CARACTERSTICAS MACROSCPICAS DE LOS CULTIVOS

MICROBIANOS, PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACIN,

COLORACIONES DE GRAM Y ZIEHL NEELSEN.

OBJETIVOS
1.

Observar y describir las caractersticas macroscpicas de las

coloniasbacterianas de los cultivos sembrados en la prctica No. 2.

2. Caracterizar colonias bacterianas mediante el uso de algunas pruebas

bioqumicas.
3. Reconocer las coloraciones de Gram y Ziehl Neelsen como tcnicas
rpidas de identificacin bacteriana haciendo uso de los cultivos
sembrados en la prctica No. 2.
MARCO TERICO
MORFOLOGA Y CRECIMIENTO DE LAS COLONIAS
El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite identificar las
bacterias su forma y aspecto caracterstico. Cuando se ha sembrado una
poblacin mixta adecuadamente, a veces es posible identificar la colonia
deseada por su aspecto general y utilizarla para obtener un cultivo puro. Las
colonias crecen normalmente con mayor rapidez en los extremos, donde la
cantidad de recursos disponibles es mayor.
Las colonias bacterianas exhiben diferentes comportamientos en respuesta
al ambiente de crecimiento. Por ejemplo, los Estreptococos se pueden
clasificar teniendo en cuenta su accin sobre los glbulos rojos in vitro. Se
debe observar la formacin de un halo hemolisis alrededor de las colonias
que crecieron en el agar sangre, que puede ser verde transparente.

Cuando no se forma el halo, la colonia queda del mismo color del medio de
cultivo. Ver tabla.
Tabla 5. Clasificacin de los Estreptococos segn el tipo de hemolisis en los glbulos rojos.

Beta hemolticos
Hemlisis
Transparente
en Grupos
agar sangre
Alfa hemolticos
Hemlisis verde en
medio

De

agar

Grupos

sangre
Gamma-hemolticos Grupos
No hemolticos

A (pyogenes) No se considera microbiota

Normal
B (agalactiae)
C
D (enterococo y no enterococo)

F
G
D (enterococo y no enterococo)
Viridans
S. pneumoniae

Aerococcus
D (enterococo y no enterococo
Viridans
Aerococcus

MICROBIOTA NORMAL DEL HUMANO

Dependiendo del tipo de tejido, algunos organismos inocuos u oportunistas
se hospedan nuestro cuerpo.
Tabla 4. Microbiota normal del tracto respiratorio superior y enfermedades que producen

CLASIFICACION
Enterobacterias
Estreptococos
Pneumoniae
Grupo viridans
Enterococos
Estafilococos
Aureus
Epidermidis

LOCALIZACION
PROCESO INFECCIOSO
HABITUAL
Cavidad
oral Neumona,
Abscesos
pulmonares,
Nasofaringe Amgdalas endocarditis, bacteriemia, queratitis
Oral,
Amgdalas, Neumona, Conjuntivitis, Meningitis,
Nasofaringe
Otitis media, endoftalmitis, queratitis
Endocarditis, bacteriemia
Oral, garganta
Oral,
Amgdalas, Bacteriemia,
endocarditis
Nasofaringe

meningitis,

neumona,

Oral,
Amgdalas, Neumona,
otitis,
endocarditis,
Nasofaringe
parotiditis, abscesos, queratitis
Oral,
Amgdalas, Endocarditis, bacteriemia,
Nasofaringe

CLASIFICACION
Corynebacterium
Haemophyllus
Neisseria
No fermentadores
Acynetobacter
Moraxella
Anaerobios
Actinomyces
Arachnia propionica
Bacteroides
Bifidobacterium
Fusobacterium
Lactobacillus
Peptostreptococcus
Propionibacterium
Veionella
Candida

LOCALIZACION
PROCESO INFECCIOSO
HABITUAL
Oral, Nariz, Garganta
Endocarditis, bacteriemia, abscesos
Cavidad
oral Meningitis, conjuntivitis,
neumona,
Nasofaringe
bacteriemia, bronquitis
Oral, nasofaringe
Meningitis
Nasofaringe
Nasofaringe

Conjuntivitis, meningitis
Conjuntivitis, meningitis

Cavidad
oral,
Amgdalas
Actynomicosis, dacriocictitis
Cavidad oral
Actynomicosis
Cavidad
oral, Abscesos y gangrenas pulmonares
Amgdalas
Actinomicosis
Cavidad oral
Abscesos pulmonares,
angina de
Cavidad
oral, Vincent
Amgdalas
Endocarditis
Cavidad oral, saliva
Abscesos y gangrenas pulmonares
Cavidad oral, saliva
Acn, endoftalmitis, endocarditis
Nariz
Endocarditis
Cavidad oral
Cavidad oral, garganta Neumona, Endoftalmitis, queratitis

Desde mediados del siglo XIX Anthony Van Leewenhoek report a la Real
Sociedad Inglesa la presencia del mundo bacteriano, que luego fue
confirmado por los estudios de Louis Pasteur y Robert Koch. Desde entonces
se han estudiado los miles de microorganismos presentes tanto en el cuerpo
humano como en el medio ambiente.
Debido a la importancia de los microorganismos saprofitos y patgenos,
durante el curso de Microbiologa los estudiantes comprobaran
experimentalmente la presencia de bacterias en su cuerpo y en el entorno
que los rodea, empleando para ello los diferentes mtodos de estudio,
ampliamente utilizados, como microscopa ptica, preparaciones en fresco,
coloraciones como la de Gram y Ziehl Nielsen, que permiten diferenciar las
bacterias de acuerdo a la estructura de la pared. Igualmente se cuenta con el
recurso de los cultivos bacterianos, donde se pueden observar
caractersticas morfolgicas de las colonias y trabajar con ellas pruebas
bioqumicas para su caracterizacin.
De otro lado, es evidente que los estudiantes de ciencias de la salud estn
expuestos riesgos biolgicos, en las prcticas hospitalarias, debido a la
elevada concentracin de grmenes patgenos y resistentes, existentes en
las instituciones de salud, razn por la cual se debe promover entre ellos el

autocuidado y la observacin de las medidas de prevencin desde los inicios

de su vida universitaria.
Para el estudio de los microorganismos existen diversas tcnicas de rpida y
sencilla ejecucin como:
I

PRUEBAS BIOQUIMICAS:

Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas

convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto
de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y
que la bacteria al crecer transforma o no. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son
pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada
caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad
enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una
determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de
ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo,
se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador,
etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes
microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de
cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el
microorganismo en estudio es exigente. A la determinacin de la especie se puede llegar
segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.).a) Los
comerciales

utilizan

modificaciones

de

las

pruebas

bioqumicas

convencionales,ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en

reactivos o pequeos compartimentos con medios listos para sembrar. En
todos los casos se emplean cdigos numricos para la interpretacin de resultados.
En esquema, la realizacin de una prueba bioqumica implica:

1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado

sustrato o inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de
un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de
la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin.
2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de
una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica. En
todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en
un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica,
atmsfera y temperatura adecuados.
Si bien existe una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de
identificacin, a continuacin se relacionan las de uso frecuente que desarrollaremos en la
prctica de laboratorio y que constituyen tcnicas directas, fciles y rpidas para una
caracterizacin inicial de cultivos bacterianos:
1. Prueba de Catalasa
2. Prueba de Coagulasa en lmina
3. Prueba de Oxidasa
II COLORACIONES:
La morfologa bacteriana se puede observar ms claramente si las clulas se
someten a coloracin, debido a que las bacterias vivas son casi incoloras y
presentan muy poco contraste con el agua en la cual estn suspendidas. Al
aplicar un colorante a la preparacin microbiana, las bacterias se tien
resaltando con claridad debido a que la composicin qumica es diferente a la
del medio que las rodea. De esta manera se pueden observar las
caractersticas
morfolgicas
y
emplear
mayores
amplificaciones
microscpicas.
Segn la estructura que el colorante tie en la bacteria, las coloraciones se
han clasificado en:
DIRECTAS: Cuando las bacterias son impregnadas por el colorante
directamente.
INDIRECTAS: Se utiliza previamente un mordiente para permitir la fijacin
del colorante a la bacteria.

REGRESIVAS: Despus de un primer tiempo de sobrecoloracin por un

colorante concentrado aplicado con ayuda de calor o por el contacto
prolongado del mismo, en un segundo tiempo se agrega un diferenciador que
elimina el colorante no fijo.
SIMPLE: Se emplea un solo colorante para el proceso.
COMPUESTAS Y DIFERENCIALES: Se utiliza ms de un colorante y con la
misma coloracin, las clulas se tien de manera diferente.
ESPECIALES: Permiten la observacin de estructuras especiales de la
bacteria como esporas, cpsula, flagelos.
COLORACIN DE GRAM:
Es la base de la bacteriologa y uno de los mtodos ms antiguos de estudio
bacteriano. Fue descubierto de una manera fortuita por el histlogo dans
Hans Christian Gram en el ao 1833, al querer diferenciar un Neumococo de
una Klebsiella pneumoniae. Ms tarde fue aplicado por Roux para la
identificacin de especies, convirtindose rpidamente en la base de la
clasificacin bacteriana.
Este mtodo incluye 4 etapas:
1. Coloracin primaria con un colorante trifenilmetano como el cristal violeta,
que suele contener un mordiente como el oxalato de amonio.
2. Aplicacin de solucin yodada diluida de lugol.
3. Decoloracin con alcohol acetona
4. Coloracin de contraste con fucsina bsica.

De acuerdo a este mtodo las bacterias se clasifican en dos grupos:

GRAM POSITIVAS: aquellas que presenta un color violeta
GRAM NEGATIVAS: color rosado.
En las bacterias es fundamental conocer la reaccin a la coloracin de Gram,
ya que este dato implica estructura y composicin qumica de la pared
bacteriana y la reaccin de la bacteria frente a agentes fsicos y qumicos.

Tabla 3. Reacciones de la bacteria frente a la coloracin de Gram.

GRAM POSITIVAS
CRISTAL VIOLETA (CV)
Colorante bsico
LUGOL SOLUCION YODO
YODURADO (I)
Fijador

ALCOHOL ACETONA
Decolorante

Bacteria violeta

Bacteria violeta

Se forma complejo CV-I

Se forma complejo CV-I

Bacteria violeta

Bacteria violeta

Deshidratacin
de paredes
celulares,
retraccin
de
poros,
disminucin
de
permeabilidad, presencia de
complejo CV-I

Extraccin de lpidos de
la
pared,
mayor
porosidad, se
libera el
complejo CV-I

Bacteria violeta
FUCSINA BASICA
Colorante de contraste

1min

Enjuague

Bacteria violeta

1min

GRAM NEGATIVAS

Enjuague

10-15 seg

Bacteria incolora
Bacteria rosada

Enjuague

30 seg

En cada uno de los pasos, antes de adicionar el siguiente colorante se debe

enjuagar la placa, retirando el colorante no directamente desde la llave del
agua sino con la ayuda de un recipiente, de lo contrario se retirara la
muestra del portaobjetos.

COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN
Se utiliza para los bacilos que tienen la propiedad de resistir la decoloracin
por cidos y alcohol, todas las Mycobacterias y las Nocardias presentan esta
caracterstica.
Debido a su alto contenido lipdico y ceroso las paredes celulares de las
Mycobacterias tienen la capacidad nica de ligarse a la fucsina, no siendo
decoloradas por el cido alcohol. Por sta razn los microorganismos que
tienen la propiedad antes descrita se denomina bacilos cido alcohol
resistentes (BAAR).
III FIJACIN:
Es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posicin las estructuras
internas y externas de las clulas de los microorganismos. Inactiva enzimas
que podran alterar la morfologa celular y endurece las estructuras celulares,
de manera que no cambien durante la tincin y la observacin. Normalmente
durante la fijacin se destruye al microorganismo y se fija firmemente al
portaobjetos. Existen 2 clases de fijacin fundamentalmente diferentes:
1)
Fijacin con calor : Este mtodo conserva adecuadamente la
morfologa general, pero no las estructuras internas de la clula.
Consiste en pasar suavemente los bordes de la lmina portaobjetos
con la preparacin secada previamente al aire por la llama del
mechero 3 4 veces.
2)
Fijacin qumica para proteger la subestructura fina y la morfologa de
microorganismos delicados de mayor tamao. Los fijadores qumicos
penetran las clulas y reacciona con componentes celulares, normalmente
protenas y lpidos, para inactivarlos y convertirlos en solubles inmviles,
ejemplo: etanol, cido actico, formaldehdo.

MATERIALES Y REACTIVOS

Cultivos sembrados en prctica 1

Saliva recogida previamente en frascos desechables
Asas bacteriolgicas
Pipetas pasteur
Lpiz de cera
Cinta de enmascarar
Fsforos
Mechero
Solucin salina 0.9%
Perxido de hidrgeno 3%
Tiras reactivas de Oxidasa
Plasma
Colorantes de gram
Colorantes de Ziehl Neelsen

Laminas porta y cubre objetos

Aceite de inmersin
Recipiente con Hipoclorito al 5% para descartar material
Guantes, gorro, tapabocas, gafas de bioseguridad
Papel para limpiar objetivos de microscopio
Microscopio

PROCEDIMIENTO
Describir las colonias bacterianas de los cultivos sembrados en la prctica
No. 1:
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I. Prueba de Catalasa
La prueba de catalasa es de gran utilidad para observar si se trata de
colonias de Estafilococo o de Estreptococo. Esta enzima est presente en los
Estafilococos y ausente en los Estreptococos y cataliza la siguiente reaccin:
CATALASA
2H2O2 ----------------------------- 2H2O + O2
Para realizar la prueba de catalasa proceda de la siguiente forma:

1. En una lmina portaobjetos colocar una gota de perxido de hidrogeno 3%

2. Con el asa en punta tomar una pequea colonia del cultivo a examinar

3. Emulsionarla sobre la gota de perxido de hidrogeno 3%

4. Observar si hay presencia de burbujas para organismos catalasa positivos.

Marque con una X sus observaciones:

Produccin de burbujas: Si
No
Clasificacin preliminar:__________________________________________

II. Prueba de Coagulasa en lmina

Para identificar la especie de Estafilococo se realiza una prueba de
coagulasa (enzima que coagula el plasma sanguneo). Esta prueba es til
para distinguir las especies de Staphylococcus, siendo aureus coagulasa
positivo y epidermidis negativo.

1. En una lmina portaobjetos colocar una gota de plasma sanguneo

2. Con el asa redonda tomar una pequea colonia del cultivo a examinar

3. Emulsionarla sobre la gota de plasma sanguneo en el portaobjetos

4. Observar si hay formacin de grumos o cogulos para determinar si la

prueba es positiva o negativa
Formacin de grumos: Si
No
Clasificacin preliminar:__________________________________________

III. Prueba de Oxidasa

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La
reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema
citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por
el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la
especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de
electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el
sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios,
algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo,
pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.

Se investiga la presencia del enzima citocromo-oxidasa en la bacteria en

estudio.

1. Utilizamos tiras de papel impregnadas con el reactivo para-amino-Ndimetil-anilina, que se oxida por la citocromo-oxidasa.
2. El procedimiento consiste en impregnar la zona coloreada de la tira
reactiva con una colonia de bacterias tomada del cultivo con asa redonda.
3. Se observa si en el transcurso de un minuto la zona impregnada vira a un
color azul-violeta.

IV. Coloracin de Gram

Es la base de la bacteriologa y uno de los mtodos ms antiguos de estudio
bacteriano. Fue descubierto de una manera fortuita por el histlogo dans
Hans Christian Gram en el ao 1833, al querer diferenciar un Neumococo de
una Klebsiella pneumoniae. Ms tarde fue aplicado por Roux para la
identificacin de especies, convirtindose rpidamente en la base de la
clasificacin bacteriana.
Este mtodo incluye 5 etapas:
Previamente se realiza frotis en portaobjetos de colonia de cultivo
emulsionada en una gota de solucin salina y seca a temperatura ambiente,
la cual se fija a llama de mechero antes de proceder con las siguientes
etapas de coloracin:
1. Coloracin primaria con un colorante trifenilmetano como el cristal violeta,
que suele contener un mordiente como el oxalato de amonio, dejar actuar por
1 minuto y enjuagar con agua.
2. Aplicacin de solucin yodada diluida de lugol, dejar actuar por 1 minuto y
enjuagar con agua.
3. Decoloracin con alcohol acetona, dejar actuar entre 10 y 15 segundos y
enjuagar con agua.
4. Coloracin de contraste con fucsina bsica o safranina, dejar actuar por 30
segundos y enjuagar con agua.
5. Dejar secar a temperatura ambiente y mirar al microscopio.

De acuerdo a este mtodo las bacterias se clasifican en dos grupos:

GRAM POSITIVAS: aquellas que presenta un color violeta
GRAM NEGATIVAS: color rosado.
En las bacterias es fundamental conocer la reaccin a la coloracin de Gram,
ya que este dato implica estructura y composicin qumica de la pared
bacteriana y la reaccin de la bacteria frente a agentes fsicos y qumicos.

Tabla 3. Reacciones de la bacteria frente a la coloracin de Gram.

GRAM POSITIVAS
CRISTAL VIOLETA (CV)
Colorante bsico
LUGOL SOLUCION YODO
YODURADO (I)
Fijador

ALCOHOL ACETONA
Decolorante

FUCSINA BASICA
Colorante de contraste

GRAM NEGATIVAS

Bacteria violeta

Bacteria violeta

Se forma complejo CV-I

Se forma complejo CV-I

Bacteria violeta

Bacteria violeta

Deshidratacin
de paredes
celulares,
retraccin
de
poros,
disminucin
de
permeabilidad, presencia de
complejo CV-I

Extraccin de lpidos de
la
pared,
mayor
porosidad, se
libera el
complejo CV-I

Bacteria violeta

Bacteria incolora

Bacteria violeta

Bacteria rosada

Observar con objetivo de 100X y clasificar las bacterias segn la coloracin

de Gram y la morfologa:
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V. Coloracin de Ziehl-Neelsen
Realizar previamente extendido de saliva en portaobjetos y dejar secar a
temperatura ambiente, una vez seca la muestra, fijar a llama de mechero y
proceder con la coloracin, as:

a. Cubrir el frotis con fucsina fenicada, durante 20 segundos.

b. Caliente con mechero varias veces la placa por debajo hasta observar la
emisin de vapores, sin dejar hervir por 5 minutos, adicionar colorante en
caso de derramarse o evaporarse.
c. Lavar con agua corriente.
d. Aplicar alcohol cido hasta decoloracin total aproximadamente 30 seg a
1 minuto y lavar con agua.
e. Aplicar solucin de azul de metileno por 3 minutos y lavar con agua.

Observar con objetivo de 100X y clasificar las bacterias segn la coloracin

de Ziehl-Neelsen y la morfologa:
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CUESTIONARIO
1. Qu es una colonia y de cuntos microorganismos est formada
aproximadamente?
2. Qu significa UFC?
3. Por qu se observan las colonias de diversos colores en los diferentes
agares?
4. Por qu las bacterias Gram positivas fijan el cristal violeta?
5. Cul es el fundamento de las tcnicas microbiolgicas de identificacin
catalasa, coagulasa y oxidasa desarrolladas en la prctica?
6. Establezca las diferencias entre la pared celular Gram positiva y Gram
negativa
7. Cules son las bacterias consideradas cido alcohol resistentes? Cul
es la razn bioqumica de dicha resistencia a la coloracin de Gram?
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