Lipasa termoestable de Bacillus pumilus GMA1: Produccin fermentativa y algunas propiedades

Patricia Wong y Amelia Farrs

Departamento de Alimentos y Biotecnologa, Facultad de Qumica, UNAM
Circuito de la Investigacin s/n. Conj.E lab. 312 Cd. Universitaria
Coyoacn 04510, Mxico, D.F. Fax. 56-22-53-09, farres@servidor.unam.mx

Palabras clave: lipasa, termorresistencia, Bacillus pumilus.

Introduccin. Las lipasas son enzimas que catalizan la
hidrlis is de triacilgliceroles en una interfase aceite/agua,
cuya actividad depende de la naturaleza de la propia enzima
as como de las condiciones de ensayo (1). El
microorganismo de estudio, Bacillus pumilus GMA1, fue
aislado en las aguas termales de Los Azufres, Michoacn. Su
lipasa presenta actividad a pH 10.5 y 50C, adems de tener
preferencia por cidos grasos de cadena corta. Las lipasas
termoactivas y, en general, aqullas que presentan actividad
en ambientes extremos, han cobrado importancia industrial
dado que sus caractersticas las hacen ms adecuadas para
procesos que requieren de condiciones que resultan
UI/mL). El perfil electrofortico de esta fraccin en un gel
SDS-PAGE al 12% con tincin de plata muestra una banda
en la regin de pesos moleculares de 30 a 20 kDa. Los
resultados del proceso de cromatografa de intercambio
inico permiten detectar dos picos con actividad lipoltica.
Este resultado debe ser corroborado mediante
microsecuenciacin para determinar a cul de las enzimas
presentes en el microorganismo corresponden las secuencias
genticas y enzimticas previamente caracterizadas (2).
1.0 D.O. 1 . 6

--*-- Actividad
desnaturalizantes para la mayora de las enzimas (2). En 0.8
1 . 4

este trabajo se analiza la lipasa de B. pumilus GMA1 con

D.O. (640nm)
1 . 2

0.6
1 . 0

tcnicas bioqumicas con el fin de determinar sus posibles 0.4

0 . 8

aplicaciones. 0.2
0 . 6

Metodologa. B. pumilus se inocul en medio lquido de 0.0

0 . 4

0 2 0 4 0 6 0 8 0

BHI adicionado con tributirina al 1%, y se incub durante 24 Tiempo (h)

h a 37C. La actividad lipoltica se determin tanto

mediante la titulacin de los cidos grasos liberados como a
travs de un mtodo espectrofotomtrico utilizando o-
nitrofenil-laurato como sustrato. El extracto crudo se
satur con (NH4 )2 SO4 (80%), y el precipitado obtenido se
disolvi en buffer de fosfatos (pH 8.0). Posteriormente se
carg en una columna de Superosa 12, pre-equilibrada con
buffer de fosfatos 0.2 M, pH 8.0. Las fracciones que
presentaron actividad lipoltica se concentraron en Centricon
y se corri un gel SDS-PAGE al 12% para observar su perfil
electrofortico. El extracto enzimtico semipurificado se
caracteriz en cuando a la afinidad por sustrato, perfil de
actividad contra pH y temperatura, especificidad posicional
y actividad en solventes orgnicos.
Resultados y Discusin. El curso de la fermentacin fue
monitoreado mediante la evaluacin del crecimiento celular,
la actividad lipoltica y el pH (Fig. 1). El microorganismo
alcanz su mximo desarrollo a las 24 h de incubacin a
37C, y su actividad lipoltica se manifiesta desde la etapa
lag de crecimiento. Para la determinacin de la actividad
lipoltica mediante los mtodos sealados fue necesaria la
seleccin de las condiciones adecuadas para el ensayo (pH
10.5 a 50C) con el fin de asegurar la estabilidad de la
enzima. El buffer seleccionado fue CHES 50 mM y, en el
caso del mtodo titulomtrico, se utiliz una emulsin de
tributirina al 5% como sustrato El extracto crudo
concentrado con (NH4 )2 SO4 tiene un factor de
enriquecimiento de 7. La subsecuente cromatografa en una
columna de filtracin en gel resulta en la elucin de un pico
a los 10 min, el cual presenta la mxima actividad (9.7
Fig.1 Cintica de crecimiento y produccin de la lipasa de
B. Pumilus GMA1 a 37C en presencia de tributirina al 1%
Conclusiones.
Se determin que una fermentacin de 24 h a pH 7.2 a 37C,
son las condiciones que favorecen una mejor produccin de
la lipasa. La actividad lipoltica mxima del extracto
purificado es de 9.7 UI/mL bajo las condiciones de ensayo.
Se observ que el mtodo titulomtrico es el ms adecuado
para la determinacin de la actividad lipoltica, en relacin al
mtodo con ONFL, dado que este ltimo manifiesta
actividad de esterasas. El microorganismo parece presentar
dos protenas con actividad lipoltica.
Agradecimientos.
A Augusto Gonzlez, Unidad de Medicina Experimental,
Facultad de Medicina, Hospital General.
Bibliografa.
1. Sugihara, A., Tadaki, T. y Tominaga, Y. (1991).
Purification and Characterization of a novel
thermostable lipase from Bacillus sp. J. Biochem.
109:211-216.
2. Bustos, I. (1998). Anlisis del gen que codifica para la
lipasa de B. pumilus GMA1. Tesis. Facultad de
Qumica, UNAM.
3. N. Nawani y J. Kaur (1999). Purification,
characterization and thermostability of lipase from a
thermophilic Bacillus sp. J33. Mol. Cell. Biochem. 206:
91-96