UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SAN LUIS POTOS

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

ANLISIS INSTRUMENTAL

TEMA: Espectrofotometra de UV-VIS

Evaluacin mediante Espectrofotometra UV-Vis derivativa de la
degradacin del 2-clorofenol

Integrantes:
Rosa Ernestina Ortega Herrera
Diana Lizeth Ramrez Hernndez
Jess Hernn Salazar Coronado
Eliseo Vinaja Hernndez
FECHA: 25 DE OCTUBRE DE 2016

Introduccin
La espectrofotometra UV-VIS derivativa consiste en la representacin de la variacin de la absorbancia
respecto a la longitud de onda en funcin de la longitud.
Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de
luz absorbida depende de forma lineal de concentracin.

El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las molculas para absorber radiaciones,

entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que
una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atmica y
de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha
tcnica constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas.
Metodologa
Actualmente la utilizacin de sistemas electrnicos de diferenciacin mediante el empleo de un micro
ordenador acoplado en serie con el Espectrofotmetro permite la presentacin de derivadas de primero
y segundo grado e incluso de rdenes superiores de la absorbancia frente a la longitud de onda.

Espectro de derivadas presenta

valores positivos y valores negativos en la escala de ordenadas o bien, mximos y mnimos, segn el
carcter de pendiente. Para una sustancia absorbente, la posicin de longitud de ondas y la relacin
entre los valores de los extremos (mximos y mnimos) representa una magnitud caracterstica.
VENTAJAS DEL EQUIPO:
1.
2.
3.
4.

Medida exacta de longitud de onda

Mejor resolucin de los espectros
Determinacin de presencia de turbidez
Determinacin cuantitativa de uno o dos componentes.

Aislamiento: se aislaron dos cultivos bacterianos de suelos contaminados con hidrocarburos de un lugar
x a una refinera denominada RS11 Y RS13

Degradacin del 2-clorofenol:

Para conocer la capacidad de las bacterias para degradar se tomaron aislados bacterianos conservados
en agar nutrientes, este proceso duro 24 hrs. Posteriormente se lavaron dos veces con mineral salino,
los botones obtenidos se suspendieron en un volumen final de un mililitro.

DESCRIPCIN EXPERIMENTAL
Se tomaron alcuotas de 0.5 ml de los inculos iniciales y se aadieron en el medio Mineral salino
suplementado con 200mg/L de 2-clorofenol se incub mantenindose en agitacin a 146 rpm. Once das
realizando toma de muestra cada cuatro das.

Se realiz la aclimatacin de los aislados bacterianos conservados en el medio Mineral salino con 1.5%
de agar y 2-clorofenol 500mg/L. Para realizar los mismos cultivos bacterianos se inocularon en el medio
Mineral salino +glucosa 1% con 2-clorofenol 200mg/L. Se aadi igual concentracin de 2-clorofenol
cada nueve das en cuatro ocasiones durante dos meses, incubando en agitacin hasta que el cultivo
estuvo turbio, indicando el crecimiento celular.

NOMBRE DEL EQUIPO Y SU RANGO DE ONDA

La remocin del 2-clorofenol fue monitoreada con un espectrofotmetro: sprectroquant pharo 300Merck a
travs de una lectura del espectro UV.
Leyndose en intervalos de longitudes de onda de 200-450 nm. Se obtuvieron los espectros de la primera
derivada para evaluar la existencia de intermediarios.

Previamente se seleccion la longitud de onda de trabajo realizando un barrido espectral entre 200 y 700
nm a la longitud de onda donde se encontr el mximo de absorcin se realiz la lectura de la curva de
calibracin graficando do (densidad ptica) vs c (concentracin en mg/l). la curva de calibracin se realiz
con los
Estndares en el rango de 3-150 mg/l de 2-cf (ver figura 1). el porcentaje de degradacin se calcul
segn la frmula: (1) todas las lecturas se realizaron contra blanco de medio MMS sin el compuesto
aromtico

RESULTADOS Y DISCUSION
Los aislados conservados en medio agar nutriente, se utilizaron para conocer la capacidad que tienen
estas bacterias sin adaptacin para degradar el compuesto orgnico estudiado. Para esto, los aislados

seleccionados fueron inoculados en MMS suplementado con 200 mg/L de 2-CF, buscndose en el mismo
el cambio de coloracin del medio indicativo de la acumulacin de algn intermediario.
Al evaluar los espectros obtenidos de los aislados se encontr una disminucin de la intensidad de la
banda de absorcin con longitud de onda mxima a 274 nm, donde absorbe el 2-CF, a medida que
transcurri el tiempo.

Comportamiento de los espectros UV y de su primera derivada en el tiempo durante la

degradacin del 2-clorofenol por RS-11 sin adaptar sembrado en MMS con 2-CF 200 mg/L.

Comportamiento de los espectros UV y de su primera derivada en el tiempo durante la

degradacin del 2-clorofenol por RS-13 sin adaptar sembrado en MMS con 2-CF 200 mg/L.

Los resultados al final del experimento (268 h, 11 das) mostraron un porcentaje de degradacin del 2clorofenol de aproximadamente 25-30 % en ambos aislados existiendo diferencias significativas con los
resultados del inicio del experimento. Los resultados mostraron que los aislados evaluados, an sin
adaptar, son capaces de degradar el txico ensayado pero requiriendo un tiempo ms prolongado.

Evaluacin de la degradacin del 2-clorofenol por los aislados microbianos luego de la adaptacin
El comportamiento de los mximos de absorbancia de los espectros mostr una disminucin de estos a
los 12 das (288 h) existiendo una diferencia significativa con el valor inicial

Comportamiento de los espectros UV y de su primera derivada en el tiempo durante la

degradacin del 2-clorofenol por RS-11 adaptado sembrado en MMS con 2-CF 300 mg/L.

Comportamiento en el tiempo de los espectros UV y de su primera derivada durante la

degradacin del 2-clorofenol por RS-13 adaptado y sembrado en MMS con 2-CF 300 mg/L.

Cuando se calcul la concentracin del 2-CF a los diferentes tiempos se apreci una disminucin de esta
en las condiciones ensayadas observndose en este caso, adems, un porcentaje de degradacin del 56
% por RS-11 y 71 % por RS13, existiendo diferencias significativas entre los resultados del inicio y el final del experimento, as como
los resultados obtenidos con los aislados sin adaptar para el mismo perodo de tiempo.
Lo anterior permiti afirmar que la estrategia de adaptacin fue adecuada. La degradacin del 2-CF se ha
documentado que sigue la va de los clorocatecoles con la formacin del 3-clorocatecol. Si la ruptura del
3-clorocatecol ocurre por la va meta, posicin extradiol, el producto formado se ha informado que se une
de manera irreversible con la enzima que debiera degradarlo (clorocatecol-2,3-dioxigenasa), impidiendo
su accin o da lugar a un intermediario altamente reactivo que hace el mismo efecto pero antes libera
cloro, aunque no la cantidad esperada, indicando degradacin incompleta.
El intermediario formado se acumula en el medio de cultivo dando una coloracin parda. Este ltimo
compuesto ya no puede utilizarse como fuente de carbono, por lo que el microorganismo est obligado a
crecer a expensas de otra fuente alternativa, de lo contrario, perece.
Si ocurre por medio de la va orto, el 3-clorocatecol se rompe en la posicin intradiol, mediante la
clorocatecol-1,3-dioxigenasa, llegando a formar el 3-oxoadipato, logrando que el 2-CF se degrade de
manera completa, pues a partir de este se genera una serie de intermediarios que entran al ciclo de los
cidos tricarboxlicos.

En los experimentos realizados, el medio ensayado se mantuvo transparente o ligeramente turbio blanco
con el crecimiento del microorganismo, lo cual indic que no se estuvo acumulando en el mismo ningn
intermediario coloreado.
La observacin anterior se interpreta como ocurrencia de una degradacin completa, la que, segn la
literatura, generalmente solo es posible cuando el 3-clorocatecol formado es degradado por la va orto.
Cuando se calcul la concentracin del 2-CF a los diferentes tiempos se apreci una disminucin de esta
en las condiciones ensayadas, observndose un porcentaje de degradacin del 56 % por RS-11 y 71 %
por RS- 13, existiendo diferencias significativas entre los resultados del inicio y el final del experimento,
as como los resultados obtenidos con los aislados sin adaptar para el mismo perodo de tiempo
Al analizar ms a detalle el proceso de degradacin, en ambos aislados se observ un mayor por ciento
de degradacin en los tres primeros das; el mismo disminuye en los siguientes tres das y vuelve a
incrementarse en los prximos das (fase de crecimiento exponencial). Esta observacin sugiere que las
bacterias pudieran estar utilizando el compuesto orgnico como fuente de carbono para su crecimiento.
En conjunto con el comportamiento microbiano sugiere que el microorganismo est utilizando este
compuesto como fuente de carbono para su metabolismo.
Es posible que se acumule un intermediario en el interior de la clula que, no obstante, luego se utilice en
la continuacin del proceso para la utilizacin como fuente de carbono, en un momento lentifique el
proceso de degradacin y sea la causa de la demora que se observa entre los 3 y 7 das.
La reduccin de los mximos de absorbancia esperados en los diferentes experimentos ofreci una idea
de la disminucin de la concentracin del compuesto en el medio. La ausencia de otro mximo durante el
transcurso del tiempo puede ser un indicio de la necesidad de reducir los intervalos de toma de muestras
o que la cepa ensayada metaboliz los intermediarios que se fueron formando durante la degradacin del
2-CF incorporndolos en su metabolismo, por lo que se puede sugerir que la degradacin es completa.
Existen dos formas de transformar los compuestos fenlicos clorados: la declorinacin reductiva, que es
tpica de las bacterias anaerobias, las cuales eliminan los tomos de cloro de manera sucesiva por medio
de enzimas dehalogenasas y la declorinacin oxidativa o biodegradacin aerobia, donde se forman,
principalmente los catecoles clorados. Estos ltimos se degradan por las vas orto y meta segn la
ruptura del clorocatecol se haga intra o extradiol, respectivamente.
La degradacin del 2-CF se ha documentado que sigue la va de los clorocatecoles con la formacin del
3-clorocatecol. Si la ruptura del 3- clorocatecol ocurre por la va meta, posicin extradiol, el producto
formado se ha informado que se une de manera irreversible con la enzima que debiera degradarlo
(clorocatecol-2,3-dioxigenasa), impidiendo su accin o da lugar a un intermediario altamente reactivo que
hace el mismo efecto pero antes libera cloro, aunque no la cantidad esperada, indicando degradacin
incompleta.
Si la degradacin ocurre por medio de la va orto, el 3-clorocatecol se rompe en la posicin intradiol,
mediante la clorocatecol-1,3-dioxigenasa, llegando a formar el 3- oxoadipato, logrando que el 2-CF se
degrade de manera completa, pues a partir de este se genera una serie de intermediarios que entran al
ciclo de los cidos tricarboxlicos (figura 9) /21, 20/.
En los experimentos realizados, el medio ensayado se mantuvo transparente o ligeramente turbio blanco
con el crecimiento del microorganismo, lo cual indic que no se estuvo acumulando en el mismo ningn
intermediario coloreado. Ocurriendo una degradacin completa, generalmente solo es posible cuando el
3-clorocatecol formado es degradado por la va orto.

CONCLUSIONES
La degradacin ensayada con los cultivos aislados utilizando la tcnica de espectrofotometra derivativa
no solo demostr que ocurra la degradacin, sino que era necesaria la adaptacin de los

microorganismos al compuesto orgnico para mejorar la velocidad de degradacin del compuesto por los
aislados ensayados.