Fab 224 C

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Agrarias

Escuela de Agronoma
Control Biolgico de Rhizoctonia solani Khn en

papa (Solanum tuberosum L), mediante
diferentes concentraciones y formulados de una
cepa de Bacillus subtilis Cohn
Tesis presentada como parte de los

requisitos para optar al grado de
Licenciado en Agronoma.
Cecilia Adriana Barahona Aazco

Valdivia Chile
2012
PROFESOR PATROCINANTE:
____________________________________
Luigi Ciampi P.
Ing. Agr., M Sc., Ph. D
Instituto de Produccin y Sanidad Vegetal
PROFESORES INFORMANTES:
____________________________________
Ernesto Moya E.
Ing. Agr., M Sc., Ph.D
Departamento de Produccin Vegetal
Universidad de Concepcin
___________________________________
Carolina Lizana A.
Ing. Agr., Dr. Cs. Agr.
Instituto de Produccin y Sanidad Vegetal
INSTITUTO DE PRODUCCION Y SANIDAD VEGETAL
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer en primer lugar a mi Profesor patrocinante Luigi Ciampi, por

su constante e incondicional apoyo para terminar esta tesis. A mis profesores
colaboradores por su buena disponibilidad para orientarme y compartir sus
conocimientos.
A mis amigos Mauricio, Lorena y Cesar quienes me ayudaron en la fase

prctica y a Nolberto por su paciencia y buena disponibilidad para escucharme y
ayudarme en el anlisis estadstico. No puedo dejar de nombrar a don Ramn, don
Jos y Titin por su apoyo y hacerme los das ms gratos con sus simpatas.
Tambin, a mis amigas Dagny, Yanina y Yoya por estar siempre apoyndome y
dndome palabras de aliento cuando lo necesitaba, por compartir mis penas y por
supuesto sta y otras alegras. A Daniela por su ayuda que ha sido muy importante
para m.
No puedo dejar de agradecer a mi Familia por su apoyo incondicional en cada

momento de mi vida. A mi madre por hacer de mi la mujer que hoy soy y mis hermanos
que los quiero mucho. Carlita, gracias por esos detalles que slo t tienes y alegran la
vida.
Gracias a todos.
A mi madre con todo mi cario por su esfuerzo,

dedicacin y apoyo incondicional.
INDICE DE MATERIAS
Captulo
Pgina
RESUMEN
SUMMARY
INTRODUCCIN
REVISIN BIBLIOGRFICA
2.1
2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.3.6
2.4
2.5
2.5.1
El cultivo de la papa en Chile

Enfermedades de la papa
Rhizoctonia solani Khn en papa
Ciclo biolgico de R. solani
Condiciones climticas que favorecen a R. solani
Caractersticas morfolgicas del hongo
Sintomatologa y signos de costra negra
Escalas fitopatolgicas para la evaluacin de R. solani
Control de rizoctoniasis
Control biolgico
El gnero Bacillus Cohn
Bacillus subtilis como controlador biolgico
8
11
12
13
16
16
17
18
19
20
21
22
ii
2.6
2.6.1
2.6.1.1
2.6.2
3
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.3.1
3.2.3.2
3.2.3.3
Formulaciones de biopesticidas
Encapsulacin de bacterias
Gelificacin inica
Bioproductos lquidos concentrados
MATERIAL Y MTODO
Material
Localizacin del ensayo
Cultivar
Cepa antagonista
Equipos
Medios de cultivo
Metodologa utilizada para la formulacin de los dos bioproductos
Activacin de la cepa D03-02 liofilizada
Formulacin del bioproducto lquido concentrado
Formulacin de las bacterias encapsuladas
Preparacin del medio para la encapsulacin
Preparacin de las cpsulas
Determinacin de la viabilidad de las clulas en el interior de las
23
24
25
25
27
27
27
27
28
28
29
30
30
30
32
32
34
35
cpsulas
3.3
Metodologa utilizada para la aplicacin del bioproducto lquido

concentrado (Ensayo I)
36
iii
3.3.1
Tratamientos
36
3.3.2
Establecimiento de las parcelas
36
3.3.3
poca de plantacin
36
3.3.4
Prcticas culturales
36
3.3.5
Aplicacin del bioproducto lquido concentrado en el ensayo
36
3.3.6
Cosecha del ensayo
37
3.3.7
Parmetros evaluados
367
3.3.7.1
Rendimiento consumo y desecho
37
3.3.7.2
Grado de presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos
38
de papa
3.3.8
Diseo experimental
38
3.3.9
Anlisis estadstico
38
3.4
Metodologa
utilizada
para
la
aplicacin
del
bioproducto
39
encapsulado (Ensayo II)

3.4.1
Tratamientos
39
3.4.2
Establecimiento de las parcelas
40
3.4.3
poca de plantacin
40
3.4.4
Prcticas culturales
40
iv
3.4.5
Cosecha del ensayo
40
3.4.6
Parmetros evaluados
40
3.4.6.1
40
3.4.6.2
Grado de presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos
40
de papa
3.4.7
Diseo experimental
41
3.4.8
Anlisis estadstico
41
PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS
42
4.1
Presentacin y discusin de los resultados del ensayo I
42
4.1.1
42
4.1.2
Evaluaciones de esclerocios sobre la piel de los tubrculos
45
4.1.2.1
Presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos
45
4.2
Presentacin y discusin de los resultados del ensayo II
47
4.2.1
48
4.2.2
Evaluaciones de esclerocios sobre la piel de los tubrculos
54
4.2.2.1
Presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos
54
CONCLUSIONES
58
BIBLIOGRAFIA
59
ANEXOS
68
vi
INDICE DE CUADROS
Cuadro
1
Pgina
Superficie, produccin y rendimiento de trigo, maz, papa y arroz
en Chile (2007 2009).

2
Superficie, produccin y rendimiento de papas desde la IV a la X
regin de Chile.
3
Rendimiento promedio (kg ha-1) en papas de calibre consumo y
43
desecho, bajo diferentes frecuencias de aplicacin de una

formulacin lquida de la cepa D03-02 (B. subtilis)
4
Presencia de esclerocios (%) sobre la piel de los tubrculos hijos
46
(consumo y desecho) bajo diferentes frecuencias de aplicacin del

bioproducto lquido de la cepa D03-02
5
Efecto sobre el rendimiento consumo (kg ha-1) de acuerdo al
49
mtodo de incorporacin y dosis de la cepa D03-02 de B. subtilis

encapsulada
6
Efecto sobre el rendimiento desecho (kg/ha) de acuerdo al mtodo

de incorporacin y dosis de la cepa D03-02 de B. subtilis
encapsulada
50
vii
Presencia de esclerocios (%) sobre la piel de tubrculos hijos

(consumo y desecho) segn las distintas dosis de la cepa D03-02
encapsulada
55
viii
INDICE DE FIGURAS
Figura
1
Pgina
Ciclo biolgico de R. solani agente causal de la costra negra de
15
la papa
Micelio de R. solani que muestra la ramificacin en ngulo recto y
16
la constriccin en la base de la ramificacin
Grado de infestacin progresiva de tubrculos de papa con
19
esclerocios de Rhizoctonia solani
Protocolo para activar la cepa D03-02 de B. subtilis
31
Protocolo para formular el bioproducto lquido concentrado
33
Equipo encapsulador Nisco Var-D
34
Pasos de la aplicacin del bioproducto lquido concentrado
37
Cpsulas utilizadas en el ensayo y que en su interior contienen a la
39
cepa D03-02
Muestra representativa del rendimiento total de acuerdo a las
44
frecuencias de aplicacin de la cepa D03-02 de B. subtilis
10
Muestra representativa del rendimiento total del testigo y del

tratamiento con la aplicacin de la cepa D03-02 encapsulada con
una dosis de 104 ufc/mL
52
ix
INDICE DE ANEXOS
Anexo
1
Pgina
Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg/ha) de
69
tubrculos calibre consumo, bajo diferentes frecuencias de aplicacin

de una formulacin lquida de la cepa D03-02
Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg/ha) de
69
tubrculos calibre desecho, bajo diferentes frecuencias de aplicacin

de una formulacin lquida de la cepa D03-02
Anlisis de varianza para la presencia de esclerocios (%) sobre la piel
70
de los tubrculos hijos calibre consumo, bajo diferentes frecuencias de

aplicacin de una formulacin lquida de la cepa D03-02
70
de los tubrculos hijos calibre desecho, bajo diferentes frecuencias de

aplicacin de una formulacin lquida de la cepa D03-02
Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg ha-1) de

tubrculos calibre consumo, de acuerdo al mtodo de aplicacin y
dosis de la cepa D03-02 encapsulada
71
Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg ha-1) de
71
tubrculos calibre desecho, de acuerdo al mtodo de aplicacin y

dosis de la cepa D03-02 encapsulada
72
de los tubrculos hijos calibre consumo, de acuerdo al mtodo de

aplicacin y dosis de la cepa D03-02 encapsulada

8
de los tubrculos hijos calibre desecho, de acuerdo al mtodo de
72
aplicacin y dosis de la cepa D03-02 encapsulada
Esquema del ensayo I en el campo, distribucin de los bloques y
73
parcelas
10
Esquema del ensayo II en el campo, distribucin de los bloques y
74
parcelas
11
Medio de cultivo agar peptona
76
12
Medio de cultivo caldo peptona
76
13
Medio de cultivo agar papa dextrosa
77
14
Medio de cultivo caldo base melaza modificado
77
RESUMEN
Con la finalidad de evaluar en campo la capacidad antagonista de Bacillus

subtilis D03-02 frente a Rhizoctonia solani, agente causal de costra negra en papas, se
llevaron a cabo dos ensayos entre septiembre 2006 y marzo 2007. Esta cepa fue
aplicada en un ensayo bajo una bioformulacin lquida concentrada, con el propsito
de determinar la ptima frecuencia de aplicacin (semanas) de la cepa D03-02. En el
segundo ensayo, la cepa se aplic como cpsulas cuyo objetivo fue determinar la
concentracin y mtodo de incorporacin adecuados para un eficiente biocontrol de
R. solani.
Ambos ensayos se llevaron a cabo en un suelo infectado de forma natural y los

tubrculos semilla utilizados se encontraban infestados con esclerocios de R. solani.
El ensayo I consisti en la aplicacin de la cepa bajo una bioformulacin lquida
concentrada a base de melaza, con una dosis 1x105 ufc mL-1 donde las frecuencias de
aplicacin al cultivo se realizaron cada 2, 4 y 8 semanas desde la plantacin hasta la
cosecha y el tratamiento control al cual no se le aplic el bioproducto lquido
concentrado. De esta manera, el diseo experimental fue bloques completos al azar
con 4 tratamientos y 4 repeticiones.
El ensayo II consisti en la aplicacin de la cepa D03-02 de B. subtilis bajo una

bioformulacin de cpsulas, con diferentes dosis (0, 104, 105 y 106 ufc mL-1) y dos
mtodos de incorporacin (MI) de las cpsulas al cultivo, los cuales consistieron en
surco abierto (SA) y surco cerrado (SC). As, el ensayo present un diseo
experimental de bloques completos al azar con 8 tratamientos y 4 repeticiones. Los
tratamientos fueron ordenados como un arreglo factorial de dos factores, siendo los
factores: (1) tipo de surcos (abierto y cerrado) y (2) Dosis de aplicacin (0, 104, 105 y
106 ufc mL-1).
Para evaluar la capacidad antagnica de la cepa D03-02 fueron considerados

los siguientes parmetros: rendimiento consumo y desecho; presencia y porcentaje de
reduccin de los esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos.
Los resultados mostraron, para el ensayo I que aplicando la cepa bajo la

bioformulacin lquida con una frecuencia de cada 4 semanas, se manifiesta una
mayor capacidad inhibitoria frente a R. solani. La presencia de esclerocios sobre la piel
de los tubrculos hijos fue slo de 4,7%.
En cuanto al segundo ensayo, fue posible establecer que las cpsulas con
dosis 104 y 105 ufc mL-1 de la cepa D03-02 presentan un control biolgico efectivo
frente a R. solani y el mtodo de incorporacin de estas cpsulas (surco abierto o
cerrado) slo fue efectivo en la evaluacin del rendimiento (kg ha-1) del cultivo
(consumo y desecho).
SUMMARY
As an evaluation in a cultivated ground the antagonistic ability of Bacillus subtilis

strain D03-02 with a Rhizoctonia solani, causal agent of black scurf in potatoes, carried
through two experiments between September 2006 and March 2007. This strain was
applicated in an essay with a liquid and concentrated bioformulation for determining the
best frequency of application (weeks) of the strain D03-02. In the second essay, it was
applicated as capsules for determining the concentration and method of an adequate
incorporation for an efficient biocontrol of R. solani.
Both essays carried through in an infected ground in a natural form and the
daughter tubers used found infected with sclerotia of R. solani.
The first essay was composed of an application of the strain with a liquid and
concentrated bioformulation based in sugar beet molasses with a quantity 1x105 ufc mL1
in which the frequency of application to the farming were made each 2, 4 and 8 weeks
from the planting to the harvest and the control treatment that was not applied the liquid
concentrated bioproduct. In this way, the experimental plan consisted in complete
blocks at random with 4 treatments and 4 repetitions.
The second essay consisted in an application of the strain D03-02 de B. subtilis

with a bioformulation of capsules with different quantity (0, 104, 105 and 106 ufc mL-1)
and two methods of incorporation (MI) of the capsules to the farming which consisted in
an opened furrow (SA) and a covered furrow (SC). In this way, the essay presented an
experimental plan of complete blocks at random with 8 treatments and 4 applications.
The treatments were ordered as a factorial agreement with two factors. The
factors were: (1) pattern of furrow (opened and covered) and (2) quantity of application
(0,104,105 and 106 ufc mL-1).
For evaluating the antagonistic capacity of the strain D03-02 were considered
the following parameters: consumption yield and discarded of potatoes; presentation
and percentage of reduction of sclerotia on the skin of daughter potato tubers.
The results showed: for the first essay that applying the strain with a liquid
formulation with four weeks of frequency, it showed a greater inhibition between R.
solani. The presence of sclerotia over the skin of daughter potato tubers was only 4,7%.
In the second essay was possible to establish that the capsules with a quantity
4
10 and 105 ufc mL-1 of the strain D03-02 show a biological and effective control in front
of R. solani and the incorporation method of these capsules (opened and covered
furrow) was effective only the evaluation of the efficient of farming (consumption and
discarded).
1 INTRODUCCION
La papa (Solanum tuberosum) es uno de los cultivos ms importantes en el

mundo como fuente de alimentacin humana despus del trigo, arroz y maz.
Actualmente est siendo ampliamente valorada por ser un alimento rico en

vitamina C, libre de grasas y tener notables propiedades antioxidantes. Todo esto se
ha logrado gracias a la tecnologa que hoy se encuentra disponible para detectar stas
y otras caractersticas en diferentes cultivos alimenticios.
Para obtener una produccin con alto rendimiento y de calidad, es necesario

considerar diferentes factores, entre ellos est el prevenir o controlar enfermedades
propias del cultivo.
En Chile, una de las enfermedades ms importantes que afecta a la papa en la

zona sur del pas es causada por el hongo Rhizoctonia solani Khn. Este agente,
induce necrosis y reduce drsticamente el rendimiento afectando adems a muchos
cultivos.
La presencia de esclerocios en la piel de la papa es conocida como costra

negra y es una de las caractersticas ms importantes de R. solani. De acuerdo a lo
mencionado anteriormente, los tubrculos-semilla que se utilizan para establecer el
cultivo son el principal vehiculo de transmisin del hongo, que dependiendo de la
susceptibilidad varietal y condiciones de clima adecuadas, desencadenan la
enfermedad daando la produccin tanto en cantidad como en calidad.
El uso de plaguicidas para controlar sta y otras enfermedades ha sido difcil y

costoso ya que no se han logrado los resultados esperados. Esto ha llevado a buscar
nuevos sistemas de control, convirtindose el control biolgico en una nueva y gran
posibilidad para el combate de enfermedades.
De esta manera, la formulacin de productos biolgicos est teniendo una gran

importancia a nivel mundial, lo que ha despertado el inters de muchos cientficos a
investigar y seleccionar diferentes microorganismos que presenten la capacidad de
desarrollar una actividad antagnica frente a R. solani.
La utilizacin de cepas de Bacillus subtilis para el control de patgenos de

plantas ha logrado buenos resultados y algunos estudios muestran que cepas de esta
especie biosintetizan sustancias bioactivas que causan la inhibicin de R. solani.
Cabe sealar que varias especies de agentes antagonistas formulados como

biopesticidas presentan otras ventajas frente a los plaguicidas tradicionales al no
contribuir con la contaminacin medioambiental y proteger la salud pblica.
Hiptesis
La inoculacin de la cepa D03-02 de Bacillus subtilis en tubrculos de papa
reduce la presencia de esclerocios de Rhizoctonia solani sobre la piel de papas hijas.
Objetivo General
Evaluar el biocontrol de Rhizoctonia solani, agente causal de la costra negra
en tubrculos de papa, mediante la aplicacin de diferentes concentraciones y
formulados de una cepa de Bacillus subtilis bajo condiciones de campo.
Objetivos especficos
Evaluar la capacidad inhibitoria frente a R. solani de una cepa de B. subtilis

formulada en estado lquido a una concentracin de 105 ufc mL-1, aplicada bajo
la modalidad de surco tapado.
Determinar la frecuencia ptima de aplicacin de la cepa de B. subtilis que

disminuya la presencia de R. solani en los tubrculos hijos, bajo una
formulacin lquida.
Evaluar el efecto de la aplicacin de una cepa de B. subtilis bajo la modalidad

de surco abierto y cerrado sobre la presencia de esclerocios de R. solani en
tubrculos hijos.
Determinar la concentracin ptima y el mtodo de incorporacin adecuados de

la cepa antagonista de R. solani encapsulada, que disminuya la presencia de
esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos.
2 REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1 El cultivo de la papa en Chile

La papa (Solanum tuberosum) es uno de los cultivos anuales de mayor
importancia en el pas, ocupando el tercer lugar en superficie y produccin;
representando el 7,6% de superficie de stos cultivos. Es as como durante la
temporada 2009/2010 las intenciones de plantacin fueron de 52.756 ha, lo que
significa un aumento de 17% respecto a las 45.078 ha plantadas en la temporada
anterior (EGUILLOR, 2009).
CUADRO 1 Superficie, produccin y rendimiento de trigo, maz, papa y arroz en

Chile (2007 2009).
Superficie (ha)
Produccin (ton)
Rendimiento (ton/ha)
Cultivo
2008/09
2009/10
2007/08
2008/09
2007/08
2008/09
Trigo
280.644
254.281
1.237.861
1.145.290
4.5
4.0
Maz
128.211
107.506
1.365.472
1.345.653
10.1
10.5
Papa
45.078
52.756
965.940
924.548
17.2
20.5
Arroz
23.680
23.980
121.400
127.311
5.7
5.3
FUENTE: OFICINA DE ESTUDIOS Y POLITICAS AGRARIAS (ODEPA), (2010)
Segn TAPIA (2005), Chile es el sexto productor de papas en Amrica Latina.

El rendimiento se ha ido incrementando de 15 ton/ha en los aos 90 a un promedio de
22 ton/ha en el 2005.
La papa, en Chile se cultiva a lo largo de todo el pas. Desde las quebradas en

Tarapac hasta la Isla de Tierra del Fuego, con producciones comerciales
concentradas en la Zona Centro Norte y Central; y en la Zona Sur, para la produccin
de tubrculo semilla (RODRIGUES, 2004).
La superficie cultivada se concentra en las regiones IV, IX, X y XIV como se

muestra en el Cuadro 2. Adems, es posible apreciar, que la mayora de las regiones
aument la superficie, produccin y rendimiento durante la temporada 2010/2011.
CUADRO 2 Superficie, produccin y rendimiento de papas desde la IV a la X

regin de Chile.
Superficie (ha)
Produccin (ton)
Rendimiento (ton/ha)
Regin
2009/10
2010/11
2009/10
2010/11
2009/10
2010/11
IV
3.421
3.208
78.466
75.516
22,9
23,5
447
1.490
11.764
31.084
26,3
20,5
RM
3.493
3.750
86.175
79.125
24,7
21,1
VI
1.981
887
38.358
15.805
19,4
17,8
VII
4.589
4.584
57.456
111.620
12,5
24,4
VIII
8.958
9.385
165.633
255.835
18,5
27,3
IX
16.756
17.757
315.519
615.990
18,8
34,7
XIV
3.767
3.839
124.688
142.120
33,1
37,0
6.672
8.063
197.024
343.081
29,5
42,6
TOTAL
50.084
52.963
1.075.083
1.670.176
205,7
248,9
FUENTE: TAPIA, (2011).
10
Este cultivo es sembrado principalmente por pequeos agricultores. Segn

TAPIA (2001), el 93% de los productores pertenecen al estrato pequeo empresarial y
de subsistencia, juntos siembran el 67% de la superficie.
Segn TAPIA (2001) y EGUILLOR (2009) a nivel de los distintos tipos de

productores existen diferencias notables en rendimiento. Los ms grandes obtienen
mejores resultados en sus cosechas, principalmente debido al acceso de mejores
tecnologas de produccin. Sin embargo, los pequeos, cuando acceden a mejores
tcnicas obtienen resultados igualmente buenos.
El principal uso de la papa en Chile es el consumo humano con un 63% de la

produccin total. El consumo fresco representa un 49%, mientras que el industrializado
est alrededor de un 14% de la produccin. La proporcin destinada a la obtencin de
papa semilla representa el 19% del total. La alimentacin del ganado (basado en
excedentes y desechos de venta) se estima en 8%. Las prdidas totales estimadas en
Chile en el cultivo de papa son de alrededor de un 10% (CONTRERAS, 2001).
Segn lo sealado por Contreras (2004), citado por CARRION (2007) el

consumo per capita en nuestro pas es de 45 kg/habitante/ao a diferencia de cualquier
pas desarrollado que supera los 70 kg/habitante/ao.
Chile est considerado como un productor de papa de muy alta calidad debido
en gran parte a las favorables condiciones fitosanitarias, de clima y suelo que se
presentan. Esto ocurre en especial en la zona sur del pas, que posee interesantes
expectativas en la exportacin de tubrculos y semilla botnica, en la medida que las
condiciones cuarentenarias y fitosanitarias se mantengan (Ciampi 2004, citado por
MUJICA, 2006).
11
Segn SANTOS (2006), la Regin de Los Lagos es considerada una de las

mejores zonas del Hemisferio Sur para la produccin de semillas de papa de alta
calidad. Los suelos francos y profundos, el clima templado-hmedo, el aislamiento
geogrfico, la ausencia de plagas y enfermedades cuarentenarias para la papa, unidos
a la capacidad cientfica y tcnica de investigadores y productores, han prestigiado la
produccin de papa semilla de esta zona en el mundo entero.
En cuanto al mercado exterior, segn EGUILLOR (2009), Chile es un

importador neto de productos derivados de papa y compra cada ao en el exterior
aproximadamente 35 millones de dlares. Durante el ao 2008 las importaciones de
papas preparadas congeladas estuvieron en primer lugar, con 23,7 millones de
dlares, seguidas por las papas snack o preparadas sin congelar (US$ 4,7 millones).
Luego, se ubicaron las importaciones de pur (US$3,6 millones) y las de consumo
fresco, con 2,2 millones de dlares.
Por otra parte, durante el perodo de enero a septiembre de 2009, se observ

un crecimiento de 22% en las exportaciones, debido a las mayores ventas de papa
para consumo fresco, snack y maicena (EGUILLOR, 2009).
2.2 Enfermedades de la papa

Una de las grandes limitaciones del cultivo de la papa son los problemas
fitopatolgicos, que producen prdidas importantes en los rendimientos y calidad del
producto, afectando su comercializacin tanto en el mercado interno como externo
(ACUA et al., 2004).
Ms de una veintena de enfermedades afecta a la papa en Chile, ms de diez

causadas por hongos, cuatro bacterianas y nueve virosas y algunas causadas por
nematodos. Todas las cuales pueden estar presentes en el suelo, en el ambiente o en
los tubrculos-semilla que se utilicen (APABLAZA, 2000).
12
Segn AGRIOS (2005), las principales enfermedades de la papa en Chile son

causadas por bacterias, que en general producen pudriciones hmedas. Las causadas
por hongos provocan pudriciones secas. Las patologas ms importantes son:
a) Enfermedades causadas por bacterias: pie negro ocasionada por Pectobacterium
carotovorum; marchitez bacteriana cuyo agente causal corresponde a Ralstonia
solanacearum Smith; sarna comn producida por Streptomyces scabies Thaxter
(AGRIOS, 2005).
b) Enfermedades causadas por hongos: Tizn temprano provocado por Alternaria
solani Ell. y Mart.; tizn tardo causado por Phytophtora infestans Mont. de Barry;
costra negra provocada por Rhizoctonia solani; sarna plateada inducida por
Helminthosporium solani Durieu y Montagne; sarna pulverulenta inducida por
Spongospora subterrnea Wallroth (AGRIOS, 2005).
c) Enfermedades causadas por virus: Enrollamiento de la hoja de la papa causada por
el virus PLRV (Potato Leafroll Virus); Mosaico severo de la papa inducido por el virus
PVY (Potato Virus Y); Virus del mosaico rugoso provocado por el virus PVX (Potato
Virus X) (AGRIOS, 2005).
2.3 Rhizoctonia solani Khn en papa

Entre las enfermedades ms recurrentes en los tubrculos de papa en la zona
sur de nuestro pas se encuentra la rizoctoniasis, tambin denominada costra negra,
siendo el agente causal, el hongo Rhizoctonia solani (ACUA et al., 2004).
La costra negra y rizoctoniasis son frecuentes en el sur de Chile y leve a

moderada en la zona central afectando el rendimiento, presentacin y comercializacin
de los tubrculos (APABLAZA, 2000).
La rizoctoniasis est presente en todas partes del mundo donde se cultivan

papas, sin embargo, los sntomas o signos asociados con cualquiera de las fases en
que el patgeno afecta al cultivo pueden ser ms o menos visibles dependiendo del
13
potencial del inculo y de las condiciones climticas locales (Hooker 1986; Banville et
al., 1996, citado por GIOVANNINI 2004).
En el cultivo de la papa, la denominacin de costra negra, se debe, segn

ROHM y HASS (1980), SAG (1982), AGRIOS (1996), y CUBETA et al., (1998), a la
presencia de pequeos esclerocios de color negro que se forman sobre la superficie de
los tubrculos. Estos corresponden a aglomeraciones de hifas que se producen hacia
el final del ciclo vegetativo de la planta y que constituyen la forma de resistencia y
diseminacin del hongo y como agregan Christias y Lockwood, (1973), citados por
JAGER et al., (1996), stos aparecen al ser estimulados por exudados de los
tubrculos, redistribuyendo recursos de las hifas a los esclerocios.
2.3.1
Ciclo Biolgico de R. solani. Segn FRANK (1980), este hongo vive
principalmente en forma de micelio y/o esclerocios en el suelo, en plantas perennes o

en rganos de propagacin como los tubrculos de papa. Cuando las condiciones son
favorables, el agente germina e invade los tallos de las plantas o los brotes
emergentes, especialmente a travs de heridas. Un medio fro y hmedo es propicio
para su desarrollo, atacando primero a los brotes y llegando a destruirlos. Cuando el
clima no favorece el desarrollo del patgeno, los brotes son dbiles, se retarda el
crecimiento de la planta y se producen tubrculos deformes.
Este hongo se expande a travs del estoln y la raz para formar una extensa
red de hifas. Durante esta etapa, la planta no presenta sntomas. La infeccin se
produce cuando ocurre la diferenciacin de las clulas de la punta de la hifa en
ramificaciones en forma de T, desarrollndose la almohadilla de infeccin sobre los
tallos y estolones susceptibles. Estas hifas, ms tarde, penetran en el tejido de la
planta (JAGER et al., 1996).
14
Sin embargo, la penetracin no es puramente mecnica (mediante almohadillas

de infeccin). Este patgeno produce una variedad de enzimas como las pectinolticas,
celulolticas y proteolticas capaces de destruir varios componentes del hospedero,
junto con la accin de toxinas que son producidas por el micelio en crecimiento activo
(Bateman, 1970, citado por BETANCOURT, 1996).
R. solani secreta algunas enzimas extracelulares como pectinasa, pectinliasa,

pectin metilesterasa, celulasa y fosfatasa, pero adems se sabe de la produccin de
ADNasa, ARNasa, alfaamilasa, quitinasa, betaglucanasa, xilanasa, proteasa y ureasa
(Bertagnolli et al., 1996, citado por GIOVANNINI, 2004).
Normalmente R. solani penetra los tejidos de un hospedero mediante

estructuras de infeccin, sin embargo, tambin posee la capacidad de penetrar a travs
de heridas, lenticelas y estomas, pero en un menor grado (MURRAY, 1982).
En la fase telomrfica o sexual, se producen basidiosporas, para el caso de

Rhizoctonia solani se denomina Thanatephorus cucumeris, perteneciente al Phylum
Basidiomycota, orden Ceratobasidiales, gnero Thanatephorus, en esta fase se
presentan hifas de ms de 17 m de dimetro con constricciones cerca del punto de
ramificacin y basidias hialinas. Este hongo forma basidiosporas en condiciones
ambientales especiales, siendo raro de encontrarlas en la naturaleza; de ah que estas
basidiosporas sean de poco valor en el diagnostico del hongo, y en la prctica se hace
referencia slo a su fase anamrfica
(AGRIOS, 1996). CIAMPI et al., (2006),
mencionan que la etapa sexual (otoo) se encuentra en condiciones de humedad y se

denomina comnmente como pie blanco.
15
FIGURA 1 Ciclo biolgico de Rhizoctonia solani, el agente causal de la costra

negra de la papa.
FUENTE: AGRIOS (1996)
16
2.3.2
Condiciones climticas que favorecen a R. solani. La temperatura ptima
para el desarrollo de la enfermedad es de 18 C y se ve favorecida por una alta

humedad de suelo y ambiente. El hongo tiene una mnima de 8 C y una mxima de
35 C (APABLAZA, 2000). Smith y Wilson (1978), citados por SCHNETTLER (1993)
indican que los esclerocios germinan de 7,7 a 30 C con el ptimo a 23 C, y el ptimo
para la germinacin de basidiosporas flucta entre 21 a 25 C.
2.3.3
Caractersticas morfolgicas del hongo. En la fase anamrfica que se ubica
dentro de Phylum Basidiomycota, gnero Rhizoctonia (anamorfo). Presenta un micelio

castao oscuro con hifas algo gruesas, posee ramificaciones en ngulo recto,
constricciones en el punto de origen de la ramificacin de la hifa y formacin de una
septa en el punto de origen (AGRIOS, 1996). Como se observa en la Figura 2.
FIGURA 2 Micelio de R. solani que muestra la ramificacin en ngulo recto y la

constriccin en la base de la ramificacin.
FUENTE: CIAMPI et al., (2006).
17
Estas caractersticas morfolgicas anteriormente descritas no permiten

diferenciar R. solani de otros aislamientos del mismo gnero, por esta razn se debe
recurrir a otras ms especificas como son sus clulas jvenes multinucleadas, aparato
septal desarrollado y la propia de su fase sexual (OGOSHI, 1987).
2.3.4
Sintomatologa y signos de costra negra. LESS (2001), indica que el
desarrollo de la planta es afectado desde la emergencia hasta la cosecha. La

enfermedad ocurre principalmente bajo el suelo, donde se observa gran variedad de
sntomas en brotes, races, tallos y estolones. Se producen manchas necrticas de
color caf, que pueden ser superficiales o extenderse internamente hacia el centro del
tallo o raz, estrangulando estos rganos (SANDOVAL, 1987; BANVILLE et al., 1996 y
AGRIOS, 1996).
Dentro de otros sntomas es posible observar agrietaduras, tubrculos

deformes, concavidades y necrosis en la superficie de los tubrculos. Este agente,
tambin puede producir cancros en brotes nuevos. Asimismo, puede causar
estrangulamiento de tallos, menor crecimiento de la planta; pigmentacin prpura de
hojas, formacin de tubrculos axilares areos y clorosis de hojas basales de la planta.
Es comn apreciar presencia de micelio blanco del hongo en la base de los tallos. Los
estolones subterrneos pueden tambin mostrar lesiones color caf claro (Hooker
1980, citado por APABLAZA, 2000).
Cuando la planta se ha desarrollado y las races y el tallo subterrneo se

encuentran afectados, se manifiestan los sntomas en el follaje. En un comienzo el
color normal de las hojas apicales y los brotes se torna amarillento. Luego adquiere un
tono rojo desteido. Los tallos suelen engrosarse y las yemas axilares comienzan a
alargarse y engrosarse, originando tubrculos areos. En los estolones y races
aparecen al principio, manchas castao oscuras, que posteriormente se transforman
en cancros alargados y bien delimitados (CALDERONI, 1978).
18
Segn CIAMPI et al., (2006), como signo de sta patologa, el agente forma
esclerocios de color negro o castao oscuro sobre la piel del tubrculo (que si se les
hace un corte transversal se ven las clulas corticales y la mdula). Estos pueden ser
chatos y superficiales o grandes e irregulares. Generalmente, la piel no presenta
anormalidades por debajo de los esclerocios. Para diferenciarlos de aglomeraciones de
tierra, se deben lavar: la tierra saldr y los esclerocios quedarn adheridos (ALONSO,
1996).
Los esclerocios pueden variar de tamao desde muy pequeo, planos, con
punteado negro, hasta grandes masas irregulares que cubren una gran parte del
tubrculo, perjudicando su apariencia y calidad (ACUA et al., 2004).
2.3.5
Escalas Fitopatolgica para la evaluacin de R. solani: Son utilizadas para
el procesamiento de datos y son ms adecuadas utilizando nmeros reales que

porcentuales. Relaciona el paquete estadstico que se va a utilizar con el tipo de dato
que se tiene. En este sentido, la escala debe manifestar en profundidad la naturaleza
de la interaccin hospedero-patgeno. Luego, el tipo de sntomas o la presencia de
signos representan la evidencia de una respuesta de la planta frente a una infeccin
(CIAMPI et al., 2006).
Para enfermedades como la costra negra o sarna plateada en papa, el grado

de severidad es preferible realizarlo en una escala de 1 a 5, donde 1 es un ejemplar
sano y 5 altamente infestado. La Figura 3 entrega un ejemplo de estos estados.
19
FIGURA 3 Grado de infestacin progresiva de tubrculos de papa con

esclerocios de Rhizoctonia solani. La flecha indica el incremento y
mayor severidad de incidencia de sarna negra. La infestacin por
esclerocios sobre la piel va de 1 (sin) hasta 5 (altamente infestada).
FUENTE: CIAMPI et al., (2006).
2.3.6
Control de rizoctoniasis: Se han propuesto variados mtodos para controlar
esta enfermedad, sin embargo, hasta la fecha, ninguno ha sido efectivo. Segn
KATARA et al., (1991) sealan que en la mayora de las regiones productoras de
papa, el uso de fungicidas constituye la prctica ms comn para el control de este
patgeno, pero los resultados varan debido posiblemente a la diferente sensibilidad a
los fungicidas que presentan los aislamientos. A continuacin se detallarn algunas
formas de controlar R. solani (ACUA et al., 2004):
- Rotacin de cultivos, por lo menos 3 o 4 aos, con cultivos de cereales y crucferas
que no son afectados por R. solani.
- Uso de semilla certificada, garantiza la ausencia de esclerocios del hongo.
- Uso de cultivares resistentes a R. solani.
- Prcticas culturales que induzcan una rpida emergencia y desarrollo de plantas.
- Cosecha rpida de los tubrculos.
- Tratamiento qumico a la semilla con fungicidas.
20
- Control biolgico y solarizacin del suelo con la finalidad de reducir la incidencia de

las enfermedades del suelo (Muoz et al., 2001, citado por, GIOVANNINI, 2004).
2.4 Control Biolgico

Segn BAKER y COOK (1974), el control biolgico se define como la
reduccin de la actividad o densidad del inoculo del organismo que produce una
enfermedad, a travs de uno o ms organismos en forma natural, o mediante la
manipulacin del ambiente husped o antagonista. Por lo tanto, este tipo de accin
ms que eliminar un patgeno, reduce su poblacin o su capacidad para producir la
enfermedad o el dao. De igual forma, CIAMPI et al., (1991), sealan que en patologa
vegetal el control biolgico se entiende como la destruccin o inhibicin total o parcial
de poblaciones del patgeno por otros microorganismos.
El control biolgico ha sido una herramienta en el manejo de plagas en la

agricultura, cuyos inicios se remontan a China 200 aos A.C. En aquellos tiempos los
agricultores utilizaban caas de bamb para comunicar los rboles entre s y permitir
que las hormigas circulasen de un rbol a otro comiendo insectos plagas (GERDING,
2005).
Para que un antagonista susceptible se convierta en un eficaz agente de control

biolgico, debe ser capaz de producir inculo abundante en cualquier condicin
climtica. Adems, debe ser genticamente estable y poseer una alta especificidad
sobre el hospedero al que se quiere controlar. Tambin debe infectar y destruir
eficazmente al patgeno en un amplio rango de condiciones ambientales y ser inocuo
para el medioambiente y animales. Como condicin final debe tolerar la accin de otros
antagonistas (MORALES, 1997).
Se han descrito varios mecanismos de accin de los antagonistas para

controlar el desarrollo de patgenos. Ellos son: competencia por espacio o por
nutrientes, interacciones directas con el patgeno (parasitismo, lisis enzimtica),
21
produccin de enzimas que degraden la pared celular, produccin de antibiticos e

induccin de resistencia (COOK y BAKER, 1983).
Entre los agentes de control biolgico ms estudiados se encuentran cepas de

microorganismos
pertenecientes
los
gneros
Streptomyces,
Pseudomonas,
Agrobacterium, Trichoderma y Bacillus (Whipps 2001, citado por ULLOA, 2007).
2.5 El gnero Bacillus Cohn

Respecto a este gnero, se puede sealar que son microorganismos fciles de
aislar desde el suelo o del aire, dado que son capaces de inducir la formacin de
endosporas. Muchos producen enzimas hidrolticas
extracelulares que rompen los
polisacridos, cidos nucleicos y lpidos, permitiendo al organismo el uso de aquellos

productos como fuente de energa y carbono. Adems, muchos Bacillus producen
antibiticos de los cuales la bacitracina, polimixina y tirocidina son algunos ejemplos.
En muchos casos, la produccin de antibiticos est relacionada a los procesos de
esporulacin y el antibitico comienza a liberarse cuando el cultivo entra en la fase
estacionaria de crecimiento (BROCK y MADIGAN, 1993).
Los miembros de este gnero son aerobios, formadores de endosporas y gram

(+). El gnero fue creado en 1872 por Cohn, quien describe a Bacillus subtilis como la
especie tipo. Esto conlleva a la observacin de las primeras endosporas en clulas de
este gnero. Pasteur describe estas estructuras en la especie causando una
enfermedad llamada flacherie en gusanos de seda pero al parecer no se percataron
que eran resistentes al calor o que estas estructuras eran responsables de la
longevidad en estas bacterias. La resistencia al calor de estas esporas fue reconocida
en B. subtilis por Cohn en 1877 (Lechevalier y Solotorovsky 1965, citado por GARAY,
2006).
La mayora de las especies de Bacillus son saprfitos que desempean, en
virtud de su considerable poder de proteolisis y la capacidad de degradar polisacridos
complejos, un papel importante en el ciclo de nutrientes en la naturaleza. La capacidad
22
para alterar molculas orgnicas complejas y resistentes se combinan para hacer del
grupo el gnero ms importante de deterioro y contaminacin de los organismos que
afectan a las actividades industriales del hombre (Starr 1981, citado por ULLOA, 2007).
2.5.1
Bacillus subtilis como controlador biolgico. En la bsqueda y seleccin de
microorganismos como agentes de control biolgico, el gnero Bacillus spp. ha

resultado de gran eficacia en el control de fitopatgenos (Katz y Demain, 1977 citados
por GIACAMAN, 2006).
Gracias a su reconocida actividad antimicrobiana es que Bacillus es usado en la

produccin comercial, lo cual ha permitido emplearlo en la actualidad como un agente
de control biolgico. B. subtilis es reconocido por producir ms de dos docenas de
antibiticos, donde la clase predominante son los de naturaleza peptdica (GIACAMAN,
2006).
B. subtilis es un microorganismo inocuo y por lo tanto no es considerado

patgeno o toxignico de los humanos, animales o plantas, por lo que el potencial
riesgo asociado al uso de ste es totalmente bajo (GIACAMAN, 2006).
B. subtilis es conocido por ser el antagonista de muchos hongos fitopatgenos.

Esta especie es capaz de lograr el antagonismo por diversos mecanismos tales como
los descritos por BUTT et al., (1999):
- Competencia por nutrientes en la rizsfera en lo que respecta a la utilizacin de
carbohidratos y nitrgeno.
- Exclusin de sitio, en la que el antagonista debe ser ms rpido que el patgeno al
momento de colonizar la rizsfera.
- Colonizacin de la bacteria en el patgeno y/o la liberacin de componentes celulares
durante el crecimiento, protegiendo su nicho, inhibiendo el crecimiento de los
competidores y utilizando la misma fuente nutricional.
23
- Antibiosis. Este mecanismo consiste en la inhibicin de un microorganismo por parte

de otro a travs de la accin de metabolitos. Para que ocurra la sntesis de la sustancia
antibitica por parte del antagonista, debe existir una adecuada fuente de carbono, la
cual puede encontrarse en diversas formas de alimentos producidos por los exudados
radiculares o de las semillas, siendo la calidad de este sustrato alimenticio un factor
determinante en la calidad y cantidad del antibitico producido.
- Se cree que el proceso de liberacin del contenido celular ha evolucionado. As el
organismo protege su nicho, inhibiendo el crecimiento de los competidores y utilizando
la misma fuente nutricional, e incluso posiblemente consumiendo a los competidores.
Sumando al antagonismo competencia y la liberacin de contenido celular, B. subtilis
tambin ha demostrado inducir la resistencia sistmica natural de la planta contra
patgenos bacterianos y fngicos, propiedad llamada Resistencia Sistmica Adquirida
(SAR).
2.6 Formulaciones de biopesticidas

Considerando los riesgos y aprehensiones manifestadas por numerosas
personas e instituciones, respecto al empleo de pesticidas en el control qumico de
enfermedades de las plantas cultivadas y sus repercusiones en la salud de las
personas e impacto ambiental, surge la urgente necesidad de desarrollar nuevos y
efectivos mtodos para control de patgenos de pre- y post-cosecha (CIAMPI, 2007).
Los biopesticidas son productos que contienen clulas de un microorganismo

como ingrediente activo o bien se extraen de un ser vivo mediante procedimientos que
no alteran su composicin qumica. Pueden estar constituidos por toda o una parte de
la sustancia extrada, concentrada o no, adicionada o no a sustancias coadyuvantes.
Estos constituyen una excelente alternativa a los productos qumicos

convencionales para el control de enfermedades y de malezas. Es as que en el mundo
la investigacin se ha concentrado principalmente en la produccin de biopesticidas
24
formulados para competir con los agroqumicos existentes, o bien para reemplazarlos o
complementarlos con aquellos pesticidas qumicos que han logrado resultados
inadecuados (CIAMPI et al., 2009).
Segn BASHAN (1998), seala que los biopesticidas se presentan en 4

formulaciones bsicas de dispersin:
Polvo
Suspensin
Cpsulas
Lquidas
2.6.1
Encapsulacin de Bacterias
La inmovilizacin de sustancias biolgicamente activas o de clulas, ha sido
una herramienta universal en la biotecnologa desde dcadas pasadas. La

inmovilizacin celular puede definirse como un procedimiento que limita clulas o
sustancias dentro de un sistema dado y que, adems, controla la migracin o difusin
de sustancias (Huebner y Buccholz, 1999, citado por RUMINOT, 2005).
Una activa inmovilizacin puede lograrse mediante un atrapamiento de clulas

mediante fuerzas fsicas o qumicas. SHULER y KARGI (2002), sealan algunas
ventajas de la inmovilizacin celular frente a cultivos en suspensin:
La inmovilizacin provee de una alta concentracin de clulas.
La combinacin de altas concentraciones celulares y elevadas tasas de flujo,

permiten una alta productividad volumtrica.
Provee de condiciones microambientales favorables para las clulas (contacto

entre clula, gradiente nutriente producto, gradientes de pH), lo que permite un
mejor rendimiento de la biocatlisis.
25
En algunos casos, la inmovilizacin mejora la estabilidad gentica de los

cultivos.
Las cpsulas son partculas esfricas con membranas semipermeables,

definindose como una manera especial de empacar, en la que un material en
particular puede ser cubierto de una manera individual para protegerlo del ambiente y
de influencias desfavorables. En un sentido amplio la encapsulacin provee de un
medio para envasar, separar y almacenar materiales a escala microscpica, para una
posterior liberacin bajo condiciones controladas (PEDROZA, 2002, SHULER Y
KARGI, 2002, CIAMPI et al., 2009).
2.6.1.1 Gelificacin inica. Es un mtodo de microencapsulasin que se desarroll

para inmovilizar clulas, donde se utiliza principalmente alginato de sodio como
componente de la membrana y la combinacin con iones divalentes como el calcio,
para
inducir
la
gelificacin
(PEDROZA,
2002).
Las
gotas
se
transforman
inmediatamente en esferas, atrapando a las clulas en una matriz tridimensional de

alginato inico, es seco, simple de usar, uniforme, biodegradable y no txico, adems,
es capaz de contener una alta poblacin bacteriana y proporciona una liberacin lenta
de los microorganismos al suelo por perodos prolongados (CIAMPI et al., 2009).
Segn BASHAN (1998), las formulaciones de encapsulacin de bacterias en la

agricultura tiene por lo menos 2 objetivos:
i) Proteger temporalmente a los microorganismos encapsulados del medio ambiente
del suelo y de la competencia microbiana
ii) La liberacin gradual de los microorganismos al suelo
2.6.2
Bioproductos lquidos concentrados. Estos inoculantes usan caldos de
cultivos o formulaciones lquidas, principalmente en agua, pero tambin en minerales o

aceites orgnicos. Las semillas se sumergen en el inoculante antes de la siembra, o
26
con un aplicador se roca uniformemente el inocuante lquido a las semillas. Despus

del secado, las semillas se siembran. Este mtodo garantiza una cobertura uniforme de
las semillas sin interferir en el sistema de control de las semillas o prdida de inoculo
cuando se secan (Smith, 1995, citado por BASHAN, 1998).
Como agentes de control biolgico de enfermedades de las hojas, el inoculante

se puede diluir en agua y rociado para una mejor cobertura de las hojas. Tambin, el
inoculante lquido se puede rociar directamente en el surco o en las semillas antes de
sembrar. En el surco proporciona una mayor cantidad de bacterias a la planta que la
inoculacin a la semilla (BASHAN, 1998).
Para bacterias con una pobre supervivencia en el suelo, como Azospirillum sp.,
stas formulaciones son en gran parte intil, ya que no proporcionan un entorno
protector para las bacterias. Adems, en algunas plantas, estas formulaciones deben
aplicarse varios das despus de la siembra en estado de plntulas, causando un
trabajo extra y un aumento en el costo para el agricultor (BASHAN, 1998).
27
3 MATERIAL Y MTODO
En esta seccin se describen los materiales y mtodos que se utilizaron para

evaluar 2 formulaciones de biopesticidas (cpsulas y lquido concentrado) a nivel de
campo, formulados en base a una cepa de Bacillus subtilis (D03-02) con actividad
antagnica in vitro frente al hongo fitopatgeno R. solani.
3.1 Material
En los siguientes puntos se describe el material que se utilizo en la presente
investigacin.
3.1.1 Localizacin del ensayo. Esta investigacin, se llevo a cabo en la Estacin

Experimental Santa Rosa, propiedad de la Universidad Austral de Chile, ubicada en el
sector Cabo Blanco a 6 km de la ciudad de Valdivia. El ensayo se realiz
seleccionando previamente un suelo que presenta incidencia de la enfermedad.
La formulacin de los bioproductos que se evaluaron en esta investigacin

fueron desarrollados en el Laboratorio de Bioinsumos y Bacteriologa del Instituto de
Produccin y Sanidad Vegetal, perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrarias de la
Universidad Austral de Chile.
3.1.2
Cultivar. Se seleccion una variedad de piel roja con presencia de la
enfermedad costra negra sobre la piel, que son los esclerocios de Rhizoctonia solani.
El cultivar que se utiliz fue Desire, y los tubrculos utilizados correspondieron a
papa-semilla descartada por la presencia de costra negra en la piel del tubrculo.
28
Las papa-semillas se seleccionaron de acuerdo a la escala fitopatolgica

mencionada en el punto 2.3.5, donde todos los tubrculos seleccionados se
encontraban dentro de la escala entre el grado 4 y 5, que presentaron un alto nivel de
incidencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos.
La papa-semilla utilizada en el ensayo proviene de Semillas SZ, empresa

Chileno-Holandesa productora de semillas certificadas de papa.
3.1.3 Cepa antagonista. Se utiliz la cepa D03-02 correspondiente a un tipo de

Bacillus subtilis. Esta cepa ha sido oficialmente registrada en la ATCC (American Type
Culture Collection) bajo la sigla y nmero ATCC PTA 8805. Adems, sta misma
forma parte de la patente Nueva cepa de Bacillus subtilis ATCC PTA 8805,
bioproductos que contienen dicha cepa y uso de los mismos para controlar al hongo
Rhizoctonia solani importante patgeno vegetal de cultivos de importancia econmica,
la que tuvo su solicitud de patente en Chile bajo el nmero 602-2008.
Esta cepa nativa de Bacillus subtilis, pertenece al cepario del proyecto Fondef
D03I 1140. La cual fue aislada desde muestras de suelo del jardn botnico de la
ciudad de Valdivia, en el ao 2005. La cepa presenta un antagonismo comprobado
frente al hongo R. solani en estudios realizados in vitro (BARRIA, 2005).
Esta cepa fue utilizada bajo dos formulaciones en los ensayos:

I) Bioproducto lquido concentrado
II) Cepa bioencapsulada
3.1.4 Equipos. Todo el manejo de la cepa D03-02 y posteriormente la formulacin de

los dos bioproductos, se realiz en el laboratorio de Bioinsumos-Bacteriologa, por lo
que todo el material utilizado pertenece a ste laboratorio, y consiste en general en:
29
- Agitador magntico
- Autoclave Quimis
- Bioencapsulador tipo Nisco Var-D
- Cmara de flujo laminar (Labconco Corporation)
- Cmara de incubacin Memmert
- Cmara de refrigeracin
- Centrifuga (Beckman J2-HS, Germany)
- Shaker agitador orbital termorregulado Max 4.000, Barnstead Lab-Line
- Stomacher 80 Laboratory Systems
- Materiales de uso habitual de laboratorio, tales como: matraces, probetas, placas de
Petri, pipetas, micropipetas, frascos Schott de 1000 ml estriles, tubos de ensayo,
entre otros.
- Materiales para la evaluacin en terreno, tales como: regadera, azadn, mallas y
balanza electrnica.
3.1.5 Medios de cultivo. Los medios de cultivo que se utilizaron son los siguientes:
- Agar peptona (Merck ), para reactivar la cepa de Bacillus subtilis liofilizada (Anexo
11).
- Caldo peptona (Merck ), para multiplicar la cepa de Bacillus subtilis (Anexo 12).
- Agar Papa Dextrosa APD (Difco ), para realizar recuentos de Bacillus subtilis (Anexo
13).
- Medio melaza, Medio utilizado para cultivar Bacillus subtilis, ha demostrado tener alto
rendimiento de biomasa, bajo costo y fcil preparacin, adems de mantener la
capacidad antagonista de la cepa (GIACAMAN, 2006) (Anexo 14).
30
3.2 Metodologa utilizada para la formulacin de los dos bioproductos.

A continuacin se describe toda la metodologa utilizada para la elaboracin del
bioproducto lquido concentrado y las cpsulas, que contienen a la cepa utilizada en
este ensayo.
3.2.1
Activacin de la cepa DO3-02 liofilizada1. Al vial que contena la cepa
liofilizada se le agreg 3 a 5 ml de Caldo Peptona (CP) y para su homogenizacin se

coloc en el vortex 5 veces por 10 segundos. Posteriormente se extrajo una alcuota
con ayuda de un asa de siembra, la que se sembr por estra en una placa Petri con
Agar Peptona (AP) y se dej incubar a 25 + 2 C durante 24 h. Transcurrida la
incubacin se procedi a extraer una colonia aislada de la cepa antagonista y
posteriormente se realiz una tincin de Gram para comprobar la pureza del cultivo
(Figura 4).
3.2.2
Formulacin del bioproducto lquido concentrado. Despus de la
reactivacin de la cepa D03-02, se procedi con la formulacin del bioproducto lquido

concentrado (Figura 5). Primero se procedi a sacar una colonia aislada de la misma
placa y se inocul en un tubo con 10 mL de CP y se incub a 25 + 2 C durante 24 h.
Posteriormente se sac 100 L del caldo con el inculo de ste tubo con una pipeta
estril y se introdujo en 10 mL de CP el que se dej incubar a 25 + 2 C durante 24 h.
Transcurrido este tiempo los 10 ml de CP con la cepa se colocaron en 1 L de Caldo
base melaza modificado estril, ya que es un medio econmico y con buen rendimiento
celular para cepas de Bacillus sp. Luego este caldo melaza fue colocado en un
agitador orbital a 25 + 2 C por 72 h, para alcanzar una concentracin de 108 ufc/mL
(OJEDA, 2007). Luego se dej decantar a temperatura ambiente por 48 h, seguido de
una eliminacin del sobrenadante para posteriormente dar un golpe fro al concentrado
para que quedase a 4 C por 24 h (CIAMPI et al., 2009). Posteriormente este
concentrado lquido fue diluido en agua y aplicado en terreno. Una vez diluido en agua
Comunicacin personal Dr. Luigi Ciampi P. Instituto de Produccin y Sanidad Vegetal, Facultad de
Ciencias Agrarias. Universidad Austral de Chile.
31
se realiz un recuento en placas para estar seguros que se aplic una concentracin
de 1x105 ufc mL-1.
FIGURA 4
Protocolo para activar la cepa D03-02 de B. subtilis. Describe el

proceso que permite corroborar la pureza de la cepa que se utilizar
para la produccin del antagonista en gran escala.
32
3.2.3 Formulacin de las bacterias encapsuladas. El proceso de encapsulacin de

las bacterias comenz una vez que la cepa D03-02 fue reactivada y se inocul el caldo
melaza para multiplicarla masivamente hasta alcanzar altas concentraciones de
biomasa (mnimo 1x108 ufc mL-1). Las cpsulas se obtuvieron de acuerdo al siguiente
procedimiento.
3.2.3.1 Preparacin del medio para la encapsulacin. El medio para la

encapsulacin correspondi a 92 mL de Caldo Melaza, al cual se le agreg alginato de
sodio al 2% como agente gelificante, para un volumen final de 100 mL (92 mL de caldo
de cultivo ms 8 mL de pellet final). Toda esta mezcla fue solubilizada durante
aproximadamente 12 h en agitador magntico (THERMOLYNE) a temperatura
ambiente y autoclavada a 100 C durante 5 min, antes de la encapsulacin (adaptado
de RUMINOT, 2005). Ver Figura 5
33
FIGURA 5 Protocolo para formular el bioproducto lquido concentrado. Describe

los pasos realizados para la elaboracin del antagonista a gran escala.
34
3.2.3.2 Preparacin de las cpsulas. Para la preparacin de las cpsulas de alginato

se utiliz el equipo Bioencapsulador Nisco Var D (Figura 6), el cual consta de una
bomba peristltica que regula el flujo del medio a encapsular, un depsito eliminador
de burbujas, un vibrador de alta frecuencia y una boquilla.
FIGURA 6 Equipo encapsulador Nisco Var-D. (1) bomba peristltica, (2)

eliminador
de
burbujas,
(3)
vibrador
de alta frecuencia,
(4)
luz
estroboscopica, (5) cabina de control.
Los parmetros utilizados para la encapsulacin, fueron los siguientes2: bomba

peristltica 25 rpm, boquilla 400 m de dimetro, frecuencia: 0,90 KHz, amplitud:
100%, luz estroboscpica: 100%. Mediante estos parmetros de encapsulacin, se
obtuvieron cpsulas homogneas en tamao, esfricas y sin colapso del sistema de
encapsulacin.
Comunicacin personal Dr. Luigi Ciampi P. Instituto de Produccin y Sanidad Vegetal, Facultad de
Ciencias Agrarias. Universidad Austral de Chile.
35
Para encapsular, se hizo pasar el homogenizado con las bacterias por el

equipo, donde las cpsulas formadas fueron recibidas en un vaso precipitado que
contena 200 mL de cloruro de calcio (Sigma-Aldrich) 0.1M estril (121 C por 15 min).
De esta manera se coagularon y formaron cpsulas con un dimetro constante de
aproximadamente 3 mm.
Las cpsulas se agitaron durante 20 min, controlando el tiempo a partir de la

primera cpsula en contacto con el cloruro de calcio (0,1 M), para lograr la firmeza y la
gelificacin deseada.
Una vez coaguladas las cpsulas en la solucin de cloruro de calcio, fueron

retiradas por medio de un colador estril y lavadas con abundante agua desionizada
estril, para eliminar el exceso de cloruro de calcio. Finalmente las biocpsulas frescas
se almacenaron en frascos Schott con 20 mL de buffer (Na2HPO4 + NaH2PO4, 0,05 M
pH 7,0), a 4 C hasta su aplicacin en terreno.
3.2.3.3 Determinacin de la viabilidad de las clulas en el interior de las cpsulas.

La viabilidad de la cepa D03-02 en el interior de las cpsulas, se determin mediante la
tcnica de siembra en placa. Para ello un gramo de las cpsulas de alginato de calcio
se suspendi en 9 mL de buffer fosfato pH 7,0 (Na2HPO4 + NaH2PO4, 0,05 M pH 7,0) y
se homogeneiz en stomacher (Stomacher 80 Laboratory Systems) mediante bolsas
de 250 mL de capacidad, divididas en dos por sellado con calor. El homogeneizado se
realiz durante 30 min a velocidad mxima del equipo, para la destruccin completa de
las cpsulas (RUMINOT, 2005).
El recuento se realiz a las cpsulas en fresco, una vez terminada su

elaboracin.
Para esto,
se
sembraron las diluciones
10-5
hasta
10-10
del
homogeneizado en placas con Agar Papa Dextrosa (APD), incubados a 25 + 1 C por

48 h. De esta manera se obtuvieron cpsulas con concentraciones de 104, 105 y 106 ufc
mL-1.
36
3.3 Metodologa utilizada para la aplicacin del bioproducto lquido concentrado

(ensayo I)
A continuacin se describe toda la metodologa utilizada en la aplicacin en
terreno del bioproducto lquido concentrado con la cepa D03-02 de B. subtilis, como
controlador biolgico de R. solani en papa.
3.3.1 Tratamientos. Los tratamientos consistieron en 3 frecuencias de aplicacin de la

cepa D03-02 de B.subtilis en formulacin lquida: cada 2, 4 y 8 semanas, desde la
plantacin hasta la cosecha. El control consisti en parcelas a las cuales no se les
aplico la formulacin lquida.
3.3.2 Establecimiento de las parcelas. Para este ensayo se establecieron parcelas

de 2,5 m2 cada una (Anexo 9). Todas con 3 hileras en las cuales se plantaron 10
tubrculos para obtener un total de 30 plantas por parcela, con una distancia de
plantacin de 75 cm entre hilera y 25 cm sobre hilera. As se obtuvo una densidad de
plantacin de 5,32 plantas / m2 (53.200 plantas ha-1).
3.3.3 poca de plantacin. Fue realizada en el mes de septiembre.
3.3.4 Prcticas culturales. Se realiz una plantacin manual, el control de malezas

tambin se desarroll manualmente y se efecto al momento de la aporca.
3.3.5 Aplicacin del bioproducto lquido concentrado en el ensayo. La aplicacin

de la formulacin lquida con B. subtilis se entrego en diferentes pocas: cada 2, 4 y 8
semanas, hasta el final del ensayo. La primera aplicacin se llevo a cabo el da de la
plantacin en todas las parcelas. El bioproducto lquido concentrado fue diluido en 10 L
de agua y aplicado en cada una de las parcelas de acuerdo a la frecuencia de
aplicacin que corresponda. La aplicacin se realiz con una regadera, sobre el surco
de la planta (Figura 7).
37
La concentracin del bioproducto lquido concentrado al momento del riego fue

de 1x105 ufc mL-1 de la cepa de B. subtilis.
1
FIGURA 7
Pasos de la aplicacin del bioproducto lquido concentrado. 1)

Bioproducto liquido concentrado, 2) Dilucin del bioproducto lquido
concentrado, 3) y 4) Aplicacin del bioproducto en terreno.
3.3.6 Cosecha del ensayo. La cosecha se llevo cabo manualmente con un azadn a
los 140 das de la plantacin. Se cosech slo la hilera central de las parcelas, que
corresponden a 2 m lineales, y se excluy a las plantas de los extremos de cada hilera.
3.3.7 Parmetros evaluados. La evaluacin se llev a cabo en las papas hijas en

post- cosecha. Esta evaluacin consisti en clasificar, pesar y evaluar el nivel de
presencia de costra negra de acuerdo a la escala fitopatolgica descrita por CIAMPI
et el., (2006) y una adaptacin de la escala descrita por TALBOT y LARKIN (2005).
3.3.7.1
Rendimiento consumo y desecho. Los tubrculos cosechados fueron
clasificados con un calibrador de papa-semilla de acuerdo al dimetro ecuatorial de

cada uno de ellos. Los tubrculos con calibre superior a 30 mm se consideraron calibre
consumo y el resto desecho. Segn CONTRERAS (2001), esto se debe a que los
tubrculos que presentan un calibre menor a 30 mm, no presentan aceptacin para el
38
consumidor, tampoco son recomendadas para el uso de semillas por poseer pocos
ojos, por lo que se consideran como desecho.
Las papas de cada categora fueron pesadas en una balanza electrnica y el

rendimiento se expres en kg ha-1.
3.3.7.2 Grado de presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos de

papa. Todos los tubrculos clasificados en consumo y desecho, se analizaron segn la
escala fitopatolgica que fue descrita por CIAMPI et al., (2006) y una adaptacin de la
escala descrita por TALBOT y LARKIN (2005).
3.3.8 Diseo experimental. El diseo experimental fue bloques completos al azar con
4 tratamientos y 4 repeticiones, siendo los tratamientos la frecuencia de aplicacin del
bioproducto lquido cada 2, 4 y 8 semanas despus de la plantacin, ms el control (no
aplicacin del bioproducto). As, la dimensin del ensayo fue dada por 4 bloques de
cuatro parcelas cada uno. Cada unidad experimental fue separada por un pasillo de 1
m por 0,4 m entre y sobre ellas respectivamente.
3.3.9 Anlisis estadstico. Se estableci la normalidad y homogeneidad de varianza

de los datos, en aquellos casos en que no se cumpli esta condicin los datos fueron
transformados a (X+1). Se realiz un anlisis de varianza (ANOVA de una va) a
0,05 y una comparacin (separacin) de medias a posteriori mediante la Diferencia
Mnima Significativa de Fisher (LSD), con un nivel de confianza del 95%.
Para el anlisis de los datos se utiliz el programa StatSoft Statistica 7.0.
39
3.4
Metodologa utilizada para la aplicacin del bioproducto encapsulado
(ensayo II)
A continuacin se describe toda la metodologa utilizada en la aplicacin en
terreno de las cpsulas con la cepa D03-02 de B. subtilis, como controlador biolgico
de R. solani en papa.
3.4.1 Tratamientos. Los tratamientos consistieron en dos mtodos de incorporacin

de las cpsulas inoculadas con la cepa D03-02 (Figura 8) al cultivo:
i) Siembra con surco abierto (SA)
ii) Siembra con surco cerrado (SC)
Y tres concentraciones de la formulacin (1x104, 1x105 y 1x106 ufc mL-1). Los

controles para ambos mtodos de incorporacin consistieron en la aplicacin de las
cpsulas sin estar inoculadas con la cepa D03-02 de B. subtilis.
FIGURA 8 Cpsulas utilizadas en el ensayo y que en su interior contienen a la

cepa D03-02.
40
3.4.2
Establecimiento de las parcelas. Similar al descrito para la aplicacin del
bioproducto lquido (Anexo 10).
3.4.3 poca de plantacin. Se realiz en el mes de septiembre.
3.4.4 Prcticas culturales. Se realiz una plantacin manual, el control de malezas

tambin se desarroll manualmente y se efecto al momento de la aporca.
3.4.5 Cosecha del ensayo. La cosecha se llevo cabo manualmente con un azadn a
los 140 das de la plantacin. Se cosech slo la hilera central de las parcelas, que
corresponden a 2 m lineales, excluyendo a las plantas de los extremos de cada hilera.
3.4.6 Parmetros evaluados. La evaluacin se llevo a cabo en las papas hijas en

post - cosecha. Esta evaluacin consisti en clasificar, pesar y evaluar el nivel de
presencia de costra negra de acuerdo a la escala fitopatolgica descrita por CIAMPI
et al., (2006) y una adaptacin de la escala descrita por TALBOT y LARKIN (2005).
3.4.6.1
Rendimiento consumo y desecho.
Los tubrculos cosechados fueron
clasificados con un calibrador de papa-semilla de acuerdo al dimetro ecuatorial de

cada uno de ellos. Los tubrculos con calibre superior a 30 mm se consideraron calibre
consumo y el resto desecho. Las papas de cada categora fueron pesadas en una
balanza electrnica y el rendimiento se expres en kg ha-1.
3.4.6.2 Grado de presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos de

papa. Todos los tubrculos clasificados en consumo y desecho, se analizaron segn la
escala fitopatolgica que fue descrita por CIAMPI et al., (2006) y una adaptacin de la
escala descrita por TALBOT y LARKIN (2005).
41
3.4.7 Diseo experimental. El diseo experimental fue bloques completos al azar con
8 tratamientos y 4 repeticiones. Los tratamientos fueron ordenados como un arreglo
factorial de dos factores, siendo los factores: (1) tipo de surcos (abierto y cerrado) y (2)
Dosis de aplicacin (0, 104, 105 y 106). As, la dimensin del ensayo fue dada por 4
bloques de 8 parcelas cada uno. Cada unidad experimental fue separada por un pasillo
de 1 m por 0,4 m entre y sobre ellas respectivamente.
3.4.8 Anlisis estadstico. Se estableci la normalidad y homogeneidad de varianza

de los datos, en aquellos casos en que no se cumplieron estos supuestos los datos
fueron transformados a (X+1). Se realiz un anlisis de varianza factorial (ANOVA
Factorial) siendo los factores (1) tipo de surcos con dos niveles (abierto y cerrado) y (2)
dosis de aplicacin con cuatro niveles (0,104, 105 y 106). Cuando el anlisis de varianza
fue significativo se procedi a realizar un test de comparaciones mltiples mediante la
Diferencia Mnima Significativa de Fisher (LSD) a 0,05, por medio del programa
StatSoft Statistica 7.0.
42
4 PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS
4.1 Presentacin y discusin de los resultados del ensayo I.

El ensayo I se refiere a lo obtenido como consecuencia de las diferentes
frecuencias de aplicacin de la bioformulacin lquida de la cepa D03-02 de B. subtilis,
con una dosis de 1x105 ufc mL-1. Metodologa descrita en el capitulo 3.3.
Cabe recordar que este ensayo se llev a cabo en un suelo infestado de forma
natural y los tubrculos semilla utilizados presentaban esclerocios de R. solani.
Las cifras que a continuacin se presentan son: rendimiento consumo desecho y presencia de los esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos.
4.1.1 Rendimiento consumo y desecho. En el Cuadro 3 se presentan los datos

referidos al rendimiento promedio (kg ha-1) de consumo y desecho, obtenidos de las
diferentes frecuencias de aplicacin del bioproducto lquido concentrado.
Al observar el Cuadro 3 es posible mencionar que no se detectaron diferencias

estadsticamente significativas (F
(3; 73)=
1,7782; p= 0,1588) en lo que se refiere a las
distintas frecuencias de aplicacin del bioproducto lquido despus de la plantacin,

asociado al rendimiento consumo (Anexo 1). Lo mismo se observ para el rendimiento
asociado al calibre de papa desecho, (F(3; 73)= 0,8384; p= 0,4771) (Anexo 2).
43
CUADRO 3: Rendimiento promedio (kg ha-1) en papas de calibre consumo y

desecho,
bajo
diferentes
frecuencias
de
aplicacin
de
una
formulacin lquida de la cepa D03-02 (B. subtilis).
FRECUENCIA DE
RENDIMIENTO CONSUMO
RENDIMIENTO DESECHO
APLICACIN
(kg/ha) (MEDIAS) EE
(kg/ha) (MEDIAS) EE
Control 1
14.400 3.939,70 a
54.272 4.527 a
16.679 4.383,60 a
42.743 5.830 a
26.943 5.503,20 a
44.685 6.250 a
27.152 6.641,70 a
50.158 6.058 a
(Semanas)
Control: Tratamiento sin la aplicacin del bioproducto lquido concentrado
Las medias con letras distintas en las columnas manifiestan diferencias significativas
(LSD, P 0,05)
Al no presentarse diferencias estadsticamente significativas entre las distintas

frecuencias de aplicacin y el control, slo es posible mencionar que la cepa
antagonista bajo esta bioformulacin lquida, no tuvo el efecto esperado sobre estos
parmetros evaluados. Dichos resultados pueden deberse a que las formulaciones
lquidas no protegen a las bacterias del medio ambiente del suelo, de los predadores
que pueden existir en este ambiente y adems, no ayudan a la sobrevivencia de las
bacterias bajo condiciones de stress (BASHAN, 1998). Sin embargo, es posible
mencionar en relacin al control, que la cepa antagonista est actuando sobre el
agente R. solani, ya que es posible apreciar en el cuadro 3 que en el calibre de papa
consumo, es el control quien presenta el menor rendimiento en comparacin a las 3
frecuencias de aplicaciones del bioproducto lquido. En un estudio realizado por
BANVILLE (1989), se demostr que plantas provenientes de tubrculos semillas
infectadas producen una reduccin entre un 21 a 34% menos de tubrculos
comerciales durante los tres aos que se realiz el estudio.
44
FIGURA 9. Muestra representativa del rendimiento total de acuerdo a las

frecuencias de aplicacin de la cepa D03-02 de B. subtilis.
2) aplicacin cada 2 semanas
1) Testigo
3) aplicacin cada 4 semanas
4)
aplicacin cada 8 semanas
En la Figura 9, se puede apreciar el rendimiento total de lo obtenido en el

campo para todos los tratamientos, destacndose el testigo ya que presenta una gran
cantidad de tubrculos pequeos y deformes; a diferencia de la aplicacin del
bioproducto cada 4 semanas (representado por el nmero 3) que se puede observar
tubrculos ms grandes y una muy baja deformacin de los mismos. Segn HARTILL
(1989) y CASTRO et al., (2011), aseguran que R. solani afecta a las plantas en el
campo, casi siempre en forma inadvertida, donde un sntoma notorio y reconocido de
este hongo es la gran cantidad de tubrculos pequeos y deformes, incrementndose
drsticamente el desecho y reducindose la calidad de los tubrculos hijos. Al igual
que en la Figura 9, esto se puede apreciar en el Cuadro 3, donde las cifras del
rendimiento pertenecientes al calibre desecho son mayores que el rendimiento
promedio del calibre de papa consumo. Estos resultados concuerdan con los de
HARTILL (1989), quien menciona que en aquellos ensayos donde haba una severa
infeccin con R. solani hubo un aumento en el rendimiento de tubrculos desecho de
entre 20 a 30 tubrculos por planta, los cuales presentaron un peso menor a 5 gr. As
mismo, en un trabajo realizado por READ et al., (1989), sealan que en la cosecha de
aquellas plantas infectadas con R. solani, presentaban una ampla distribucin en el
tamao y nmero de tubrculos, pero que predominaban tubrculos pequeos
menores a 3 cm comparados con aquellos tubrculos ms grandes
encontraban entre 3 a 7 cm.
que se
45
HARTILL (1989), seala que el gran nmero de tubrculos subterrneos en las

plantas severamente infectadas se debe a un intento de las plantas por realizar la
fotosntesis y cuando eso falla, la formacin de tubrculos areos o tallos engrosados
es una estrategia alternativa de las plantas.
4.1.2
Evaluaciones de esclerocios sobre la piel de los tubrculos.
Una vez
cosechados los tubrculos, se evalu la cantidad de esclerocios presentes sobre la piel

de los tubrculos hijos.
4.1.2.1 Presencia de esclerocios sobe la piel de los tubrculos hijos. El Cuadro 4

muestra la presencia de esclerocios (%) sobre la piel de los tubrculos para el calibre
de papa consumo y calibre de papa desecho, que se obtuvieron de acuerdo a las
diferentes frecuencias de aplicacin del bioproducto lquido concentrado.
La presencia de esclerocios (%) en la piel de los tubrculos hijos calibre

consumo es afectada significativamente (F(3;
73)=
2,99; p= 0,0362) por las distintas
frecuencias de aplicacin del bioproducto lquido, como tambin, para los tubrculos
calibre desecho (F(3; 73)= 24,02; p < 0,0001) (Anexos 3 y 4).
De acuerdo a estos resultados es posible mencionar que para esta variable en

ambos calibres, la cepa antagonista present un efecto positivo para reducir la
presencia de esclerocios de R. solani, sobre la piel de los tubrculos hijos.
En el Cuadro 4 es posible ver que la presencia de esclerocios en tubrculos de

papa consumo es muy bajo cuando se aplica el bioproducto lquido con la cepa D03-02
de B. subtilis. El mejor tratamiento se logr con la aplicacin de cada 4 semanas. Este
porcentaje (4,7%) es considerado aceptable cuando se utilizan como papa-semilla
corriente para la siguiente temporada.
46
CUADRO 4: Presencia de esclerocios (%) sobre la piel de los tubrculos hijos

(consumo y desecho) bajo diferentes frecuencias de aplicacin del
bioproducto lquido de la cepa D03-02.
FRECUENCIA DE
APLICACIN
(semanas)
Presencia de esclerocios (%)

en calibre consumo EE
Presencia de esclerocios
(%) en calibre desecho
EE
4,70 1,63
9,73 1,93
14,64 3,50
ab
20,44 3,98
ab
16,63 4,80
ab
23,78 3,30
ab
Control 1
25,10 5,31
47,91 3,62
Control: Tratamiento sin la aplicacin del bioproducto lquido concentrado
(LSD, P 0,05)
Por otro lado, el tratamiento control, al cual no se le aplic la bioformulacin

lquida con la cepa D03-02, presenta el mayor porcentaje de esclerocios,
especialmente en el tratamiento control de papa desecho (47,91%). Esto arroja una
diferencia en la presencia de esclerocios de 20,4% entre la aplicacin del bioproducto
cada 4 semanas y el tratamiento control en los tubrculos de papa consumo. As
mismo, para los tubrculos de papa desecho esta diferencia se increment casi el
doble alcanzando un 38,18% entre la misma frecuencia de aplicacin y la no aplicacin
de este bioproducto en forma lquida (control).
Estos resultados difieren de otros similares. Por ejemplo TALBOT y LARKIN

(2005), sealan que al aplicar un bioproducto lquido con la cepa GB03 de B. subtilis a
un ensayo de papa que se encontraba infestado con R. solani, se obtuvo entre un 50 a
54% de presencia de esclerocios en los tubrculos hijos y que al aplicar un bioproducto
47
lquido combinando la cepa GB03 de B. subtilis con la cepa ZH 1 de Laetisaria

arvalis, la presencia de esclerocios aumento a un 66,7%. Estos resultados pueden
deberse a que las frecuencias de aplicacin y las concentraciones (ufc mL-1) utilizadas
de cada cepa no hayan sido las mas adecuadas para que ambas cepas logren una
buena accin biocontroladora contra el hongo de R. solani, o bien, que ocurra lo que
menciona BASHAN (1998), que las formulaciones lquidas no protegen a las bacterias
del medio ambiente del suelo y que adems, no ayudan a la sobrevivencia de ellas
bajo condiciones de stress. Asimismo, WHARTON et al., (2007), mencionan que los
esclerocios transmitidos por el suelo son potencialmente tan perjudiciales como el
inculo transmitido a la siembra (papa-semilla), pero puede causar la infeccin slo
cuando los rganos de las plantas se desarrollan en la proximidad de ellas. En relacin
a lo anterior, es necesario recordar que este ensayo se llev a cabo en un suelo
infectado de forma natural y que los tubrculos de papa-semilla se encontraban
fuertemente infestados con esclerocios de R. solani.
4.2 Presentacin y discusin de los resultados del ensayo II.

A continuacin se presentan los resultados de los parmetros medidos, una vez
cosechados los tubrculos de papa del ensayo II. Este consisti en la aplicacin de la
cepa D03-02 de B. subtilis bajo una bioformulacin de cpsulas, con diferentes dosis y
dos mtodos de incorporacin (MI) de las cpsulas al cultivo, los cuales consistieron en
surco abierto (SA) y surco cerrado (SC). Metodologa descrita en el captulo 3.4
Es pertinente recordar que este ensayo se llev a cabo en un suelo infectado

de forma natural y los tubrculos semilla utilizados presentaban esclerocios de R.
solani.
Las cifras que a continuacin se presentan son: rendimiento consumo

desecho y presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos.
48
4.2.1 Rendimiento consumo y desecho. Los Cuadros 5 y 6 muestran el rendimiento

de los tubrculos de acuerdo al calibre consumo y desecho, respectivamente. La
variable rendimiento de tubrculos para el consumo es afectada significativamente por
la interaccin entre el mtodo de incorporacin (MI) y la dosis de aplicacin del
encapsulado bacterial (F(3;
149)=
2,93; p= 0,0355). De igual forma, el anlisis de los
datos del calibre desecho, indica que es tambin afectada significativamente por la
interaccin entre el mtodo de incorporacin y la dosis de aplicacin de la cepa B.
subtilis D03 02 (F(3; 149)= 3,2844; p= 0,0225) (Anexos 5 y 6).
Es probable que estos resultados se encuentren enmascarados ya que se

existe una influencia significativa (F(3; 149)= 5,47; p= 0,001332) de las parcelas donde se
llevo a cabo el ensayo. Esto podra tener relacin con factores tales como: humedad
del suelo, el pH, temperatura del suelo y/o la concentracin de nutrientes en las
parcelas. Durante el desarrollo de sta investigacin los factores mencionados no
fueron medidos. Por lo tanto, no es posible determinar cul o cules seran los que
estn influyendo en el efecto bloque.
Como seala CARRION (2007), posiblemente tanto el agente causal de costra

negra como el biocontrolador no encuentren el medio adecuado en la rizsfera, ya que
por lo general para que stos acten, tienen que escapar del mecanismo de defensa
de las plantas y encontrar las condiciones adecuadas nutritivas y medioambientales
para su crecimiento.
49
CUADRO 5: Efecto sobre el rendimiento consumo (kg ha-1) de acuerdo al mtodo

encapsulada.
MTODO DE
DOSIS
RENDIMIENTO CONSUMO (kg/ha) EE
INCORPORACIN
ufc/mL
SC
Control 1
11.748 4.161
SC
106
12.462 3.874
SA
106
14.511 2.983
ab
SA
Control 2
15.788 3.619
ab
SA
105
16.900 3.688
ab
SA
104
19.339 3.680
ab
SC
105
22.727 4.201
bc
SC
104
36.084 5.382
Control SC: Tratamientos con aplicaciones de las cpsulas sin la presencia de la cepa D03-02
bajo el mtodo de incorporacin surco cerrado.
Control SA: Tratamientos con aplicaciones de las cpsulas sin la presencia de la cepa D03-02
bajo el mtodo de incorporacin surco abierto.
(LSD, P 0,05).
50
CUADRO 6: Efecto sobre el rendimiento desecho (kg ha-1) de acuerdo al mtodo

encapsulada.
METODO DE
DOSIS
RENDIMIENTO DESECHO (kg/ha) EE
INCORPORACIN
ufc/mL
SC
Control 1
28.337 6.724
SA
105
33.355 5.441
SA
104
37.866 5.790
ab
SC
104
37.294 3.638
ab
SC
106
39.636 4.475
ab
SA
Control 2
43.473 5.537
ab
SC
105
46.990 7.659
bc
SA
106
47.186 3.788
Control SC: Tratamientos con aplicaciones de las cpsulas sin la presencia de la cepa D03-02
bajo el mtodo de incorporacin surco cerrado.
Control SA: Tratamientos con aplicaciones de las cpsulas sin la presencia de la cepa D03-02
bajo el mtodo de incorporacin surco abierto.
(LSD, P 0,05)
51
Es conocido que el rendimiento de papa consumo ms el de papa desecho es

el rendimiento total. Por lo tanto, el tratamiento ideal sera aquel que presente el mayor
rendimiento consumo con el menor desecho. Al observar los Cuadros 5 y 6 es posible
determinar que este tratamiento ideal no se logr, ya que en todos los tratamientos el
rendimiento del desecho fue mayor al consumo, quedando de manifiesto la presencia
de R. solani durante el desarrollo del cultivo. Pero s hay una cercana con el
tratamiento SC 1x104 ufc mL-1 que presenta una diferencia 1210 kg ha-1 entre el
rendimiento consumo y desecho. De igual manera, al analizar de forma independiente
los rendimientos, el Cuadro 5 muestra que el mejor rendimiento para tubrculos
consumo lo obtuvo la dosis de aplicacin del encapsulado 104 ufc mL-1 cuando se
realiz una incorporacin de dichas bacterias a surco cerrado; con un rendimiento
superior a los 36000 kg ha-1, sobrepasando en ms de 24 toneladas/ha al tratamiento
control. Lo cual refleja una mejora sustancial en el rendimiento de tubrculos consumo.
Sin embargo,
dosis ms altas (105 y 106 ufc mL-1) y con ambos mtodos de
incorporacin (SA y SC) no difieren significativamente del control, aunque dichos

resultados, en algunos casos, siguen siendo mejores que al tratamiento control
(Cuadro 5).
Es probable que estos resultados tenga relacin con la movilidad de la cepa, ya

que sta debe salir de la cpsula y llegar hasta el tubrculo de papa-semilla y actuar
sobre R. solani, que puede estar presente en el suelo o sobre la piel de la papa-semilla
por la presencia de los esclerocios y ser capaz de biocontrolar la enfermedad mediante
las diferentes sustancias antibiticas que son capaces de generar las bacterias del
gnero Bacillus.
La Figura 10 ilustra lo mencionado anteriormente, donde se observa en el

tratamiento testigo
la presencia de R. solani en el cultivo por el gran nmero de
tubrculos pequeos y deformes formando parte del desecho, a diferencia del

rendimiento logrado con la aplicacin de la cepa encapsulada de B. subtilis con una
dosis de 104 ufc mL-1 cuyo rendimiento presenta un mayor cantidad de tubrculos
pertenecientes al calibre consumo y por supuesto sin grandes deformaciones.
52
WHARTON et al., (2007), mencionan que los daos a las plantas al final de la
temporada es un resultado directo de los cancros en los estolones y tallos causando
problemas con la traslocacin del almidn. Lo cual induce que la forma, tamao y
nmero de tubrculos producidos se vean afectados, en algunos casos, drsticamente.
FIGURA 10. Muestra representativa del rendimiento total del testigo y del
tratamiento con la aplicacin de la cepa D03-02 encapsulada con
una dosis de 104 ufc/mL.
Asimismo, la dosis 104 ufc mL-1 es tambin la que produce menos desecho que
otras dosis aplicadas, ya sea surco abierto o cerrado, an as, no difiere
significativamente del tratamiento control. En este sentido, dosis ms altas de B.
subtilis D03-02 inducen una mayor cantidad de tubrculos para desecho (Cuadro 6).
Estos resultados son diferentes a los obtenidos por CARRION (2007), quien
seala que existe una mejor supresin de la enfermedad con la cepa antagonista a
una concentracin de 109 ufc mL-1.
Sin embargo, que altas poblaciones de B. subtilis tengan una menor eficacia
como antagonista, podra deberse al hecho que la bacteria bajo estas condiciones de
stress, producira menos metabolitos para controlar a R. solani.
53
Estudios anteriores hacen referencia (SZCZECH y MAKOTO, 2005), que las

bacterias del gnero Bacillus son prometedoras inoculantes debido a que stas forman
endosporas que pueden persistir en el suelo por largos periodos de tiempo. La cepa de
B. subtilis RB14C ha sido documentada como un exitoso control biolgico de R. solani
al producir sustancias antibiticas como las iturinas y surfactinas que juegan el mayor
rol de responsabilidad en el control del patgeno.
Segn NISSEN et al., (2008), al existir interaccin entre Pectovacterium

caratovorum y altas concentraciones de la cepa D03-02, del orden de 1x1014 ufc mL-1
se incrementa la severidad de la enfermedad. Por lo tanto, es posible que esta misma
situacin sea lo que suceda entre el hongo R. solani y la cepa antagonista D03-02 (ver
Cuadro 5 y 6).
BASHAN (2002), seala que las bacterias liberadas a partir de las cpsulas
tienen que migrar a travs del suelo, frente a la competencia con la micro flora nativa
del lugar y que en prcticas agrcolas convencionales ste recorrido puede ser mayor,
ya que las cpsulas pueden caer varios centmetros lejos de las semillas. Adems, en
el mismo estudio se menciona que la ausencia de una pelcula continua de agua podra
bloquear temporalmente su movimiento. Por lo cual, la colonizacin de la raz no puede
ocurrir y el efecto beneficioso no se observa en las plantas. Pero esto demuestra
tambin que la tcnica de utilizar microorganismos encapsulados es muy beneficiosa
en la agricultura por diversas razones mencionadas por BASHAN (2002). Este autor
indica que dentro de las principales ventajas de las cpsulas est su naturaleza no
txica, su biodegradabilidad y su lenta liberacin de los microorganismos en el suelo.
Es por esta razn que se obtuvieron buenos resultados en este ensayo, ya que la cepa
D03 02 fue capaz de salir de la cpsula a travs del tiempo y reducir la incidencia de R.
solani en tubrculos, especialmente para consumo.
En
la
literatura
no
existen
registros
de
fitotoxicidad
por
elevadas
concentraciones aplicadas con B. sutilis. Sin embargo, se conocen las dosis usadas de
biopesticidas que estn siendo comercializados y que tienen como ingrediente activo a
54
esta bacteria antagonista. En estos casos las concentraciones aplicadas para el control
de diversas enfermedades van desde 1x106 ufc mL-1 a 1x109 ufc mL-1 (NISSEN et al.,
2008).
4.2.2
Evaluaciones de esclerocios sobre la piel de los tubrculos. Una vez
cosechados los tubrculos, se evalu la cantidad de esclerocios presentes sobre la piel

de los tubrculos hijos.
4.2.2.1
Presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos. En el
Cuadro 7 es posible apreciar el porcentaje de incidencia de esclerocios sobre la piel de

los tubrculos para ambos calibres, consumo y desecho. Los cuales se obtuvieron de
acuerdo a la aplicacin de la cepa D03-02 encapsulada a diferentes dosis e
incorporada al suelo bajo dos modalidades.
Analizados estadsticamente los datos (Cuadro 7) para el calibre de papa

consumo, se determin que slo existen diferencias significativas (F(3; 149) = 5,633; p=
0,001102) en las distintas dosis de aplicacin de las cpsulas. Para el mtodo de
aplicacin no se observaron diferencias significativas (F(1;
149)
= 3,56; p= 0,061251)
(Anexo 7). En forma similar, para tubrculos del calibre desecho, slo se detect
diferencias significativas en la dosis de aplicacin (F(3; 149) = 5,71; p = 0,0009) pero no
as en el mtodo de aplicacin (surco abierto o cerrado) (F(1; 149) = 3,42; p = 0,0662) de
los encapsulados de B. subtilus cepa D03-02 (Anexo 8).
55
CUADRO 7: Presencia de esclerocios (%) sobre la piel de tubrculos hijos

(consumo y desecho) segn las distintas dosis de la cepa D03-02
encapsulada.
Dosis
Presencia de esclerocios (%) en
Presencia de esclerocios (%)
ufc/mL
calibre consumo EE
en calibre desecho EE
105
10,19 1,62
17,02 1,45
104
11,21 2,11
19,93 1,95
106
11,33 2,23
21,69 2,53
Control
20,47 2,11
27,44 1,80
Control: Tratamiento con aplicacin de las cpsulas sin la presencia de la cepa D03-02.
(LSD, P 0,05)
Se puede apreciar que para ambos calibres de papa (consumo y desecho) el

tratamiento control present un mayor porcentaje de presencia de esclerocios sobre la
piel de los tubrculos (Cuadro 7). Por lo tanto, es posible mencionar que al no aplicar la
cepa D03-02 encapsulada, se encuentra significativamente la presencia de esclerocios.
En ste estudio la presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos fue

menor a los obtenidos por SIMONS y GILLIGAN (1997), donde se desarrollaron
cantidades significativas de costra negra sobre la piel de los tubrculos durante las
dos temporadas en que se llevo a cabo este ensayo. Durante la primera temporada
con un nivel de inculo bajo se obtuvo un 19%
el cual aument en la segunda
temporada a un 37,4%, y con un nivel de inculo alto se produjo un 43,2% el cual

tambin aumento en la segunda temporada a un 47,8%.
56
Segn AGRIOS (1996) y WHARTON et al., (2007) sealan que la presencia de

R. solani sobre la piel de los tubrculos de papa se expresa a travs de pequeos
esclerocios de color negro, los cuales son masas compactas de micelio que se
producen hacia el final del ciclo vegetativo de la planta y que constituyen la forma de
resistencia y diseminacin del hongo.
Es por esto que se requieren tubrculos de papa-semilla libres de esclerocios

para evitar la diseminacin del hongo y todas las consecuencias negativas que provoca
esta enfermedad en el cultivo de la papa. WHARTON et al., (2007) sealan que
aunque la sarna negra es el signo ms evidente de R. solani, es el cancro del tallo el
componente ms perjudicial de la enfermedad. Por lo tanto, si las plantas estn
expuestas al patgeno durante el perodo vegetativo, el rendimiento se reduce en
comparacin al obtenido con las plantas libres de este agente. A lo cual nuevamente
WHARTON et al., (2007), mencionan que se produce una reduccin en el vigor del
cultivo debido a que hay un gasto de energa que es utilizado para producir tubrculos
en brotes secundarios o terciarios y de esta manera compensar los daos producidos
por R. solani en los brotes primarios. Ocasionalmente, los tubrculos de papa semilla
muy infestados con esclerocios de R. solani, son incapaces de producir tallos, por lo
cual los tubrculos producen estolones con varios tubrculos pequeos.
Por lo tanto, como se puede entender, es muy importante el control de esta

enfermedad para poder obtener un rendimiento de buena calidad. Este hongo est
presente durante el ciclo vegetativo de la planta provocando daos que llevan a tener
un mal rendimiento y que al final del cultivo vuelve a estar presente con los esclerocios
sobre la piel, disminuyendo la calidad del cultivo y el conjunto de daos provocados
por esta enfermedad trae consecuencias econmicas para el productor.
57
En esta investigacin se lograron efectivos resultados que reducen la incidencia

del hongo R. solani durante el desarrollo del cultivo de la papa. La cepa de B. subtilis
D03-02 demostr tener un efecto inhibitorio no slo en el laboratorio sino tambin en el
campo, siendo inocua para las plantas de papa, por lo tanto es posible su utilizacin
como controlador biolgico en este tipo de cultivos sin afectar su crecimiento y
desarrollo.
58
CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos durante el desarrollo de estos dos

ensayos es posible concluir lo siguiente:
La cepa D03-02 bajo una bioformulacin lquida present un efecto antagnico

frente a R. solani bajo condiciones de campo, donde la presencia de
esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos fue de 4,7% con aplicaciones
del bioproducto cada 4 semanas.
La frecuencia de aplicacin (semanas) de la cepa D03-02 no afecto el

rendimiento total y comercial del cultivo.
El uso de cpsulas con la cepa D03-02 de B. subtilis presentaron un efectivo

biocontrol sobre R. solani bajo condiciones de experimentos de campo en todos
los parmetros evaluados: rendimiento de papa consumo, papa desecho y
presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos.
El mtodo de incorporacin de las cpsulas al suelo, ya sea, surco abierto (SA)

o cerrado (SC) y las dosis de la cepa encapsulada, slo fueron significativos en
el rendimiento (kg ha-1) de papas que fueron clasificadas como consumo o de
desecho. La dosis 1x104 ufc mL-1 de la cepa que fue aplicada al suelo con el
mtodo de incorporacin SC fue la ms favorable para el rendimiento.
La cepa D03-02 encapsulada con dosis de 104 y 105 ufc mL-1, presenta una
accin antagnica frente a R. solani bajo condiciones de campo .
59
6 BIBLIOGRAFA
ACUA, I., BRAVO, R. y VARGAS, M. 2004. Cultivo de la papa. Tratamiento de

semilla para disminuir la incidencia de Rhizoctoniasis. INIA. Tierra Adentro.
Chile. pp 36-39
AGRIOS, G. 1996. Fitopatologa. 2 Ed. Mexico, Limusa. 838p.
AGRIOS, G. 2005. Plant Pathology. San Diego, Estados Unidos. 5 ed. Academic
Press. 922 p.
ALONSO, F. 1996. El cultivo de la patata. Madrid, Espaa. Mundi-Prensa. 272p.
APABLAZA, G. 2000. Patologa de cultivos, epidemiologa y control holstico. Ed.

Universidad Catlica de Chile. 347 p.
BAKER, K. y COOK, J. 1974. Biological control of plant pathogens. Freeman. San

Francisco, U.S.A. 433p.
BANVILLE, G. 1989. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia
solani Kuhn. American Potato Journal 66: 821 834.
60
BANVILLE, G.; CARLING, D. y OTRYSKO, B. 1996. Rhizoctonia disease on potato. In

Sneh, B.; Jabaji-Hare, S.; Neate, S. y Dijst, G. (eds), Rhizoctonia Species:
Taxonomy, Molecular Biology, Ecology, Pathology and Disease Control.
Dordrecht, The Netherlands. Kluwer Academic Publishers. 321-330.
BARRIA, M.
2005.
ambiental.
Antagonismo biolgico en contra de hongos de importancia

Tesis Tecnologa mdica.
Valdivia, Facultad de Medicina.
Universidad Austral de Chile. 65p.
BARRIENTOS, C.; BERNIER, R.; BRAVO; R.; CATALN, P.; CISTERNAS, E.;
KALAZICH, J.; LARRAN, P.; LPEZ, H.; ORENA, S.; PERALTA, J.;
SAGREDO, B.; SANTOS, J.; SIERRA, C. 2006. Manual de Produccin de
papa para la Agricultura Familiar Campesina (A.F.C).
Servicio Agrcola y
Ganadero (SAG), Santiago, Chile. Boletn tcnico N 147. 172p.
BASHAN, Y. 1998.
Inoculants of plants growth-promoting bacteria for use in
agriculture. Biotechnology Advances 16: 729-770.
BASHAN, Y.
2002.
Alginate microbeads as inoculants carriers for plant growth-
promoting bacteria. Biology Fertilization Soil. 35: 359-368.
BETANCOURT, O.
1996.
Evaluacin del dao tisular en germoplasma de papa
(Solanum tuberosum L.) mediante el uso de filtrados fitotxicos producidos por

Rhizoctonia solani Khn AG-3. Escuela de Graduados. Tesis de Magster en
Ciencias mencin Microbiologa. Universidad Austral de Chile.
Ciencias Agrarias. 146p.
Facultad de
61
BROCK, L y MADIGAN, M. 1993. Microbiologa. Prentice Hall Hispanoamericana.

Mxico. 956p.
BUTT, T., HARRIS, J. y POWELL, A. 1999. Microbial biopesticides. The European

scene. In: Biopesticides Use delivery. Eds. F. R. Hil l & J.J. Menn. Humana
Press .NJ. Pp 23-44.
CALDERONI, A. 1978. Enfermedades de la papa y su control. Buenos Aires.

Hemisferio Sur. 143p.
CARRION, J. 2007. Evaluacin de cepas de Bacillus subtilis para biocontrolar Erwinia

caratovora subp. caratovora en cala (Zantedeschia sp) y Rhizoctonia solani
Khn en papa (Solanum tuberosum L). Tesis Lic. Agr. Valdivia, Universidad
Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias. 114p.
CASTRO, I. y CONTRERAS, A. 2011. Manejo de plagas y enfermedades en el cultivo

de la papa. Imprenta Austral, Valdivia-Chile. 72p.
CIAMPI, L. y SILVA, S. 1991.
Perspectivas para el Control Biolgico de Botrytis
cinerea de vides a fungicidas dicarboximidas. Agricultura tcnica (Chile) 50:

298-303.
CIAMPI, L., RADIC, S., ALVAREZ. E. 2006. Patologa vegetal micolgica. Valdivia,
Chile.
Nuova Firenze.
Agrarias. 266p.
Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias
62
CIAMPI, L. 2007. Estado del Arte. El control biolgico y su aplicacin a situaciones

productivas. La bioencapsulacin. <http://www.bioinsumos.cl >. (05 sep 2010)
CIAMPI, L.; FUENTES, J.; COSTA, M.; NISSEN, J., SCHOBITZ, R.; SCHOEBITZ, M.;
AGUILA, P. y VERGARA, C. 2009. New Bacillus subtilis strain atcc pta-8805,
bioproducts containing said strain and use of the same to control the fungus
Rhizoctonia solani, an important plant pathogen that attacks economically
relevant crops ed. MERCHANT & GOULD PC (P.O. BOX 2903, M., MN, 554020903, US) p.7. United State: Universidad Austral de Chile (Valdivia, CL).
CHILE, SERVICIO AGRICOLA Y GANADERO (SAG). 1982. Plagas y enfermedades

comunes de la papa. Departamento de diagnstico y vigilancia. Divisin de
proteccin agrcola. Informe fitosanitario N11. 1p.
CHILE, MINISTERIO DE AGRICULTURA, OFICINA DE ESTUDIOS Y POLITICAS

AGRARIAS (ODEPA).
2010.
El mercado de la papa 2008-2009.
<http://www.odepa.gob.cl> (28 sep 2010).
COOK, J. y BAKER, K. 1983. The nature and practice of biological control of plant
pathogens. St. Paul, Minnesota. APS Press. 539p.
CONTRERAS, A. 2001. Ecofisiologa del rendimiento de la planta de papa. Revista de

la papa. Asociacin Chilena de la Papa 6: 15-16.
CUBETA, M.; CODY, B.; CERESINI, P. 1998. Rhizoctonia disease of potato. Vegetable
disease information. Note N 26. Department of Plant Pathology. North Carolina
State University. < http://www.ces.ncsu.edu/plymouth/pubs/scurf.html>. (4 Sep.
2010).
63
EGUILOR, P. 2009. El mercado de la papa. 2008 2009. Oficina de Estudios y

Polticas Agrarias (ODEPA). <http://www.odepa.gob.cl> (28 sep 2010).
FRANK, J. 1980. Rhizoctoniasis, costra negra. In: Hooker, W. J. Compendio de

enfermedades de la papa. Centro Internacional de la Papa. Lima, Per. pp: 7375.
GARAY, Y.
2006.
Aislamiento y caracterizacin de metabolitos con actividad
antagonista de cepas de Bacillus sp. hacia los agentes fitopatgenos Erwinia

caratovora (Dye) Hall y Rhizoctonia solani Khn. Escuela de Graduados. Tesis
de Magster en Ciencias mencin Microbiologa. Universidad Austral de Chile.
Facultad de Ciencias. 109p.
GERDING, M. 2005. Control biolgico en Chile, una herramienta en la agricultura

nacional.
Centro de Desarrollo Medioambiental, Universidad Central.
<http://www.sustentable.cl/portada/Reportajes/4516.asp.> (30 de abr 2010).
GIACAMANN, A. 2006. Formulacin de un biopesticida para combatir la pudricin

hmeda en la cala (Zantedeschia spp) producida por Erwinia caratovora. Tesis
Lic. Bioq. Valdivia, Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias.
165p.
GIOVANNINI, C.
2004.
Caracterizacin de Rhizoctonia solani Khn a partir de
tubrculos de papa (Solanum tuberosum L.) provenientes de diferentes predios

de la Dcima Regin de Chile. Tesis Lic. Agr. Valdivia, Universidad Austral de
Chile, Facultad de Ciencias Agrarias. 135p.
64
HARTILL, W.
1989.
Some effects of Rhizoctonia solani on growth and yield of
potatoes. Potato Research 32: 283-292.
JAGER, G., HIDE, G., VAN DEN BOOGERT, P.,TERMORSHUIZEN, A. y VAN

BAARLEN, P. 1996. Pathology and control of soil-borne fungal pathogens of
potato. Potato Research. 39: 437-469.
KATARIA, H.; VERMAN, P. y GISI, V. 1991. Variability in sensivity of Rhizoctonia solani

anastomosis groups to fungicides. Journal of Phytopathology 133: 121-133.
LEES, A. 2001. Detection and epidemiology of Rhizoctonia solani.
Harper Adams
University College SAC. <http://www.scri.sari.ac.uk/Health/HostPara/PotPath

/Rhizoct.htm > (27 sep. 2009)
MORALES, A.
1997.
Control Biolgico de Botritis cinerea en vides.
Chile
Hortofrutcola 45: 13-16.
MUJICA, P. 2006. Formulacin de la cepa S 111 de Serratia liquefaciens (Grimes y

Hennerty 1993) Bascomb et al. 1971, en matrices de alginato y su efectividad
para inhibir in vitro a Rhizoctonia solani Khn. Tesis Lic. Agr. Valdivia,
Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias. 120p.
MURRAY, D. 1982. Penetration of barley root and coleoptile surface by Rhizoctonia

solani. Trans. Br. Mycol. Soc. 79: 354-360.
NISSEN, J. et al. 2008. Biocontrol de Erwinia caratovora en cala (Zantedeschia sp.).

Agro Sur Vol. 36. 56-63.
65
OGOSHI, A. 1987. Ecology and pathogenicity of anastomosis and intraspecific groups

of Rhizoctonia solani Khn. Annual Review of Phytopathology 25: 125 143.
OJEDA, C. 2007. Formulacin de un Biocontrolador de Erwinia caratovora en polvo, a

partir de una cepa de Bacillus subtilis utilizando secado spray. Tesis Lic. Ing.
Alim. Valdivia, Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agraraias.
55p.
PEDROZA, R. 2002. Alimentos Microencapsulados: Particularidades de los procesos

para la microencapsulacin de alimentos para larvas de especies acucolas.
Cruz, L., Ricque, D., Tapia, M., Gaxiola, M., y Simoes, N. Editores. Avances en
Nutricin Acucola VI. Memorias del VI Simposium Internacional de Nutricin
Acucola. Cancn, Mxico. p438-447.
READ, P.; HIDE, G.; FIRMAGER, J. y HALL, S. 1989. Growth and yield of potatoes as
affected by severity of stem canker (Rhizoctonia solani). Potato Research. 32:
9-15.
RODRIGUES, M. 2004. La produccin y el comercio de la papa en el contexto

internacional y latinoamericano. Revista de la papa 6: 8-9.
ROHM AND HASS COMPANY, 1980. La papa. Control de sus enfermedades y plagas
en Amrica Latina. Industrias qumicas Chile S.A. Santiago, Chile. 40 p.
RUMINOT, C. 2005. Encapsulacin de bacterias lcticas en geles de alginato para la

produccin de bacteriocinas e inhibicin de Listeria monocytogenes. Tesis Lic.
Cs. Alim. Valdivia, Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias.
80p.
66
SANDOVAL, C. 1987. Enfermedades fungosas y bacterianas en papa. Estacin

Experimental Remehue, Chile. Boletn tcnico N 116. 32 p.
SCHNETTLER, E. 1993. Efecto de bacterias antagonistas en la incidencia de

Rhizoctonia solani Khn AG 3 agente causal de la sarna negra en el cultivo de
la papa (Solanum tuberosum L.). Tesis Lic. Agr. Valdivia, Universidad Austral
de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias.152 p.
SHULER, M., y KARGI, F.
2002.
Bioprocess Engineering Basic Concepts.
2nd
edition. Prentice Hall, USA. 553p.
SIMONS, S. y GILLIGAN, C. 1997. Relationships between stem canker, stolon canker,

black scurf (Rhizoctonia solani) and yield of potato (Solanum tuberosum) under
different agronomic conditions. Plant Pathology. 46: 651-658.
SZCZECH, M. y MAKOTO, S. 2005. The influence of Bacillus subtilis RB14-C on the

development of Rhizoctonia solani and indigenous microorganisms in the soil.
Canadian Journal of Microbiology 51: 405-411.
TALBOT, M. y LARKIN, R. 2005. Efficacy of several potential biocontrol organisms

against Rhizoctonia solani on potato. Crop Protection 24: 939-950.
TAPIA, B. 2001. Mercado de la papa.
Oficina de Estudios y Polticas Agrarias.
ODEPA. <http:// www.odepa.gob.cl> (13 de abr 2010).
TAPIA, B. 2005.
Mercado de la papa.
Oficina de Estudios y Polticas Agrarias.
ODEPA. <http:// www.odepa.gob.cl> (11 de abr 2010).
67
TAPIA, B. 2011. Boletn de la papa. Oficina de Estudios y Polticas Agrarias. ODEPA.

<http:// www.odepa.gob.cl> (12 de mar 2012).
WHARTON, P.; KIRK, W.; BERRY, D. y SNAPP, S. 2007. Michigan Potato Diseases.
Rhizoctonia stem canker and black scurf of potato. Extension Bulletin E-2994New.
<http://www.potatodiseases.org/pdf/rhizoctonia-bulletin.pdf> (12 enero
2012).
ULLOA, M. 2007. Identificacin de especies del gnero Bacillus no degradadores de

pectina antagonistas de Erwinia spp. y Rhizoctonia solani. Tesis Lic. Tec. Med.
Valdivia, Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias.152 p.
68
ANEXOS
69
Anexo 1. Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg/ha) de tubrculos

calibre consumo, bajo diferentes frecuencias de aplicacin de una formulacin
lquida de la cepa D03-02.
Fuente
SC
GL
CM
P-Valor
A: Bloque
1822,71
607,57
0,85
0,4712
B:
Frec.
Aplicacin
3814,21
1271,4
1,7782
0,1588
Error
52197,4
73
715,03
Total
57834,3
79
Anexo 2. Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg/ha) de tubrculos

calibre desecho, bajo diferentes frecuencias de aplicacin de una formulacin
lquida de la cepa D03-02.
Fuente
SC
GL
CM
P-Valor
A: Bloque
15445476,72
5148492,24
0,7837
0,506822
B:
Frec.
Aplicacin
16523265,03
5507755,01
0,8384
0,477151
Error
479545833,69
73
6569121,01
Total
511514575,4
79
70
Anexo 3. Anlisis de varianza para la presencia de esclerocios (%) sobre la piel

de los tubrculos hijos calibre consumo, bajo diferentes frecuencias de
aplicacin de una formulacin lquida de la cepa D03-02.
Fuente
SC
GL
CM
P-Valor
A: Bloque
376,714
125,571
0,42
0,7416
B:
Frec.
Aplicacin
2708,05
902,682
2,9948
0,0362
Error
22003,2
73
301,414
Total
25088,0
79

de los tubrculos hijos calibre desecho, bajo diferentes frecuencias de aplicacin
de una formulacin lquida de la cepa D03-02.
Fuente
SC
GL
CM
P-Valor
A: Bloque
758,088
252,696
1,17
0,3280
B:
Frec.
Aplicacin
15593,0
5197,66
24,02
< 0,0001
Error
15796,6
73
216,391
Total
32147,6
79
71
Anexo 5. Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg ha-1) de

tubrculos calibre consumo, de acuerdo al mtodo de aplicacin y dosis de la
cepa D03-02 encapsulada.
Fuente
SC
GL
CM
P-Valor
A: Bloque
8287,5
2762,5
5,4748
0,001332
B: Surco
284,6
284,6
0,5650
0,453443
C: Dosis
9270,4
3090,1
6,1352
0,000581
Interaccin
BC
4429,0
1476,3
2,9312
0,035554
Error
75047,4
149
503,7
Total
97318,9
159
Anexo 6. Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg ha-1) de

tubrculos calibre desecho, de acuerdo al mtodo de aplicacin y dosis de la
cepa D03-02 encapsulada.
Fuente
SC
GL
CM
P-Valor
A: Bloque
5396,2
1798,7
3,700
0,013204
B: Surco
222,2
222,2
0,457
0,500056
C: Dosis
1987,9
662,6
1,363
0,256351
Interaccin
BC
4789,8
1596,6
3,284
0,022568
Error
72431,0
149
486,1
Total
84827,1
159
72

de los tubrculos hijos calibre consumo, de acuerdo al mtodo de aplicacin y
dosis de la cepa D03-02 encapsulada.
Fuente
SC
GL
CM
P-Valor
A: Bloque
255,31
85,1
0,5189
0,66989
B: Surco
583,31
583,31
3,5567
0,06125
C: Dosis
2771,4
923,80
5,6328
0,00110
Interaccin
BC
523,06
174,35
1,0631
0,36670
Error
24436,46
149
164,00
Total
28569,54
159

de los tubrculos hijos calibre desecho, de acuerdo al mtodo de aplicacin y
dosis de la cepa D03-02 encapsulada.
Fuente
SC
GL
CM
P-Valor
A: Bloque
3274,5
1091,50
8,0813
0,00005
B: Surco
462,4
462,4
3,4235
0,06624
C: Dosis
2315,3
771,76
5,7140
0,00099
Interaccin
BC
358,93
119,64
0,8858
0,45003
Error
20124,68
149
135,06
Total
26535,81
159
73
Anexo 9. Esquema del ensayo I en el campo, distribucin de los bloques y

parcelas.
Bloques
Frecuencia de
Aplicacin
II
III
IV
A: C/2 Semanas
12
15
B: C/4 Semanas
10
13
C: C/8 Semanas
11
14
D: Testigo sin
antagonista
16
1,0 m
B: 13
C: 14
A: 15
D: 16
D: 9
B: 10
C: 11
A: 12
D: 5
B: 6
A: 7
C: 8
A: 1
B: 2
C: 3
D: 4
0,4 m
74
Anexo 10. Esquema del ensayo II en el campo, distribucin de los bloques y

parcelas.
Bloques
Mtodo de
incorporacin
Concentracin
II
III
IV
A: Surco Abierto
(S A)
B: Surco Abierto
104
12
17
25
105
10
20
28
C: Surco Abierto
106
18
30
D: Surco Cerrado
(S C)
E: Surco Cerrado
104
11
21
26
105
15
19
29
F: Surco Cerrado
106
14
24
32
16
22
27
13
23
31
G:Testigo
sin
antagonista S A
H:Testigo
sin
antagonista S C
1,0 m
A: 1
B: 2
C: 3
D: 4
E: 5
F: 6
G: 7
H: 8
0,4 m
75
C: 9
B: 10
D: 11
A: 12
H: 13
F: 14
E: 15
G: 16
A: 17
C: 18
E: 19
B: 20
D: 21
G: 22
H: 23
F: 24
A: 25
D: 26
G: 27
B: 28
E: 29
C: 30
H: 31
F: 32
76
ANEXO 11. Medio de cultivo agar peptona.

Reactivo
Cantidad
Extracto de carne
3g
NaCl
5g
Peptona de Casena
10 g
Agar
20 g
Agua destilada
1000 mL
Se pesa en una balanza analtica extracto de carne, NaCl, peptona de casena

y agar, los cuales se depositan en un matraz de 2000 mL con agua destilada. Se
calienta revolviendo constantemente en un agitador magntico hasta lograr una
suspensin transparente, para luego esterilizar a 1 atm. por 20 min. A continuacin, se
deposita el lquido en placas Petri.
ANEXO 12. Medio de cultivo caldo peptona.

Reactivo
Cantidad
Extracto de carne
3g
NaCl
5g
Peptona de Casena
10 g
Agua destilada
1000 mL
Este caldo requiere de los mismos elementos que el Agar Peptona, pero con la
diferencia de que se elimina el uso de agar, para que el medio no solidifique. La
preparacin es la misma; siendo necesario colocar el caldo (5mL) en tubos de ensayo
de 10 mL. Estos se tapan y luego de esterilizarlos estn listos para su utilizacin.
77
ANEXO 13. Medio de cultivo agar papa dextrosa.

Reactivo
Cantidad
Agar Papa Dextrosa Difco (ADP)
39 g
Agua destilada
1000 mL
Se prepara en un matraz de 2000 mL con agua destilada y se le agrega el APD.

Luego, se calienta revolviendo constantemente en una agitador magntico hasta quedar
transparente y se esteriliza. A continuacin, se deposita el lquido en placas Petri.
ANEXO 14. Medio de cultivo caldo base melaza modificado.

Reactivo
Cantidad
Melaza
20 g
Sacarosa
2g
Extracto de levadura
1g
Sulfato de amonio
5g
Agua destilada
1000 mL
Tampn Fosfato
K2HPO4
0,38 g
KH2PO4
11,23 g
Se pesan los reactivos y en una balanza analtica y se vierten en un matraz de

2000 mL con agua destilada, se calienta y homogeniza en un agitador magntico, para
luego ser esterilizado.

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Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Agrarias

Control Biolgico de Rhizoctonia solani Khn en

Tesis presentada como parte de los

Cecilia Adriana Barahona Aazco

INSTITUTO DE PRODUCCION Y SANIDAD VEGETAL

Quiero agradecer en primer lugar a mi Profesor patrocinante Luigi Ciampi, por

A mis amigos Mauricio, Lorena y Cesar quienes me ayudaron en la fase

No puedo dejar de agradecer a mi Familia por su apoyo incondicional en cada

A mi madre con todo mi cario por su esfuerzo,

El cultivo de la papa en Chile

Metodologa utilizada para la aplicacin del bioproducto lquido

Establecimiento de las parcelas

Aplicacin del bioproducto lquido concentrado en el ensayo

Cosecha del ensayo

Rendimiento consumo y desecho

Grado de presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos

encapsulado (Ensayo II)

Establecimiento de las parcelas

Cosecha del ensayo

Rendimiento consumo y desecho

Grado de presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos

PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Presentacin y discusin de los resultados del ensayo I

Rendimiento consumo y desecho

Evaluaciones de esclerocios sobre la piel de los tubrculos

Presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos

Presentacin y discusin de los resultados del ensayo II

Rendimiento consumo y desecho

Evaluaciones de esclerocios sobre la piel de los tubrculos

Presencia de esclerocios sobre la piel de los tubrculos hijos

en Chile (2007 2009).

Superficie, produccin y rendimiento de papas desde la IV a la X

Rendimiento promedio (kg ha-1) en papas de calibre consumo y

desecho, bajo diferentes frecuencias de aplicacin de una

Presencia de esclerocios (%) sobre la piel de los tubrculos hijos

(consumo y desecho) bajo diferentes frecuencias de aplicacin del

Efecto sobre el rendimiento consumo (kg ha-1) de acuerdo al

mtodo de incorporacin y dosis de la cepa D03-02 de B. subtilis

Efecto sobre el rendimiento desecho (kg/ha) de acuerdo al mtodo

Presencia de esclerocios (%) sobre la piel de tubrculos hijos

Micelio de R. solani que muestra la ramificacin en ngulo recto y

la constriccin en la base de la ramificacin

Grado de infestacin progresiva de tubrculos de papa con

esclerocios de Rhizoctonia solani

Protocolo para activar la cepa D03-02 de B. subtilis

Protocolo para formular el bioproducto lquido concentrado

Equipo encapsulador Nisco Var-D

Pasos de la aplicacin del bioproducto lquido concentrado

Cpsulas utilizadas en el ensayo y que en su interior contienen a la

Muestra representativa del rendimiento total de acuerdo a las

frecuencias de aplicacin de la cepa D03-02 de B. subtilis

Muestra representativa del rendimiento total del testigo y del

tubrculos calibre consumo, bajo diferentes frecuencias de aplicacin

Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg/ha) de

tubrculos calibre desecho, bajo diferentes frecuencias de aplicacin

Anlisis de varianza para la presencia de esclerocios (%) sobre la piel

de los tubrculos hijos calibre consumo, bajo diferentes frecuencias de

Anlisis de varianza para la presencia de esclerocios (%) sobre la piel

de los tubrculos hijos calibre desecho, bajo diferentes frecuencias de

Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg ha-1) de

Anlisis de varianza para el rendimiento promedio (kg ha-1) de

tubrculos calibre desecho, de acuerdo al mtodo de aplicacin y