Inmunodeteccion: Este proceso implica el uso de anticuerpos especficos previamente conjugados

con compuestos enzimticos, radioactivos o luminiscente.

Bloqueo: se trata de bloquear la unin de protenas a la membrana, que puedan unirse a esta en
los lugares que hayan quedado libres, posteriormente a la transferencia. Sin este paso, el
anticuerpo, que es de naturaleza proteica, podra unirse en esos huecos libres y producir una unin
inespecfica o ruido de fondo o backgfround, y dificultar la distincin del complejo antgenoanticuerpo que se trata de obtener.
Para bloquear, se suele usar una solucin proteca, que incluye albmina de suero bovino (BSA),
leche en polvo o casena. Esta solucin proteca rellena los huecos libres, y como el anticuerpo que
se usar es especfico, no se unir en estos huecos, ya que no habr en ellos la proteina que el
anticuerpo busca.
El agente bloqueante se diluye, para eliminar el excedente mediante tampones de lavado, se
puede aadir tambin detergente Tween 20. Si los niveles del ruido de fondo son demasiados
altos, se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo alternativas.
Deteccin: se trata de buscar en la membrana una determinada protena, y por este motivo se usa
un anticuerpo especfico, unido a una enzima, que si encuentra su sustrato, se producir una
reaccin y podremos observar a la protena por diversos mtodos.
Una vez la membrana ha sido bloqueada se expone a un primer anticuerpo (El que se une a la
protena buscada) y posteriormente se expone a un segundo anticuerpo dirigido contra el primero.
Anticuerpo secundario.
ste reconoce de forma especfica una regin concreta del anticuerpo primario, a la cual se une, y
estos secundarios suelen estar marcados para ser detectables por diversos mtodos. Tambin
otros compuestos como la protena A o G pueden ser utilizados para detectar elanticuerpo primario
pero estas protenas no reconocen todos los Ac de la clase IgG de todas las especies.
La deteccin de la protena se puede hacer mediante mtodos directos o indirectos, cada uno con
sus ventajas e inconvenientes. Los mtodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con
un marcaje detectable, como un enzima, biotina o molcula fluorescente. Los mtodos indirectos
utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del
primer anticuerpo. En la deteccin indirecta, es el anticuerpo secundario el que est conjugado con
un marcaje detectable.
Mtodos de deteccin.
Los mtodos ms comnmente utilizados para detectar protenas son:
1. Quimioluminiscencia.
El luminol es el compuesto ms utilizado, este compuesto es oxidado para producir un producto en
estado excitado que emite luz. Utilizan comnmente anticuerpos secundarios conjugados con
peroxidasa (HRP). La reaccin entre el encima y el substrato produce luz, que puede ser detectada
mediante la exposicin de la membrana a una pelcula de rayos X.
Ventajas: muy sensible, fcil de documentar.

Inconvenientes: es semicuantitativa - porque se basa en una reaccin enzimtica, la intensidad de

la seal puede variar con la incubacin o el tiempo de exposicin, no esposible la deteccin de mas
de una protena.
2. Marcados con isotopos
Los anticuerpos son marcados con isotopos radioactivos, el ms utilizado es el 125I. Tiene la
ventaja de permitir cuantificar la protena de inters por medio de densitometra.
3. Fluorescencia.
El anticuerpo secundario se une a un fluorforo, que cuando es excitado emite luz. La luz emitida,
se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia.
Alta sensibilidad para detectar protenas. Se puede utilizar el Rojo Nilo,
4. Colorimetra.
Los mtodos colorimtricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un
enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) que una vez reaccionan con el sustrato producen un
precipitado de color en donde tuvo lugar el reconocimiento del antgeno por el ac especifico, lo que
permite visualizar la protena de inters. La intensidad de la tincin puede ser medida por
espectrofotometra. Existen modificaciones que pueden aumentar la sensibilidad de deteccin,
como el uso de AC conjugados con biotina, entonces muchas enzimas reporteras se unen al AC
secundario y amplifican la seal.
Ventajas: Sencilla de realizar.
Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos mtodos, el color se desvanece con el
tiempo
Tipo y modificaciones:
Existen otros mtodos ms simples para transferir o aplicar protenas sobre una membrana.
DOT BLOT: se aplica las protenas que estn en una solucin directamente en forma de una
pequea gota sobra la membrana sin que sean separadas por electroforesis, la absorcin de la
gota provoca la adhesin de la protena a la membrana que queda en forma de mancha. No
permite discriminan entre la protena de inters y la reactividad cruzada con otro antgeno se utiliza
como prueba de rutina en laboratorio en especial para diagnosticar algunas enfermedades de
origen infeccioso como en la cisticercosis porcina, en rotavirus, papilomavirus, herpes simple,
citomegalovirus.

FAR WESTERN BLOT: modificacin del wb, aqu se utiliza una protena marcada en lugar de un
anticuerpo como sonda en la membrana, la cual reconoce y se una a las protenas de la membrana
a travs de interacciones protena-protena, por lo que si se genera una seal en la membrana,
indica la presencia de una protena que interacciona con la protena-sonda y adems que dicha
protena posee el peso molecular correspondiente a la banda donde se observa la seal. Se utiliza
para buscar interacciones desconocida entre protenas o modificaciones postraduccionales.
DOUBLE BLOTTING: los anticuerpos unidos a las protenas que se encuentran adheridas a la
membrana, son transferidos a una nueva membrana por procesos de difusin simple. Fue
desarrollado con el objetivo de disminuir el ruido de fondo o falsos positivos que se presentan como
consecuencia de las uniones inespecficas de los anticuerpos secundarios.

http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-wb-webinar.pdf
http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf
https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/