ANLISIS CROMATOGRAFA DE CAPA FINA DE EXTRACTO DE ACEITE

VEGETALES
ANLISIS CROMATOGRFICO
Las tcnicas cromatogrficas se basan en la separacin de las sustancias presentes en una mezcla compleja
al poner sta en contacto con una fase mvil (lquido o gas) y otra estacionaria (slida o lquida) que
permanece fija. Las sustancias van a migrar a travs de la fase estacionaria arrastradas por la fase mvil, a
distinta velocidad segn su afinidad o solubilidad en una u otra fase. Las sustancias ms afines por la fase
estacionaria migrarn ms despacio, y las ms afines por la fase mvil, ms deprisa. Ajustando los
parmetros cromatogrficos, conseguiremos separar todos los componentes. Los tres tipos ms comunes
son la cromatografa en capa fina (CCF), cromatografa de gases (CGL) y la de lquidos (HPLC).
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (CCF)
Se emplea en controles de todo tipo de productos naturales, habindose establecido como mtodo analtico
muy importante en las farmacopeas modernas. Permite identificar de forma rpida y bajo coste los
componentes presentes en un determinado material vegetal. Tambin se puede emplear como mtodo
semicuantitativo.
En un proceso de cromatografa lquida entran en juego, por lo tanto, tres elementos principales: el
adsorbente y su forma fsica de apoyo, el sistema eluyente y su composicin concreta, y finalmente la
muestra a analizar y su naturaleza qumica.
El soporte de la TLC son placas de mximo 20 x 20 cm de vidrio, aluminio o plstico, recubiertas por una
cara de una fina capa de material adsorbente, que tradicionalmente ha sido celulosa, gel de slice, xido de
aluminio o poliamida, y que ltimamente se ha ampliado la gama de posibilidades a slices qumicamente
modificados.
El nmero de sistemas eluyentes son casi infinitos. Mayoritariamente son combinaciones de disolventes de
diferentes polaridades, con presencia ocasional de cidos o bases. El nico requisito que se exige a estos
reactivos qumicos, es que contengan pocas impurezas, y por lo tanto, es redundante decir que su grado de
riqueza sea elevado. Son aconsejables los productos de calidad PA (para anlisis), como mnimo.
Con respecto a las muestras, la mayora de los materiales utilizados en los procedimientos artsticos son
sustancias complejas. Un barniz como el damar, por ejemplo, no es una sustancia qumica pura, sino que
est formado por muchos componentes, los triterpenos, entre otros.
Cuando se siembra una gota de una disolucin de esta resina cerca del extremo de una placa
cromatogrfica, y acto seguido, se sumerge en un determinado sistema eluyente contenido en un recipiente
especialmente pensado para este uso, ste empieza a ascender por capilaridad por encima de la placa (fase
estacionaria) arrastrando la muestra de barniz.
Lo que suceder, transcurridos unos minutos, es que cada componente diferente del damar, se quedar a
una distancia concreta del origen, segn presente ms o menos afinidad por los disolventes de la fase
mvil, dibujando un spot o mancha. El conjunto de todas estas manchas y su distribucin relativa, se
convierte en una especie de huella digital de la resina, que la permite identificar.
La pregunta que surge ahora, es cmo el conservador-restaurador, sabe que ste conjunto de manchas
corresponden precisamente al damar y no a ningn otro barniz. La respuesta est en los patrones.

Dos resinas diferentes como el damar, la almciga, la colofonia, la sandraca o tambin la goma laca,
nunca presentarn la misma composicin qumica, y por lo tanto, siempre se puede encontrar un sistema
eluyente y unas condiciones cromatogrficas concretas que nos permitan obtener distribuciones de
manchas propias y perfectamente distinguibles para cada uno de los barnices.
La forma de actuar, por lo tanto, es cromatografiar junto con la muestra-problema que queremos analizar,
todos aquellos patrones de resinas conocidas que sospechamos que pueden constituir el barniz de nuestra
pieza.
Una vez desarrollada la cromatografa, por comparacin con las huellas digitales obtenidas, podremos
identificar, sin duda, la naturaleza del barniz presente en el objeto artstico.
Es absolutamente recomendable, para obtener buenas identificaciones, sembrar siempre patrones junto a la
muestra que se quiere analizar, para que se desarrollen exactamente con las mismas condiciones y no
utilizar resultados de antiguas cromatografas. Variables como la temperatura o el grado de saturacin de la
cubeta influyen en el proceso, provocando pequeas variaciones en la distribucin de las diferentes alturas
de las manchas.
Es cierto, tal y como dicen Mauro Matteini y Arcangelo Moles, [19] que la cromatografa en capa fina o
TLC presenta el inconveniente de requerir un trabajo prolongado de puesta a punto de las condiciones
operativas: encontrar qu composicin debe tener el sistema eluyente, determinar el tipo de adsorbente a
utilizar y concretar otras condiciones cromatogrficas que veremos ms adelante, todo para la resolucin de
un problema analtico muy concreto. Ahora bien, una vez han sido establecidas las condiciones ptimas, la
cromatografa de capa fina se convierte en uno de los mtodos con ms ventajas de la qumica analtica.
As pues, en el caso de la TLC, una posible colaboracin entre ciencia y restauracin podra ir por el
siguiente camino: primero, el cientfico investiga y encuentra las condiciones operativas ptimas (pone a
punto una metodologa) para resolver un determinado problema, por ejemplo, la identificacin de barnices.
Una vez encontrada, la presenta al conservador-restaurador traducida a un sencillo protocolo de anlisis,
que ste puede seguir, l mismo, cada vez que se encuentre en la necesidad de resolver analticamente una
identificacin similar.
CMO SE HACE UNA CROMATOGRAFA EN CAPA FINA?
Protocolo estndar de desarrollo cromatogrfico TLC
1- Segn las condiciones operativas de cada metodologa, se puede necesitar un tratamiento previo de la
placa, o no. Puede tratarse de:

Activacin dentro de la estufa a 120 C durante 30 minutos para eliminar toda el agua adsorbida.

Limpieza previa para eliminar impurezas, haciendo ascender por la placa el mismo sistema eluyente
que se utilizar en la cromatografa, pero sin haber sembrado las muestras.
2- Preparacin del sistema eluyente en las proporciones indicadas. Acostumbran a ser suficientes entre 25 y
50 ml en total. Se introduce en la cubeta, de manera que el nivel del lquido no quede por encima de 1 cm
de altura. Si hace falta, se vierte una cantidad controlada del eluyente dentro de la cubeta tapada, durante un
tiempo determinado, para que tenga lugar el equilibrio entre las fases del lquido y vapor (saturacin de la
cubeta).
3- Con ayuda de un lpiz se hace una lnea a unos 2 cm de uno de los lados de la placa. sta ser la lnea de
base sobre la cual se sembrarn todas las preparaciones. Se marca tambin un nmero de referencia para
cada muestra y para cada patrn.
4- Se procede al sembrado de muestras. Con la ayuda de una micropipeta capilar se deposita la cantidad
estimada de cada muestra y patrn. Normalmente se utilizan entre 1 y 10 microlitros. Para que el rea de la
mancha no sea demasiado grande, es preferible hacer deposiciones sucesivas de 1 microlitro, ms que 5
microlitros de una vez, por ejemplo.
5- Para favorecer una mejor resolucin del proceso cromatogrfico, hace falta que el disolvente con el que
hemos preparado muestras y patrones, se evapore totalmente antes de iniciar la cromatografa. Podemos

forzar esta evaporacin con un secador de aire. No obstante, hay que ir con cuidado y no transmitir
demasiado calor a las muestras.
6- Se introduce la placa, dentro de la cubeta, teniendo en cuenta que no hay que tenerla destapada ms
tiempo de lo estrictamente necesario. Se deja que el eluyente ascienda por la placa hasta una altura tal que
falten 1 o 2 cm para llegar al extremo superior. O si ya se tiene el tiempo controlado, se deja transcurrir el
tiempo que indica el protocolo.
7- Una vez transcurrido el tiempo necesario, se saca la placa de la cubeta y, antes de que los disolventes se
evaporen, se marca la lnea dnde ha llegado el frente del sistema eluyente. Se deja acabar de evaporar a
temperatura ambiental, hasta que la placa est bien seca.
8- Si los compuestos no son visibles ni con luz natural ni con luz UV, hace falta hacer un proceso de
revelado qumico, rociando sobre la placa un producto revelador. El revelador es una sustancia capaz de
reaccionar qumicamente con los compuestos cromatografiados, dando productos de reaccin que adsorben
en la zona visible, y por lo tanto presentan color, o en la zona UV, siendo semillas observables con
lmparas de Wood. Este paso es aconsejable hacerlo en cabinas de extraccin de gases y con elementos de
proteccin personal.
9- Se visualizan los resultados obtenidos, a simple vista o con luz UV. Se documenta fotogrficamente el
cromatograma, o grficamente, resiguiendo los spotsobtenidos con lpices, en caso de sustancias lbiles o
no visibles. Tambin se puede hacer una documentacin numrica, calculando los valores Rf de cada
mancha obtenida, o lo que es lo mismo, de cada componente cromatografiado.
El valor Rf para una mancha determinada se define as:
distancia recorrida por cada mancha i
distancia recorrida por el frente del eluyente
Acto seguido se presenta el diagrama de flujo a seguir, para resolver un problema analtico de
identificacin que se le puede presentar al conservador-restaurador.
Rfi=

acotacin de la NATURALEZA QUMICA

de la MUESTRA a analizar

colorante

aglutinante
proteico

goma vegetal

cera

resina

eleccin de la METODOLOGA adecuada

PREPARACIN DE LA MUESTRA
obtencin
extraccin
eleccin de los PATRONES
preparacin de los patrones
DESARROLLO CROMATOGRFICO

CROMATOGRAFA DE GASES (CGL)

La cromatografa de gases o cromatografa gas lquido (CGL) se emplea para sustancias voltiles o
volatilizables, como son los aceites esenciales. Se emplea como fase mvil un gas, y como fase
estacionaria un lquido contenido en una columna capilar, de dimetro muy pequeo y varios metros de
longitud, que va enrollada en el interior del cromatgrafo. Se trabaja a alta temperatura, para que los

componentes de la mezcla se mantengan volatilizados. Es la tcnica ms selectiva y la recomendada por la

Farmacopea Europea como el mtodo estndar para el anlisis los mismos. Permite separar e identificar
aceites esenciales, alcanfor, cidos vegetales, algunos alcaloides como los del opio y tabaco, resinas de
cannabis, y compuestos esteroideos como sapogeninas y hetersidos cardiotnicos. Es un mtodo a la vez
cuantitativo y cualitativo. Esta tcnica, acoplada con Espectrometra de Masas (GC-MS), permite obtener
el espectro de masas de cada componente, con el cual se obtiene el peso molecular e informacin
estructural. Existen bases de datos con los espectros de masas de muchos componentes. Ms recientemente
se han desarrollado columnas cromatogrficas quirales para la separacin de componentes pticamente
activos.
iii. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
HPLC son las siglas en ingls de High Pressure Liquid Chromatography. Esta tcnica permite separar e
identificar molculas de estructura qumica muy similar, incluso ismeros. Se aplica a compuestos no
voltiles, como hetersidos, alcaloides, lpidos, esteroides, glcidos, flavonoides, y a sustancias
termolbiles, como las protenas y vitaminas. Tanto la fase mvil como la estacionaria son lquidas, de
distinta polaridad, de modo que la separacin de las sustancias ocurre en base a este parmetro. Se trabaja a
temperatura ambiente, pero se bombean las fases mviles a presin. El resultado en ambos casos (CGL y
HPLC) es un cromatograma, que muestra los compuestos separados y el rea del pico de cada uno de ellos,
que es proporcional a su concentracin.

WIGANDIA ECUADORENSIS (HYDROPHYLLACEAE), UNA NUEVA ESPECIE DEL BOSQUE

MUY SECO TROPICAL AL OCCIDENTE DE ECUADOR
Se describe Wigandia ecuadorensis Cornejo, una nueva especie de arbusto o arbolillo, endmica del
fragmentado y disturbado bosque muy seco tropical, en la provincia de Manab, en la costa del Ecuador. Es
parecida a W. urens (Ruiz & Pavn) Kunth s.l., de la que difiere por presentar ovarios ms grandes (58
mm vs. 34 mm); estilos de mayor longitud (1628 mm vs. (4)612(15) mm); estambres con filamentos
completamente glabros versus provistos de pelos hspidos, patentes a retrorsos; y corolas ms grandes (2
3.5 cm), con lbulos divergentes versus corolas ms pequeas (1.21.5(2) cm), con lbulos patentes a ms
o menos reflexos. Por sus cualidades de colonizadora subleosa y elevada tolerancia a los bajos niveles de
precipitacin, esta nueva especie podra ser utilizada para recuperar la vegetacin nativa, y para proteccin
de suelos poco consolidados en las reas de bosque muy seco tropical de la costa de Ecuador y la adyacente
esquina noroccidental de Per.

ANLISIS DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN LOS EXTRACTOS DE

OREGANO
La Lippia origanoides, comnmente conocida como Organo de monte es un
arbusto silvestre nativo de algunos pases de Amrica Central y del norte de Amrica
del Sur, especialmente en la Amazona. Esta especie puede alcanzar 3 m de longitud,
posee hojas ovaladas muy aromticas e inflorescencias en racimo, axilares y blancas.
El presente estudio tiene como objetivo determinar los componentes presentes en el
organo de monte, con un enfoque investigativo en la de la presencia de los
compuestos fenlicos timol y carvacrol a travs de diferentes mtodos de deteccin
de metabolitos.
La composicin qumica del organo de monte presenta contenido de metabolitos
secundarios en la planta se encuentra determinados por muchos factores. Como
principales quimiotipos presentes en el organo de monte se encuentran el timol y el
carvacrol cada una con sus enzimas que dirigen y orientan su biosntesis, terpenos,
eugenol, trans-- bergamoteno, p- cimeno y cariofineno.
Material vegetal

Destilacin del aceite esencial

Extraccin de metabolitos clsica

Extraccin de metabolitos por Soxhlet Belton

Determinacin de la presencia de timol en el extracto.

Cromatografa en capa fina.

Cromatografa en columna.

Evaluacin de la capacidad antioxidante.

Evaluacin de la capacidad antimicrobiana

Anlisis fitoqumico preliminar

Alcaloides: Reactivo Dragendorff, reactivo de Soneshain, reactivo de
Wagner y reactivo de Meyer.
Flavonoides: Ensayo de Shinoda. Reactivos como: Magnesio, acido
clorhdrico (37%), etanol, cloruro frrico e hidrxido de sodio (10%).
Glucsidos ciangenos: cido clorhdrico al 10%, cloroformo y reactivo de
Grignard
Azucares reductores: hidrxido de sodio; pH=11. Prueba de Feling y
Benedict, las cuales utilizan como reactivos: Fehiling A, Fehiling B.
Saponinas: cido actico anhdrido, reactivo de Rosenther y cido
sulfrico.
Triterpenos: cloroformo y anhdrido actico.
Taninos: agua destilada, cloruro de sodio al 2%. Prueba con cloruro
frrico y con ferrocianuro de potasio.
Quinonas: Pruebas con hidrxido de amonio, cido sulfrico y la reaccin
de Bortraguer.
Cumarinas: Hidrxido de amonio.
Glucsidos cardiacos: piridina, nitroprusiato de sodio e hidrxido de

sodio.
Anlisis fitoqumico preliminar
Destilacin del aceite esencial: El rendimiento fue de 2,88%.
Extraccin de metabolitos por Soxhleth Belton y Extraccin clsica: la
extraccin de Soxhleth Belton, se pudo observar un extracto de tonalidad
verde clara, con un leve aroma similar al del aceite esencial extrado. El
extracto de la extraccin clsica posea un color verde muy oscuro

ANLISIS DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN LOS EXTRACTOS DE

ORGANO DE MONTE
(Lippia origanoides)
Evaluacin de la capacidad antioxidante:
Determinacin de la presencia de timol en el extracto: La solucin de timol tena una
absorbancia de 2,975. La prueba de absorbancia con el extracto a la longitud de
onda de 237 nm, se obtuvo un resultado de 2,220.
Se realiz el clculo para determinar el error de absorbancia entre la solucin patrn
y el extracto Soxhleth, de esta manera se obtuvo un valor de 32,86%.
Cromatografa en capa fina y en columna:
Evaluacin de la capacidad antimicrobiana: para el microorganismo del
Staphylococcus con una distancia de inhibicin de 0,7 cm por parte del extracto de
Soxhleth y una distancia de inhibicin de 1,3 para el patrn (norfloxacin).

Dentro de los componentes identificados en los extractos del organo de monte

(Lippia origanoides) se encontr la presencia de glucsidos y triterpenos.
Los ensayos acerca de la presencia de timol fueron positivos pero en bajas
cantidades.
El organo de monte puede contener metabolitos como timol y carvacrol pero debido
a algunos posibles factores; estos no se detectan en gran cantidad ya que sus
propiedades antioxidantes y antimicrobianas fueron relativamente bajas.
Para la evaluacin antimicrobiana se detect una distancia de inhibicin de 0,7 cm
en Staphylococcus, lo que conlleva a deducir que se presenta esta actividad pero con
baja capacidad con respecto al patrn.
Los extractos de organo presentan una capacidad antioxidante y antimicrobiana
aunque en bajos niveles de oxidacin e inhibicin respectivamente.
Qu aprendimos?
Conocimos algunas diferencias entre el organo mediterrneo y el organo de
monte.
Aprendimos a hacer la extraccin de metabolitos a partir de un material vegetal.
Realizamos un anlisis del organo para poder determinar sus propiedades y
compuestos.
Cromatografa en capa fina y columna
Determinacin de timol (prueba patrn)