3 (FOLR3).
Cuadro 4.

Altura, peso fresco y peso seco de plantas de tomate inoculadas

45

con Trichoderma asperellum Tc74 e infectadas con Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici raza 3.

IV

INDICE DE FIGURAS
Pgina
Figura 1.

Estructura qumica de una unidad de glucosa y -N-acetil-

26

glucosamina.
Figura 2.

Germinacin de semillas de tomate: testigo e inoculadas con

33

Trichoderma asperellum Tc74.

Figura 3.

Trichoderma asperellum Tc74 aislado de fragmentos de raz de

34

tomate y del sustrato.

Figura 4.

Actividad de glucanasas y quitinasas en raz de plantas de tomate

39

inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74, a tres tiempos

posteriores a la infeccin con Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici raza 3.
Figura 5.

Actividad de glucanasas y quitinasas en hoja de plantas de tomate

40

inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74, a tres tiempos

posteriores a la infeccin con Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici raza 3.
Figura 6.

Sntomas de amarillamiento y coloracin prpura en las

41

nervaduras de las hojas de plantas de tomate variedad Sun 7705

inoculadas con FOLR3.
Figura 7.

Severidad del amarillamiento en hojas de plantas de tomate

42

inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74 y/o infectadas con

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3.

Figura 8.

Severidad de la enfermedad marchitez vascular en plantas de

43

tomate de 85 das de emergencia y 50 das posteriores a la

infeccin con Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3.
Figura 9.

Races primarias y secundarias de plantas de tomate sin inocular e

44

inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74 e infectadas con

Fusarium oxysporum f. sp. lycoersici raza 3.
Figura 10.

Contenido de clorofilas y carotenoides totales de hojas de plantas

47

de tomate de 85 das de emergencia inoculadas con Trichoderma

asperellum Tc74, a los 50 das posteriores a la infeccin con
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3.

VI

RESUMEN
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (FOLR3) causa severos daos en el cultivo de
tomate. Una alternativa al control qumico es el uso de especies del gnero Trichoderma,
que inducen en plantas la actividad de las enzimas glucanasas y quitinasas para la defensa
contra patgenos. En este trabajo se evalu el efecto de la inoculacin de Trichoderma
asperellum cepa (Tc74) en la germinacin de semillas de tomate variedad Sun 7705 y en la
actividad de glucanasas y quitinasas, y su relacin con la resistencia a la marchitez vascular
causada por FOLR3. La germinacin de semillas inoculadas con Tc74 y sin inocular se
cuantific por 11 das. La actividad de glucanasas (mol de glucosa min-1 g-1 de peso
fresco) y quitinasas (mol de N-acetil-glucosamina h-1 g-1 peso fresco) en hoja y raz se
midi en cuatro lotes de plantas de 35 das de edad: 1) testigo, 2) con Tc74, 3) con FOLR3
y 4) con Tc74 y FOLR3. Se realizaron 2 experimentos, en el primero se determin la
actividad a los 5 das despus de la inoculacin (ddi) con FOLR3, y en el segundo a los 3, 5
y 7 ddi con FOLR3. La cintica de germinacin mostr que Tc74 estimul la germinacin
durante los 11 das, en un intervalo de 8.6 a 25.7%. En raz, la actividad de glucanasas no
cambi, pero la actividad de quitinasas se estimul en las plantas con los tratamientos Tc74
y FOLR3. La actividad de glucanasas en hoja se estimul con todos los tratamientos y la
actividad de quitinasas, solo con Tc74. En la cintica a los 3, 5 y 7, la actividad de
glucanasas no se indujo; pero en quitinasas se indujo con Tc74 y con Tc74+FOLR3 en raz
y hoja. La aplicacin de Tc74 disminuy el amarillamiento ascendente en las plantas,
indujo crecimiento vegetal y la produccin de clorofilas y carotenoides. Se concluye que
Tc74 favorece la germinacin de las semillas de tomate y disminuye la severidad causada
por FOLR3; a travs de que induce la actividad de quitinasas en raz y hojas y de promover
el desarrollo de las plantas.

VII

ABSTRACT
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 3 (FOLR3) causes severe damage to tomato
crop. Alternatively to the chemical control, the biological control with Trichoderma fungus
is used; because, this fungi induce enzymes activity as chitinases and glucanases involved
in the plant defense against pathogens. The aim of this work was to evaluate, the effect of
the inoculation with Trichoderma asperellum strain Tc74 (Tc74) on the seeds germination
of tomato and the activity of glucanases and chitinases, and on the resistance at the vascular
wilt caused by FOLR3. The tomato seeds from Sun 7705 variety were inoculated with Tc74
and germination was measured for 11 days. Control was non-inoculated seeds. The activity
of glucanases (mol de glucose min-1 g-1 fresh weight) and chitinases (mol of Nacetylglucosamine h-1 g-1 fresh weight) was measured in leaves and roots from plants of 35
days old. The treatments were plants: 1) non-inoculated (control), 2) inoculated with Tc74,
3) inoculated with FOLR3, and 4) inoculated with Tc74 and FOLR3. This experiment was
performed twice; in the first experiment, the enzymes activity was determined at 5 days
after inoculation with FOLR3; in the second experiment, the enzymes activity was
measured at 3, 5 and 7 after inoculation with FOLR3. The inoculation with Tc74 stimulated
the germination during the 11 days, in a range of 8.6 to 25.7%. In roots, the glucanases
activity did not change, but the chitinases activity was stimulated in plants inoculated with
only Tc74 or with FOLR3. In leaves, the glucanases activity was stimulated with the four
treatments; while, the chitinases activity was only induced in plants inoculated with Tc74.
During the 3, 5 and 7 days after inoculation, the glucanases activity was not induced; but in
roots and leaves, the chitinases activity only was induced with the application of Tc74 or
with both fungi. The inoculation with Tc74 decreased the yellowing of plants and was
stimulated the production of chlorophylls and carotenoids in leaves. In conclusion, the
inoculation with TcT4 promotes the seeds germination of tomato and decreases the disease
severity caused by FOLR3; because, Tc74 induces the chitinases activity of leaves and
roots and promotes the plant growth.

VIII

1. INTRODUCCIN

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es una hortaliza de importancia econmica y

gastronmica en Mxico, producida y consumida en todo el territorio nacional. En el 2013
Morelos produjo 77,035 t en 2,248 ha, ocupando el dcimo segundo lugar (SIAP 2013).
Un problema fitosanitario en este cultivo son las enfermedades causadas por hongos. La
marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (FOLR3) es
una de las principales enfermedades que atacan al cultivo del tomate (Amini 2009). Para su
control se aplican fungicidas sintticos los cuales son txicos, causan resistencia en los
patgenos y contaminan el producto final (Ramrez-Rojas et al. 2009). El uso de variedades
resistentes es otra alternativa pero resulta ineficaz ya que son pocas las variedades en el
mercado que presentan resistencia a la raza 3 de este patgeno (Cai et al. 2003).
Otra alternativa es el uso de cepas de hongos del gnero Trichoderma, estos tienen la
capacidad de controlar a otros organismos por diversos mecanismos de ataque; adems en
la planta inducen resistencia y promueven el crecimiento vegetal (Hermosa et al. 2004).
La cepa Trichoderma asperellum Tc74 (Tc74) ha sido evaluada in vitro y en invernadero
mostrando actividad micoparastica y de antibiosis y una menor incidencia y severidad de
la enfermedad marchitez vascular ocasionada por FOLR3, adems de promover el
crecimiento vegetal (Ortega 2010). En otro estudio con la cepa Tc74, Guzmn-Valle et al.
(2014), concluyen que la aplicacin de T. asperellum protege al cultivo de cebolla de tres
variedades contra Sclerotium rolfsii por la actividad constitutiva e inducida de las enzimas
glucanasas, quitinasas y peroxidasas. Las respuestas bioqumicas variaron dependiendo de
1

la variedad de cebolla, estos autores sugieren la aplicacin de T. asperellum como una

alternativa biolgica a los fungicidas sintticos para la proteccin contra S. rolfsii.
Las enzimas glucanasas y quitinasas pueden ser inducidas en la planta como una respuesta
al ataque de un patgeno, o por hongos benficos como Trichoderma, estas enzimas pueden
destruir la pared celular de los hongos, causando una lisis celular (Franco-Chvez et al.
2011). Aunque se han identificado los mecanismos mediante los cuales esta cepa ataca a
otros hongos, an se desconocen los cambios bioqumicos que causa en la planta y su
relacin con la induccin de la resistencia a enfermedades, por lo tanto es necesario
conocer si estas enzimas son inducidas en el patosistema tomate-FOLR3-T. asperellum
Tc74.

2. REVISIN DE LITERATURA

2.1 Origen, clasificacin taxonmica y caractersticas botnicas del tomate

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es una planta originaria de Sudamrica, del centro de
Per y Ecuador, del norte de Chile y de las islas Galpagos. Domesticado de forma
independiente en Per y Mxico, de donde se distribuy a Norteamrica y Europa (Peralta
y Spooner 2007).
Desde su introduccin a Europa en el siglo XVI, varios botnicos lo relacionaron con el
gnero Solanum, en 1753 Linneo lo clasific y lo nombr Solanum lycopersicum. Un ao
despus Miller lo reclasific y nombr como Lycopersicum esculentum (Peralta y Spooner
2007). Actualmente la clasificacin del tomate dada por la Integrated Taxonomic
Information System (ITIS 2012) es la siguiente:
Reino: Plantae
Divisin: Tracheophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Solanales
Familia: Solanaceae
Gnero: Solanum
Especie: Solanum lycopersicum L.

El tomate es una planta constituida por un tallo principal largo, con ramificaciones y posee
hojas alternas de 15 a 45 cm de longitud. Los tallos y las hojas son verdes y speros al
tacto, las flores son amarillas y se agrupan en racimos de tres a siete flores; segn el
crecimiento de la plantas se distinguen dos tipos de variedades las de crecimiento
determinado e indeterminado (FAO 2012).
Las variedades con desarrollo determinado presentan un crecimiento simpodial
(ramificado) con un porte bajo y compacto, con una cantidad de brotes que van de dos a
cinco segn el material vegetal, las ramas laterales son de crecimiento limitado (Prez et al.
2001). El tallo principal y las ramificaciones laterales terminan en una inflorescencia
(Blancard 2012) en estas variedades los racimos aparecen cada 2 hojas (Escalona et al.
2009).
Las variedades de crecimiento indeterminado cuentan con un solo tallo, cuyo pice posee
un meristemo de crecimiento que produce un alargamiento continuo creciendo
indefinidamente (Escalona et al. 2009). Despus de la germinacin y aparicin de los
cotiledones el tallo se desarrolla y se producen de 6 a 9 hojas alternas, antes de la aparicin
de la primera inflorescencia que lleva de 5 a 12 flores. A continuacin se forman 3 nuevas
hojas antes de una nueva inflorescencia, el crecimiento contina as por series de 3 hojas y
una inflorescencia (Blancard 2012). En las axilas formadas por el tallo y los pecolos de las
hojas, crecen nuevos brotes que seguirn el mismo patrn que el tallo principal, pero que
generalmente son removidos segn el sistema de poda que se aplique (Escalona et al.
2009).

2.2 Importancia econmica del cultivo de tomate

El tomate es una hortaliza de importancia mundial, por su sabor es consumida en fresco o
como ingrediente en platillos (Bautista y Alvarado 2006). La produccin del tomate ocupa
el segundo lugar entre las hortalizas cultivadas a nivel mundial, China, India y Estados
Unidos son los pases que producen el 46% de esta hortaliza (FAO 2012). En Mxico se
cultiva en las 32 entidades federativas, pero los principales productores se encuentran en la
zona centro y noroeste del pas, siendo los estados de Sinaloa, Baja California, Zacatecas,
San Luis Potos y Jalisco los que aportan el 58% de la produccin. El estado de Morelos
ocupa el dcimo segundo lugar con 2.5% de la produccin nacional y son los municipios de
Atlatlahucan, Totolapan, Tlayacapan, Tepalcingo y Yecapixtla, los que aportan el 69% de
la produccin estatal (SIAP 2013).
Para el cultivo de tomate en Morelos se distinguen dos tipos de siembra, a) a cielo abierto,
que es de temporal en los meses de junio y julio y b) la de invernadero, que se hace a lo
largo del ao. De las 2,256 ha destinadas al cultivo del tomate solo 120 ha cuentan con
siembra en invernadero (SIAP 2013, Osuna et al. 2012, SPT 2010). En el caso del cultivo
de tomate en invernadero se utiliza la plntula germinada en charola, lo que permite un
mejor control de los factores que interfieren con la emergencia, principalmente hongos
causantes de secaderas y vectores que transmiten virus, adems del riego y la nutricin.
Treinta das despus, la plntula es trasplantada a macetas con tezontle o directamente al
suelo donde la planta contina su desarrollo hasta la etapa de produccin. Para el manejo
del cultivo se realizan podas, tutoreo, despunte, deschupone y polinizacin (manual o con
insectos), as como fertilizacin y control de plagas y enfermedades (Osuna et al. 2012).

2.3 Plagas y enfermedades del cultivo del tomate en el estado de Morelos

El tomate es atacado por plagas y enfermedades que afectan en las distintas etapas
fenolgicas del cultivo, interviniendo en el desarrollo y la productividad e incluso causando
prdidas totales del cultivo. Entre las plagas del tomate se encuentra a nematodos del
gnero Meloidogyne, insectos de los rdenes Diptera, Hemiptera, Lepidoptera y
Thysanoptera, y los caros Tetranychus urticae y Aculops lycopersici (Bautista y Alvarado
2006, Ramrez-Rojas et al. 2009).
Entre los agentes que causan enfermedades y que atacan al tomate se reportan a las
bacterias Clavibacter michiganensis subp. michiganensis y Ralstonia solanacearum, a los
virus marchitez manchada del tomate (TSWV), el virus mosaico del tabaco (TMV) y el
virus mosaico del pepino (CMV), a los Ooomicetes Phytophthora infestans y Pythium spp.
y a los hongos Rhizoctonia solani, Alternaria solani, Leveillula taurica, Cladosporium,
fulvum, Botrytis cinerea, Phoma sp., Sclerotium rolfsii, Fusarium solani y Fusarium
oxysporum (Ortega 2010, Ramrez-Rojas et al. 2009).
Fusarium oxysporum se destaca por causar marchitez vascular, manchas de las hojas,
pudricin de raz, tallos, frutos, granos y semillas de diversas plantas (Leslie y Summerell
2006).

2.4 Clasificacin taxonmica, formas especiales y razas de Fusarium oxysporum

De acuerdo al National Center for Biotechnology Information (NCBI 2014) la clasificacin
taxonmica de Fusarium oxysporum es la siguiente:
Reino: Fungi
Divisin: Ascomycota
Clase: Sordariomycetes
Orden: Hypocreales
Familia: Nectriaceae
Gnero: Fusarium
Especie: Fusarium oxysporum Schltdl.
La especie comprende un complejo de ms de 100 formas especiales y razas que atacan a
diversos cultivos alrededor del mundo. El trmino forma especial (f. sp.) se aplica para
distinguir formas patgenas de una especie particular que morfolgicamente es
indistinguible, pero que son diferenciadas por su patogenicidad hacia una especie vegetal o
un grupo de especies de un mismo gnero, y estas a su vez pueden dividirse en razas, la
raza se designa en base a la patogenicidad hacia un conjunto de variedades o cultivares
(Leslie y Summerell 2006).

2.5 Sntomas de la enfermedad marchitez vascular en plantas de tomate

El cultivo del tomate puede ser atacado por dos formas especiales de F. oxysporum: F.
oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (FORL) que causa la pudricin de raz y corona

(Apodaca-Sanchez et al. 2001) y F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) causante de la

marchitez vascular o fusariosis (Bez-Valdez et al. 2010).
Las dos formas especiales de F. oxysporum, causan sntomas iniciales similares que no
permiten distinguir una forma especial de otra (Bautista y Alvarado 2006), algunas
caractersticas que nos pueden ayudar a determinar la forma especial, son el grado de
avance de la enfermedad y la temperatura a la que se presenta la enfermedad (Cruz-Alcal
et al. 2000).
En el caso de FORL el patgeno causa clorosis en el follaje, marchitez y pudricin radical;
lesiones necrticas que con frecuencia ascienden hasta 30 cm a partir del cuello de la
planta, de ah el nombre de la forma especial radicis-lycopersici. En la raz principal hay
una pudricin seca y numerosas lesiones pequeas de color caf gris en el punto de
emergencia de las races laterales, as como una coloracin prpura en las races afectadas;
las plantas mueren generalmente al inicio de la maduracin de los frutos (Apodaca-Snchez
et al. 2004); la temperatura ptima para el desarrollo de FORL es de 18 a 20 C (CruzAlcal et al. 2000).
Para el caso de FOL, en las plntulas pueden encontrarse sntomas iniciales en uno o varios
rganos de la plntula, en radcula se manifiesta necrosis en el pice o base, en el hipoctilo
la necrosis inicia en la corona, y en hojas cotiledonales se presentan puntos necrticos
aislados y tanto en radcula como en hipoctilo, la necrosis se extiende de forma ascendente
hasta abarcar parte de la plntula o cubrirla completamente, en algunos casos se presenta
estrangulamiento de la corona (Domnguez 2012).

Las plantas adultas sufren sntomas muy similares a los descritos anteriormente, en el
interior del tallo se observa necrosis color caf que puede extenderse ms de 50 cm a partir
de la corona y en el exterior la necrosis se distribuye de forma longitudinal; en raz y
corona se observa pudricin adems de coloracin rosada, en follaje se observan dos tipos
de sntomas, marchitez y/o amarillamiento en toda la planta, y marchitez y/o
amarillamiento de forma longitudinal o transversal (Domnguez 2012). El amarillamiento
de los tejidos foliares se asocia a menudo con el marchitamiento y tiende a empeorar en las
horas ms clidas del da. Eventualmente las hojas se secan por completo, pero no se
desprenden del tallo. Estos sntomas secundarios se extienden a otras partes de la planta, a
menudo esto conduce a la desecacin y muerte final de la planta (Blancard 2012). La
temperatura ptima para el desarrollo de este patgeno es de 28 C (Cruz-Alcal et al.
2000).
Se conoce que FOL es altamente destructivo en todos los lugares donde se cultiva tomate
(Amini 2009). El patgeno prospera en una diversidad de condiciones ambientales desde
trpicos secos hasta climas templados, adems se han reportado tres razas (Cai et al. 2003),
lo que hace ms difcil su control. El marchitamiento vascular del tomate fue descrito por
primera vez por Masse en 1885 en las islas de Wight y Guernsey, situadas en el Canal de la
Mancha, Inglaterra y en 1940 se encontr diseminada en todo el mundo. En 1945
Alexander y Tucker detectaron la presencia de una nueva raza en Ohio EUA, a la que se
denomin raza 2 (FOLR2). La raza 3 (FOLR3) se observ en Australia en 1978 y
posteriormente en California, Florida, Georgia, Arkansas, Carolina del Norte y Tennessee,
EUA (Cai et al. 2003).

En Mxico en 1996 se report la presencia de FOLR3 en cultivos de tomate (ValenzuelaUrieta et al. 1996). En particular para el estado de Morelos en el ao de 2010 se report por
primera vez la presencia de FOLR3 en plantas de tomate cultivadas en el municipio de
Emiliano Zapata (Ortega 2010), y en el 2012 tambin en plantas de tomate cultivadas en los
municipios de Tepalcingo, Mazatepec y Xochitepec (Domnguez 2012).

2.6 Manejo de la marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici raza 3
La aparicin y el desarrollo de nuevas razas patognicas de FOL es un problema continuo
en la produccin de tomate. Para el manejo de la marchitez vascular en tomate se usan
fungicidas sintticos del grupo qumico de los benzimidazoles, que se aplican en la etapa de
plntula; as como metam sodio que se aplica al suelo antes de la siembra. Sin embargo, la
aplicacin de dosis distintas a las recomendadas y el uso de fungicidas con el mismo sitio
de accin han generado resistencia en los patgenos hacia estos productos, contaminacin
del ambiente y daos a la salud del consumidor (Ramrez-Rojas et al. 2009, Srivastava et al.
2009, Blancard 2012).
El uso de variedades de plantas de tomate resistentes es otra opcin que se utiliza para el
control de especies de Fusarium. En el mercado existen variedades de tomate resistentes a
FOLR1 y FOLR2 que son distribuidas por las casas comerciales Enza Zaden, Harris
Moran, Gowan, Numhems, Hazera genetics y Zeraim, pero pocas de estas variedades son
resistentes a FOLR3 (Domnguez 2012).

10

Entre las variedades de tomate de crecimiento indeterminado utilizadas en los invernaderos

del estado de Morelos se encuentra la variedad Sun 7705 (Domnguez 2012) un hbrido de
crecimiento indeterminado, con una amplia adaptacin geogrfica y ambiental, y con un
buen rendimiento, resistente a las razas 1 y 2 de FOL pero susceptible a F. oxysporum f.sp.
lycopersici raza 3 (Nunhems 2014).
El control biolgico con microorganismos antagonistas de patgenos es otra alternativa
ecolgicamente aceptable, ya que tienen potencial para atacar a una gran variedad de
microorganismos del suelo (Chandel et al. 2010, Srivastava et al. 2010). Entre los
microorganismos antagonistas se encuentran a las bacterias del gnero Bacillus y hongos
del gnero Trichoderma, que actan contra un gran rango de patgenos y adems
promueven el crecimiento de la planta (Kloepper et al. 2004, Vinale et al. 2008b).

2.7 Los hongos del gnero Trichoderma en el control biolgico de fitopatgenos

Los hongos del gnero Trichoderma son utilizados en la industria como productores de
enzimas y protenas, para la produccin de metabolitos secundarios y como agentes de
control biolgico de patgenos (hongos, bacterias y nematodos) que causan diversas
enfermedades de los cultivos (Vinale et al. 2008a, Kubicek et al. 2008).

11

El hongo Trichoderma est clasificado taxonmicamente por la National Center for

Biotechnology Information (NCBI 2014) como se presenta a continuacin:
Reino: Fungi
Divisin: Ascomycota
Clase: Sordariomycetes
Orden: Hypocreales
Familia: Hypocreaceae
Gnero: Trichoderma
Trichoderma es un habitante de suelos de distintas zonas climticas, aislado de las races de
muchas plantas donde establece una relacin oportunista con las plantas (Vinale et al.
2008b).
Cuando Trichoderma se asocia con alguna planta puede producir en esta cambios
bioqumicos que pueden promover el crecimiento, proteger a la planta del ataque de otros
microorganismos e inducir metabolitos secundarios utilizados para la defensa, estas
caractersticas pueden variar entre especies e incluso entre cepas de una misma especie
(Vinale et al. 2008b, Harman 2004 ).
La promocin de crecimiento vegetal depender de la capacidad de Trichoderma para
reconocer y adherirse a las races, penetrar la epidermis y detoxificar los metabolitos
producidos por la planta en respuesta a la invasin (Hermosa et al. 2012).
Mientras que la proteccin que puede brindar a la planta puede ser mediante un
antagonismo directo por micoparasitismo, o indirectamente produciendo compuestos con

12

actividad antibitica y compitiendo por espacio y nutrientes (Nawrocka y Malolepsza

2013).

2.8 Actividad de promocin de crecimiento por Trichoderma spp.

Algunas cepas de Trichoderma pueden crear cambios positivos en el crecimiento vegetal de
las plantas causadas por algunos compuestos similares a citoquininas y auxinas,
fitohormonas que estimulan la germinacin de semillas y el desarrollo de las plantas
(Druzhinina et al. 2011), adems la colonizacin de la raz por Trichoderma puede
acidificar el entorno mediante la secrecin de cidos fumrico, glucnico y ctrico que
disminuyen el pH del suelo, permitiendo, la solubilizacin de fosfatos, micronutrientes y
cationes minerales que incluyen hierro, manganeso y magnesio, la disposicin de estos
minerales se ve reflejada en una reduccin del estrs abitico, un aumento en la tasa
fotosinttica de la hoja, mayor crecimiento y aumento en la biomasa de las plantas
(Hermosa et al. 2012, Harman et al. 2004).
La aplicacin de Trichoderma ha sido evaluada en semillas de hortalizas como pepino
(Cucumis sativus) (Pill et al. 2009) y tomate (Solanum lycopersicum) (Srivastava et al.
2010) as como en semillas de plantas ornamentales como girasol (Elianthus annuus)
(Nagaraju et al. 2012) y boca de dragn (Antirrhinum majus) (Bhargava et al. 2015), en
todos los casos se observ un aumento en la germinacin de semillas. En plntulas de maz
(Harman et al. 2004b) y tomate (Mehrabi-koushki et al. 2012) se han observado efectos

13

positivos en la produccin de races secundarias, aumento en el peso fresco y aumento del

rea foliar.

2.9 Induccin de resistencia en la planta por Trichoderma spp.

La induccin de resistencia es la reprogramacin fisiolgica y bioqumica de las plantas,
como una respuesta a la interaccin con otros microorganismos y con el ambiente, los
hongos del gnero Trichoderma poseen caractersticas para inducir cambios en las plantas
asociados a una respuesta de defensa (Nawrocka y Malolepsza 2013).
En la resistencia sistmica, pueden participan el cido saliclico, cido jasmnico y etileno.
Cuando el cido saliclico acta como sealizador, se conoce como resistencia sistmica
adquirida (RSA) y est asociado a la interaccin planta-patgeno, y cuando intervienen el
cido jasmnico y el etileno se conoce como resistencia sistmica inducida (RSI) y est
asociado a la interaccin planta-microorganismo benfico (Hermosa et al. 2012, Shoresh et
al. 2010).
La RSI es el mecanismo ms descrito en la interaccin planta-Trichoderma (Shoresh et al.
2010), entre los metabolitos que actan como inductores de la planta se han identificado a:
protenas con actividad enzimtica, los productos de genes de avirulencia y compuestos de
bajo peso molecular (Harman et al. 2004a).
La induccin de resistencia depende de varios eventos que se disparan cuando Trichoderma
reconoce a la planta e intenta penetrar las races; iniciando una cascada de eventos que

14

culmina con la produccin de enzimas para la defensa como las quitinasas, glucanasas,
peroxidasas, catalasas y fitoalexinas (Nawrocka y Malolepsza 2013).
Al reconocer a su hospedero, la hifa de Trichoderma intenta penetrar la epidermis de la
raz, la planta es capaz de detectar protenas y metabolitos secundarios secretados por el
hongo llamados patrones moleculares asociados a patgenos (PAMP por sus siglas en
ingls), a travs de patrones receptores de reconocimiento (PRRs, por sus siglas en ingls)
localizados en la membrana plasmtica; despus del reconocimiento por parte de la planta
inicia una rpida activacin de los canales inicos, con el flujo de iones de Ca2+ , H + , K + y
Cl . El desbalance de la actividad de los canales inicos provoca cambios en la membrana
plasmtica, y en las zonas del simplasto y el apoplasto; posteriormente se producen
especies reactivas de oxgeno (Vinale et al. 2008b), como el perxido de hidrgeno
involucrado en la expansin y lignificacin de la pared celular y en la activacin de las
peroxidasas y canales de calcio, adems de elicitar la sntesis y acumulacin de enzimas y
metabolitos secundarios y molculas de sealizacin, que disparan la respuesta bioqumica
de defensa (Nawrocka y Malolepsza 2013).
En la respuesta de RSA y RSI se pueden expresar genes que disparan enzimas con
actividades diversas, como las celulasas, glucanasas y quitinasas involucradas en el control
directo de patgenos; peroxidasas que son utilizadas para la sntesis de metabolitos
secundarios y en el reforzamiento de las barreras bioqumicas; las enzimas fenil amonio
liasa y chalcon sintasa involucradas en la sntesis de polifenoles que incluyen flavonoides,
antocianinas, fitoalexinas y lignina y la isoprenoide sintasa que cataliza productos

15

derivados de isoprenos como terpenoides, fitoalexinas y giberelinas (Nawrocka y

Malolepsza 2013).
La induccin de una u otra ruta depender de la interaccin Trichoderma-planta- patgeno,
incluso puede desarrollarse por etapas debido a la existencia de ms de un elicitor al
momento del reconocimiento (Hermosa et al. 2013).
Las enzimas glucanasas y quitinasas son un grupo de enzimas con actividad ltica, las
glucanasas hidrolizan los enlaces , 1-3 y , 1-6 glucano y las quitinasas que pueden
hidrolizar quitina, provocando un rompimiento de la pared celular, evitando el desarrollo
normal del hongo patgeno (Rose et al. 2002).
La pared celular de los hongos est compuesta principalmente de glucanos y quitina, se
considera que entre un 50-60% de la pared celular de los hongos est constituida de
glucanos y un 1% lo constituye la quitina, estos polisacridos, son los encargados de darle
forma y rigidez a la clula fngica (Bowman y Free 2006).
La induccin de estas enzimas utilizando Trichoderma se ha estudiado con plantas de
pepino (Cucumis sativus) ((Alizadeh et al 2013) y cebolla (Allium cepa) (Guzmn-Valle et
al. 2014, Camacho 2014), observando una mayor induccin de estas enzimas en los
tratamientos con Trichoderma.
Adems del efecto ltico de estas enzimas se han encontrado otras funciones para las
enzimas -1,3-glucanasas y quitinasas. En algunas solanceas se han encontrado que las 1,3-glucanasas son inducidas durante la germinacin debilitando el endospermo al
hidrolizar la pared celular, promover la ruptura y permitir la emergencia de la radcula.

16

Cuando las plantas se exponen a bajas temperaturas estas enzimas limitan el crecimiento de
cristales de hielo en el apoplasto, disminuyendo la ruptura de membranas (Balasubramanian
et al. 2012), para el caso de quitinasas se ha observado que estas se inducen en plntulas de
abeto rojo expuestas a bajas temperaturas (Dalen 2015), y se han relacionado con la
tolerancia al estrs causado por metales pesados (Mszros et al. 2015).

17

3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Evaluar el efecto de la inoculacin de Trichoderma asperellum Tc74 sobre la germinacin
y la actividad de las enzimas glucanasas y quitinasas de tomate (Solanum lycopersicum), y
su relacin con el control de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3.
3.2 Objetivos especficos
Evaluar la germinacin de semillas de tomate inoculadas con T. asperellum Tc74.
Evaluar la actividad de glucanasas y quitinasas, en raz y hoja de tomate inoculado con T.
asperellum, e infectado con F. oxysporum f. sp. lycopersici raza 3.
Evaluar la severidad de la enfermedad marchitez vascular en la interaccin T. asperellumtomate-F. oxysporum f. sp. lycopersici raza 3.
Evaluar el crecimiento y desarrollo, y el contenido de clorofilas y carotenoides en plantas
de tomate inoculadas con T. asperellum y/o infectado con F. oxysporum f. sp. lycopersici
raza 3.

18

4. MATERIALES Y MTODOS
El presente trabajo se realiz en los Laboratorios de Fitopatologa y Biotecnologa y en el
invernadero del campo experimental del Centro de Desarrollo de Productos Biticos
(CEPROBI) del Instituto Politcnico Nacional.
4.1 Cepas de hongos y semillas de tomate
La cepa de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Raza 3 fue provista de la coleccin de
hongos del Laboratorio de Fitopatologa de CEPROBI y la cepa de Trichoderma
asperellum Tc74 fue proporcionada por el Centro de Investigacin para los Recursos
Naturales (CIRENA), de Salaices, Chihuahua, Mxico. Las variedades de tomate (Solanum
lycopersicum) utilizados fueron Rio Grande (Seminis Inc.) y Sun 7705 (Nunhems USA
Inc.), estas semillas fueron adquiridas en la casa de agroqumicos La huerta en Cuautla
Morelos, Mxico.

4.2 Reactivacin y propagacin de Trichoderma asperellum Tc74

En cajas Petri (100 x 15 mm) con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) se sembr
un fragmento de medio de cultivo con micelio de la cepa T. asperellum Tc74 conservada
durante dos aos y medio en tubos de ensayo con medio PDA con aceite mineral. La caja
con el aislamiento se incub a 27 C 2 con iluminacin natural por 10 das. Del
crecimiento micelial se tom un disco (7 mm de dimetro) y se sembr en cajas Petri con
medio PDA y se incub durante 7 das, con este nuevo cultivo se iniciaron los ensayos para

19

la reactivacin del hongo; para lo cual a la caja del cultivo se le agregaron 20 mL de agua
destilada estril, se lav con un esptula de Drigalski, se recuper en un vaso de precipitado
y se mantuvo con agitacin suave para homogenizar la solucin de conidias.
Para la propagacin de T. asperellum Tc74 se utiliz como sustrato 250 g de granos de
trigo estril. El trigo se remoj por 12 h, se escurri y se dej a temperatura ambiente bajo
sombra para eliminar el exceso de agua, hasta obtener una humedad alrededor del 70%.
Posteriormente se colocaron 70 g de trigo en bolsas de polipapel y se esteriliz a 121 C y
15 lb/in de presin por 1.5 h. Una vez que se enfri el grano de trigo, con una jeringa
estril se inocularon con 2 mL de una solucin de conidias.
Las bolsas se mantuvieron a 272 C hasta la produccin de conidias; es decir, hasta que el
trigo se observ de color verde. Durante este periodo las bolsas se movieron en forma
manual y uniforme para distribuir el micelio (Ortega 2010). Con las conidias producidas en
el trigo se realizaron los bioensayos.

4.3 Reactivacin de la patogenicidad y propagacin de Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici raza 3 (FOLR3)
Para obtener el cultivo de FOLR3 se sigui el mismo procedimiento utilizado para propagar
la cepa T. asperellum Tc74.
La reactivacin de la patogenicidad de FOLR3 se realiz en plntulas de tomate (Solanum
lycopersicum) de la variedad Ro Grande (Seminis Inc.) que es una variedad susceptible a

20

las tres razas de FOL. Para esto, las semillas se desinfectaron previamente con hipoclorito
de sodio al 2% por 2 min, se realizaron tres lavados consecutivos con agua destilada estril
por 2 min cada uno, el exceso de agua se elimin con papel absorbente estril.
Las semillas se pusieron a germinar en cajas Petri (100 x 15 mm) con medio Agar
bacteriolgico (MCD LAB). Las plntulas de 8 das de emergencia se inocularon con
micelio de FOLR3 de un cultivo de 8 das de crecimiento. La inoculacin de las plantas se
realiz colocando con una aguja de diseccin el micelio del hongo en la radcula. Las cajas
Petri se incubaron a 272 C con iluminacin natural y se registr la aparicin de los
sntomas diariamente. En el ensayo se utilizaron 6 cajas Petri y en cada una se sembraron 6
semillas de tomate. Este procedimiento de infeccin se repiti tres veces. Para cada proceso
de infeccin se tom inoculo de las plntulas infectadas del proceso anterior, y de la tercera
infeccin se sembr micelio en cajas Petri con medio de cultivo PDA.

4.4 Evaluacin de la germinacin de semillas de tomate inoculadas con Trichoderma.

asperellum Tc74
Las semillas de tomate variedad Sun 7705 (Nunhems USA Inc.) se sembraron en charolas
de poliestireno de 98 cavidades, con sustrato compuesto por una mezcla de Metromix y
Peat Moss (3:1 v/v). Las charolas se mantuvieron en invernadero con condiciones
climticas no controladas, con una temperatura promedio de 23 C y una humedad relativa
de 76% (datos registrados con Dataloager). Las semillas sembradas se inocularon con 2 mL
de una solucin de 1 x 107 conidias/mL de Trichoderma asperellum Tc74. A las semillas

21

testigo se les agreg nicamente 2 mL de agua destilada estril. La germinacin se evalu

hasta el da 11 despus de la siembra, cuando en el testigo haban emergido ms de 19
plntulas. Para cada tratamiento con una n=21 semillas con cinco repeticiones.
La cantidad de semillas germinadas se registr diariamente y los datos para cada da se
analizaron a travs de una prueba de t con el programa estadstico Sigma Plot versin 11.

4.4.1 Deteccin de la presencia de Trichoderma asperellum Tc74 en la planta y en el

sustrato
A los 11 das despus de la inoculacin de T. asperellum Tc74 se tom al azar una plntula.
Se le retir el sustrato de las races, despus se lavaron y se cortaron fragmentos de 0.5 cm,
se desinfectaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 1% por un min y se realiz un
triple lavado con agua destilada estril por un min cada uno, el exceso de agua se elimin
con papel absorbente estril y se sembraron en medio selectivo para Trichoderma (TSM
por sus siglas en ingls). Las cajas se incubaron a temperatura de laboratorio (272 C) con
iluminacin natural por 10 das.
Para evaluar la presencia de T. asperellum Tc74 en el sustrato, se colect 1 g de este
homogenizado del cepelln de las plntulas utilizadas anteriormente y se mezcl con 9 mL
de agua destilada estril; se dej reposar por un min para dejar que el sustrato se
precipitara. Una vez que se precipit se tomaron 200 L y se dispersaron con una esptula
de Drigalsky en cajas Petri con medio selectivo TSM, finalmente las cajas se incubaron a
272 C con luz natural por 10 das.

22

4.5 Inoculacin y siembra de semillas de tomate con Trichoderma asperellum Tc74 y/o
con Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3
Los experimentos se realizaron en un invernadero ubicado en el CEPROBI, con
condiciones de temperatura y humedad no controladas durante los meses de agosto a
diciembre en los que se desarrollaron dos experimentos.
Experimento 1. Evaluacin de la actividad enzimtica a los 5 das posteriores a la
inoculacin con FOLR3. El diseo que se utiliz fue completamente al azar, con 3
tratamientos y un testigo. La unidad experimental consisti de una planta, para cada
tratamiento se utilizaron 10 repeticiones. La variedad de semilla de tomate fue Sun 7705
(Nunhems USA Inc.) lote de semilla fue del ao 2013. El sistema de riego fue manual con
aplicacin de agua a la maceta.
Experimento 2. Evaluacin de la actividad enzimtica a los 3, 5 y 7 das posteriores a la
inoculacin con FOLR3. El diseo que se utiliz fue completamente al azar, con 3
tratamientos y un testigo. La unidad experimental consisti de una planta, para cada
tratamiento se utilizaron 6 repeticiones. La variedad de semilla de tomate fue Sun 7705
(Nunhems USA Inc.) lote de semilla fue del ao 2014. El sistema de riego fue de aspersin
programado.
Las semillas de tomate se sembraron en charolas de poliestireno de 98 cavidades, con
sustrato Peat Moss previamente humedecido. Las semillas se sembraron a una
profundidad de 0.5 cm, el manejo de las plantas no incluy fertilizacin. Los tratamientos
que se realizaron fueron:

23

1) Inoculacin solo con FOLR3

2) Inoculacin solo con T. asperellum Tc74
3) Inoculacin con ambos microorganismos (T. asperellum Tc74 + FOLR3)
4) Testigo (sin FOLR3 y sin T. asperellum Tc74)
La aplicacin de T. asperellum Tc74 se realiz al momento de la siembra. Para lo cual, se
inocul cada semilla sembrada con 2 mL de una solucin de 1 x 107 conidias mL de T.
asperellum Tc74 (Ortega 2010). Treinta das despus de la siembra, las plntulas se
colocaron en macetas (de 1 L de volumen) con el misma tipo de sustrato. Cinco das
despus del trasplante se inocularon con 2 mL de una solucin de 1 x 107 conidias/mL de la
cepa de FOLR3.

4.6 Evaluacin de la actividad de las enzimas glucanasas y quitinasas

4.6.1 Colecta de muestras
Las plntulas se retiraron de las macetas y las races se lavaron con agua hasta eliminar el
sustrato y posteriormente se secaron con papel absorbente. La plntula completa se pes en
una balanza analtica (ADAM modelo AFP-720) y se fraccion en raz y hojas que tambin
se pesaron, cada tejido se empaquet en papel aluminio y se conserv en nitrgeno lquido
hasta obtener todas las muestras. Al trmino se mantuvieron en congelacin (-20 C) para
su conservacin y posterior procesamiento.

24

4.6.2 Obtencin de extractos enzimticos

Los extractos enzimticos se obtuvieron de acuerdo a El-Ghaouth et al. (2002). Se pesaron
500 mg de raz u hojas, se colocaron en un mortero y se maceraron con nitrgeno lquido
hasta obtener un polvo fino, se agreg 1 mL de buffer de extraccin, compuesto por acetato
de sodio 50 mmol a un pH de 5.0.
Cada muestra se coloc en tubos Eppendorf y se agregaron 5 mg de polivinilpirrolidonacarbn activado 1:1 (p:p) se agit con un vortex, despus se centrifug a 13000 rpm a 4 C
durante 30 min, el sobrenadante (extracto enzimtico) se separ en otro tubo Eppendorf y
se almacen a 4 C hasta su uso.

4.6.3 Elaboracin de curvas patrn para determinar la actividad de glucanasas y

quitinasas
La determinacin de los azcares reductores liberados por la actividad ltica de las enzimas
glucanasas y quitinasas se realiz por el mtodo colorimtrico descrito por Adney y Baker
(1996) y se basa en la reaccin del cido dinitrosaliclico (DNS) con un azcar reductor.
Para calcular el contenido de azcares liberados por la actividad de glucanasas se utiliz
como estndar glucosa (Sigma-Aldrich) y para la determinacin de la actividad de
quitinasas se us N-acetil-glucosamina (Sigma-Aldrich).
La glucosa (Figura 1A) es la unidad principal de la que se componen los polmeros de
glucano, principal polisacrido estructural de la pared celular fngica (Bowman y Free

25

2006), por lo cual se utiliza como estndar para determinar los azcares reductores
liberados en una reaccin de glucanasas.
El monmero -N-acetil-glucosamina (Figura 1B); es un azcar reductor y es la unidad
estructural a partir de la cual a travs de la enzima quitina sintasa, se sintetiza el polmero
quitina (Lenardon et al. 2010). Por esta razn se utiliza como estndar para determinar los
azcares reductores liberados en una reaccin catalizada por una quitinasa.
Para preparar 100 mL de DNS al 1% se disolvi 1 g de hidrxido de sodio en 10 mL de
agua desionizada, se agreg 1 g de reactivo DNS (Sigma) y 0.2 g de fenol (Sigma Aldrich),
la solucin se afor con 100 mL con agua desionizada y se conserv a 5 C. En el momento
de su uso, a la solucin se le agreg 0.05 g de sulfito de sodio.

Figura 1. Estructura qumica de una unidad de (A) glucosa y (B) -N-acetil-glucosamina

26

Para preparar 100 mL de tartrato de sodio y potasio (J. T. Baker) se pesaron 40 g del
compuesto y se disolvieron en 100 mL de agua desionizada y la solucin se conserv a 5
C hasta su uso.
Las curvas patrn de los estndares de glucosa y de N-acetil glucosamina se prepararon en
un intervalo de 0 a 4.4 moles de glucosa y de 0 a 3.616 moles de N-acetil glucosamina.
A cada tubo de ensayo se le aadieron 3 mL de la solucin de DNS al 1%, y se agitaron con
vortex, se calentaron a 90 C por 5 min a bao Mara. La reaccin gener un cambio de la
solucin de un color amarillo a rojo-caf. Para detener la reaccin y estabilizar el color se le
aadi a la mezcla 1 mL de tartrato de sodio y potasio al 40%, la solucin se enfri en bao
de agua fra y se ley la absorbancia a 575 nm en un espectrofotmetro (Shimadzu modelo
UV-160A). Los datos se graficaron y se obtuvieron las ecuaciones de regresin siguientes:
Para glucanasas: Y=0.0225x-0.130 donde Y es la absorbancia a 575 nm y x los moles
de glucosa; el coeficiente de regresin fue de 0.956.
Para quitinasas: Y=0.216x-0.055 donde Y es la absorbancia a 575 nm y x los moles de
N- acetil- glucosamina; el coeficiente de regresin fue de 0.983.

4.6.4 Evaluacin de la actividad de glucanasas y quitinasas

Para la actividad de glucanasas se utiliz como sustrato laminarina (Sigma Aldrich) al 5%
disuelta en buffer de acetato de sodio (50 mmol, pH 5).

27

La mezcla de reaccin se prepar con 20 L de extracto enzimtico y 480 L de buffer de

acetato de sodio y 500 L de laminarina. La reaccin se incub en un termomixer
(Eppendorf) a 300 rpm y 37 C por 30 min, despus del tiempo de incubacin se agregaron
3 mL de reactivo DNS y se continu el procedimiento para evaluar el contenido de
azcares reductores liberados por la actividad de la enzima. La actividad de estas enzimas
se expres en mol de laminarina min g de peso fresco.
Para la evaluacin de la actividad de quitinasas se utiliz la metodologa descrita por ElKatatny et al. (2001), usando quitina coloidal como sustrato, la cual se prepar de acuerdo a
Nava (2009).
Para esto se pesaron 0.3 g de quitina (Sigma Chemical Co) y se le adicionaron 3 mL de
cido fosfrico (J. T. Baker) al 85%; se mezclaron hasta obtener una pasta que se refriger
a 4 C durante 24 h. La pasta se coloc en un vaso de precipitado y se le agreg agua
destilada hasta que se observ la formacin de partculas de quitina de color blanquecino.
La solucin se filtr a travs de papel filtro Whatman del nmero 1 colocado en un embudo
de vidrio y se lav con agua destilada para eliminar el cido fosfrico (se agreg agua
hasta que sta sali limpia). La quitina coloidal se transfiri a un vaso de precipitado, se
cubri con papel aluminio, se esteriliz por 15 min a 121 C y 15 lb (in) de presin, se
dej enfriar a temperatura ambiente y se conserv a 5 C hasta su uso.
La mezcla de ensayo contena 100 L de extracto enzimtico, 400 L de buffer de acetato
de sodio (50 mmol, pH 5) y 500 L de quitina coloidal al 1% disuelta en el mismo buffer
de acetato de sodio. La mezcla de ensayo se incub en un termomixer a 300 rpm a 37 C

28

por 4 h, despus de este tiempo se agregaron 3 mL de reactivo DNS y se sigui el

procedimiento (apartado 4.6.3) para determinar el contenido de azcares reductores
liberados por la actividad de la enzima. La actividad de estas enzimas se expres en mol
de N-acetil glucosamina hg de peso fresco.

4.6.5 Anlisis estadstico de la actividad de glucanasas y quitinasas

Los datos se procesaron mediante un ANOVA de una va y para la comparacin de medias
se utiliz la prueba de Duncan. Los anlisis se realizaron con el programa estadstico Sigma
Plot versin 11.

4.7 Evaluacin de la severidad de la marchitez vascular en plantas de tomate

Para la evaluacin de la severidad de la enfermedad se estableci un nuevo lote de plantas
de tomate de la variedad Sun 7705, la siembra y manejo fue similar al del punto (4.5) el
diseo experimental fue completamente al azar. La unidad experimental fue 1 planta, para
cada tratamiento (Tc74, FOLR3 y Tc74+FOLR3 y testigo) se usaron 35 repeticiones. A los
30 das despus de la siembra, las plntulas se trasplantaron a macetas de un litro de
volumen. Los tratamientos con Tc74 se inocularon al momento de la siembra con 2 mL de
una solucin de 1 x 107 conidias mL y los tratamientos con FOLR3 se inocularon con 2
mL de una solucin de 1 x 107 conidias mL del patgeno a los 35 das despus de la
siembra. El desarrollo de los sntomas de la enfermedad se registr diariamente y con los

29

datos obtenidos a los 85 das despus de la siembra se determin la severidad, altura de

planta (a partir de la corona hasta el pice), peso fresco y seco de follaje y de raz. Para la
medicin de la severidad se utiliz una escala en base al amarillamiento ascendente en las
plantas generado por FOLR3, esta escala const de 8 grados como se muestra en el cuadro
1.
Cuadro 1 Escala de severidad de la enfermedad marchitez vascular
Sntoma

Grado

Planta sana

Amarillamiento 1er hoja verdadera

Amarillamiento 2da hoja verdadera

Amarillamiento en 3er hoja verdadera

Amarillamiento en 4ta hoja verdadera

Amarillamiento en 5ta e hoja verdadera

Amarillamiento en 6ta hoja verdadera

Amarillamiento en 7ma hoja verdadera

4.7.1 Evaluacin de variables de crecimiento y desarrollo

Para medir la altura de planta se utiliz un flexmetro (Truper), para obtener el peso
fresco se cortaron las races y tallos y se pesaron en una balanza digital (Ohaus modelo SP
2001), el tejido de follaje (tallos y hojas) y races se coloc en bolsas de papel y colocaron

30

dentro de una estufa a 45 C por 5 das, despus de este tiempo se pes nuevamente cada
uno de los tejidos para obtener el peso seco.

4.7.2 Determinacin del contenido de clorofilas y carotenoides totales

Para la evaluacin de clorofilas se tomaron muestras de las plantas de tomate en las que se
determin la severidad de la enfermedad. Las hojas (0.1g) se maceraron en un mortero, se
agregaron 10 mL de acetona al 80% se recuper el extracto en un tubo falcon, y se
centrifug a 13000 rpm y 4 C por 30 min. en una centrifuga (Beckman Avanti J-25). El
sobrenadante (extracto) se recuper en tubos de vidrio de 10 mL con tapn.
El extracto se diluy 1:1 (v:v) con acetona al 80% (500 L de extracto:500 L de acetona
al 80%) y se ley la absorbancia a una longitud de onda de 710, 663.20, 646.8 y 470 nm en
un espectrofotmetro (Shimadzu modelo UV-160A).
Con las absorbancias se calcul el contenido de clorofilas a, clorofilas b y clorofilas totales,
utilizando las siguientes ecuaciones:
Clorofila a (g mL1) =12.25 (Abs 663.2) - 2.79 (Abs 646.8)
Clorofila b (g mL1) =21.5 (Abs 646.8)-5.1(Abs 663.2)
Clorofilas totales (g hoja1) =715 (Abs 663.2) + 18.71 (Abs 646.8) / peso de la hoja
Carotenoides= ((Abs 470 - Abs 710) - 1.90*clorofila a - 63.14*clorofila b)/214

31

4.7.3 Anlisis estadstico

Los datos obtenidos de severidad de marchitez vascular se analizaron mediante la prueba de
Kruskal-Wallis y comparacin de medias de Tukey el anlisis de las variables clorofilas
totales, carotenoides, altura de planta, peso fresco y peso seco de follaje y raz se realiz
con ANOVA de una va y comparacin de medias Duncan, los datos de longitud de planta,
peso fresco y peso seco de follaje se transformaron a su recproco para su anlisis, mientras
que los datos de peso seco de raz se transformaron a logaritmo natural. Los anlisis se
realizaron con el programa estadstico Sigma Plot 11.0.

32

5. RESULTADOS
5.1 Evaluacin del efecto de Trichoderma asperellum Tc74 sobre la germinacin de
semillas de tomate.
Durante toda la cintica de germinacin se encontr que la aplicacin de Tc74 estimul la
germinacin de las semillas de tomate (Figura 2). El porcentaje de semillas germinadas
aument en un intervalo del 8.6 a 25.7% con respecto al testigo. Al final de la cintica de
germinacin (11 das), el porcentaje de germinacin de las semillas inoculadas con Tc74
fue de 95.2%, mientras que el de las semillas no inoculadas fue de 86.7%.

Nmero de semillas germinadas

25
Testigo
Semillas con Tc74

20

a
a

a
a

15

b
a

10

a
a
b
b

b
a

b
a

b
6

10

12

Das despes de la siembra

Figura 2. Germinacin de semillas de tomate: testigo e inoculadas con Trichoderma

asperellum Tc74. Los resultados son el promedio desviacin estndar en cada uno de los
tiempos de evaluacin (n=21). Letras diferentes para cada da indican diferencia
significativa segn la prueba de t (P=0.001).

33

5.2 Establecimiento de Trichoderma asperellum Tc74 en raz de tomate y en sustrato

A partir de fragmentos de raz de las plntulas de tomate previamente inoculadas con T.
asperellum Tc74 y del sustrato donde se sembraron las semillas, se obtuvieron colonias de
coloracin verde que indica esporulacin de los hongos del gnero Trichoderma; en
microscopio ptico se observ micelio hialino y septado, conidiforos no verticilados con
filides, conidios unicelulares subglobosos. Dichos resultados indican que Tc74 se
estableci tanto en las races como en el sustrato (Figura 3).
5 das

7 das
B

Raz

Sustrato

Figura 3. Trichoderma asperellum Tc74 aislado de fragmentos de raz de tomate (A y B) y

del sustrato (C y D). Las fotografias se obtuvieron a los 5 y 7 das de crecimiento del
micelio.

34

5.3 Evaluacin del efecto de Trichoderma asperellum Tc74 sobre la actividad de

glucanasas y quitinasas en raz y hojas de plantas de tomate infectadas con Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (FOLR3)
La actividad enzimtica en plantas a los 5 das posteriores a la inoculacin con FOLR3 se
observ un efecto sistmico de glucanasas y quitinasas; sin embargo localmente solo la
enzima quitinasa se indujo, esto dio pauta para plantear un segundo experimento para
determinar si existen diferencias en la induccin de las enzimas a travs del tiempo.

5.3.1 Experimento 1. Actividad enzimtica a los 5 das posteriores a la infeccin con

FOLR3
En la raz y con todos los tratamientos, la actividad de glucanasas no cambi; sin embargo,
la actividad de quitinasas aument 0.6 y 0.5 veces con la inoculacin con solo Tc74 o con
solo FOLR3, respectivamente (Cuadro 2).
En hoja, en todos los tratamientos aument la actividad de glucanasas con respecto al
testigo, en un intervalo de 0.5 a 0.6 veces. Mientras que la inoculacin con solo Tc74 fue el
nico tratamiento que aument la actividad de quitinasas en hojas en 0.8 veces (Cuadro 3).

35

Cuadro 2. Actividad de glucanasas y quitinasas en raz de plantas de tomate, inoculadas

con Trichoderma asperellum Tc74 (Tc74), a los cinco das posteriores a la infeccin con
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (FOLR3).
Tratamiento

Glucanasas

Quitinasas

Testigo

17.09313.65 a

1.3530.52 b

Tc74

24.76914.77 a

2.2520.29 a

FOLR3

17.90412.99 a

2.1360.35 a

17.3418.08 a
1.4980.33 b
Tc74 + FOLR3
Los datos representan la media desviacin estndar (n=10). Letras diferentes en columnas
indican diferencia estadstica segn el ANOVA (P = 0.477) (P=<0.001) y la prueba de
Duncan (p>0.05). mol de glucosa min-1 g-1 peso fresco mol de N-acetil glucosamina h-1
g-1 de peso fresco.

Cuadro 3. Actividad de glucanasas y quitinasas en hojas de plantas de tomate, inoculadas

con Trichoderma asperellum Tc74 (Tc74), a los cinco das posteriores a la infeccin con
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (FOLR3).
Tratamiento

Glucanasas

Quitinasas

Testigo

82.7136.75 b

3.8681.61 b

Tc74

123.20 27.34 a

7.2731.80 a

FOLR3

124.83 34.85 a

4.6221.33 b

133.66 25.78 a
4.9911.39 b
Tc74 + FOLR3
Los datos representan la media desviacin estndar (n=10). Letras diferentes en columnas
indican diferencia estadstica segn el ANOVA (P=0.004), (P = <0.001) y la prueba de
Duncan (p<0.05). mol de glucosa min-1 g-1 peso fresco, mol de N-acetil glucosamina h-1
g-1 de peso fresco.

36

5.3.2 Experimento 2. Actividad enzimtica a los 3, 5 y 7 das posteriores a la

infeccin con FOLR3
En raz, la actividad de glucanasas en todos los tratamientos no cambi a los 3 y 5 das
despus de inoculacin con FOLR3; pero a los 7 das de post-inoculacin esta actividad
disminuy entre 0.3 y 0.2 veces Figura 4A).
La actividad de quitinasas en la raz aument con la inoculacin con solo Tc74 o con ambos
microorganismos y el aumento de la actividad de la enzima dependi del tiempo de postinoculacin con FOLR3. En el da 3, la actividad de la enzima aument 2.08 y 1.6 veces
con la inoculacin con solo Tc74 y con ambos microorganismos respectivamente, mientras
que al da 5 dicha actividad aument 1.6 y 0.6 veces para estos mismos tratamientos.
Finalmente la actividad de quitinasas disminuy en el tratamiento con solo FOLR3 a los 7
das de post-inoculacin.
A travs del tiempo se observ que la actividad de los tratamientos inoculados con Tc74
disminuyo a medida que pasaron los das, mientras que la actividad del testigo y del
tratamiento con solo FOLR3 no cambio (Figura 4B).
En las hojas a todos los tiempos de post-inoculacin y con todos los tratamientos se
encontr que la actividad de glucanasas no cambi, solamente en el da 5 la inoculacin de
las plantas con ambos microorganismos disminuy la actividad de glucanasas (Figura 5A).
En el caso de la actividad de quitinasas, la inoculacin con solo Tc74 y con ambos
microrganismos caus un aumento en esta enzima en un intervalo de 0.7 y 1.2veces al da
3, al da 5 solo el tratamiento con Tc74 aument la actividad de esta enzima 0.5 veces y

37

disminuy 0.4 veces en el tratamiento con solo FOLR3. Sin embargo a los 7 das de la postinoculacin con FOLR3, la actividad de quitinasas fue similar en todos los tratamientos.
Mientras que la actividad de la enzima a travs del tiempo, no cambio en los tratamientos
inoculados con Tc74, en cambio en el testigo y el tratamiento con solo FOLR3 se observ
un aumento de la actividad conforme paso el tiempo (Figura 5B).

38

mol de glucosa min-1 g-1 peso fresco

35

30

aA

aA
aA

aA

aA
aA

aA

aA

25

aB aB aB

20

aB

15

10

mol de N-acetil glucosamina h-1 g-1 de peso fresco

aA

aAB
bA
6

aB

aB

aB
4

aA
cA

bA

bA

bA

cA

Tiempo de post-inoculacin (das)

Figura 4. Actividad de glucanasas (A) y quitinasas (B) en raz de plantas de tomate

inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74, a tres tiempos posteriores a la infeccin con
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3. Los datos representan la mediaerror
estandar (n=6). Letras minsculas diferentes en cada da indican diferencias estadsticas
entre tratamientos, de acuerdo al ANOVA (P=0.447), (P=0.100), (P=0.787), (P=0.006),
(P=<0.001), (P=<0.001), (P=0.005) y la prueba de Duncan (P<0.050). Letras maysculas
diferentes en el tiempo, indica diferencias estadsticas para cada tratamiento de acuerdo al
ANOVA (P=<0.001), (P=<0.001), (P=<0.001), (P=0.131), (P=0.352), (P=0.021), (P=0.002)
y la prueba de Duncan (P<0.050).

39

mol de glucosa min-1 g-1 peso fresco

160
140

aA

aA aA

aA
aA

120

aA aA

aA

aA

aA

abA
bB

100
80
60
40
20
0

mol de N-acetil gluosamina h-1 g-1 de peso fresco

10

aA
aA
8

aA

aA aA aA

aA

bA

bAB

bB
cB

cB

Tiempo de post-inoculacin (das)

Figura 5. Actividad de glucanasa (A) y quitinasa (B) en hoja de plantas de tomate

inoculado con Trichoderma asperellum Tc74, en tres tiempos posteriores a la infeccin con
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3. Los datos representan la mediaerror
estndar (n=6). Letras minsculas diferentes por das indican diferencia estadstica entre
tratamientos y letras maysculas indican diferencia significativa entre tiempo de postinoculacin. ANOVA de una va (P = 0.993), (P = 0.010), (P = 0.707), (P = 0.124), (P =
0.112), (P = 0.424), (P = <0.001) ANOVA de una va (P = <0.001), (P = <0.001), (P =
0.453), (P = 0.017), (P = 0.256), (P = <0.001), (P = 0.151) y la prueba de Duncan
(P<0.050).

40

5.4 Sintomatologa y severidad de la enfermedad marchitez vascular en plantas de

tomate inoculadas y sin inocular con Trichoderma asperellum Tc74
En las plantas inoculadas con solo FOLR3, el sntoma inicial de la marchitez vascular se
present en el primer par de hojas verdaderas las cuales mostraron un amarillamiento y un
color prpura en las nervaduras (Figura 6) que progres de forma ascendente en todas las
hojas conforme paso el tiempo de la infeccin (Figura 7C).

Figura 6. Sintomas de amarillamiento (A) y coloracin purpura en las nervaduras (B) de

las hojas de plantas de tomate variedad Sun 7705 inoculados con FOLR3.

En las plantas inoculadas previamente con Tc74 y en el testigo el amarillamiento apareci a

los 28 das posteriores a la infeccin con FOLR3, en el testigo y en el tratamiento con Tc74
y FOLR3 el amarillamiento solo alcanz hasta la tercera hoja (Figura 7A y 7D), mientras
que en el tratamiento con solo Tc74 el amarillamiento ascendi hasta el segundo par de
hojas verdaderas (Figura 7B).

41

Figura 7. Severidad del amarillamiento en hojas de plantas de tomate inoculadas con

Trichoderma asperellum Tc74 y/o infectadas Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3.
Testigo primera, segunda y tercera hoja (A), Tc74 primera y segunda hoja (B), Tratamiento
con FOLR3 de la primera a la quinta hoja (C) y Tc74+FOLR3 primera, segunda y tercera
hoja (D). Los corchetes indican el grado de amarillamiento en las hojas de plantas de
tomate.

Al trmino de la evaluacin (85 das posteriores a la emergencia) en el tratamiento con

FOLR3 la incidencia por el dao del patgeno fue de 100%, el tratamiento con ambos
microorganismos fue del 97% con los mismos sntomas de FOLR3. En el caso del testigo y
del tratamiento con solo Tc74 manifestaron 91% y 74% de dao, el cual puede atribuirse a
deficiencias nutrimentales ya que estas plantas no fueron inoculadas con FOLR3.
Para el caso de la severidad, los tratamientos con solo Tc74, la combinacin de ambos
organismos y el testigo muestran un grado de severidad menor al observado en el
tratamiento con solo FOLR3 (Figura 8).

42

Nivel de severidad

a
2

Testigo

Tc74

FOLR3

Tc74+FOLR3

Figura 8. Severidad de la enfermedad marchitez vascular en plantas de tomate de 85 das

de emergencia y 50 das posteriores a la infeccin con Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici raza 3. Letras diferentes entre tratamientos indican diferencia significativa
segn la prueba de Kruskal Wallis (P=<0.001) y comparacin de medias Tukey (P<0.050).
Escala de severidad: planta sana=0, amarillamiento en la primera hoja=1, en la segunda
hoja=2, en la tercera hoja=3, en la cuarta hoja=4, en la quinta hoja=5, en la sexta hoja=6 y
en la sptima hoja=7. Tc74, Trichoderma asperellum Tc74; FOLR3, Fusarium oxysporum
f. sp. lycopersici raza 3.

5.5 Crecimiento y desarrollo de plantas inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74 e

infectadas con Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3
La inoculacin con Tc74 estimul el crecimiento y desarrollo de las plantas de tomate. La
altura de las plantas aument en un 35% con solo Tc74, mientras que en las plantas
infectadas con FOLR3 disminuy la altura en un 11% y el peso fresco de follaje se redujo
en un 20%. Sin embargo la inoculacin previa con Tc74 permiti un desarrollo normal de
las plantas (mayor peso de follaje) en forma comparable a las plantas testigo (Cuadro 4),

43

aunque en peso fresco y seco de raz no hubo diferencias y se observ un menor peso en el
tratamiento con Tc74 y FOLR3, en la figura 9 se observa un mayor crecimiento de races
primarias y secundarias, en los tratamientos inoculados con Tc74.

Figura 9. Races primarias y secundarias de plantas de tomate sin inocular (A) e

inoculadas con Tc74 (B), FOLR3 (C) y Tc74+FOLR3 (D).

44

Cuadro 4. Altura, peso fresco y peso seco de plantas de tomate inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74 (Tc74) e
infectadas con Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (FOLR3).

Tratamientos
Testigo

Altura de planta
(cm)
53.641.05 b

Peso fresco de
follaje (g)
19.780.68 b

Peso seco de
follaje (g)
3.380.114 a

Peso fresco raz

(g)
8.790.28 a

Peso seco de raz4

(g)
0.820.05 a

Tc74

63.491.29 a

26.722.55 a

3.770.324 a

8.890.37 a

0.850.04 a

FOLR3

47.090.47 c

15.810.52 d

3.170.109 ab

8.080.33 ab

0.850.03 a

Tc74+FOLR3

51.590.71 b

17.940.68 c

2.990.108 b

7.150.37 b

0.700.03 b

Los datos representan la media el error estndar de la media para las columnas: altura de planta, peso fresco de follaje, peso
seco de follaje, peso fresco de raz y peso seco de raz (n=35). Letras diferentes en columnas indican diferencia significativa
segn el ANOVA de una va (P = <0.001), (P = 0.001), (P = 0.027), (P = 0.006)4 y la prueba de Duncan (P<0.050). FOLR3,
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3; Tc74, Trichoderma asperellum Tc74. Para el anlisis estadstico de altura de
planta, peso fresco de follaje y peso seco de follaje los datos se transformaron a su recproco y para el anlisis de peso seco de
raz se transform a logaritmo natural.

45

5.6 Cuantificacin de clorofilas y carotenoides totales en hojas de plantas de tomate

inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74 e infectadas con Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici raza 3
El contenido de clorofilas y carotenoides totales de las hojas tambin disminuyeron en un
73% en las plantas infectadas con FOLR3. Sin embargo la inoculacin previa con Tc74
permiti que en las plantas de tomate se mantuvieran los contenidos de ambos pigmentos, a
niveles comparables a los que se encontraron en las plantas testigo y en las inoculadas con
solo Tc74 (Figura 10).

46

mg de clorofila g de peso fresco

20

A
a

15

10

b
5

Testigo

mg de carotenoides g de peso fresco

1.8

Tc74

FOLR3 Tc74+FOLR3

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Testigo

Tc74

FOLR3

Tc74+FOLR3

Figura 10. Contenido de clorofilas (A) y carotenoides totales (B) de hojas de plantas de
tomate de 85 das de emergencia inoculadas con Trichoderma asperellum Tc74 e infectados
con Fusarium oxysporum f. sp. lycoersici raza 3. Los datos son la media error estndar de
la media (n=5). Letras diferentes indican diferencia estadstica entre tratamientos segn el
ANOVA (P=<0.001) y la prueba de Duncan (P<0.050).

47

6. DISCUSIN
1. Efecto de Trichoderma asperellum Tc74 sobre la germinacin de semillas,
crecimiento y desarrollo de plantas de tomate
En este estudio la aplicacin de Trichoderma asperellum Tc74 a la semilla de tomate
estimul la germinacin en un intervalo del 8.5 a 25.7% y disminuy el tiempo de
germinacin de las mismas. Otros estudios han reportado un efecto similar en tomate y en
otros cultivos. Srivastava et al. (2010) mostraron que la aplicacin de Trichoderma
harzianum a semillas de tomate estimul la germinacin en un 25%; mientras que en
pepino Yedidia et al. (2001) obtuvieron un incremento del 30% en la germinacin de
semillas inoculadas con Trichoderma harzianum T-203, los autores sugieren que al
establecerse Trichoderrma en las races puede promover la formacin de races
secundarias, mediante la produccin de compuestos similares a fitohormonas o por el
control de fitohormonas de crecimiento de la planta.
En ornamentales, tambin se ha observado que la aplicacin de Trichoderma harzianum
incrementa la germinacin de semillas, tal es el caso de boca de dragn (Antirrhinum majus
L.) que se increment en un 21% (Bhargava et al. 2015). Estos autores argumentan que
Trichoderma provoca cambios cuantitativos en la composicin bioqumica de las semillas,
mejorando el metabolismo y la sntesis de algunas protenas de reserva como globulinas y
cruciferinas.
Algunas cepas de Trichoderma pueden producir metabolitos que actan como auxinas
(Vinale et al. 2008a), promoviendo la diferenciacin celular y el crecimiento vegetal, o

48

como giberelinas cuya funcin principal es incrementar la divisin celular (Harman 2006).
La cepa T. asperellum Tc74 produce algunos metabolitos similares a auxinas
(comunicacin personal Leticia Bravo Luna), pero adems se pudieron haber producido
otros compuestos similares a giberelinas o citoquininas que se han reportado que inducen la
germinacin de semilla de tomate (Druzhinina et al. 2011).
El aislamiento de T. asperellum Tc74 de raz de plntulas y del sustrato, sugieren que el
hongo se estableci en las plntulas de tomate. De acuerdo a Yedidia et al. (2001) y Vinale
et al. (2008a) Trichoderma invade hasta la epidermis de las races y se relaciona con su
efecto de promocin de crecimiento de las races. La inoculacin con T. asperellum Tc74
tambin promovi el crecimiento de races lo cual podra permitir que las plantas ocupen
una mayor superficie de sustrato y aumentar su capacidad para la absorcin de nutrientes
(Yedidia et al. 2001).
La aplicacin de T. asperellum Tc74 a la semilla marc tambin diferencias en la
incidencia y severidad de la marchitez y en el desarrollo de las plantas en comparacin con
las inoculadas solo con FOLR3. El amarillamiento observado en los tratamientos y el
testigo podra deberse a la infeccin por FOLR3 y por deficiencias nutrimentales,
respectivamente; ya que el manejo que se dio a las plantas no incluy ningn tipo de
fertilizacin.
Con la infeccin con FOLR3 el amarillamiento se presenta como un sntoma inicial de la
marchitez, ya que el hongo penetra a la raz ataca al xilema y corta el paso de agua y
nutrientes a la parte area de la planta (Domnguez 2012), sin el suministro de nutrientes y

49

agua la planta optimiza las fuentes de energa que le quedan disminuyendo el crecimiento
para activar sus mecanismos de defensa (Hermosa et al. 2013). El amarillamiento tambin
est relacionado a las deficiencias de elementos como nitrgeno fosforo y azufre (Haifa
2014).
Por lo cual se sugiere que el dao que se observ principalmente hasta la tercer hoja
verdadera (grado 3) podra deberse a deficiencias nutrimentales, mientras que la infeccin
con FOLR3 podra ser un factor para exacerbar el amarillamiento no solo hasta el tercer par
de hojas sino tambin hasta la sexta y sptima hoja (grado 6 y 7).
Sin embargo en los tratamientos donde estuvo presente T. asperellum Tc74, las plantas
mostraron menor grado de amarillamiento que las plantas testigo y las inoculadas solo con
FOLR3. Este efecto de T. asperellum Tc74 podra deberse a que este hongo podra
aumentar la disponibilidad de nutrientes, la secrecin de cidos fumrico, glucnico y
ctrico disminuyen el pH del suelo lo que permite la solubilizacin de los nutrientes
(Hermosa et al. 2012).
A nivel celular el magnesio y el fierro son empleados en la sntesis de clorofila, mientras
que el nitrgeno y potasio en la divisin celular y sntesis de protenas y otros elementos
como el potasio est implicado en las reacciones metablicas para activar enzimas
(Maathuis 2009). En este estudio se observ que la aplicacin de T. asperellum Tc74
disminuy el amarillamiento causado por FOLR3 y las deficiencias nutrimentales
observadas en el testigo, por lo que esta cepa de Trichoderma podra inducir el
alargamiento de las races principales y aumentar la produccin de races secundarias, esto

50

pudo ayudar a que la planta tuviera un mayor disponibilidad de P y Fe u otros elementos

del suelo (Yedidia et al. 2001), disminuyendo el amarillamiento causado por FOLR3 y por
las deficiencias nutrimentales.
La disponibilidad de nutrientes en las plantas de tomate por efecto de la aplicacin de Tc74
se reflej en una mayor promocin del crecimiento vegetal y en un mayor contenido de
clorofilas y carotenoides. As lo observaron Vinale et al. (2008a) al inocular plntulas de
trigo con 6 metabolitos secundarios de los tipos azopilonas, poliqutidos, alquilpironas,
arziano piridonas y antroquinonas obtenidos de diferentes cepas de Trichoderma, y
observar aumentos significativos en la altura y peso seco de planta. En otro estudio Cai et
al. (2013) midieron el efecto a diferentes concentraciones del metabolito secundario SQRT037 del tipo de los poliqutidos, de una cepa de Trichoderma harzianum en la promocin
de crecimiento de plntulas de tomate de 15 das de edad. Estos autores observaron un
aumento significativo en la biomasa de las plntulas expuestas al metabolito en
concentraciones de 0.1 y 1ppm, sugiriendo que estos metabolitos secundarios pueden actuar
como compuestos similares a auxinas. En esta investigacin se observ un menor contenido
de clorofilas y carotenoides, en plantas inoculadas con FOLR3. Se conoce que las plantas
que son sometidas a algn tipo de estrs pueden perder capacidad fotosinttica y disminuir
el contenido de clorofilas en sus hojas (Carter y Knapp 2001). Las clorofilas son las
responsables de transformar la energa lumnica en energa qumica, por lo tanto una
disminucin de estas se manifiesta en amarillamiento en hojas y tallos y poco desarrollo de
la planta por una menor produccin de energa utilizable (Salisbury y Ross 2001). El dao
causado por FOLR3 afect de manera directa en la sntesis de clorofilas, la aplicacin de

51

Tc74 permiti un desarrollo normal de la planta cuando se inocul solo y al inocularla de

manera previa ayud a disminuir los efectos causados por FOLR3.
Cabe sealar que an cuando la cepa Tc74 se aisl de un cultivo de chile mostr un efecto
positivo en las plantas de tomate, lo que sugiere el potencial que tiene esta cepa de
Trichoderma, para ser utilizada en diferentes cultivos de importancia agrcola.
2. Efecto de Trichoderma asperellum Tc74 en la actividad de las enzimas glucanasas y
quitinasas de races y hojas de tomate infectado con Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici raza 3
En esta investigacin se obtuvieron diferentes resultados en la actividad de las enzimas
glucanasas en hojas en ambos experimentos, tal vez se deba al uso de diferente lote de
semilla de tomate y al sistema de riego empleado, que en el caso del segundo experimento
donde se utiliz riego por aspersin se dieron mejor las condiciones de temperatura
(intervalo de 23 a 30 C) y humedad relativa (alrededor de 90%) para el desarrollo de
FOLR3, mientras que en el primer experimento las temperatura fue entre 23 a 34 C y la
humedad relativa fue menor de 77%. Se ha reportado que a temperaturas de 21 a 33 C con
una temperatura ptima de 28 C y una humedad relativa alta son las condiciones ptimas
para el desarrollo de sntomas por F. oxysporum f. sp. lycopersici (Blancard 2012, CruzAlcal et al. 2000).
La induccin de glucanasas en hojas del primer experimento pudo deberse a una respuesta
al ataque de FOLR3, pero las condiciones ambientales no fueron las idneas para una
efectiva infeccin por lo que se pudieron expresar las glucanasas, mientras que en el

52

segundo experimento las condiciones ambientales fueron idneas para el crecimiento de

FOLR3 dndose una interaccin incompatible, donde el patgeno suprime o retrasa su
reconocimiento por la planta, permitiendo la infeccin, manifestndose los sntomas y
reprimiendo la actividad enzimtica (Daz 2009); y por otro lado la variedad de tomate
utilizada es susceptible a FOLR3 (Nunhems 2014), por lo que tal vez no cuenta con la
informacin gentica para producir estas enzimas de defensa para combatir a este patgeno.
Algo similar observaron Harman et al. (2004b) al inocular Trichoderma T22 en varios
hbridos de maz, donde algunos mostraron expresin de enzimas como glucanasas, y
quitinas para la defensa contra Pythium ultimum y Colletotrichum graminicola y otros
hbridos que no expresaron las protenas de defensa. Es posible tambin que el control de
FOLR3 pudo darse por otras enzimas como la peroxidasa (Camacho 2014, Guzman-Valle
2014) o las polifenol oxidasa (PO) y fenilalanina amonio liasa (PAL) (John et al. 2010),
tambin inducidas por algunas cepas de Trichoderma, o por un ataque directo de
Trichoderma mediante micoparasitismo o antibiosis, mecanismos que han sido observados
in vitro al confrontar a Tc74 contra diferentes especies de Fusarium (Ortega 2010).
En el segundo experimento se encontr que con solo la aplicacin de T. asperellum Tc74
hay un aumento de la actividad de quitinasas en las races y hojas, y que esta actividad es
an mayor con la inoculacin con ambos organismos, por lo cual se sugiere que es una
induccin de una respuesta de defensa de las plantas de tomate. La inoculacin con Tc74
desencadena en las plantas mecanismos de seales que conducen a la activacin de la
respuesta de defensa de las plantas (Shoresh et al. 2010, Hermosa et al. 2013). Un efecto
similar se observ al inocular plntulas de pepino con Trichoderma harzianum (Yedidia et

53

al. 1999) donde el aumento en la actividad de enzimas quitinasas ocurri a las 72 horas
posteriores a la inoculacin, seguido de una rpida disminucin de la actividad despus de
este tiempo. Los autores sugieren que la actividad de quitinasas se induce como respuesta
de la planta al reconocimiento de un microorganismo, iniciando con los cambios celulares
como la deposicin de calosa y la sntesis de sustancias txicas, aumentando la produccin
de compuestos fenlicos y fitoalexinas, estos compuestos son sintetizados antes de la
formacin de quitinasas y otras protenas relacionadas con la patogenicidad (PR) todo esto
para prevenir la colonizacin, probablemente existan patrones de Trichoderma que
reconoce la planta para disminuir la sntesis y acumulacin de molculas de defensa,
estableciendo una asociacin similar a una simbiosis, posterior a esto disminuye la
actividad de quitinasas despus de las 120 h por lo que se sugiere que este fenmeno fue el
observado en este trabajo al disminuir la actividad de quitinasas despus de las 72 horas.
La induccin de resistencia sistmica en hojas ha sido observada en plantas de maz
inoculadas con Trichoderma viride (Vargas et al. 2009), esta induccin se ha relacionado
con la capacidad de Trichoderma para hidrolizar la sacarosa depositada en el apoplasto de
la epidermis, este evento controla la expresin de una protena llamada Sm1 que sirve como
elicitor de la respuesta de defensa, estos autores adems observaron un aumento en la
actividad fotosinttica probablemente por la prdida de sacarosa empleada por Trichoderma
como fuente de carbono.
En otros trabajos se ha observado la actividad de ambas enzimas. Por ejemplo GuzmnValle y col. (2014) observaron mayor actividad local de las enzimas glucanasas de 0.3-0.6
veces ms actividad y quitinasas de 0.1-1.0 veces al inocular tres variedades distintas de

54

cebolla con T. asperellum Tc74 y con Sclerotium rolfsii. As como tambin Camacho
(2014) observ un aumento de 1.7 veces en la actividad de glucanasas y de 1.9 veces en
quitinasas en hojas de cebolla inoculadas con T. asperellum TC3 y Alternaria porri, pero
observ que A. porri tiene la capacidad de reprimir la actividad de glucanasas. Al respecto
se ha observado que los hongos poseen mecanismos para protegerse del ataque de otros
microorganismos y para contrarrestar los mecanismos de defensas de las plantas, por lo
tanto la respuesta depender de la relacin planta-hongo que se estudie y del tiempo en que
se determine la actividad de estas y otras enzimas relacionadas con la defensa (Tucci et al.
2011).

55

7. CONCLUSIONES
La aplicacin de Trichoderma asperellum Tc74 incrementa la germinacin de semillas,
acorta el tiempo de germinacin e incrementa el desarrollo de las plantas de tomate
variedad Sun 7705.
La aplicacin de Trichoderma asperellum Tc74 reduce la severidad de la marchitez
vascular causada por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3, debido a que
Trichoderma asperellum Tc74 promueve la produccin de clorofilas y carotenoides, el
desarrollo de las plantas y la induccin de la actividad de quitinasas en races y hojas en
tomate.

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ANEXO 1
Medio selectivo (TSM Askew & Lang 1993) Adicionado con captan

Reactivo
Sulfato de magnesio (MgSO4 7H2O)
Fosfato de potasio (K2HPO4)
Cloruro de potasio (KCl)
Nitrato de amonio (NH4NO3)
Glucosa
Cloranfenicol*
PCNB*
Rosa de Bengala
Agar
Captan*

Cantidad (g/L)
0.2
0.9
0.15
1.0
3.0
0.25
0.2
0.075
20.0
0.04

*Aplicar despus de esterilizar agregando lentamente y agitando el medio.

68