PROTOCOLO DE HEMAGLUTINACIN

A. Extraccin del Lquido alantoideo

Procedimiento:
Cortar con las tijeras la cscara (cmara de aire) cerca al nivel del lmite de la cmara
de aire.
Extraer el lquido alantoideo con ayuda de una jeringa de 3 mL con aguja N 22x1
Depositar en un vial esterilizado y tapar el vial.
Guardar en refrigeracin y codificar.
B. Extraccin de Vena braquial en Aves:
Procedimiento:
Se necesitan jeringas de 10 ml y aguja N 21 x 1 .
Se eliminan las plumas de la parte interna del ala y se localiza la vena.
Se desinfectar el rea con algodn y alcohol
Se introduce la aguja, tomar la muestra succionando lentamente para evitar que se
colapse la vena.
Al terminar se saca la aguja y se hace presin con el dedo en el sitio de puncin para
evitar hemorragias.
C. Preparacin de Glbulos Rojos Lavados:

Extraer la sangre del animal de experimentacin; y conservarla en un tubo con Citrato

de Sodio hasta la medida.

Centrifugar a 1500 rpm por 5 min.

Eliminar el sobrenadante (plasma) y conservar el paquete globular.

Agregar al tubo SSFE o PBS y homogenizar.

Centrifugar a 1500 rpm por 5min.

Eliminamos el sobrenadante y volvemos a repetir el proceso de lavado 2 3 veces ms

hasta obtener el sobrenadante transparente.

Finalmente, con una pipeta extraer 0.5 0.7 ml. de glbulos rojos y completamos con
SSF o PBS hasta 100 mL, para obtener el 0.5% 0.7 % de glbulos rojos lavados
respectivamente.
D. Prueba de Macro-Hemoaglutinacin:
En una gradilla, colocar 12 tubos, agregarle al primero 0.8 ml. de SSFE y del tubo 2 al
12 aadir 0.5 ml. de SSFE.
Luego, con una jeringa extraer 0.2 ml. de la vacuna de New Castle y depositarla en el
tubo N 01.
Luego extraer 0.5 ml. del tubo 01 y lo depositamos en el tubo N 02. Repetir hasta el
tubo N 10 y eliminar 0.5 mL del ltimo tubo.
Al tubo N 11 contiene 0.5 mL SSFE agregar 0.5 mL de vacuna de New Castle , siendo
el Control positivo
Al tubo N 12 no se debe agregar de New Castle, siendo el control de Glbulos rojos
Posteriormente a todos los tubo agregar 0.5 ml. de los glbulos rojos lavados al 0.7 %
Dejar reposar a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos.
Transcurrido el tiempo, colocamos debajo de la gradilla un espejo, para observar si hay
hemoaglutinacin positiva (formacin de una malla delgada, gris) o hemoaglutinacin
negativa (se observa un punto rojo).
La ltima dilucin en la cual aparece HA es el ttulo del virus (este es el inverso de
dicha dilucin).

E.

Prueba de Micro-Hemoaglutinacin:
A las bandejas con fondo U, se adicionar 100 L de PBS a la 1era celdilla y 50 L en
la dems hasta la celdilla N 12,
Con ayuda de una micropipeta adicionar 25 L del vacuna VNC en la primera mezclar
bien, luego traspasar 50 L de la 1era celdilla a la 2da celdilla homogenizar, luego
traspasar 50 L de la 2da celdilla a la 3ra celdilla y as sucesivamente hasta llegar a la
10va celdilla donde se descartar los 50 L sobrantes
A la celdilla 11va agregar 50 L de la vacuna VNC
A la celdilla 12va no se agrega la vacuna VNC, siendo el control de G.R.
Agregar 50 L de Glbulos rojos lavados a todos las celdillas
Mover ligeramente la placa e incubar a temperatura ambiente, leer a los 5 min y luego
cada 10 min; al final el ttulo hemaglutinante del antgeno ser la dilucin ms alta
donde existir hemaglutinacin completa.

F. Prueba de Micro-Hemoaglutinacin en Lquido alantoideo

- Del vial contenido de lquido alantoideo, de manera estril extraer 300 uL de cada
dilucin y depositar en un tubo.
- Agregar 300 uL de Glbulos rojos lavados en cada tubo, leer cada 1 minuto; al final el
ttulo hemaglutinante del antgeno ser la dilucin ms alta donde existir
hemaglutinacin completa

PROTOCOLO DE INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN

Obtenido el ttulo HA, proceder a dividir el ttulo entre 10 para el clculo de dilucin de la
vacuna VNC
A. Prueba de Macro-Inhibicin de la Hemoaglutinacin:
Colocamos 09 tubos en un gradilla, colocndole al primero 0.8 ml. de SSF y del tubo 2
al 09 aadir 0.5 ml. de SSFE.
Luego, con una jeringa extraer 0.2 ml. de la vacuna de New Castle de 10 UHA y
depositarla en el tubo N 01.
Luego extraer 0.5 ml. del tubo 01 y lo depositamos en el tubo N 02. Repetir hasta el
tubo N 08 y eliminar 0.5 mL del ltimo tubo.
Al tubo N 09 no se debe agregar de New Castle, siendo el control de Glbulos rojos
Dejar reposar a temperatura ambiente por 1 hora
Luego, a cada tubo agregar 0.5 ml. de los glbulos rojos lavados al 0.5 - 0.7 %
Finalmente leer cada 10 a 15 minutos.
Transcurrido el tiempo, colocamos debajo de la gradilla un espejo, para observar si hay
IHA negativo (formacin de una malla delgada, gris) o IHA positiva (se observa un
punto rojo).
La ltima dilucin en la cual aparece IHA es el ttulo del virus (este es el inverso de
dicha dilucin).
B. Prueba de Micro-Inhibicin de la Hemoaglutinacin
Depositar 50 l de PBS a los pozos del 1 al 12 de todas las filas
Agregar 50 l de l vacuna VNC 10 UHA a la celdilla nmero 1 y realizar las diluciones,
iniciar con la celdilla nmero 1, mezclar cinco veces y pasa a la celdilla nmero 2 y as
sucesivamente hasta el pozo nmero 11, descartar finalmente 50 l.
Incubar la microplaca a temperatura de laboratorio durante 30 minutos.
Agregar 50 l de glbulos rojos al 0.5% a todos los pozos
La celdilla nmero 12 contendrn 50 l de PBS y 50 l de glbulos rojos.
Mover ligeramente la placa e incubar a temperatura ambiente, , leer cada 10 a 15 min