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ESTUDIO DE LOS CIDOS NUCLICOS: EXTRACCIN Y

CUANTIFICACIN DEL ADN DE FRESA.


Molano, J(1), Tapasco, J(2), Vargas, A(3)
Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad del Valle
Santiago de Cali, Colombia, jueves 27 de octubre del 2016
(1)

molano.juan@correounivalle.edu.co
jennifer.tapasco@correounivalle.edu.co
(3)
andres.vargas@correounivalle.edu.co
(2)

ABSTRACT
Keywords: extraction of DNA, strawberry DNA, quantification of nitrogenous bases
INTRODUCCIN
Los cidos nucleicos son molculas biolgicamente claves en el
desarrollo de la vida, debido a que estos contienen la
informacin gentica de los seres vivos. Estos estn encargados
de otorgarle la estructura a las protenas, tambin intervienen en
la sntesis de biomolculas y de todos los componentes dentro de
las clulas, adems de actuar como intercambiador energtico en
el metabolismo celular, principalmente en forma de ATP.

MATERIALES Y METODOLOGA

El procedimiento y materiales empleados en la realizacin de la


prctica sigui el orden y se llev a cabo de acuerdo a lo
consignado en la gua de laboratorio de Bioqumica del
Departamento de Qumica de la Universidad del Valle1.

La estructura qumica de stos cidos nucleicos est formada por


una unidad de azcar (desoxirribosa en el ADN), una unidad de
base nitrogenada (prica o pirimidnica) en posicin C1y un
grupo fosfato en la posicin C5, donde las bases son adenina
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Por medio de enlaces
de hidrgeno, estas bses nitrogenadas forman pares que
permiten la unin de las dos hebras del ADN, de la cual adenina
se une con timina y guanina con citosina. (Figura 1)

2
1.1

RESULTADOS Y DISCUSIN
EXTRACCIN

DEL DNA

Para realizar el proceso de extraccin del DNA de fresa, se


toman 4,0015g 0,0001 g de fresa, posteriormente se agrega 5
mL de cada uno de los Buffers de extraccin (1 y 2). El Buffer
de extraccin 1 contiene EDTA y cloruro de sodio, estos
permiten lograr la desnaturalizacin del estado donde se
encuentra el DNA y el Buffer de extraccin 2, el cual se usa con
DSS que es un agente anionico, se usa para poder extraer en una
especie de micela, y por medio de dos fases, las molculas de
DNA.

1.2

CUANTIFICACIN

DEL DNA

Se realiz la curva de calibracin para cuantificacin de DNA


por colorimetra; la curva se muestra en la grfica 1. Para la
preparacin, se sigui el procedimiento descrito en la
metodologa1. Teniendo en cuenta la temperatura controlada
35C y con tiempo de 20 minutos. Las lecturas de absorbancia
de cada estndar se tomaron a una longitud de onda de 474 nm.

Figura 1. Pares de bases nitrogenadas del ADN

Debido a estas propiedades es que el ADN se ha convertido a


travs de los aos en una de las biomolculas ms estudiadas a
nivel bioqumico. En ste caso se determin la concentracin de
ADN en la fresa, gracias a que esta fruta es fcil de macerar y
contienen pectinasas y celulasas que ayudan a romper las
paredes celulares, adems posee ocho copias de cada
cromosoma (octoploide), lo cual implica una gran cantidad de
ADN para extraer.

Se realiz el mismo tratamiento (mismas condiciones) de los


estndares de muestras de: patrn de ARN, albumina y la
disolucin de DNA de fresa, para la cuantificacin de DNA.

En las siguientes figuras se observa el barrido espectral y


longitud de onda mxima para cada uno de los patrones y la
disolucin de DNA.

Figura 5. Espectro UV-Vis tomado para un patrn de


albumina
La tabla 1 resume la longitud de onda de mxima
absorcin para cada uno de las soluciones medidas.
Figura 2. Espectro UV-Vis tomado para un patrn de DNA.

Tabla 1. Resultados para la determinacin cualitativa por UV-Vis


y as la determinacin del contenido de DNA extrado.
Solucin
mx
Absmx
Abs a
Abs a
260 nm
280 nm
Solucin ADN
~235
de Fresa
Patrn ADN
261
2.692
2.671
1.526
Patrn ARN
260
2.385
2.385
1.175
Patrn
277
0.026
Albmina

Desde los nucletidos, RNA, ss DNA y ds DNA todos absorben


a 260 nm, y contribuirn a la absorbancia total de la muestra. Sin
embargo la medicin necesitar unas medidas de purificacin
para esto, se tiene en cuenta la relacin 260/280 la cual es el
rango de absorbancia y con esto se determina la pureza de un
DNA. El radio ~1,8 es generalmente aceptado para el DNA
puro, mientras que un radio de ~2,0 es generalmente aceptado
para RNA puro. Si el radio es menor se puede tener es una
protena. Si el radio es mayor, que 2,0, se puede pensar en una
degradacin de cidos nucleicos.2

Figura 3. Espectro UV-Vis tomado para un patrn de ARN

Segn lo obtenido en las medidas experimentales, la relacin


260/280 se encuentra registrada en la tabla 2.
Tabla 2. Relacin de pureza 260/280
Compuesto
DNA de Fresa
DNA Patrn
RNA Patrn

Radio
1,75
2,03

Segn los resultados se puede observer que tanto el DNA patrn


como el RNA patron cumplen con los valores aproximados
consginados en la literatura. Sin embargo, no es possible
determiner la pureza del DNA de fresa, debido a que el grupo
encargado no registr los valores correspondientes a las
absorbancias de 260 y 280 nm.

Figura 4. Espectro UV-Vis tomado para el extracto de DNA de


fresa

1.3

PROPIEDADES DEL DNA

Tm causa una prdida rpida y casi simultnea de las mltiples


interacciones dbiles que mantienen las hebras unidas a lo largo
de toda la molcula de DNA, lo cual ocasiona un cambio
abrupto en la absorcin de la luz UV. No todas las molculas de
DNA experimentan el fenmeno de la desnaturalizacin de igual
manera, porque depende de la composicin de las bases.

1.3.1 Determinacin de la dilucin


apropiada
Para estudiar las propiedades del DNA, se busc la dilucin
apropiada del DNA patrn. Para esto, se tom el espectro UV de
las soluciones de DNA patrn, ARN patrn, albumina y dilucin
de fresa. La dilucin usada para el ensayo fue 1/5.

Las temperaturas Tm son generalmente altas (85C -100C),


superior a la temperatura de desnaturalizacin de las protenas,
indica que la doble hlice es una estructura estable. Si el DNA
tiene una proporcin mayor de pares de bases G:C tendr una
temperatura de disociacin (Tm) mayor, esto se debe a los tres
puentes de hidrgeno entre G:C son ms estables que los dos
puentes en los pares A:T.

Para el caso del ADN patrn, se logr un mximo de


absorbancia a 261 nm y para el ARN patrn un mximo de
absorbancia en 260 nm siguiendo los Anexos 1 y 3. La solucin
de ADN extrada de la fresa presento una absorbancia mxima
alrededor de 235 nm aproximadamente, ya que, no se registr
este dato por parte del grupo encargado.

Para determinar el efecto de calentamiento y rpido enfriamiento


se llev volmenes iguales de muestras de la dilucin adecuada
de DNA patrn en los tubos de ensayos. Los tubos fueron
repartidos a temperaturas de 25, 60,70, 85, 90 y 97 C
(ebullicin), a un tiempo de 15 minutos. Se midi la absorbancia
a una longitud de onda de 260 nm. La figura 6 muestra los
resultados obtenidos.

La absorcin a 260 nm no puede distinguir entre ADN y ARN,


ya que ambos cidos nucleicos contienen las bases pricas y
pirimidnicas que son las que absorben a esa longitud de onda.
Para el caso de la absorcin a 235 nm, se puede ver que se alej
de la longitud de onda de 260 nm. La posible causa puede ser
debido a que trazas de etanol u otro compuesto presente de la
matriz de la muestra, que hizo que desplazara su absorcin a
longitudes de onda menor.

1.3.2

EFECTO DE CALENTAMIENTO Y RPIDO ENFRIAMIENTO


0.5
0.45

Efecto de calentamiento y rpido


enfriamiento.

0.4

Absorbancia
A medida que una solucin de DNA de doble hebra es calentada
y su temperatura supera la temperatura a la cual el DNA es
estable, su estructura nativa colapsa y sus hebras
complementarias se separan, ya que, por efecto de la
temperatura los enlaces se debilitan y vibran hasta romperse, una
vez se separan la configuracin de la estructura es semejante a
una configuracin al azar.

0.35
0.3
0.25
20 40 60 80 100 120

Temperatura C

A bajas temperaturas algunas pares de bases se desaparecen


formando unas burbujas en los espacios entre las cadenas, se
forman en las regiones que contienen una proporcin mayor de
pares adenina-timina, esto se debe a las menores energas de
apilamiento de los pares de bases. A medida que la temperatura
va en aumento, estas burbujas incrementan su tamao y se d la
separacin de las hebras. Este proceso de desnaturalizacin
causa cambios en las propiedades fsicas del DNA, como por
ejemplo: reduccin de la viscosidad, cambio en la absorcin de
la luz UV, aumento de la densidad3.

Figura 6. Curva de Absorbancia Vs temperatura.


Al observar la figura se puede apreciar como la
absorbancia tiende a aumentar a medida que la
temperatura tambin lo hace, sin embargo, hay dos puntos
en los cuales la absorbancia decae, a una temperatura de
70 C la absorbancia cae un poco, y a 100C el
decaimiento es mucho ms pronunciado estos cambios
pueden atribuirse al proceso de enfriamiento rpido el
cual no fue llevado a cabo con xito, quizs no se dej
enfriar el suficiente tiempo o no se lleg a la temperatura
de enfriamiento adecuada. En este proceso las hebras
comienzan a reorganizarse, es decir, sucede la
renaturalizacin del DNA debido a las interacciones de
especificidad de las bases, estas interacciones son
cooperativas, se distorsionan progresivamente hasta que
ocurre la separacin completa de las hebras que se
presenta a temperaturas entre los 90 a los 100C
aproximadamente, por encima de esta temperatura no se

La absorbancia de DNA en la regin UV se debe bases


aromticas, las cuales poseen valores mximos de absorcin de
la luz UV cerca de la longitud de onda de 260 nm, ocasionado
por la presencia de sistemas conjugados de dobles enlaces en su
molcula. La absorbancia aumenta un 40% al desnaturalizarse,
esto es causado por la desestabilizacin de las interacciones
electrnicas entre las bases vecinas. El aumento de la
absorbancia se conoce como efecto hipercrmico. 3 La
temperatura a la cual se ha desnaturalizado la mitad de la doble
hlice de DNA se conoce como temperatura de fusin o
disociacin Tm. Un incremento pequeo de temperatura cerca de

observar ningn cambio en la absorcin, esto es debido a


que las bases no emparejadas presentan absorbancias
similares a las bases que conforman los nucletidos de la
molcula de DNA. La temperatura a la cual el DNA se
encuentra semidesarrollado est alrededor de los 90 C
dicha temperatura es la Tm.

la absorbancia puede seguirse el proceso de


desnaturalizacin del ADN, ya que cuando esto se
da, la absorbancia aumenta debido a la separacin
parcial o total de las dos hebras que estn unidas
principalmente por enlaces de hidrogeno e
interacciones hidrofbicas lo que limita la resonancia
en el anillo aromtico.

Efecto del pH

A pH por debajo de 4,5 unidades algunas bases


como (G, C y A) se protonan, lo cual desestabiliza la
doble hlice y disminuye as la temperatura de
fusin, y se esperara un aumento en la
absorbancia, ya que cuando el ADN se encuentra
como una sola hebra su absorbancia debera
aumentar en aproximadamente 37%. [8]

Se tomaron 6 tubos de ensayo y se dispuso en ellos


la solucin de ADN patrn, 0,5 mL de etanol y el
respectivo buffer de pH (1, 3, 7, 9, 12 y 13).
Posteriormente se midi las absorbancias a una
longitud de onda de 261 nm. La figura 7 muestra los
valores obtenidos:

Al incrementar el pH (alcalino) puede producirse


tautomera en algunas bases, por ejemplo el grupo
amino (NH2) puede tautomerizarse a (=NH) al igual
que el grupo (C=O) se tautomeriza a (=COH), estos
tautomeros pueden formar pares de bases no
estndar que encajan en la doble hlice y pueden
causar la introduccin de mutaciones durante la
replicacin del ADN, tambin hay cambios en los
enlaces de hidrogeno y por ello perdida de la
estabilidad de la estructura del ADN, disminuyendo
as la temperatura de fusin. [9]
La doble cadena de ADN sufre desnaturalizaciones
tanto a pH por encima de 12 como por debajo de 2,
debido a ionizacin de bases. La ionizacin se da
como resultado de un cambio en las propiedades
donor/aceptor de las bases, la cual no es acorde a
la normal y estable distribucin de enlaces de
hidrgeno; la pelcula de hidratacin alrededor del
ADN se ve afectada por altos o bajos pH,
desestabilizando el apareamiento de bases. Los
tratamientos cidos dan lugar a la depirimidizacin y
depurinizacin, la perdida de bases por ruptura de
enlaces glicosidicos. Por otra parte el enlace
fosfodiester es ms susceptible a hidrlisis. [10]

Grfica 7. Efecto del pH en la estructura del ADN.

Los cambios de pH desnaturalizan el ADN, debido a


que afecta la ionizacin de los grupos funcionales
en las bases nitrogenadas, generando as un
rompimiento en las interacciones por enlaces de
hidrogeno, las cuales son la base fundamental de la
estabilizacin de la doble hlice.

Figura 3. Interaccin entre bases nitrogenadas


complementarias en el ADN a diferentes valores de
pH.
El ADN absorbe en la regin de UV debido a la
presencia de grupos aromticos, por lo cual al medir

Figura 1. Apareamiento a pH fisiolgico y por encimas de


10. [12]

Segn lo mencionado anteriormente, debi


esperarse que las absorbancias aumentaran a
medida que el pH del medio tambin lo haca por
des-apareamiento de las cadenas de ADN, pero se
observ que para las muestras sin etanol el
comportamiento no vario mucho y por otra parte en
las muestras con etanol la absorbancia presento
disminucin, Una posible explicacin para la
disminucin de la absorbancia en presencia de
etanol se puede atribuir a que el etanol puede
formar puentes de hidrogeno con las bases
nitrogenadas de cadenas libres, lo cual tiene como
efecto neto el apantallamiento de las bases
impidiendo su participacin en el fenmeno de
absorcin.

Esquema 1. Reacciones de protonacin y desprotonacin


de las distintas bases segn sus constantes. [11]

Esquema 2. Reacciones de protonacin y desprotonacin


de las distintas bases segn sus constantes. [11]

Como se observa en el Esquema 1 y 2, tanto la


guanina como la timina poseen pKas que se
encuentran alrededor de 9.5; a un pH por encima de
10 estas bases se desprotonan y dan lugar a una
carga negativa conjugada; como las especies
desprotonadas hacen parte de los enlaces de
hidrogeno que estabilizan la doble hlice, esta se
desestabiliza. La Figura 1 muestra lo anterior
descrito. [12]

RESPUESTA A LAS PREGUNTAS

1.) Suponga que su ADN presenta un elevado nmero de


errores en el apareamiento de las bases: Qu influencia
tendra esto sobre, por ejemplo, el Tm?
R// Al elevar el nmero de errores en el apareamiento de las
bases nitrogenadas del ADN, la temperatura de fusin se ve
afectada de forma proporcional, debido a que sta temperatura
es funcin de la concentracin de las bases nitrogenadas
guanina-citosina y de la fuerza inica, por lo cual al aumentar
los enlaces de hidrgeno, se requiere mayor energa para
desnaturalizar el ADN. En contraste con lo anterior, al haber un
nmero de errores con el apareamiento de las bases

nitrogenadas, se espera un menor nmero de enlaces de


hidrgeno y, por lo tanto, la temperatura de fusin del ADN debe
ser menor o diferente con respecto al valor que se espera.

R// ste anlisis no se llev acabo en la prctica... o s?


5.) Si hubiese realizado el experimento del efecto de la
temperatura en presencia de formaldehdo. Cmo sera el
resultado de Tm obtenido en tales condiciones frente al que
obtuvo usted en ausencia de formaldehido? Explique.

2.) Qu informacin se obtiene a partir de la medida Abs a


mx / Abs a 280 nm para la dilucin de trabajo de ADN en
el punto 4.3 A?

R// El formaldehdo presenta el fenmeno de cross-linkange con


el ADN, este ocasiona el entrecruzamiento entre cidos
nucleicos y protenas. De acuerdo a ello, la Tm sera mayor si el
experimento se realizar en presencia de formaldehido, ya que
se necesitara aplicar una mayor temperatura llevar a cabo la
desnaturalizacin del ADN., pero en sta prctica el experimento
no se llev acabo.

R// Yo creo que esto se debe resolver en discusin de resultados.


3.) De acuerdo al rango de Tm que Ud. determin para el
ADN de la fresa y el de esperma de arenque, Es un ADN
rico en C y G? Comprelo con el Tm de otros ADN (otros
vegetales, organismos termfilos o psicrfilos) en la
literatura.
R//
Tabla 1. Temperaturas de fusin para diferentes tipos de ADN con
diferentes porcentajes de GC.16

ADN
Dictyostelium discoideum (hongo)
Clostridium butyricum (bacteria)
Homo sapiens
Streptomyces albus (bacteria)

GC (%)
23.0
37.4
40.3
72.3

Tm (C)
79.5
82.1
86.5
100.5

4.) Cul es la temperatura inicial de ADN que ms cambio


tuvo en la lectura de absorbancia a mx? Por qu esto fue
as?

CONCLUSIONES

REFERENCIAS