Rezuma - Rom Miftode Alina

Universitatea de Medicin i Farmacie
Gr. T. Popa Iai

Facultatea de Farmacie
REZUMATUL
TEZEI DE DOCTORAT
Sisteme de detecie i evaluare a

activitii antioxidante a unor compui
bioactivi. Aplicaii
Conductor tiinific,
Prof. univ. dr. Vasile Dorneanu
Doctorand,
Asist. univ. farm. Alina Monica Miftode
Iai 2011
Cuprins
Introducere_____________________________________________________ 1
Scop i obiective ________________________________________________ 4
Stadiul actual al cunoaterii n domeniu
Capitolul 1. Radicalii liberi i stresul oxidativ__________________________ 5
1.1. Specii reactive ale oxigenului (SRO)___________________________ 5
1.1.1. Structura molecular a dioxigenului _______________________ 5
1.1.2. Activarea moleculei de oxigen. Oxigenul singlet _____________ 6
1.1.2.1. Oxigenul singlet: caracterizare; metode de obinere _______ 6
1.1.2.2. Formarea oxigenului singlet n organismele vii __________ 9
1.1.3. Specii reactive ale oxigenului rezultate prin reducerea univalent
a dioxigenului ____________________________________________ 10
1.1.3.1. Mecanismul reducerii univalente a dioxigenului ________ 10
1.1.3.2. Ionul radical superoxid: O 2 _______________________ 10
1.1.3.3. Radicalul hidroxil: HO __________________________ 12
1.1.3.4. Peroxidul de hidrogen: H2O2 ________________________ 12
1.2. Specii reactive ale azotului (SRN)____________________________ 14
1.2.1. Oxidul nitric: NO ____________________________________ 14
1.2.2. Anionul peroxinitrit: ONOO _________________________ 14
1.3. Stresul oxidativ. Implicaii funcionale ________________________ 15
1.3.1. Surse de producere a radicalilor liberi la nivelul organismului
uman. Stresul oxidativ______________________________________ 15
1.3.2. Efecte benefice ale agresiunilor stresante celulare ___________ 18
1.3.3. Efecte duntoare ale stresului oxidativ ___________________ 19
Capitolul 2. Antioxidani. Caracterizare general ______________________ 21
2.1. Antioxidani: concept, clasificare, aciune______________________ 21
2.1.1. Concept. Criterii de clasificare __________________________ 21
2.1.2. Mecanism de aciune. Asocierea compuilor antioxidani _____ 23
2.2. Antioxidani endogeni _____________________________________ 26
2.2.1. Antioxidani enzimatici ________________________________ 26
2.2.2. Antioxidani neenzimatici ______________________________ 27
2.3. Antioxidani exogeni ______________________________________ 28
2.3.1. Antioxidani naturali __________________________________ 28
2.3.1.1. Polifenoli ______________________________________ 28
2.3.1.2. Vitamine antioxidante_____________________________ 30
2.3.1.3. Ali compui naturali cu aciune antioxidant___________ 35
2.3.1.4. Antioxidani minerali _____________________________ 36
2.3.2. Antioxidani exogeni sintetici ___________________________ 39
2.4. Antioxidanii i sntatea___________________________________ 41
2.4.1. Implicarea antioxidanilor n diferite patologii ______________ 41
2.4.2. Medicamente cu aciune antioxidant ____________________ 43

Capitolul 3. Metode de evaluare a activitii antioxidante a compuilor bioactivi 45
3.1. Etapele de identificare i cuantificare a aciunii antioxidante_______ 45
3.1.1. Identificarea i determinarea cantitativ a compuilor fenolici _ 46
3.1.2. Cuantificarea activitii de captare a radicalilor liberi ________ 47
3.1.2.1. Metode clasice de detectare a activitii antioxidante ____ 47
3.1.2.2. Metode de detectare a captatorilor (scavengeri) de radicali
stabili _______________________________________________ 49
3.1.2.3. Detecia captatorilor de radicali instabili ______________ 50
3.1.2.4. Determinarea potenialelor de reducere _______________ 52
3.1.2.5. Efectul solventului_______________________________ 52
3.2. Sistememodel de evaluare a inhibrii oxidrii lipidice in vitro ____ 53
3.3. Metode de determinare analitic a antioxidanilor i de evaluare a
aciunii antioxidante _________________________________________ 54
3.3.1. Spectrofotometria n UVVIS __________________________ 55
3.3.2. Spectrometria prin fluorescen _________________________ 56
3.3.3. Spectroscopia de mas ________________________________ 57
3.3.4. Spectroscopia de rezonan electronic de spin (RES) _______ 57
3.3.5. Spectroscopia prin chemiluminiscen____________________ 58
3.3.6. Analiza cromatografic _______________________________ 58
3.3.7. Metode electrochimice de separare i analiz a antioxidanilor _ 60
Partea experimental
Capitolul 4. Generarea i caracterizarea radicalului cation cromofor al
clorpromazinei (CP+) ___________________________________________ 62
4.1. Scopul i obiectivele cercetrii______________________________ 62
4.2. Clorpromazina: caracterizare general. Mecanisme de oxidare _____ 63
4.3. Generarea radicalului cation CP+ n sistemul clorpromazin
maleat/persulfat de potasiu. Optimizarea parametrilor variabili ________ 64
4.3.1. Material i metod ___________________________________ 65
4.3.2. Stabilirea lungimii de und de detecie ___________________ 65
4.3.3. Influena pHului asupra mecanismului de reacie __________ 66
4.3.4. Stabilirea raportului molar optim maleat de
clorpromazin/persulfat de potasiu ___________________________ 68
4.3.5. Stabilitatea n timp a radicalului cation CP+ ___________________________ 69
4.3.6. Discuii ___________________________________________________________________________ 70
4.4. Generarea radicalului cation CP+ n sistemul clorpromazin
maleat/clorur de Fe(III). Optimizarea parametrilor variabili __________ 70
4.4.1. Material i metod ___________________________________ 71
4.4.2. Stabilirea lungimii de und de detecie ___________________ 71
4.4.3. Influena pHului asupra reaciei de oxidare a clorpromazinei cu
clorur de Fe(III) _________________________________________ 72
4.4.4. Stabilirea raportului molar optim clorpromazin maleat/ clorur de

Fe(III) __________________________________________________ 73
4.4.5. Discuii ____________________________________________ 74
4.5. Concluzii _______________________________________________ 76
Capitolul 5. Interaciunea radicalului cation CP+ cu unii antioxidani. Metode
spectrofotometrice de evaluare a activitii antioxidante _________________ 79
5.1. Interaciunea radicalului cation CP+ cu unii oxidani _____________ 79
5.2. Determinarea spectrofotometric a activitii antioxidante n sistemul
clorpromazin maleat persulfat de potasiu acid galic ______________ 79
5.2.1. Material i metod____________________________________ 80
5.2.2. Validarea metodei ____________________________________ 82
5.2.2.1. Liniaritatea funciei de rspuns______________________ 82
5.2.2.2. Limita de detecie i limita de cuantificare _____________ 89
5.2.2.3. Precizia ________________________________________ 89
5.2.2.4. Exactitatea (acurateea)____________________________ 96
5.2.3. Concluzii referitoare la determinarea prin spectrofotometrie n
vizibil a activitii antioxidante n sistemul clorpromazinacid galic _ 98
5.2.4. Evaluri analitice specifice metodelor de determinare a activitii
antioxidante_____________________________________________ 100
5.2.4.1. Determinarea absorbanelor la timp fixat _____________ 100
5.2.4.2. Determinarea ariei de sub curb (AUC) ______________ 104
clorpromazin maleat persulfat de potasiuacid ascorbic____________ 107
5.3.1. Material i metod___________________________________ 108
5.3.2. Validarea metodei ___________________________________ 110
5.3.2.1. Liniaritatea funciei de rspuns_____________________ 110
5.3.2.2. Limita de detecie i limita de cuantificare ____________ 114
5.3.2.3. Precizia _______________________________________ 115
5.3.2.4. Exactitatea (acurateea)___________________________ 119
5.3.3. Concluzii referitoare la determinarea activitii antioxidante
prin prin spectrofotometrie n vizibil n sistemul CP+ acid ascorbic _ 120
5.3.4. Evaluri analitice specifice metodelor de determinare a
activitii antioxidante_____________________________________ 121
5.3.4.1. Determinarea absorbanelor la timp fixat _____________ 121
5.3.4.2. Determinarea ariei de sub curb (AUC) ______________ 123
clorpromazin clorur de Fe(III) acid ascorbic__________________ 125
5.4.1. Material i metod___________________________________ 125
5.4.2. Validarea metodei ___________________________________ 125
5.4.2.1. Liniaritatea funciei de rspuns_____________________ 127
5.4.2.2. Limita de detecie i limita de cuantificare ____________ 133
5.4.2.3. Precizia _______________________________________ 134
5.4.2.4. Exactitatea (acurateea) ___________________________140

5.4.3. Concluzii referitoare la determinarea activitii antioxidante n
sistemul CP FeCl3 acid ascorbic prin spectrofotometrie n vizibil __ 142
5.4.4. Evaluri analitice specifice metodelor de determinare a
activitii antioxidante _____________________________________144
5.5. Aplicaii analitice ________________________________________148
5.5.1. Determinarea activitii antioxidante a liofilizatului de
Crataegus macracantha Lodd (frunze i flori) __________________148
5.5.2. Determinarea activitii antioxidante a produsului
IMUNOGRIP + zinc i vitamina C ___________________________159
5.5.3. Determinarea activitii antioxidante a produsului Antioxidant
comprimate (Farmacon) __________________________________164
5.5.4. Determinarea activitii antioxidante a produsului Ceai verde__169
5.5.5. Analiza produilor n sistemul Fe3+/K3[Fe(CN)6]. Compararea
rezultatelor ______________________________________________173
5.5.6. Discuii____________________________________________178
Capitolul 6. Studiul proprietilor oxido reductoare ale aminofenazonei.
Aplicaii la evaluarea activitii antioxidante _________________________179
6.1. Scopul i obiectivele cercetrii______________________________179
6.2. Mecanisme de oxidare a aminofenazonei de ctre speciile reactive ale
oxigenului _________________________________________________180
6.3. Determinarea catalimetric a peroxidului de hidrogen n sistemul
aminofenazon H2O2 Mo(VI) _______________________________183
6.3.1. Material i metod ___________________________________183
6.3.2. Rezultate i discuii __________________________________184
6.3.2.1. Influena concentraiei catalizatorului asupra vitezei de
reacie _______________________________________________184
6.3.2.2. Determinarea pHului optim _______________________186
6.3.2.3. Obinerea curbei de calibrare_______________________186
6.3.2.4. Discuii _______________________________________190
6.4. Determinarea spectrofotometric a polifenolilor n sistemul
aminofenazon persulfat (+)catehin_________________________192
6.4.1. Material i metod ___________________________________192
6.4.2. Rezultate i discuii __________________________________192
6.4.2.1. Obinerea curbei de calibrare_______________________192
6.4.2.2. Discuii _______________________________________197
6.5. Concluzii ______________________________________________198
Capitolul 7. Concluzii generale. Contribuii originale. Perspective de cercetare _201
7.1. Concluzii generale _______________________________________201
7.2. Contribuii originale ______________________________________205
7.3. Perspective de cercetare ___________________________________206
Bibliografie___________________________________________________208
Introducere
Studiul speciilor reactive ale oxigenului (SRO) i ale azotului
(SRN) i a implicrii acestora n declanarea sau agravarea unor
procese oxidative constituie n prezent un obiectiv important al
cercetrilor din diferite domenii: medicin, farmacie, industria
alimentar, cosmetic, petrochimie etc.
Speciile reactive ale oxigenului i ale azotului cuprind att
radicali liberi, ct i unii compui neradicalici cum ar fi peroxidul de
hidrogen, oxigenul singlet, acidul hipocloros, monoxidul de azot.
Alterrile structurale i funcionale produse de radicalii liberi,
denumite generic stres oxidativ, determin declanarea unor procese
adaptative normale sau patologice.
Stabilirea mecanismului formrii radicalilor liberi i a
modului lor de aciune a facilitat crearea unor modaliti de prevenire
a reaciilor oxidative din alimente, medicamente, produse cosmetice
etc. De asemenea, descifrarea rolului speciilor reactive ale oxigenului
i azotului n declanarea unor boli degenerative (cancer, diabet, boli
cardiovasculare) i neurodegenerative (ex. bolile Alzheimer i
Parkinson, scleroza multipl, sindromul Down) creeaz premisele
preveniei i a remedierii acestor afeciuni prin intermediul
antioxidanilor.
Antioxidanii sunt substane capabile s inhibe procesele
oxidative care se produc n diferite sisteme sub aciunea oxigenului
molecular (dioxigenul) sau a speciilor reactive ale acestuia.
Substanele antioxidante intervin n mecanismul de aprare a
organismului mpotriva strilor patologice generate de atacul
radicalilor liberi, avnd rolul de a menine un echilibru ntre
procesele prooxidative iniiate i catalizate de radicalii liberi i
procesele metabolice normale.
Antioxidanii endogeni (enzimatici i neenzimatici) au
capacitatea de a neutraliza speciile reactive radicalice i neradicalice
ale oxigenului. Atunci cnd antioxidanii endogeni nu pot asigura un
control riguros i o protecie complet a organismului mpotriva
atacului oxidativ, este necesar intervenia unor antioxidani exogeni,
furnizai fie prin alimentaie, fie prin aport medicamentos.
Se insist mult n prezent asupra rolului dietei antioxidante n
creterea imunitii i a rezistenei organismului la infecii; de aceea,
1
se urmrete permanent identificarea unor noi surse de antioxidani

exogeni i evaluarea aciunii acestora att in vitro ct i in vivo.
Metodele de evaluare a activitii antioxidante se axeaz fie
pe determinarea cantitativ a antioxidanilor individuali fie pe
cuantificarea activitii antioxidante totale a unui anumit produs:
metodele respective se pot aplica att pe plante, produse alimentare,
suplimente nutritive, cosmetice etc. ct i pe lichide biologice: snge,
ser, urin, aer expirat etc.
De multe ori rezultatele raportate sunt contradictorii datorit,
n special, faptului c nu toate metodele aplicate au fost
standardizate; de asemenea sunt mari fluctuaii n coninutul de
antioxidani, chiar n cadrul aceluiai produs, determinate de
numeroi factori: procedee de obinere, ambalare, pstrare,
temperatur, umiditate etc.
Stabilirea unei metodologii unitare de evaluare a activitii
antioxidante constituie una dintre preocuprile cercettorilor din
domeniu fiind o surs generoas de noi concluzii i recomandri.
Scop i obiective
Scopul lucrrii const n aplicarea radicalilor cationi
cromofori ai clorpromazinei (CP) i ai aminofenazonei (APH) la
realizarea unor sisteme de evaluare a activitii antioxidante din
diferite medii biologic active.
Obiectivele propuse pentru realizarea studiului sunt:
Studierea literaturii de specialitate n vederea informrii
asupra stadiului actual al cunoaterii n domeniul complex al
implicrii radicalilor liberi n declanarea stresului oxidativ i a
modului de intervenie a antioxidanilor n reglarea mecanismelor
oxidative.
Analiza i sistematizarea metodologiei actuale aplicate la
detectarea i evaluarea activitii antioxidante.
Optimizarea parametrilor reaciei de generare a radicalilor
cation ai clorpromazinei in vitro.
Realizarea unor metode spectrofotometrice de evaluare a
activitii antioxidante pe baza reaciei de captare (scavenging) a
radicalilor cation cromofori ai clorpromazinei de ctre antioxidani.
2
Validarea metodelor propuse n conformitate cu

reglementrile naionale i europene.
Se vor verifica o serie de parametri: liniaritatea, precizia,
exactitatea, limita de detecie i limita de cuantificare.
Aplicarea metodelor la detectarea i evaluarea activitii
antioxidante a unor produse bioactive: plante, suplimente nutritive,
preparate farmaceutice.
Studiul proprietilor oxidoreductoare ale amino
fenazonei i aplicarea acestora la realizarea unor sisteme de
determinare cantitativ a antioxidanilor sau a speciilor reactive ale
oxigenului.
Se va urmri ca metodele realizate s rspund exigenelor
actuale n ceea ce privete performanele analitice dar, n acelai timp
s poat fi uor aplicate, s necesite aparatur i reactivi accesibili i
necostisitori, iar timpul afectat analizei s fie ct mai redus.
Partea teoretic
Stadiul actual al cunoaterii n domeniu
n primele trei capitole sunt prelucrate datele din literatura de
specialitate care reflect stadiul actual al cunoaterii n domeniul
antioxidanilor: rolul acestora n meninerea echilibrului redox i
modalitile de evaluare a activitii antioxidante.
Capitolul 1 cuprinde o prezentare general a speciilor
reactive ale oxigenului (SRO) i ale azotului (SRN): oxigenul singlet,
ionul radical superoxid, radicalul hidroxil, peroxidul de hidrogen,
oxidul nitric, anionul peroxinitrit (4, 6, 33).
Alturi de biomolecule, radicalii liberi pot juca rolul de
mediatori ai unui mare numr de procese biologice, fie prin
modificarea unor tipuri de molecule bioactive fie prin cooperare cu
aceste molecule (13). Meninerea echilibrului dintre radicalii liberi i
biomolecule precum i a echilibrului dintre radicalii liberi i
captatorii de radicali (scavengers) sunt de o importan vital pentru
procesele fiziologice.
Perturbrile multiple celulare i tisulare produse de speciile
reactive ale oxigenului au fost denumite generic stres oxidativ (17).
Radicalii liberi contribuie, prin stresul oxidativ creat, att la
3
modularea unor procese fiziologice ct i la declanarea diverselor

stri patologice. n numeroase studii se evideniaz caracterul dual
(two faced) al SRO i SRN (18, 19).
Dintre efectele benefice ale agresiunilor stresante celulare
amintim: proprietile antibacteriene i antivirale ale radicalilor
liberi, implicarea n citoprotecia miocardic, participarea la reaciile
adaptative produse de stresul oxidativ de efort etc. (20, 21).
Efectele duntoare ale stresului oxidativ sunt ns mult mai
numeroase. Astfel, radicalii liberi n exces favorizeaz declanarea
unor boli ca ateroscleroza, Parkinson, Alzheimer (30, 33).
De asemenea, speciile reactive ale oxigenului i ale azotului
joac un rol important n procesul de cancerogenez (37) i n
declanarea complicaiilor n diabetul zaharat (39).
Se poate astfel considera c radicalii liberi pot aciona att ca
factori de autoreglare, aprare i adaptare protectiv ct i ca
generatori ai unor stri patologice, datorit dezechilibrelor
biochimice pe care le produc.
n capitolul 2 se face o sistematizare a informaiilor
referitoare la antioxidani: concept, clasificare, aciune.
Conceptul de antioxidant nu poate fi definit printro
formulare unic, aplicabil n orice sistem. n general, antioxidanii
sunt substane capabile s neutralizeze sau s stabilizeze radicalii
liberi (42).
Antioxidanii pot fi clasificai n dou mari clase: antioxidani
endogeni i antioxidani exogeni.
Antioxidanii endogeni pot fi enzimatici i neenzimatici
(45).
Antioxidanii exogeni se clasific n:
Antioxidani
naturali:
polifenoli,
vitamine
antioxidante (A, E, C, K), coenzima Q10 (48, 56, 57,
63, 66, 67, 72, 75), antioxidani minerali (compui de
seleniu, cupru, zinc, crom, mangan) (81, 87);
Antioxidani sintetici: analogi ai tocoferolului,
compui de sintez aminosterolici, analogi ai
coenzimei Q10 (97, 98).
Mecanismul de aciune a antioxidanilor depinde de natura
acestora. Stingerea (quenching) radicalilor se poate realiza prin:
- transferul unui electron singular (TES);
4
- transferul unui atom de hidrogen (TAH);

- ambele mecanisme;
- complexarea (chelatarea) ionilor metalelor tranziionale
care catalizeaz procesele oxidative.
Antioxidanii au un rol important fie n prevenirea apariiei
unor boli, fie n reducerea efectelor acestora (101, 102). Astfel,
antioxidanii naturali din diet pot reduce incidena bolilor
cardiovasculare, a cancerului, diabetului zaharat, a bolilor neuro
degenerative (109, 112, 113, 129, 133). Antioxidanii contribuie de
asemenea la protejarea sistemului imunitar (120, 126).
Deoarece sa demonstrat efectul antioxidanilor asupra
sntii, n prezent se fac cercetri n vederea identificrii unor noi
surse de antioxidani; de asemenea, sa dezvoltat metodologia de
evaluare a activitii antioxidante a diverilor produi.
n capitolul 3 se prezint un studiu comparativ al metodelor
de evaluare a activitii antioxidante a compuilor bioactivi, ncepnd
cu etapele de identificare i cuantificare a aciunii antioxidante i
menionnd apoi metodele practice de determinare analitic a
antioxidanilor i a activitii acestora.
Evaluarea aciunii antioxidante este dificil, datorit
proprietilor multifuncionale ale antioxidanilor, att n procesele
oxidative din alimente ct i n procesele fiziologice.
n literatura de specialitate recent se propune urmrirea unui
protocol de testare standardizat, elaborat iniial pentru antioxidanii
din alimente i extins apoi la studierea interveniei antioxidanilor n
organismul uman (137, 140).
Prima etap a protocolului const n identificarea i
determinarea cantitativ a compuilor fenolici (143); n etapa a doua
se cuantific activitatea de captare a radicalilor liberi (158).
Etapa urmtoare evalueaz abilitatea antioxidantului de a
inhiba oxidarea lipidic n sistememodel relevante (166). n ultima
etap cercetrile se vor orienta n funcie de scopul studiului: aplicaii
pe alimente, medicamente, cosmetice etc. sau evaluarea efectelor
antioxidanilor asupra organismului uman.
Pentru realizarea practic a acestor obiective se folosesc
metode variate: spectrofotometria n UVVIS, spectrometria prin
fluorescen, spectroscopia de mas, spectroscopia de rezonan
5
electronic de spin (RES), spectroscopia prin chemioluminiscen

(178, 188, 189).
Separarea antioxidanilor din medii complexe se realizeaz
cel mai adesea prin tehnicile cromatografice; cromatografia de
lichide de nalt performan (HPLC) cu diferite sisteme de detecie
este aplicat la determinarea antioxidanilor din medii complexe
foarte variate (192, 196, 202). Separarea i evaluarea activitii
antioxidante se realizeaz i prin metode electrochimice:
voltamperometrie, electroforez capilar, coulometrie (206, 211).
Partea experimental
Cap.4. Generarea i caracterizarea radicalului cation
cromofor al clorpromazinei (CP+)
Obiective
Generarea radicalului cation cromofor pe care
clorpromazina l formeaz prin oxidare univalent, optimizarea
parametrilor variabili i aplicarea radicalului la elaborarea unor
metode spectrofotometrice de evaluare a activitii antioxidante.
4.2. Clorpromazina: caracterizare general.
Mecanisme de oxidare
Clorpromazina ([2cloroN(3dimetilaminopropil) feno
tiazina]) formeaz prin oxidare parial un radical cation colorat,
relativ stabil, cu implicaii majore n sistemele biologice. Prin
intermediul acestor radicali, clorpromazina acioneaz ca mediator
redox al reaciilor cu transfer de electroni.
Radicalii cation ai clorpromazinei se pot forma att n mediu
apos ct i neapos.
Prin oxidarea univalent a clorpromazinei rezult dou
structuri de rezonan radicalice (2) i (3), a cror evoluie depinde n
mare msur de pHul mediului (fig. 6)
O
S
[O]
N
..
S
..
N
-eCl
.+
N
..
N
Cl
(1)
Cl
(3)
(2)
Cl
R
clorpromazin sulfoxid
incolor (4)
.+
S
..
S
H
..
S
R
+
H
R:
CH3
+
CH2 CH2 CH2 N H
CH3
.+
N
Cl
R
radical cation protonat stabil
rosu violet (5)
Fig. 6. Mecanismul de oxidare a clorpromazinei
Prin oxidare avansat se formeaz clorpromazin sulfoxidul

incolor (4) iar prin protonarea atomului de sulf (mediu puternic acid)
radicalul cation se stabilizeaz (5).
Oxidarea clorpromazinei sa realizat cu persulfat de potasiu
i, respectiv cu clorur de Fe(III). Pentru realizarea unui sistem bine
definit de determinare a activitii antioxidante, sa urmrit
optimizarea parametrilor variabili principali, care influeneaz reacia
de oxidare a clorpromazinei i stabilitatea radicalului cation.
4.3. Generarea radicalului cation CP+ n sistemul
clorpromazin maleat persulfat de potasiu.
Optimizarea parametrilor variabili.
Principiul metodei. Maleatul de clorpromazin reacioneaz
cu persulfatul de potasiu n mediu acid, formnd radicalul cation
CP+ colorat n rouviolet ce prezint un maxim de absorbie la
=525 nm.
Sau studiat urmtorii parametri:
- lungimea de und de detecie;
- influena pHului;
- raportul molar optim clorpromazin maleat / persulfat de
potasiu;
- stabilitatea n timp a radicalului cation.
4.3.2. Stabilirea lungimii de und de detecie
Pentru stabilirea lungimii de und de detecie, soluia de
radical cation se prepar astfel: la un volum de 1 mL soluie maleat
7
de clorpromazin 0,01M se adaug 8,5 mL soluie acid clorhidric 1M

i 0,5 mL persulfat de potasiu 0,001M.
Dup 20 de minute de la preparare, produsul de reacie
obinut (radicalul cation) este analizat spectrofotometric,
nregistrnduse spectrul de absorbie pe intervalul 190900 nm, fa
de ap, n cuv de 1 cm (fig. 7).
Fig. 7. Spectrul de absorbie n UVVIS pentru radicalul cation CP+

generat n sistemul clorpromazin K2S2O8
Din analiza spectrului de absorbie se observ c radicalul

cation CP+ prezint un maxim de absorbie la lungimea de und
=525 nm. Toate determinrile au fost efectuate la aceast lungime
de und.
4.3.3. Influena pHului asupra mecanismului de reacie
Se trateaz volume egale de soluii de clorpromazin maleat
cu soluii de acid clorhidric cu concentraii cuprinse ntre 0,001M
1M i cu volume egale de soluie de persulfat de potasiu. n toate
soluiile, concentraiile molare ale clorpromazinei i ale persulfatului
rmn constante. Absorbana sistemului este maxim n soluia de
HCl 1M i rmne constant timp de 30 minute.
4.3.4. Stabilirea raportului molar optim maleat de
clorpromazin/persulfat de potasiu
La stabilirea raportului molar optim maleat de clorpromazin/
persulfat de potasiu sau avut n vedere dou aspecte:
Determinrile s se efectueze n soluii de radical care s
prezinte o absorban suficient de mare, nct n urma interveniei
antioxidantului, decolorarea s poat fi msurabil;
8
Persulfatul de potasiu s reacioneze total, astfel ca n

soluia de radical s nu existe n final persulfat nereacionat care s
interfereze reacia radicalului cation cu antioxidantul.
Sa determinat absorbana soluiilor de radical la diferite
rapoarte molare clorpromazin/persulfat i sa constatat c raportul
molar optim clorpromazin/persulfat este de 20:1, raport la care
radicalul este stabil 20 de minute.
4.4. Generarea radicalului cation CP+ n sistemul
clorpromazin maleat clorur de Fe(III).
Optimizarea parametrilor variabili
Pentru extinderea posibilitilor de aplicare a radicalului
cation CP+ la determinarea activitii antioxidante, sa studiat reacia
dintre clorpromazin i clorura de Fe(III), urmrinduse optimizarea
parametrilor variabili i stabilirea condiiilor optime de generare a
radicalului cation n sistemul clorpromazin maleat FeCl3.
Principiul metodei. Clorpromazina este oxidat n mediu acid
de ctre clorura de Fe(III), cu formarea radicalului cation CP+,
colorat n rou.
Sau studiat parametrii variabili ai reaciei de oxidare, n
vederea optimizrii acestora.
4.4.2. Stabilirea lungimii de und de detecie
Pentru stabilirea lungimii de und de detecie, se prepar
soluia de radical astfel: La 1 mL soluie acid clorhidric 1M se
adaug 2 mL soluie de clorpromazin maleat 0,01M i 0,5 mL
soluie clorur de Fe(III) 0,005M. Se aduce la volum final de 5 mL
cu ap bidistilat.
Dup 20 de minute de la preparare, produsul de reacie este
analizat spectrofotometric, pe domeniul de lungimi de und 190900
nm, fa de ap ca martor, n cuve de 1 cm (fig. 10).
Fig. 10. Spectrul de absorbie n VIS a radicalului cation CP+

generat n sistemul clorpromazin FeCl3
Se constat c produsul de oxidare prezint absorbana

maxim la =525 nm, maxim identic cu al produsului de oxidare al
clorpromazinei cu persulfat de potasiu.
4.4.3. Influena pHului asupra reaciei de oxidare a
clorpromazinei cu FeCl3
Volume egale de soluie de clorpromazin 0,01M (4 mL) se
trateaz cu 1 mL soluie FeCl3 0,005M i cu 5 mL soluie acid
clorhidric de diferite concentraii (0,001M1M). Se determin
variaia absorbanei soluiilor n timp. Stabilitatea radicalului cation
este optim n soluia de HCl 1M.
Raportul molar optim CP/Fe3+, att n ceea ce privete
valoarea absorbanei, ct i stabilitatea acesteia n timp este de 8:1.
La acest raport molar radicalul rmne stabil aproximativ 60 de
minute.
Avnd n vedere aceste rezultate considerm c radicalul
cation cromofor CP+ obinut att n sistemul clorpromazin maleat
persulfat de potasiu, ct i n sistemul clorpromazin maleat clorur
de Fe(III) poate fi aplicat la evaluarea activitii antioxidante a unor
substane bioactive.
10
Cap. 5. Interaciunea radicalului cation CP+ cu unii

antioxidani. Metode spectrofotometrice de
evaluare a activitii antioxidante
5.1. Interaciunea radicalului cation CP+
cu unii antioxidani
Se consider c radicalul cation CP+ este forma bioactiv a
clorpromazinei, care rezult n organism prin oxidarea enzimatic a
acesteia.
Datorit potenialului de reducere ridicat al sistemului
CP+/CP (~860 mV), aceti radicali exercit n organism o aciune
prooxidant.
Astfel, sa evideniat faptul c radicalii cation ai
clorpromazinei pot interaciona cu unii antioxidani fiziologici cum
ar fi acidul uric i bilirubina, dar pot oxida i alte biomolecule, de ex.
tirosina sau unele proteine (caseina) (214).
Deoarece radicalul cation CP+ poate interaciona in vivo i cu
alte substane cu caracter reductor, neam propus s studiem reacia
radicalului cu dou substane antioxidante, consacrate ca standarde
de evaluare a activitii antioxidante, anume acidul ascorbic
(vitamina C) i respectiv, acidul galic (acidul 3,4,5
trihidroxibenzoic).
Acidul ascorbic constituie un antioxidant standard pentru
evaluarea activitii antioxidante a produselor vegetale,
medicamentelor, suplimentelor nutritive, cosmeticelor, dar i pentru
evaluarea antioxidanilor din plasm i din alte lichide biologice.
Acidul galic constituie un antioxidant standard pentru
evaluarea, n principal, a coninutului polifenolic din diferite produse.
Acidul ascorbic reduce radicalul CP+, prin cedarea unui
electron i oxidarea sa la acid dehidroascorbic, iar acidul galic
determin stingerea radicalului prin cedarea unui atom de hidrogen.
Deci, radicalul cation CP+ interacioneaz cu antioxidanii
prin ambele mecanisme: transferul unui electron singular (TES) i
respectiv, transferul unui atom de hidrogen (TAH).
11
5.2. Determinarea spectrofotometric a activitii

antioxidante n sistemul clorpromazin maleat
persulfat de potasiu acid galic
Dezactivarea radicalului cation CP+ de ctre unii antioxidani
conduce practic la decolorarea soluiei de radical. Mecanismul
reaciilor va depinde de compoziia i structura antioxidanilor
prezeni n prob.
Astfel, acidul galic (acidul 3,4,5 trihidroxibenzoic) poate
reaciona cu radicalul cation CP+, determinnd o reducere a
absorbanei soluiei proporional cu concentraia antioxidantului;
acidul galic poate fi folosit ca antioxidant standard pentru
determinarea spectrofotometric a activitii antioxidante (220).
Principiul metodei. Absorbana soluiei de radical cation se
diminueaz proporional cu concentraia acidului galic (antioxidantul
standard), n intervalul analitic cuprins ntre 0,010,10 moli/mL
acid galic, respectiv 10100 m/L.
Obinerea curbei de calibrare
Modul de lucru. Pentru prepararea soluiei de radical, la un
volum de 1 mL soluie de maleat de clorpromazin 0,01M se adaug
8,5 mL HCl 1M i 0,5 mL soluie K2S2O8 0,001M.
Dup 20 minute de la adugarea K2S2O8, la 2 mL soluie de
radical se adaug cte 1 mL soluie etalon de acid galic cu
concentraii cuprinse ntre 10100moli/L, volumul final fiind de 3
mL.
Se determin absorbana soluiilor la =525 nm, cuva 1 cm
fa de ap.
5.2.2. Validarea metodei
Pentru validarea metodei sau determinat urmtorii
parametri: liniaritatea funciei de rspuns, limita de detecie, limita de
cuantificare, precizia (precizia sistemului, precizia metodei i
precizia intermediar) i exactitatea (221, 222).
Liniaritatea funciei de rspuns. Conform curbelor de
calibrare se constat c domeniul de concentraie considerat (10100
moli/L acid galic), se poate mpri n dou subdomenii de
liniaritate: 1050 moli/L acid galic i respectiv 50100 moli/L
(fig.15).
12
0.50
0.45
Absorbana = -0,0039 Concentraia+ 0,4703
r2 = 0,9975
0.40
Absorbana
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
Absorbana = -0.00167 Concentraia + 0.3616
r2 = 0.9964
0.10
0.05
0.00
0
20
40
60
80
100
120
Concentraie acid galic (M/L)
Fig. 15. Curbele de calibrare
Ecuaiile dreptelor de regresie sau calculat prin metoda celor

mai mici ptrate pentru fiecare domeniu de concentraie (tabelul 27).
Tabelul 27. Liniaritatea funciei de rspuns
Parametri
Domeniul analitic (M/L acid galic)

1050 M/L
50100 M/L
Ecuaia dreptei
A=0,00393911C+0,4703313 A=0,00166684C+0,3615839
de regresie
Coeficient de
0,9987
0,9982
corelaie (r)
Coeficient de
0,9975
0,9964
regresie (r2)
0,00393911
0,0016684
Panta
0,4703313
0,3615839
Intercept
A fost evaluat i liniaritatea rezultatelor, prin

reprezentarea grafic a variaiei valorilor concentraiei calculate pe
baza ecuaiei dreptei de regresie n funcie de concentraia introdus
de acid galic. Valorile calculate indic o dependen liniar (tabelul
28).
Tabelul 28. Liniaritatea rezultatelor
Parametri
Panta
Intercept
Coeficient de regresie (r2)

1050 M/L
50100 M/L
0,9999
1,00
0,003
0
0,9975
0,9964
13
Au fost calculate limita de detecie (LD=3,03 M/L) i

limita de cuantificare (LQ=9,18 M/L); estimarea acestor limite sa
fcut pe baza deviaiei standard i a pantei dreptei de regresie.
Pentru estimarea preciziei sau determinat:
- repetabilitatea determinrii (precizia sistemului) pentru un
numr de 10 determinri, valoarea deviaiei standard
relative (RSD) fiind de 1,5541%;
- repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluii
independente la trei nivele de concentraie diferite i
precizia intermediar pentru trei soluii independente la trei
nivele de concentraie diferite (tabelul 29).
Tabelul 29. Precizia metodei i precizia intermediar
Parametri
Domeniul analitic
1050 M/L acid galic
Precizia
Precizia
metodei
intermediar
Deviaia standard
4,1868%
relativ (RSD)
Interval de
94,46%
ncredere
101,14%
a valorii medii
Domeniul analitic
50100 M/L acid galic
Precizia
Precizia
metodei
intermediar
3,7385%
4,066%
4,3665%
97,34%
103,46%
96,49%
103,11%
96,15%
102,87%
Pentru estimarea exactitii sa determinat regsirea pentru

un numr de trei probe la trei nivele de concentraie diferite pe cele
dou intervale de concentraie studiate (tabelul 30).
Tabelul 30. Exactitatea metodei
Parametri
Regsire medie (%)
Intervalul de ncredere

1050 M/L
50100 M/L
98,1%
99,6%
91,8%104,2%
95,1%105,6%
Avnd n vedere rezultatele obinute, considerm c metoda

poate fi aplicat la determinarea activitii antioxidante din diferite
medii.
14
5.2.4. Evaluri analitice specifice metodelor de

determinare a activitii antioxidante
Pentru evaluarea activitii antioxidante n sistemul
clorpromazin K2S2O8 acid galic am aplicat dou variante ale
metodei:
Determinarea absorbanei radicalului i a probei la timp
fixat;
Determinarea ariei de sub curb pentru un anumit interval
de timp.
5.2.4.1. Determinarea absorbanelor la timp fixat
Prin msurarea absorbanelor radicalului i a probei la timp
fixat, se poate obine curba de calibrare n dou moduri:
a) prin reprezentarea grafic a absorbanei relative funcie de
concentraia antioxidantului standard;
b) prin reprezentarea grafic a procentului de inhibiie a
culorii funcie de concentraia antioxidantului standard.
Formula de calcul pentru absorbana relativ:
A
Arel = p ,
Ar
n care Ap absorbana probei;
Ar absorbana radicalului.
Procentul de inhibiie se calculeaz cu relaia:
A Ap
% Inh = r
100
Ar
Folosind valorile absorbanelor probelor i ale radicalului, sa
calculat procentul de inhibiie la 10 minute i respectiv, la 20 minute.
n fig. 18 i 19 sunt reprezentate grafic valorile absorbanei
relative i a procentului de inhibiie funcie de concentraia acidului
galic n intervalul de concentraie 1050 M/L acid galic. n mod
asemntor sau calculat i reprezentat grafic valorile absorbanei
relative i a procentului de inhibiie funcie de concentraia acidului
galic pentru intervalul de concentraie 50100 M/L acid galic.
Pentru intervalul de concentraie 1050 M/L acid galic,
ecuaiile dreptelor de regresie sunt:
Arel = 0,0084 Concentraia (M/L) + 1,0001; r2 = 0,9975
%Inh=0,8376 Concentraia (M/L) 0,0067; r2 = 0,9975
15
1.0
Absorbana relativ = -0,0084 Concentraia + 1,0001
r2 = 0,9975
Absorbana relativ
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0
10
20
30
40
50
60
Fig. 18. Modificarea absorbanei relative funcie de concentraie

n sistemul CP+ acid galic (interval de concentraie 1050 M/L)
45
Procent inhibiie = 0,8376 Concentraia - 0,0067
r2 = 0,9975
40
Inhibiie (%)
35
30
25
20
15
10
5
0
10
20
30
40
50
60
Fig. 19. Modificarea procentului de inhibiie funcie de concentraie

n sistemul CP+ acid galic (interval de concentraie 1050 M/L)
Curbele de calibrare obinute sunt folosite pentru

determinarea activitii antioxidante a probelor luate n lucru.
5.2.4.2. Determinarea ariei de sub curb (AUC)
Antioxidanii reduc radicalul preformat cu o intensitate i o
vitez dependent de activitatea antioxidantului, de concentraia sa i
de timpul de reacie.
Din acest motiv, intensitatea decolorrii soluiei de radical,
exprimat ca procent de inhibiie, este de obicei monitorizat att n
raport cu concentraia antioxidantului, ct i cu timpul de reacie;
procentul de inhibiie se coreleaz cu parametrii respectivi ai
standardului antioxidant, n aceleai condiii de lucru.
16
Activitatea antioxidant poate fi, de asemenea, exprimat n

termeni de contribuie total la activitatea antioxidant n
intervalul de timp studiat, prin calcularea ariei de sub curb,
rezultat din reprezentarea grafic a variaiei procentului de inhibiie,
ntrun anumit interval de timp la diferite concentraii de antioxidant
sau prin reprezentarea grafic a gradientului % Inh / concentraia
antioxidantului, funcie de timp.
Curba de calibrare se obine prin reprezentarea grafic a ariei
de sub curb funcie de concentraia antioxidantului standard.
n cazul determinrii activitii antioxidante n sistemul CP+
acid galic, sau calculat valorile ariei de sub curb pentru cele dou
intervale de concentraie studiate i sa reprezentat grafic variaia
valorilor ariei de sub curb funcie de concentraia n acid galic
n fig. 22 este reprezentat profilul ariei de sub curb la diferite
concentraii de acid galic.
60
Inhibiie (%)
50
40
30
20
10
60
50
40
10 min.
30
20 min.
20
10
ea
trai
ce n
Co n
70
80
90
100
/L)
( M
alic
cid g
Fig. 22. Aria de sub curb calculat pentru domeniul 10100 M/L acid galic
Graficul din fig. 23 red curba de calibrare obinut prin

reprezentarea grafic a variaiei ariei de sub curb funcie de
concentraia antioxidantului standard, respectiv acidul galic, pe cele
dou intervale de concentraie: 1050 M/L i 50100 M/L.
17
700
AUC = 3,6575 Concentraia + 240,75
r2 = 0,9938
600
AUC
500
400
300
200
AUC = 8,6798 Concentraia - 0,069
r2 = 0,9975
100
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Fig. 23. Aria de sub curb (AUC) funcie de concentraie
Ecuaiile dreptelor de regresie pentru cele dou domenii de

concentraie sunt:
AUC = 8,6798 Concentraia (M/L) 0,069;
r2 = 0,9975 (1050 M/L)
AUC = 3,6575 Concentraia (M/L) + 240,75;
r2 = 0,9938 (50100 M/L)
Cu ajutorul curbelor de calibrare, utiliznd cele dou ecuaii
ale funciei de regresie se poate determina activitatea antioxidant a
probelor, exprimat n echivaleni molari de acid galic (AGE).
Pentru aceasta, se determin absorbana probei i a radicalului
la dou momente de timp, stabilite n prealabil, aceleai ca i n cazul
standardului (timp fixat), se calculeaz procentele de inhibiie, se
reprezint grafic variaia procentului de inhibiie n intervalul de timp
fixat i se calculeaz aria de sub curb; cu ajutorul curbelor de
calibrare se determin contribuia total la activitatea antioxidant, n
intervalul de timp ales.
n concluzie, determinarea ariei de sub curb este un mod
alternativ de a descrie activitatea antioxidant, n care se iau n
consideraie vitezele diferite de reacie ale antioxidantului cu radicalii
liberi.
Aria de sub curb implic att concentraia antioxidantului,
ct i timpul de reacie, fiind o msur complet a abilitii
antioxidantului de a capta radicalii liberi, raportat la un antioxidant
standard, ntrun interval de timp fixat.
18
5.3. Determinarea spectrofotometric a activitii

antioxidante n sistemul clorpromazin maleat
persulfat de potasiu acid ascorbic
Acidul ascorbic (vitamina C) este un antioxidant solubil n
ap. Activitatea antioxidant a acidului ascorbic se datoreaz
capacitii acestuia de a ceda cu uurin doi electroni i doi protoni,
transformnduse n final n acid dehidroascorbic.
Acidul ascorbic este un antioxidant eficace i deci poate fi
considerat ca un captator standard de radicali liberi.
Din acest motiv, neam propus elaborarea unei metode
spectrofotometrice de determinare a activitii antioxidante, bazate pe
reacia de stingere a radicalului cation al clorpromazinei (CP+) de
ctre acidul ascorbic. Reacia care are loc este prezentat n fig. 24.
O
O
O
HO
O + 2CP +
O + 2CP
O
HO
CHOH
CH2OH
acid ascorbic
CHOH
CH2OH
acid dehidroascorbic
Fig. 24 Reducerea radicalului cation CP+ cu acid ascorbic
Rezultatele obinute prin aplicarea acestei metode se vor

exprima n echivaleni molari acid ascorbic (AAE) raportai la
unitatea de msur aleas pentru proba analizat.
Principiul metodei. Acidul ascorbic capteaz radicalii liberi
ai clorpromazinei i determin scderea absorbanei soluiei de
radical; decolorarea soluiei este proporional cu concentraia n acid
ascorbic.
Obinerea curbei de calibrare
Modul de lucru. La un volum de 2 mL soluie de radical
obinut n sistemul CP persulfat se adaug 1 mL soluie acid
ascorbic de diferite concentraii, iar dup 10 minute se analizeaz
prin spectrofotometrie n VIS la o lungime de und de 525 nm n
cuv de 1 cm fa de ap.
Domeniul analitic: 10100 moli/L acid ascorbic.
19
Funcia de rspuns este liniar pe domeniul de

concentraie analizat (10100 moli/L acid ascorbic) (fig. 27).
0.55
Absorbana = -0,0019 Concentraie + 0,5193
r2 = 0,9991
Absorbana
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Concentraie acid ascorbic (M/L)
Fig. 27. Curba de calibrare n sistemul CP+ acid ascorbic
Ecuaia dreptei de calibrare sa calculat prin metoda celor

mai mici ptrate.
Absorbana = 0,0019 Concentraia (
M/L) + 0,5193;
2
r = 0,9991
- precizia sistemului pentru 10 determinri, RSD = 0,7535%;
- precizia metodei pentru trei soluii la trei nivele de
concentraie, pentru care RSD = 4,5036% cu un interval de
ncredere a valorii medii 98,70%105,79%;
- precizia intermediar pentru trei soluii independente la trei
nivele de concentraie diferite; valoarea RSD = 4,6373% cu
un interval de ncredere a valorii medii de 98,42%
105,71%;
un numr de trei probe la trei nivele de concentraie diferite,
obinnduse o regsire medie de 101,7% pe intervalul 91,1 %
105,9%.
Limita de detecie LD = 3,13 moli/L, iar limita de
cuantificare LQ = 9,49 moli/L.
20
Estimarea acestor limite sa fcut pe baza deviaiei standard

i a pantei dreptei de regresie.
Metoda propus a fost aplicat pentru studiul unor
comprimate sau liofilizate.
5.3.4. Evaluri analitice specifice metodelor de
determinare a activitii antioxidante
5.3.4.1. Determinarea absorbanelor la timp fixat
Pentru aplicarea practic a metodei, valorile experimentale
obinute au fost folosite pentru calcularea absorbanei relative i a
procentului de inhibiie.
Sa reprezentat grafic variaia absorbanei relative i a
procentului de inhibiie funcie de concentraia acidului ascorbic, iar
dreptele de calibrare obinute au fost folosite la determinarea
activitii antioxidante a probelor analizate.
Calculul statistic al dreptelor de regresie este prezentat n
tabelul 47.
Tabelul 47. Calculul statistic al dreptelor de regresie
Parametri
Absorbana
Procentul de inhibiie
relativ
(Inh %)
Ecuaia dreptei de regresie Arel=0,0037C+0,9778 Inh %=0,3661C+2,2181
0,9991
0,9991
0,9778
2,2181
Intercept
0,0037
0,3661
Panta
5.3.4.2. Determinarea ariei de sub curb

Sa calculat procentul de inhibiie la 10 minute i 20 minute
de la introducerea acidului ascorbic i apoi sa calculat aria de sub
curb pentru intervalul de timp respectiv, la fiecare concentraie de
acid ascorbic din domeniul de concentraie ales.
Profilul variaiei ariei de sub curb funcie de concentraia n
antioxidant standard (acid ascorbic) este prezentat n fig. 31.
21
45
Inhibiie (%)
40
35
30
25
20
15
10
5
60
0
10 min.
30
20 min.
20
10
40
80
70
50
as
a cid
aie
ce ntr
Co n
100
90
ic (
corb
M/L )
Fig.31. Profilul ariei de sub curb la diferite concentraii de acid ascorbic
Cu ajutorul ecuaiei de regresie a curbei de etalonare

prezentat n fig. 32 se calculeaz activitatea antioxidant a probelor,
exprimat n echivaleni molari acid ascorbic (AAE).
450
AUC = 3,7783 x Concentraia + 22,883
r2 = 0,9991
400
350
AUC
300
250
200
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Concentraie acid ascorbic (M/L)
Fig. 32. Aria de sub curba (AUC) funcie de concentraia acidului ascorbic
Ecuaia de regresie:
AUC = 3,7783 Concentraia (
M/L) + 22,883; r2 =0,9991
5.4. Determinarea spectrofotometric a activitii antioxidante
n sistemul clorpromazin clorur de Fe(III) acid ascorbic
Radicalul cation cromofor CP+, obinut prin oxidarea
maleatului de clorpromazin cu clorur de Fe(III) n mediu acid a
fost aplicat la determinarea spectrofotometric a activitii
antioxidante, utiliznd ca antioxidant standard acidul ascorbic (227).
22
Principiul metodei: Acidul ascorbic reduce radicalii cation

cromofori ai clorpromazinei, determinnd o diminuare a absorbanei
soluiilor de radical, proporional cu concentraia acidului ascorbic.
Prepararea probelor n vederea obinerii curbei de calibrare
Pentru obinerea curbei de calibrare sau studiat dou
variante de realizare a acesteia:
Varianta 1. Acidul ascorbic (antioxidantul) se adaug n
radicalul preformat; n aceast variant, acidul ascorbic determin
decolorarea radicalului deja format.
Varianta 2. Acidul ascorbic (antioxidantul) se adaug nainte
de formarea radicalului; n acest caz, acidul ascorbic (antioxidantul)
inhib formarea radicalului, deci inhib dezvoltarea culorii acestuia.
Modul de lucru (varianta 1). Se prepar soluiile de radical
cation al clorpromazinei astfel: la un amestec format din 2 mL soluie
de clorpromazin maleat 0,01M i 1 mL soluie acid clorhidric 1M se
adaug 0,5 mL soluie FeCl3 0,005M. Dup 10 minute de la
adugarea FeCl3, n soluiile de radical se introduc cte 1 mL soluie
acid ascorbic cu concentraii cuprinse ntre 0,0500,750 M/mL. Se
completeaz cu ap distilat la volumul de 5 mL.
Dup 10 minute de la adugarea acidului ascorbic se msoar
absorbanele soluiilor, meninnduse constant timpul la care se
determin absorbanele pentru toate probele, respectiv 10 minute.
Pentru varianta 2, modul de lucru este acelai, cu deosebirea
c n soluiile acidulate de clorpromazin se introduc mai nti
soluiile de acid ascorbic i apoi soluia de clorur de Fe(III).
n ambele variante, domeniul analitic a fost de 0,0500,750
moli/mL acid ascorbic.
Pentru validarea metodei sau determinat urmtorii
parametri: liniaritatea funciei de rspuns, limita de detecie, limita de
cuantificare, precizia (precizia sistemului i precizia metodei) i
exactitatea.
Pe domeniul studiat funcia de rspuns este liniar n
ambele variante. Ecuaiile dreptelor de regresie obinute sau calculat
prin metoda celor mai mici ptrate.
pentru varianta 1
Absorbana = 0,7203730 Concentraia (M/L) + 0,8319425
23
Coeficientul de corelatie (r) = 0,9981, iar coeficientul de regresie r2 =

0,9962.
pentru varianta 2
Absorbana = 0,6401154 Concentraia (M/L) + 0,8454726
Coeficientul de corelatie (r) = 0,9952, iar coeficientul de regresie r2 =
0,9905.
A fost evaluat de asemenea liniaritatea rezultatelor, prin
reprezentarea grafic a variaiei valorilor concentraiei calculate pe
baza ecuaiei dreptei de regresie n funcie de concentraia introdus
de acid galic. Valorile calculate indic o dependen liniar pentru
ambele variante ale metodei.
Au fost calculate limita de detecie (LD = 0,063 M/mL
pentru varianta 1, LD = 0,09 M/mL pentru varianta 2) i limita de
cuantificare (LQ = 0,17 M/mL pentru varianta 1, LQ = 0,28
M/mL pentru varianta 2); estimarea acestor limite sa fcut pe baza
deviaiei standard i a pantei dreptei de regresie. Se constat c att
LD ct i LQ au valori mai mici n prima variant a metodei, deci
metoda este mai sensibil n cazul n care antioxidantul se introduce
n radicalul preformat.
- repetabilitatea determinrii (precizia sistemului) pentru un
numr de 10 determinri, valoarea deviaiei standard
relative (RSD) este de 1,2430%;
- repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluii
independente la trei nivele de concentraie diferite pentru
care valoarea deviaiei standard relative (RSD) este de:
3,3492% cu un interval de ncredere a valorii medii
cuprins n domeniul 100,30%105,61% pentru
varianta 1;
cuprins n domeniul 96,17%103,12% pentru varianta
2.
- precizia intermediar pentru trei soluii independente la trei
nivele de concentraie diferite pentru care valoarea deviaiei
standard relative (RSD) este de:
1;
24

2.
un numr de trei probe la trei nivele de concentraie diferite pentru
cele dou variante studiate.
Astfel, pentru varianta 1 sa obinut o regsire medie de
102,2% pe intervalul 97,7 %109,6 %, iar pentru varianta 2 sa
obinut o regsire medie de 100,6% pe intervalul 94,4%108,1%.
Metoda de determinare a activitii antioxidante prin
spectrofotometrie n vizibil n sistemul clorpromazin FeCl3 acid
ascorbic, a fost aplicat pentru studiul unor produse vegetale.
5.4.4. Evaluri analitice

Cu datele experimentale obinute sa calculat absorbana
relativ i procentul de inhibiie pentru domeniul de concentraie
cuprins ntre 0,050,75 M/mL acid ascorbic pentru ambele variante
ale metodei.
Ecuaiile dreptelor de calibrare obinute prin reprezentarea
grafic a parametrilor respectivi funcie de concentraia n acid
ascorbic sunt urmtoarele:
Varianta 1
Arel = 0,8658 Concentraia (M/mL) + 0,9999; r2 = 0,9962
% Inh = 86,583 Concentraia (M/mL) + 0,0069; r2 = 0,9962
Varianta 2
Arel = 0,7566 Concentraia (M/mL) + 0,9994; r2 = 0,9905
% Inh = 75,664 Concentraia (M/mL) + 0,0623; r2 = 0,9905
5.5. Aplicaii analitice

Metodele spectrofotometrice de evaluare a activitii
antioxidante propuse au fost aplicate pe diferite produse.
Deoarece la elaborarea metodelor sau folosit ca antioxidani
standard acidul galic i acidul ascorbic, activitatea antioxidant a
produselor analizate a fost exprimat n echivaleni molari acid galic
(AGE) i (sau) n echivaleni molari acid ascorbic (AAE) raportai la
unitile de msur adecvate pentru fiecare tip de produs.
25
Metodele au fost aplicate pe produse variate: plante,

suplimente nutritive i preparate farmaceutice.
5.5.1. Determinarea activitii antioxidante a liofilizatului
de Crataegus macracantha Lodd (frunze i flori)
Crataegus macracantha, familia Rosaceae, este o specie rar
ntlnit n Europa; este frecvent rspndit n America de Nord
(sudul Canadei i SUA).
Aciunea farmacologic a speciei Crataegus monogyna
(frunze i flori) a fost studiat destul de intens i este demonstrat
aciunea antiaritmic i antioxidant a extractelor din planta
respectiv.
Specia Crataegus macracantha este studiat mai puin i
constituie o direcie de cercetare cu rezultate promitoare.
n cadrul Disciplinei de Farmacognozie, Facultatea de
Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai,
sau studiat extractele din frunze i flori obinute de la un exemplar
unic care crete n Grdina Botanic Iai.
Pentru verificarea metodelor de evaluare a activitii
antioxidante propuse am aplicat aceste metode la studierea aciunii
antioxidante a liofilizatelor din frunze i flori preparate la disciplina
de Farmacognozie.
Pregtirea probelor de analizat. se cntresc n jur de 0,05 g
liofilizat (frunze sau flori) i se dizolv n 10 mL ap distilat. Dup
30 minute se filtreaz amestecul i se aduce la volum final de 25 mL.
Modul de lucru. La 2 mL soluie radical (preparat n sistemul
clorpromazinpersulfat) se adaug un anumit volum de soluie de
liofilizat diluat la 1 mL cu ap distilat. Se msoar absorbana
soluiei dup 10 i 20 minute de la declanarea reaciei, la =525 nm,
cuve 1 cm, martor ap.
Activitatea antioxidant calculat din curbele de calibrare a
fost exprimat att n echivaleni micromolari acid galic (fig. 41 i
fig. 42), ct i n echivaleni micromolari acid ascorbic (fig. 43 i fig.
44), raportat la 1 gram material vegetal ( frunze, respectiv flori).
26
35
AGE (M/1 g frunze)
30
25
20
10 min.
15
20 min.
10
5
0
1
Medie
Proba
Fig. 41. Echivaleni micromolari de acid galic (AGE) / 1 g frunze

Crataegus macracantha (la 10 i 20 minute de la efectuarea reaciei)
40
AGE (M/1 g flori)
35
30
25
10 min.
20
20 min.
15
10
5
0
1
Medie
Proba
Fig. 42. Echivaleni micromolari de acid galic (AGE) / 1 g flori

60
AAE (M/1 g frunze)
50
40
10 min.
30
20 min.
20
10
0
1
Medie
Proba
Fig. 43. Echivaleni micromolari de acid ascorbic (AAE) / 1 g frunze

27
70
AAE (M/1 g flori
60
50
10 min.
40
20 min.
30
20
10
0
1
Medie
Proba
Fig. 44. Echivaleni micromolari de acid ascorbic (AAE) / 1 g flori

n toate cazurile, valoarea RSD se ncadreaz n valorile RSD

ale metodei.
Valorile obinute la evaluarea activitii antioxidante din
curbele de calibrare AUCf(concentraia antioxidantului) se situeaz
ntre cele dou valori limit (de la 10 i respectiv 20 minute), eroarea
determinrilor fiind de asemenea sub valoarea RSD a metodei.
Comparnd valorile obinute la evaluarea activitii
antioxidante exprimate n moli acid galic i respectiv moli acid
ascorbic, se constat c activitatea antioxidant a liofilizatului obinut
din flori de Crataegus macracantha este mai mare dect a celui
obinut din frunze.
De asemenea, activitatea antioxidant exprimat n
echivaleni micromolari acid galic (AGE), n cazul ambelor extracte,
este mai mic dect cea exprimat n echivaleni micromolari acid
ascorbic (AAE). Acest lucru este explicabil, avnd n vedere c
activitatea antioxidant exprimat n acid galic reflect coninutul
total n polifenoli, pe cnd cea exprimat n acid ascorbic reflect
puterea reductoare a tuturor componentelor din produsul analizat.
n funcie de scopul propus pentru analiz se poate opta
pentru una dintre variantele propuse sau pentru ambele.
IMUNOGRIP +zinc i vitamina C
Produsul Imunogrip + zinc i vitamina C (OZONE
Laboratories Pharma) este un preparat obinut pe baz de ingrediente
28
naturale, destinat creterii imunitii generale a organismului precum

i tratrii rcelii i gripei.
Coninutul produsului justific aciunea sa antioxidant i, din
acest motiv, neam propus s evalum activitatea antioxidant total
a produsului prin aplicarea metodelor realizate de noi.
Pregtirea probelor. Se cntrete o cantitate precis de
soluie care se dilueaz la V=50 mL cu ap. Se stabilete n prealabil
cantitatea de soluie care se ia n lucru precum i diluia care trebuie
fcut astfel nct valorile absorbanelor s se ncadreze n limitele
curbei de calibrare.
Modul de lucru. n 2 mL soluie radical preparat n sistemul
clorpromazinpersulfat se introduc volume diferit din soluia diluat
de Imunogrip + zinc i vitamina C. Se completeaz cu ap la 3 mL i
se determin absorbana la 10 minute i respectiv la 20 minute de la
adugarea probei, la lungime de und = 525 nm n cuv de 1 cm
fa de ap.
Rezultatele experimentale obinute la evaluarea activitii
antioxidante a produsului Imunogrip + zinc i vitamina C sau
exprimat n echivaleni micromolari de acid galic/100 g preparat i
respectiv, echivaleni micromolari de acid ascorbic/100 g preparat
(fig.45 i fig.46)
AGE (M/100 g Imunogrip
1000
800
600
10 min.
20 min.
400
200
0
1
Medie
Proba
Fig. 45. Echivaleni micromolari de acid galic (AGE) / 100 g Imunogrip

(la 10 i 20 minute de la efectuarea reaciei)
29
AAE (M/100 g Imunogrip
1400
1200
1000
800
10 min.
600
20 min.
400
200
0
1
Medie
Proba
Fig. 46. Echivaleni micromolari de acid ascorbic (AAE) / 100 g Imunogrip

Sau efectuat determinrile la cele dou momente pentru a se

evalua activitatea antioxidant i cu ajutorul curbei de calibrare AUC
concentraie antioxidant.
Valorile obinute la evaluarea activitii antioxidante a
produsului Imunogrip+zinc i vitamina C conduc la urmtoarele
concluzii:
Activitatea antioxidant se modific n timp, valorile
obinute la 20 minute fiind mai mari, n ambele metode aplicate;
acest fapt este explicabil avnd n vedere compoziia complex a
produsului.
Antioxidanii prezeni n preparat, n principal polifenoli i
acid ascorbic (vitamina C) au capacitate reductoare diferit i viteze
de reacie diferit. Rezultatele obinute reprezint o evaluare a
activitii antioxidante totale, la timp fixat.Este de preferat, n acest
caz, ca determinrile s se efectueze dup 20 minute de la
declanarea reaciei.
Coninutul total n polifenoli exprimat n echivaleni
micromolari de acid galic determinat la 20 minute este apropiat de
valoarea declarat de productor. Activitatea antioxidant exprimat
n echivaleni micromolari acid ascorbic are valoare mai ridicat,
acidul ascorbic acionnd ca standard pentru activitatea antioxidant
total.
30

Antioxidant comprimate (Farmacom)
Antioxidant comprimate este un supliment alimentar
obinut prin comprimare din Lcarnozin (500 mg/comprimat) n
amestec cu excipieni adecvai.
Lcarnozina este o dipeptid format din doi aminoacizi
(alanina i histidina). Acetia sunt responsabili de aciunea
antioxidant care asigur buna funcionare a organismului, prevenind
semnele mbtrnirii premature.
Pregtirea probelor. Se determin greutatea medie a
comprimatelor. Se cntrete cu exactitate n jur de 1 g de pulbere i
se dizolv n aproximativ 20 mL ap distilat. Se agit i apoi se
filtreaz. Se spal filtrul cu ap distilat. Volumul final dup fiecare
filtrare este adus la 25 mL.
Modul de lucru. La 2 mL soluie de radical (preparat n
prealabil n sistemul CP K2S2O8 dup modul de lucru propus) se
adaug volume diferite de soluie de lucru i se completeaz cu ap la
volum final de 3 mL. Se determin absorbana la = 525 nm, n cuve
de 1 cm fa de ap.
Rezultatele experimentale obinute sau exprimat n
echivaleni micromolari de acid galic (AGE)/comprimat (fig. 47),
respectiv echivaleni micromolari de acid ascorbic (AAE)/
comprimat (fig. 48), determinrile efectunduse la dou intervale de
timp 10 i 20 minute de la declanarea reaciei.
Valorile absorbanelor la 10 minute i 20 minute sau utilizat
la calcularea procentului de inhibiie la cele dou momente i apoi la
evaluarea activitii antioxidante prin intermediul curbei de calibrare
AUC concentraia antioxidantului.
31
2.0
AGE (M/cp Antioxidant
1.8
1.6
1.4
1.2
10 min.
1.0
20 min.
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
1
Medie
Proba
Fig. 47. Echivaleni micromolari de acid galic (AGE) / cp Antioxidant

1.8
AAE (M/cp Antioxidant
1.6
1.4
1.2
1.0
10 min.
0.8
20 min.
0.6
0.4
0.2
0.0
1
Medie
Proba
Fig. 48. Echivaleni micromolari de acid ascorbic (AAE) / cp Antioxidant

Din rezultatele experimentale obinute se constat c:

La determinrile efectuate la 20 minute de la declanarea
reaciei cu radicalul se obin valori apropiate pentru activitatea
antioxidant, fie c aceasta se exprim n echivaleni micromolari
acid galic (AGE), fie n echivaleni micromolari acid ascorbic
(AAE).
Avnd n vedere c aciunea antioxidant se datoreaz
singurului component activ din punct de vedere redox Lcarnozina,
rezultatele obinute reflect compoziia comprimatelor, fiind n
concordan cu aceasta.
Se recomand efectuarea determinrilor la 20 minute de la
iniierea reaciei.
32

Ceai verde
Pentru verificarea aplicabilitii metodelor de evaluare a
activitii antioxidante propuse, sa analizat ceaiul verde (VEDDA),
neambalat n plicuri.
Evaluarea activitii antioxidante a ceaiului verde sa fcut
prin dou metode, urmrinduse aciunea sa asupra radicalului cation
al clorpromazinei obinut pe de o parte n sistemul CP K2S2O8 i pe
de alt parte, n sistemul CP FeCl3.
Ca antioxidani standard sau folosit acidul galic (pentru
sistemul CP K2S2O8 ) i acidul ascorbic (pentru sistemul CP
FeCl3).
Pregtirea probei. O cantitate de ~1,21,4 g ceai verde a fost
tratat cu 25 mL ap distilat la t=1000C. Se infuzeaz apte minute
(conform indicaiilor productorului). Se agit i apoi se filtreaz.
Volumul final dup fiecare filtrare i splare a filtrului cu ap este
adus la 50 mL. Soluia astfel obinut (soluia stoc) sa diluat
corespunztor pentru a obine valori ale absorbanei care s se
ncadreze n domeniul analitic al curbei de calibrare.
Modul de lucru.
n sistemul clorpromazinpersulfatacid galic. Pentru
obinerea soluiei de lucru, soluia iniial se dilueaz n raportul
1:50. La un volum de 2 mL soluie de radical (preparat n prealabil
n sistemul CP K2S2O8) se adaug volume diferite de soluie de
lucru (0,251 mL) i se completeaz cu ap la volum final de 3 mL.
Se determin absorbana la = 525 nm n cuva de 1 cm fa de ap.
La =525 nm, soluia diluat de ceai nu prezint absorban
proprie.
Determinrile sau efectuat de asemenea la 10 i 20 de
minute de la declanarea reaciei pentru a se calcula procentul de
inhibiie la cele dou momente i apoi valorile pentru aria de sub
curb (fig.49).
Rezultatele se exprim n echivaleni micromolari acid galic
(AGE)/ gram de produs vegetal.
33
AGE (M/g Ceai verde
300
250
200
10 min.
150
20 min.
100
50
0
1
Medie
Proba
Fig. 49. Echivaleni micromolari de acid galic (AGE) / g ceai verde

n sistemul clorpromazin FeCl3 acid ascorbic. Soluia

de lucru se obine prin diluarea soluiei iniiale n raportul 1:10. La
un volum de 3,5 mL soluie de radical (preparat n prealabil n
sistemul CP FeCl3 dup modul de lucru propus se adaug volume
diferite de soluie de lucru (01,5 mL) i se completeaz cu ap la
volum final de 5 mL. Se determin absorbana la =525 nm n cuve
de 1 cm fa de ap.
Rezultatele se exprim n echivaleni micromolari acid
ascorbic (AAE)/ gram produs vegetal.
Rezultatele obinute sunt concordante i ilustreaz o activitate
antioxidant ridicat, valorile obinute fiind apropiate ca ordin de
mrime cu cele raportate de diferii cercettori.
5.5.5. Analiza produilor n sistemul Fe3+/K3[Fe(CN)6].

Compararea rezultatelor
Pentru verificarea exactitii metodelor propuse, sau analizat
produsele luate n studiu printro metod consacrat (173), folosind
ca reactiv soluia de fericianur feric.
Principiul metodei. Acidul ascorbic reduce ionul [Fe(CN)6]3
la [Fe(CN)6]4, din reacie rezultnd ferocianura feric, de culoare
albastr ce prezint absorbana maxim la =760 nm. Absorbana
soluiei crete proporional cu concentraia acidului ascorbic.
Trasarea curbei de etalonare
Modul de lucru. Peste 1 mL soluie standard de acid ascorbic
(domeniul de concentraie 0,050,40 moli/mL) se adaug 2 mL
soluie reactiv i 1 mL acid clorhidric. Se completeaz la volumul
34
final de 5 mL. Dup 15 minute se msoar absorbana la

spectrofotometrul UVVIS tip Hewlett Packard 8453, =760 nm,
cuva de 1 cm, fa de un martor preparat n condiii similare.
Activitatea antioxidant a probelor analizate sa exprimat n
echivaleni micromolari acid ascorbic.
Probele au fost prelucrate conform metodologiei aplicate la
evaluarea activitii antioxidante prin metodele propuse.
Valorile obinute la evaluarea activitii antioxidante a
produilor analizai prin cele dou metode sunt prezentate n tabelul
106.
Tabelul 106. Activitatea antioxidant a produilor analizai,
exprimat n echivaleni micromolari acid ascorbic (AAE),
determinat n sistemul CPK2S2O8 i n sistemul Fe3+/K3[Fe(CN)6]
AAE (echivaleni micromolari acid ascorbic)
Produs analizat
Sistemul
Sistemul
CPK2S2O8
Fe3+/K3[Fe(CN)6]
48,96 (M/g)
48,02(M/g)
Liofilizat Crataegus
macracantha (frunze)
61,23 (M/g)
59,86 (M/g)
Liofilizat Crataegus
macracantha (flori)
954,50 (M/100g)
956,28 (M/100g)
IMUNOGRIP +zinc
i vitamina C
1,45 (M/cp)
1,437 (M/cp)
ANTIOXIDANT
comprimate
468,78 (M/g)*
453,41 (M/g)
CEAI VERDE
* Valoare obinut n sistemul CPFeCl3.
Se constat o bun concordan ntre valorile obinute prin

cele dou metode.
Este de remarcat faptul c sensibilitatea metodei de evaluare a
activitii antioxidante n sistemul clorpromazin persulfat este mai
mare; domeniul analitic pentru metoda respectiv este de 0,010,10
M/mL, iar pentru metoda cu fericianur feric domeniul analitic
este de 0,050,40 M/mL.
35
Capitolul 6. Studiul proprietilor oxidoreductoare ale

aminofenazonei. Aplicaii la evaluarea activitii
antioxidante
Deoarece aminofenazona prezint proprieti interesante din
punct de vedere redox, putnd aciona att ca antioxidant prin
molecula neutr ct i ca prooxidant prin radicalul su cation, ne
am propus s studiem posibilitile de oxidare a aminofenazonei in
vitro i aplicarea acestor reacii la evaluarea activitii antioxidante.
Obiective
Studierea mecanismelor de oxidare a aminofenazonei de
ctre diveri oxidani in vitro; Studiul interaciunii aminofenazonei
cu peroxidul de hidrogen, n prezena Mo(VI) cu posibile aplicaii la
identificarea i evaluarea cantitativ a peroxidului de hidrogen din
fluide biologice; Aplicarea proprietilor prooxidante ale
produilor de oxidare ai aminofenazonei la evaluarea cantitativ a
unor antioxidani (compui polifenolici).
6.2. Mecanisme de oxidare a aminofenazonei de ctre
speciile reactive ale oxigenului
Aminofenazona, respectiv 4(dimetilamino)1,5dimetil2
fenilpirazol3ona sau 4dimetilamino antipirina (APH) conine la
carbonul 4 o grupare aminic dimetilat.
Prezena perechii de electroni de pe azotul aminic confer
moleculei caracter reductor, aceasta fiind una dintre proprietile
sale cele mai importante.
H3C
H3 C N
N(CH3)2
N
C6H5
Aminofenazona poate fi oxidat cu uurin att de oxidanii

minerali (persulfai i metavanadai alcalini sau de amoniu, iod, nitrat
de argint), ct i de speciile reactive ale oxigenului (ROS) existente
n diferite sisteme biologice; oxidarea aminofenazonei decurge n
mai multe etape intermediare, cu formarea unor produi diferit
colorai (230233).
36
Se consider c oxidarea aminofenazonei de ctre oxidanii

minerali amintii are loc printrun mecanism identic, care implic
formarea ntro prim etap a unui dication (colorat n albastru
violet, cu max=600 nm), care reacioneaz apoi cu o nou molecul
de aminofenazon i formeaz un radical cation colorat n rou, cu
max=540 nm. n final, prin dimerizarea radicalilor, rezult un
compus colorat n galben (max=355 nm). Reaciile respective se
produc n timp.
6.3. Determinarea catalimetric a peroxidului de hidrogen
n sistemul aminofenazon H2O2 Mo(VI)
Peroxidul de hidrogen (H2O2) este considerat o specie
reactiv a oxigenului, rezultat n organismele vii din reducerea
univalent a dioxigenului.
Deoarece peroxidul de hidrogen are implicaii foarte mari n
declanarea stresului oxidativ n organism, evidenierea sa calitativ
i evaluarea cantitativ din diferite fluide biologice constituie o
preocupare de actualitate.
Avnd n vedere aceste constatri, neam propus s realizm
o metod de identificare i de determinare cantitativ a H2O2, pe baza
reaciei dintre H2O2 i aminofenazon, reacie catalizat de Mo(VI)
(240).
Principiul metodei. Peroxidul de hidrogen oxideaz
aminofenazona la produsul de oxidare albastru violet (dication) ce
prezint absorbana maxim la =575nm. Reacia este catalizat de
Mo(VI).
Pentru obinerea curbei de calibrare sau studiat parametrii
care influeneaz reacia de oxidare: concentraia catalizatorului i
pHul.
6.3.2.1. Influena concentraiei catalizatorului asupra
vitezei de reacie
Pentru stabilirea cantitii optime de catalizator, sa studiat
influena concentraiei Mo(VI) asupra vitezei de reacie.
n acest scop, soluii de aminofenazon, de o anumit
concentraie, sau tratat cu H2O2 i cu soluii de molibdat de amoniu
cu concentraii n Mo(VI) cuprinse ntre 0,060,10 g/mL. Se
aciduleaz soluia cu acid acetic i se msoar absorbana ntrun
37
anumit interval de timp pentru fiecare concentraie de catalizator, la

=575 nm, cuva de 1 cm, fa de ap ca martor.
Probele au fost termostatate la temperatura de 200C.
Se reprezint grafic variaia absorbanei n funcie de timp
(fig.53).
Reprezentarea grafic este utilizat la estimarea vitezei de
reacie, respectiv a gradientului A/t.
0.16
0.14
Absorbana
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
1
Timp (min.)
0,06 g
0,20 g
0,40 g
0,60 g
0,80 g
1,00 g
Fig. 53. Variaia vitezei de reacie funcie de concentraia de Mo(VI)
Se constat c valoarea cea mai mare a vitezei de reacie (a

gradientului A/t) se obine la o concentraie Mo(VI) de 1 g/mL.
Determinrile ulterioare sau efectuat folosind soluii de
Mo(VI) de aceast concentraie.
6.3.2.2. Determinarea pHului optim
Sa determinat variaia absorbanei sistemului de reacie la
diferite valori ale pHului. Sau folosit soluii tampon acid acetic
acetat de sodiu, cu valori ale pHului cuprinse ntre 3,6 i
5,6.Absorbana sa msurat la timpul fixat de 2 minute.
pHul optim pentru efectuarea analizei este de 5,6; la acest
pH, stabilitatea culorii este mare, iar valoarea respectiv este
apropiat de pHul fiziologic.
6.3.2.3. Trasarea curbei de calibrare
Modul de lucru. 2 mL soluie aminofenazon 0,1M se
trateaz cu 1 mL soluie molibdat de amoniu (1 g/mL Mo(VI)) i cu
anumite volume de soluie H2O2 de concentraie cunoscut (0,5
2,5moli n prob). Se aduce la volum de 5 mL cu soluie tampon
38
acid aceticacetat de sodiu cu pH=5,6. Se determin absorbana

probelor dup 5 minute, cuva de 1 cm la =575 nm, martor ap
distilat.
Curba de calibrare este prezentat n fig. 54.
0.11
Absorbana
0.10
Absorbana = 0,024 x Concentraia + 0,0419

r2 = 0,9917
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
Concentraia H2O2 n prob (moli)
Fig. 54. Curba de calibrare
Funcia de rspuns este liniar pe domeniul de concentraie

studiat. Ecuaia dreptei de regresie sa calculat prin metode celor mai
mici ptrate.
Ecuaia dreptei de calibrare:
Absorbana = 0,024Concentraia (M) + 0,0419; r2 = 0,9917
Limita de detecie i limita de cuantificare au fost calculate
folosind valoarea deviaiei standard (SE) i a pantei dreptei de
regresie. LD = 0,285 moli H2O2 n prob, iar LQ = 0,863 moli
H2O2 n prob.
Precizia metodei sa stabilit prin msurarea absorbanei unui
set de trei soluii de H2O2, la trei nivele de concentraie diferite din
domeniul specific de concentraie; se calculeaz concentraiile pentru
fiecare prob n parte. Se determin concentraia calculat ca procent
din concentraia teoretic. RSD = 3,97% cu un interval de ncredere a
valorii medii pentru 8 grade de libertate i precizie de 95% (t = 2,31):
94,68% < < 101,02%.
Se constat c pe un interval de 25 % fa de valoarea de
interes, metoda este precis, deviaia standard relativ (RSD) fiind
sub limita impus de 5%.
39
n concluzie, metoda propus poate fi aplicat la detectarea

calitativ a prezenei peroxidului de hidrogen n diferite medii.
Utilizarea unui catalizator mineral n locul catalizatorilor enzimatici
constituie un avantaj al metodei.
Liniaritatea curbei de regresie justific i eventuala aplicare a
metodei la determinarea cantitativ a H2O2 din medii biologice,
acesta fiind unul dintre obiectivele de perspectiv.
6.4. Determinarea spectrofotometric a polifenolilor n
sistemul aminofenazon persulfat (+)catehin
Aminofenazona poate fi oxidat ntro prim etap de ctre
diferii oxidani, cu formarea unui dication la atomul de azot aminic.
n etapa urmtoare, dac se lucreaz cu exces de
aminofenazon, acest dication este redus rezultnd un radical cation
colorat n rou.
Avnd n vedere acest mecanism, neam propus s realizm o
metod de determinare cantitativ spectrofotometric a polifenolilor,
pe baza aciunii reductoare a acestora asupra dicationului amino
fenazonei (242).
Principiul metodei. Catehina (trans3,3,4,5,7 penta
hidroxiflavan) formeaz cu aminofenazona, n prezena persulfatului
de amoniu, n mediu slab alcalin (pH=89) un compus colorat n
rouportocaliu al crui absorban este proporional cu concentraia
n catehin (=540 nm).
6.4.2.1. Obinerea curbei de calibrare
Modul de lucru. Soluiile de catehin, cu un coninut cuprins
ntre 50250 g catehin/mL sunt tratate cu 0,5 mL soluie
aminofenazon 0,01M i 0,5 mL persulfat de amoniu 0,01M. Dup
10 minute se adaug 0,5 mL NaHCO3 5%. Se determin absorbana
soluiei dup 5 minute de la adugarea NaHCO3, la =540 nm, cuva
de 1 cm, fa de ap ca martor. Curba de calibrare este reprezentat
grafic n fig. 56.
n urma prelucrrii statistice a datelor experimentale se
constat c metoda este liniar n domeniul de concentraie ales (50
250 g catehin/mL).
40
0.8
Absorbana = 0,003 x Concentraia - 0,0513
r2 = 0,9988
0.7
Absorbana
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
50
100
150
200
250
300
Concentraia n catehin (g/mL)
Fig. 56. Curba de calibrare
Ecuaia dreptei de calibrare este:

Absorbana = 0,003 x Concentraia (g/mL) 0,0513
n tabelul 115 sunt prezentai parametrii statistici ai metodei.
Tabelul 115. Parametrii statistici ai metodei
Calculul statistic al regresiei
Eroare standard a dreptei de regresie (SE)
Intercept
Pant
0,9988
0,0093434
0,0513
0,0030
Sau calculat limita de detecie (LD) i limita de cuantificare

(LQ). Precizia metodei este satisfctoare, deviaia standard relativ
pe un interval de 33,33% fa de valoarea de interes fiind sub limita
impus de 5%.
Din observaiile experimentale considerm c intervenia (+)
catehinei are loc n cea de a doua etap a oxidrii aminofenazonei
(242).
Dac se lucreaz cu volume egale de persulfat de amoniu i
aminofenazon de aceiai molaritate, se formeaz ntro prim etap
dicationul aminofenazonei, reacia avnd loc cu schimb de doi
electroni. n etapa urmtoare intervine (+)catehina, care cedeaz un
electron, iar din reacie rezult radicalul cation al aminofenazonei,
cruia i se msoar absorbana.
Raportul molar optim aminofenazon/persulfat de amoniu
este de 1:1.
41
Metoda este rapid, uor accesibil i necostisitoare i poate

fi aplicat fie la determinarea catehinei din diferite medii, fie la
aprecierea coninutului total n polifenoli, exprimat n catehin.
Concluzii generale. Contribuii originale

Teza de doctorat este structurat n dou pri: o parte
teoretic, n care se face o evaluare a stadiului actual al cunoaterii n
domeniul antioxidanilor, pe baza datelor din literatur i o parte
experimental n care sunt prezentate rezultatele cercetrilor
originale ntreprinse n cadrul temei tezei de doctorat.
Partea teoretic cuprinde trei capitole care sintetizeaz
datele din literatura de specialitate referitoare la speciile reactive ale
oxigenului i azotului, implicarea acestora n procesele oxidative din
diferite medii i modul de intervenie a substanelor antioxidante n
pstrarea echilibrului redox.
De asemenea este prezentat metodologia actual de evaluare
a activitii antioxidante a substanelor bioactive. Metodele de
evaluare a activitii antioxidante sunt foarte variate, adaptate la tipul
de antioxidani studiai i la produsele analizate: plante, alimente,
preparate farmaceutice, produse cosmetice, suplimente nutritive,
lichide biologice etc. Rezultatele raportate sunt de multe ori
contradictorii datorit faptului c nu toate metodele aplicate sunt
standardizate, iar coninutul n antioxidani a produselor studiate
poate s fie influenat de foarte muli factori.
n partea experimental a lucrrii se propune aplicarea
proprietilor a doi radicali cu relevan biologic radicalul cation
al clorpromazinei (CP+) i radicalul cation al aminofenazonei
(APH+) pentru realizarea unor metode spectrofotometrice de
detecie i evaluare a aciunii antioxidante. Se cunoate faptul c cei
doi radicali intervin n procesele oxidative din organismele vii
acionnd ca substrat al peroxidazei.
Sau studiat posibilitile de generare in vitro a radicalilor
i sau optimizat parametrii variabili care influeneaz stabilitatea
acestora.
Astfel, sa generat radicalul cation al clorpromazinei prin
oxidarea clorpromazinei cu persulfat de potasiu i clorur feric.
Cei doi oxidani, cu poteniale de reducere diferite
interacioneaz cu clorpromazina dup mecanisme de reacie similare
42
dar se difereniaz dup viteza de reacie i dup modalitatea de

finalizare a reaciei.
Sau stabilit condiiile optime n care radicalul cation
cromofor CP+ poate fi aplicat la determinarea spectrofotometric a
activitii antioxidante: lungime de und, pH, raport molar
clorpromazin/oxidant.
Raportul molar clorpromazin/oxidant este un parametru
foarte important deoarece, n perspectiva utilizrii radicalului la
determinarea activitii antioxidante, este necesar ca n soluia final
a radicalului s nu rmn oxidant nereacionat care s interfere
reacia principal. n ambele variante sa lucrat cu exces de
clorpromazin.
Sau realizat trei metode spectrofotometrice n VIS de
evaluare a activitii antioxidante n sistemele: clorpromazin
persulfatstandard acid galic, clorpromazin persulfat standard
acid ascorbic i clorpromazin FeCl3 standard acid ascorbic.
Ca antioxidani standard sau folosit acidul galic (cu
ajutorul cruia se poate monitoriza coninutul fenolic total) i acidul
ascorbic, prin intermediul cruia se poate evalua activitatea
antioxidant total. Reaciile au loc n mediu acid.
Determinarea activitii antioxidante n mediu acid conduce
la o evaluare real a capacitii antioxidante a polifenolilor n starea
lor natural, nedeprotonat. La pH mai ridicat, se produce ionizarea
hidrogenului din gruprile OH fenolice i activitatea antioxidant
crete, astfel c rezultatele obinute vor indica o activitate
antioxidant mai mare dect cea real.
Metodele au fost validate, stabilinduse principalii parametri:
liniaritate, limita de detecie i limita de cuantificare, repetabilitatea
deteciei (precizia sistemului i precizia metodei) i exactitatea.
Rezultatele obinute se ncadreaz n limitele prevzute de normele
europene i internaionale.
Metodele au o liniaritate bun, pe domeniul de concentraii
ales, sunt precise i exacte.
Datele experimentale obinute au fost utilizate pentru
realizarea unor evaluri analitice specifice pentru determinarea
activitii antioxidante.
Sau obinut i analizat statistic curbele de calibrare ale
variaiei absorbanei relative (Arel = Ap/Ar) funcie de concentraia
43
antioxidantului, evaluare care implic o eventual modificare a

absorbanei radicalului n timp;
Sa calculat procentul de inhibiie [% Inh = (ArAp) /
Ar100] i sa trasat curba de calibrare n funcie de acest parametru
specific pentru reacia de stingere (neutralizare) a radicalilor de ctre
antioxidani;
Sa aplicat n calcul un parametru specific de evaluare a
activitii antioxidante, respectiv aria de sub curb (AUC), parametru
care reunete influena celor doi factori variabili care pot modifica
exactitatea determinrilor: timpul fixat pentru efectuarea msurtorii
i concentraia antioxidantului. Curba de calibrare rezultat din
reprezentarea grafic a AUC funcie de concentraia antioxidantului a
fost prelucrat de asemenea statistic;
Pentru evaluarea activitii antioxidante se pot utiliza toate
variantele propuse, dar rezultatele cele mai bune se obin prin
calcularea AUC.
Metodele au fost aplicate la determinarea activitii
antioxidante a produselor urmtoare: liofilizat din Crataegus
macracantha Lodd (frunze i flori), preparatul Imunogrip + Zinc i
vitamina C, Antioxidant comprimate, ceai verde.
Activitatea antioxidant a acestor produse sa exprimat att
n echivaleni micromolari acid galic (AGE), ct i n echivaleni
micromolari acid ascorbic (AAE).
Valorile respective au fost comparate cu valorile obinute prin
analizarea acelorai produse prin metoda cu fericianur feric. Sa
constatat o bun concordan ntre rezultate, ceea ce confirm
validitatea metodelor propuse.
Sa ntreprins, de asemenea, un studiu asupra proprietilor
oxidoreductoare ale aminofenazonei (APH) i a posibilitilor de
aplicare a acestora fie la determinarea direct a unor specii reactive
ale oxigenului (peroxidul de hidrogen), fie la determinarea activitii
antioxidante a unor compui polifenolici.
Astfel sa realizat o metod catalimetric de determinare a
peroxidului de hidrogen n sistemul aminofenazon Mo(VI)
H2O2; au fost stabilite condiiile optime de lucru, sa obinut curba
de calibrare i sau prelucrat statistic rezultatele.
44
Metoda este foarte sensibil i poate fi aplicat la

determinarea unor cantiti foarte mici de peroxid de hidrogen, n
special n fluide biologice (snge, urin, aer expirat).
Utilizarea unui catalizator mineral (Mo(VI)) n locul
catalizatorilor enzimatici constituie un avantaj al metodei.
A fost studiat, de asemenea, interaciunea produilor de
oxidare ai aminofenazonei cu polifenolii (catehina).
Sau stabilit condiiile de formare a radicalului cation
cromofor al aminofenazonei prin aciunea catehinei asupra
dicationului rezultat n prima etap a reaciei de oxidare a
aminofenazonei de ctre persulfat.
Cantitatea de radical cation format este proporional cu
concentraia n catehin.
Sa realizat o metod spectrofotometric de determinare a
activitii antioxidante n sistemul aminofenazonpersulfat
catehin.
Metoda este liniar n intervalul de concentraie 50250
g/mL i poate fi aplicat la determinarea coninutului total n
polifenoli din plante sau alte produse.
Metodele propuse sunt simple, precise i exacte; nu necesit
echipamente speciale, au un pre de cost foarte sczut, iar timpul
necesar analizelor este redus.
Se preteaz la automatizare pentru determinri n serie n
cazul controlului calitii i pentru determinri de stabilitate.
Teza de doctorat are 222 pagini i 245 referine
bibliografice, selectate din literatura de specialitate referitoare la
aciunea antioxidanilor i la modul de evaluare calitativ i
cantitativ a activitii antioxidante n diferite sisteme.
Datele experimentale sunt prezentate sintetic n 117 tabele i
58 figuri.
Perspective de cercetare
Se va continua investigarea posibilitilor de adaptare a
metodelor propuse la evaluarea activitii antioxidante n medii ct
mai variate: alimente, produse cosmetice, suplimente nutritive etc. i
diversificarea modalitilor de aplicare a acestora.
45
Se va urmri n continuare optimizarea metodei de evaluare

a activitii antioxidante pe baza determinrii ariei de sub curb
deoarece rezultatele obinute prin aplicarea acesteia sunt cele mai
apropiate de valorile reale i elimin fluctuaiile determinate de
fixarea timpului la care se efectueaz msurtorile.
Se va aplica metoda de determinare a peroxidului de
hidrogen pe probe biologice, avnd n vedere c metoda este foarte
sensibil.
Metodele propuse vor fi optimizate i se va urmri
generarea unor noi radicali cu relevan biologic, prin intermediul
crora s se poat realiza sisteme de detecie i evaluare a activitii
antioxidante, avnd n vedere marea actualitate a acestei direcii de
cercetare.
Bibliografie selectiv
(se pstreaz numerotarea din tez)
4.
6.
13.
17.
18.
19.
20.
21.
30.
33.
46
Palamaru MN, Iordan AR, Cecal A. Chimie bioanorganic general.

Iai: Ed Univ Al. I. Cuza, 1998, 125145.
Hartung J. Organic Radical Reactions Associated with Nitrogen
Monoxid. Chem Rev 2009; 109(9): 45004517.
Mo Y. A novel theory: biological process mostly involved two types of
mediators, namely general and specific mediators. Endogenous small
radicals such as superoxide and nitric oxide may play a role of general
mediators in biological process. J Org Chem 2005; 70(13): 51035110.
Davies KFA. Oxidative stress: the paradox of aerobic life. Biochem Soc
Symposium, London, Portland Press 1994; 61: 131.
Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. Free
radicals and antioxidants in normal physiological functions and human
disease. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39(1): 4484.
Hulic I, Boiteanu D, Neagu B. Rolul stresului oxidativ n reaciile
adaptative normale i patologice. Rev Med Chir Soc Med Nat Iai 2001;
105(1): 1118.
Bauer V, Bauer F. Reactive oxygen species as mediators of tissue
protection and injury. Gen Physiol Biophys 1999; 18: 714.
Bahorun T, Soobrattee MA, LuximonRamma V, Aruoma OI. Free
radicals and antioxidants in cardiovascular health and disease. Internet
Journal of Medical Update 2006; 1(2): 2541.
Halliwell B. Role of free radicals in the neurodegenerative disease:
therapeutic implications for antioxidant treatment. Drug aging 2001;
18(9): 685716.
Halliwell B, Guteridge YMC. Free radicals in Biology and Medicine, 4
th Ed. Oxford University Press: Clarendon, 2007.
37.
39.
42.
45.
48.
56.
57.
66.
67.
72.
75.
81.
87.
97.
98.
101.
102.
109.
Valko M, Rhodes CJ, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Free radicals,

metals and antioxidants in oxidative stressinduced cancer. Chem Biol
Interact 2006; 160: 140.
Baynes JW, Thorpe SR. Role of oxidative stress in diabetic
complications: a new perspective on an old paradigm. Diabetes 1999;
48(1): 19.
Kostyuk VA, Potapovich AI. Mechanisms of the suppression of free
radical overproduction by antioxidant. Front Biosci (Elite Ed) 2009; 1:
179188.
Chaudire J, FerrariIlion R. Intracellular antioxidants: from chemical to
biochemical mechanisms. Food Chem Toxicol 1999; 37: 949962.
Miron A, Stnescu U. Antioxidanii naturali ntre medicament i aliment.
Iai: Ed Gr. T. Popa, 2003.
Stevenson DE, Hurst RD. Polyphenolic phytochemicals just
antioxidants or much more? Cell Mol Life Sci 2007; 64(22): 29002916.
Boots AW, Haenen GR, Bast A. Health effects of quercetin: from
antioxidant to nutraceutical. Eur J Pharmacol 2008; 585(23): 325337.
Clarke MW, Burnett JR, Craft KD. Vitamin E in human health and
disease. Crit Rev Clin Lab Sci 2008; 45(5): 417450.
Padayatty SJ, Katz A, Wang Y et al. Vitamin C as an antioxidant:
evaluation of its role in disease prevention. J Am Coll Nutr 2003; 22(1):
1835.
Li J, Lin JC, Wang H et al. Novel Role of Vitamin K in Preventing
Oxidative Injury to Developing Oligodendrocytes and Neurons. J
Neurosci 2003; 23(13): 58165826.
Littarru GP, Tiano L. Bioenergetic and antioxidant properties of
coenzyme Q10: recent developments. Mol Biotechnol 2007; 37(1): 3137.
Papp LV, Holmgren A, Khauna KK. Selenium and selenoproteins in
health and disease. Antiox Redox Signal 2010; 12(7): 793795.
Klotz LO, Kroncke KD, Buchczyk DP, Sies H. Role of Copper, Zinc,
Selenium and Tellurium in the Cellulare Defense against Oxidative and
Nitrosative Stress. J Nutr 2003; 133(5): 14481451.
Hall DE. 21Aminosteroids or Lazaroids. In: Packer L, Cadenas E
editor. Handbook of Synthetic Antioxidants, New York: Dekker M, 1997,
261273.
McDaniel DH, Neudecker BA, Di Nardo JC et al. Idebenone: a new
antioxidant. Part I. Relative assessement of oxidative stress protection
capacity compared to commonly known antioxidants. Journal of
Cosmetic Dermatology 2005, 4: 1017.
Krishnaiah D, Sarbatly R, Bono A. Phitochemical antioxidants for health
and medicine A move towards nature. Biotechnol Mol Biol Rev 2007;
1(4): 97104.
Herrera E, Jimnez R, Aruoma OI, Hercberg S, SnchezGarcia I, Fraga
C. Aspects of antioxidant foods and supplements in health and disease.
Nutr Rev 2009; 67(Suppl 1): S 140144.
Terao J, Kawai Y, Murota K. Vegetable flavonoids and cardiovascular
47
112.
113.
120.
126.
129.
133.
137.
140.
143.
158.
166.
173.
178.
188.
189.
192.
196.
48
disease. Asia Pac J Clin Nutr 2008; 17(Suppl 1): 291293.

Sadruddin S, Arora R. Resveratrol: biologic and therapeutic implications.
J Cardiometab Syndr 2009; 4(2): 102106.
Lopaczynski W, Zeisel SH. Antioxidants, programmed cell death and
cancer. Nutr Res 2001; 21: 295307.
Elswaifi SF, Palmieri JR, Hockey KS, Rzigalinski BA. Antioxidant
nanoparticles for control of infectious disease. Infect Disord Drug
Targets 2009; 9(4): 445452.
Nance CL, Siwak EB, Shearer WT. Preclinical Development of the green
tea, catechin, epigallocatechin gallate as an HIV1 therapy. J Allergy
Clin Immunol 2009; 123(2): 459465.
Kaur C, Ling EA. Antioxidants and neuroprotection in the adult and
developing central nervous system. Curr Med Chem 2008; 15(29): 3068
3080.
Kim J, Lee HJ, Lee KW. Naturally occuring phytochemicals for
prevention of Alzheimers disease. J Neurochem 2010; 112(6): 1415
1430.
Aruoma OI. Methological considerations for characterizing potential
antioxidant actions of bioactive components in plant foods. Mutat Res
2003; 523524: 920.
Prior RL, Wu X, Schaichk. Standardized methods for the determination
of antioxidant capacity and phenolic in food and dietary supplements. J
Agric Food Chem 2005; 53(10): 42904302.
Stalikas CD. Extraction, separation and detection methods for phenolic
acids and flavonoids. J Sep Sci 2007; 30(18): 32683295.
SnchezMoreno C. Review: Methods Used to Evaluate the Free Radical
Scavenging Activity in Foods and Biological Systems. Food Science and
Technology International 2002; 8(3): 121137.
Niki E. Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo. Free
Radic Biol Med 2010; 49(4): 503515.
Ashawat MS, Shailendra S, Swarnlata S. In vitro Antioxidant Activity of
Etanolic Extracts of Centella asiatica, Punica granatum, Glycyrrhiza
glabra and Areca catechu. Res J Medicinal Plant 2007; 1: 1316.
Zeng W, Martinuzzi F, Mac Gregor A. Development and application of a
novel UV method for the analysis of ascorbic acid. J Pharm Biomed Anal
2005; 36(5): 11071111.
Waring SW, Mishra V, Maxwell SRY. Comparison of
spectrophotometric and enhanced chemiluminescent assay of serum
antioxidant capacity. Clin Chim Acta 2003; 338: 6771.
Stanciu G, Chiril E, Dobrina S, NegreanuPrjol T. Studies Regarding
the Determination of Antioxidant Properties of New Plant Extracts for
Cosmetic Purposes. Rev Chim Bucureti 2010; 61(1): 4144.
Niederlander HA, van Beek TA, Bartasinte A, Koleva II. Antioxidant
activity assays online with liquid chromatography. J Chromatogr A
2008; 1210(2): 121134.
Merken HM, Beecher GR. Measurement of Food Flavonoids by High
202.
206.
211.
214.
220.
221.
222.
227.
230.
231.
232.
233.
Performance Liquid Chromatography a review. J Agric Food Chem

2000; 48: 577599.
ZafraGmez A, LuznToro B, JimnezDiaz I, Ballesteros O, Navaln
A. Quantification of phenolic antioxidants in rat cerebrospinal fluid by
GCMS after oral administration of compounds. J Pharm Biomed Anal
2010; 53(1): 103108.
Wang Y, CallasBlanchard C, CortinaPuig M, Baohong L, Marty JL.
An Electrochemical Method for Sensitive Determination of Antioxidant
Capacity. Electroanalysis 2009; 21: 13951400.
Ziyatdinova GK, Budnikov HC, Pogoreltzev VI, Ganeev TS. The
application of coulometry for total antioxidant capacity determination of
human blood. Talanta 2006; 68(3): 800805.
Joshi R, Ghanty TK, Mukherjee T. Reactions and structural investigation
of chlorpromazine radical cation. Journal of Moleculare Structure 2008;
888: 401408.
Miftode AM, tefanache A, Stan M, Dorneanu V. Evaluation of the
antioxidant activity with chromogenic chlorpromazine radical cation. The
XIV th National Congres of Pharmacy from Romania Trgu Mure,
october 13th 16th, 2010. Rezumat publicat n: Acta Medica Marisiensis,
2010; 56(suppl 2): 41.
Roman L, Boji M, Sndulescu R, Muntean DL. Validarea metodelor
analitice. Editura Medical, Bucureti 2007.
Oprean R, Rozet E, Dew W, Boulanger B, Hubert Ph. Ghid de validare
a procedurilor analitice cantitative, Ed Medical Universitar Iuliu
Haieganu, Cluj Napoca 2007.
Miftode AM, tefanache A, Stan M, Dorneanu V. Measurement of Total
Antioxidant Activity with Chlorpromazine Radical Cation. Rev Med Chir
Soc Med Nat Iai 2010; 114(3): 892895.
Miftode M, Miftode AM, tefanache A, Caraman C. 4Dimethyl
Aminoantipiryne Radicals. Applications in the Drug Analysis.
Proceedings of 11th Panhellenic Pharmaceutical Congres, Athens
Greece, march 2931, 2003. Rezumat n European Journal of Drug
Metabolism and Pharmacokinetics 2003; 28(1): 69 (P103).
Miftode AM, tefanache A, Miftode M, Dorneanu V. The study of
chromogen radical APH+ and its reaction with some antioxidants.
Proceedings 12th Panhellenic Pharmaceutical Congress, Athens Greece,
may 1416, 2005. Rezumat n European Journal of Drug Metabolism
and Pharmacokinetics 2005; 30: 34 (P075).
Miftode AM, tefanache A, Miftode M. Metode de generare a
radicalului cationic APH+ cu posibile aplicaii la evaluarea activitii
antioxidante. Congresul Naional de Farmacie, ed. a XIIIa, Cluj
Napoca, 2830 septembrie 2006; 95.
Miftode AM, tefanache A, Miftode M. Quantitative analysis of certain
antioxidants in the metavanadate aminophenazone system. Proceedings
of 13th PanHellenic Pharmaceutical Congress, Athens Greece may 12
14, 2007. Rezumat n European Journal of Drug Metabolism and
49
240.
242.
Pharmacokinetics 2007; 32: 98 (P221).

Miftode AM, Lazr D, Miftode M. O nou metod spectrofotometric de
determinare a apei oxigenate i a ionilor peroxidici. Sesiunea tiinific
Tendine n medicina nceputului de mileniu (Zilele Universitii de
Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai), noiembrie 2003.
Miftode AM, tefanache A, Dorneanu V. The study of Aminophenazone
radical cation and its interaction with some antioxidants. Rev Med Chir
Soc Med Nat 2010; 114(4): 12151218.
Lucrri publicate din teza de doctorat

Lucrri publicate n reviste cotate CNCSIS B+
1.
2.
Miftode AM, tefanache A, Stan M, Dorneanu V. Measurement of Total

Antioxidant Activity with Chlorpromazine Radical Cation. Rev Med Chir
Soc Med Nat Iai 2010; 114(3): 892895.
Miftode AM, tefanache A, Dorneanu V. The study of Aminophenazone
radical cation and its interaction with some antioxidants. Rev Med Chir Soc
Med Nat 2010; 114(4): 12151218.
Lucrri publicate n volume ale unor manifestri tiinifice

internaionale
1.
2.
3.
Miftode M, Miftode AM, tefanache A, Caraman C. 4Dimethyl

Aminoantipiryne Radicals. Applications in the Drug Analysis. Proceedings
of 11th Panhellenic Pharmaceutical Congres, Athens Greece, march 2931,
2003. Rezumat n European Journal of Drug Metabolism and
Pharmacokinetics 2003; 28(1): 69 (P103).
Miftode AM, tefanache A, Miftode M, Dorneanu V. The study of
chromogen radical APH+ and its reaction with some antioxidants.
Proceedings 12th Panhellenic Pharmaceutical Congress, Athens Greece,
may 1416, 2005. Rezumat n European Journal of Drug Metabolism and
Miftode AM, tefanache A, Miftode M. Quantitative analysis of certain
antioxidants in the metavanadate aminophenazone system. Proceedings of
13th PanHellenic Pharmaceutical Congress, Athens Greece may 1214,
2007. Rezumat n European Journal of Drug Metabolism and
Lucrri publicate n rezumat

1.
50
Miftode AM, tefanache A, Stan M, Dorneanu V. Evaluation of the

antioxidant activity with chromogenic chlorpromazine radical cation. The
XIV th National Congres of Pharmacy from Romania Trgu Mure, october
13th16th, 2010. Rezumat publicat n: Acta Medica Marisiensis, 2010; 56
(suppl 2): 41.
2.
3.
Miftode AM, tefanache A, Miftode M. Metode de generare a radicalului

cationic APH+ cu posibile aplicaii la evaluarea activitii antioxidante.
Congresul Naional de Farmacie, ed. a XIIIa, ClujNapoca, 2830
septembrie 2006; 95.
Miftode AM, Lazr D, Miftode M. O nou metod spectrofotometric de
determinare a apei oxigenate i a ionilor peroxidici. Sesiunea tiinific
Tendine n medicina nceputului de mileniu (Zilele Universitii de
Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai), noiembrie 2003.
51

Rezuma - Rom Miftode Alina

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Rezuma - Rom Miftode Alina

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Universitatea de Medicin i Farmacie

Gr. T. Popa Iai

Sisteme de detecie i evaluare a

2.4.2. Medicamente cu aciune antioxidant ____________________ 43

4.4.4. Stabilirea raportului molar optim clorpromazin maleat/ clorur de

5.4.2.4. Exactitatea (acurateea) ___________________________140

se urmrete permanent identificarea unor noi surse de antioxidani

Validarea metodelor propuse n conformitate cu

modularea unor procese fiziologice ct i la declanarea diverselor

- transferul unui atom de hidrogen (TAH);

electronic de spin (RES), spectroscopia prin chemioluminiscen

Fig. 6. Mecanismul de oxidare a clorpromazinei

Prin oxidare avansat se formeaz clorpromazin sulfoxidul

de clorpromazin 0,01M se adaug 8,5 mL soluie acid clorhidric 1M

Fig. 7. Spectrul de absorbie n UVVIS pentru radicalul cation CP+

Din analiza spectrului de absorbie se observ c radicalul

Persulfatul de potasiu s reacioneze total, astfel ca n

Fig. 10. Spectrul de absorbie n VIS a radicalului cation CP+

Se constat c produsul de oxidare prezint absorbana

Cap. 5. Interaciunea radicalului cation CP+ cu unii

5.2. Determinarea spectrofotometric a activitii

Concentraie acid galic (M/L)

Fig. 15. Curbele de calibrare

Ecuaiile dreptelor de regresie sau calculat prin metoda celor

Domeniul analitic (M/L acid galic)

A fost evaluat i liniaritatea rezultatelor, prin

Domeniul analitic (M/L acid galic)

Au fost calculate limita de detecie (LD=3,03 M/L) i

Pentru estimarea exactitii sa determinat regsirea pentru

Domeniul analitic (M/L acid galic)

Avnd n vedere rezultatele obinute, considerm c metoda

5.2.4. Evaluri analitice specifice metodelor de

Concentraie acid galic (M/L)

Fig. 18. Modificarea absorbanei relative funcie de concentraie

Concentraie acid galic (M/L)

Fig. 19. Modificarea procentului de inhibiie funcie de concentraie

Curbele de calibrare obinute sunt folosite pentru

Activitatea antioxidant poate fi, de asemenea, exprimat n

Graficul din fig. 23 red curba de calibrare obinut prin

Concentraie acid galic (M/L)

Fig. 23. Aria de sub curb (AUC) funcie de concentraie

Ecuaiile dreptelor de regresie pentru cele dou domenii de

5.3. Determinarea spectrofotometric a activitii

Fig. 24 Reducerea radicalului cation CP+ cu acid ascorbic

Rezultatele obinute prin aplicarea acestei metode se vor

5.3.2. Validarea metodei

Funcia de rspuns este liniar pe domeniul de

Concentraie acid ascorbic (M/L)

Fig. 27. Curba de calibrare n sistemul CP+ acid ascorbic

Ecuaia dreptei de calibrare sa calculat prin metoda celor

Estimarea acestor limite sa fcut pe baza deviaiei standard

5.3.4.2. Determinarea ariei de sub curb

Fig.31. Profilul ariei de sub curb la diferite concentraii de acid ascorbic

Cu ajutorul ecuaiei de regresie a curbei de etalonare

Concentraie acid ascorbic (M/L)

Principiul metodei: Acidul ascorbic reduce radicalii cation

Coeficientul de corelatie (r) = 0,9981, iar coeficientul de regresie r2 =

4,4948% cu un interval de ncredere a valorii medii

5.4.4. Evaluri analitice

5.5. Aplicaii analitice

Metodele au fost aplicate pe produse variate: plante,

AGE (M/1 g frunze)

Fig. 41. Echivaleni micromolari de acid galic (AGE) / 1 g frunze