LP 4-5. Cultivarea i identificarea bacteriilor.

Testarea sensibilitii la antibiotice (antibiograma).

OBIECTIVE
1. S cunoasc scopurile cultivrii bacteriilor.
2. S cunoasc condiiile necesare pentru cultivarea bacteriior: medii de cultur
(definiie, criterii de clasificare, exemple) i condiii de incubare.
3. S tie ce este cultura pur, cum se obine i rolul ei in examenul microbiologic..
4. Descrierea caracterelor de cultur ale bacteriilor.
5. S tie etapele identificarii unei bacterii: caractere microscopice, caractere de cultur,
caractere biochimice, caractere antigenice.
6. S ineleag necesitatea testrii sensibilitii bacteriilor la antibiotice.
7. Antibiograma difuzimetric: definiie, principiu, interpretare rezultate.
I.

CULTIVAREA I IDENTIFICAREA BACTERIILOR

Scopurile cultivrii:
- Medical permite izolarea bacteriilor n cultur pur necesar pentru identificarea
pn la nivel de specie i pentru testarea sensibilitii la antibiotice
- Industrial obinere de antigene, vaccinuri, etc
Cultivarea bacteriilor:
- reprezint creterea i multiplicarea bacteriilor realizat prin nsmnarea (depunere
i dispersie) unui material microbian (inoculum) pe suprafaa/n profunzimea unui
mediu de cultur i incubare (meninere n anumite condiii de temperatur,
atmosfer i timp).
- cultivarea permite obinerea culturilor
Cultura = totalitatea microorganismelor acumulate prin multiplicare ntr-un mediu de
cultur
Cultura pur (tulpina) = format din bacterii de acelai fel
Tulpina= populaie microbian constituit din descendenii unei singure izolri n
cultur pur, pe care cerecettorul o manipuleaz n scopul studierii.
Mediu de cultur
1. Definiie: amestec de substane care ofer nutrieni i condiii fizico-chimice
necesare pentru creterea, multiplicarea bacteriilor i manifestarea proprietilor lor
biologice caracteristice
- nutrieni substane ale cror soluii pot traversa membrana citoplasmatic
- condiii fizico-chimice pH majoritatea bacteriilor necesit pH neutru (7-7,5),
dar pot fi acidofile (pH = 5-5,5) sau bazofile (pH = 8,5-9); presiunea osmotic
majoritatea bacteriilor patogene cresc n medii izotone cu mediul intern al
organismului gazd
2. Condiii minime care trebuie s le ndeplineasc
1

 s fie nutritiv
s asigure condiiile fizico-chimice (pH, presiune osmotic)
s fie steril
s permit vizualizarea culturii
3. Clasificare dup:
a. Proveniena nutrienilor empirice (din produse de origine animal/vegetal) i
sintetice (ingrediente pure)
b. Valoarea nutritiv simple (extract de carne, proteine, sare) pentru bacterii
nepretenioase nutritiv i mbogite (extract de carne, proteine, sare + snge, ser,
ou) pentru bacterii pretenioase nutritiv
c. Consisten
Lichide repartizate n eprubete/baloane; indicaii produse monomicrobiene,
evideniere caractere biochimice;
Solide repartizate n cutii Petri/eprubete; indicaii pe aceste medii se pot
obine colonii izolate (cultura pur) necesare pentru identificare i testarea
sensibilitii la antibiotice
1 colonie (1 clon) este format din bacterii de acelai fel (cultura pur) care
rezult prin multiplicare pornind de la o bacterie/un mic grup de bacterii numit
unitate formatoare de colonii (UFC).
De explicat tehnica nsmnrii n 4 cadrane.
Semisolide repartizate de regul n eprubete; indicaii observarea
mobilitii bacteriilor, caracterelor biochimice sau pentru conservarea tulpinilor
d. Scopul utilizrii
Medii de izolare
uzuale: satisfac exigenele nutritive pentru numeroase bacterii; indicaii
produse monomicrobiene, polimicrobiene cu apreciere calitativ i/sau cantitativ;
selective: medii solide care conin substane (ex. antibiotice) cu efect
antimicrobian asupra microorganismelor asociate, dar fr efect asupra celor a
cror izolare o urmrim; indicate pentru izolarea preferenial a anumitor specii
dintr-un produs polimicrobian
difereniale: medii solide (agarizate) care conin substratul pentru o enzim
microbian caracteristic i un indicator de culoare (indicator de pH) care arat
atacarea acelui substrat; un caracter metabolic poate diferenia microorganisme cu
colonii identice pe mediile de cultur uzuale (permit diferenierea pe culturi primare
hemoliza streptococi, enterobacteriacee lactozo pozitiv/lactozo negativ);
de mbogire: medii lichide care favorizeaz multiplicarea unor
microorganisme i inhib flora de asociaie; se utilizeaz ca etap premergtoare
epuizrii pe medii selective, pentru izolarea unui organism aflat n numr redus
ntr-un produs polimicrobian.
Medii de identificare: medii care conin substratul activitii unei enzime
microbiene i un indicator adecvat care evideniaz modificarea acestui substrat n
cursul cultivrii bacteriei cercetate
2

 Medii pentru testarea a sensibilitii la antibiotice

Medii de transport: sunt medii lichide sau semigelificate care asigur
supravieuirea microrganismelor fragile din momentul recoltrii pn n momentul
nsmnrii probelor
Medii de conservare
Cultivarea (nsmnarea i incubarea culturilor) i izolarea bacteriilor n cultur
pur
Tehnica uzual de cultivare a bacteriilor pentru izolarea lor n cultur pur este
nsmnarea materialului microbian prin epuizare pe suprafaa mediilor solide
(insmnarea n 4 cadrane).
Se va efectua demonstrativ.
Inoculum = materialul patologic pe care-l nsmnez
nsmnare = depunerea i dispersia materialului microbian (inoculum) pe/n mediul de
cultur
Incubare = meninerea mediilor de cultur nsmnate n condiii adecvate
(temperatur, atmosfer, timp) necesare dezvoltrii culturii:
Temperatura enzimele i membranele celulare funcioneaz optim ntre anumite
limite de temperatur microorganismele pot fi: psihrofile (0-20C), mezofile
(25-45C), termofile (50-70C);
Atmosfera de incubare microorganismele pot fi: strict aerobe = se dezvolt
doar n prezena oxigenului; facultatativ anaerobe = se dezvolt n
prezena/absena oxigenului; microaerofile = cultiv numai n prezena unor
concentraii reduse de oxigen (5%); carboxifile = necesit pentru cultivare
cantiti de CO2 mai mari (3-5-10%) dect cele din aer (0,03%); strict anaerobe
= se dezvolt doar n absena oxigenului;
Timp microorganismele pot fi cu cretere: rapid cultura apare dup 24-48
de ore de incubare; lent cultura apare dup 3, 4, 7 zile; foarte lent cultura
apare dup 2-4 sptmni, chiar 8-12 sptmni de incubare (ex. Mycobacterium
tuberculosis)
Izolare = operaia prin care o bacterie este obinut n cultur pur (colonii izolate)
Repicaj = nsmnarea ntr-un mediu de cultur proaspt a unei bacterii dintr-o alt
cultur cu scopul de a obine colonii izolate.
Colonie izolat (cultur pur) necesar pentru identificarea bacteriilor pn la nivel
de specie i testarea sensibilitii la antibiotice (antibiograma).
Necesiti pentru cultivarea bacteriilor = condiii de cultivare:
1. Mediul de cultur n funcie de exigenele nutritive bacteriile care
cultiv pe medii simple sunt bacterii nepretenioase, iar bacteriile care
cultiv doar pe medii mbogite sunt bacterii pretenioase/fastidioase;
pH neutru (marea majoritate a bacteriilor), acid bacterii acidofile;

bazic bacterii bazofile; presiune osmotic bacterii care cultiv pe

medii izotone (majoritatea)/ bacterii halofile.
2. Condiii de incubare (temperatur bacterii psihrofile, mezofile,
termofile; atmosfer bacterii strict aerobe, strict anaerobe, facultativ
anaerobe, microaerofile, carboxifile; timp bacterii cu cretere rapid,
lent, foarte lent)
Caractere de cultur
Dup apariia culturii se studiaz caracterele de cultur n termeni de:
1. Capacitatea bacteriilor de a cultiva pe medii artificiale le difereniaz n bacterii
cultivabile i necultivabile
2. Condiii de cultivare (mediul de cultur, condiii de incubare temperatur,
atmosfer, timp)
3. Aspectul culturii pe medii lichide sau solide
Forma de cultur S sau R
Forma de cultur Mediu lichid
Mediu solid
S
Tulburare omogen
Suprafaa neted, lucioas;
contur circular, net
R
Cultiv sub form de grunji; Suprafaa uscat, rugoas;
las supernatantul clar
contur neregulat
Aspectul coloniilor dimensiune, circumferin, contur, suprafa,
transparen, relief, culoare, consisten, aderen la mediu
4. Eventuale modificri ale mediilor de cultur induse de cultivare ex. hemoliza
pe agar snge, reacii pe medii difereniale, producerea unui pigment difuzibil n
mediu sau a unui miros particular.
Identificarea bacteriilor se realizeaz pe baza urmtoarelor caractere:
1. Microscopice categoria microscopic (caractere morfo-tinctoriale vezi LP 3).
Permit identificarea de regul pn la nivel de familie sau gen (excepional de
specie ex. Clostridium tetani)
2. De cultur condiii de cultivare (n funcie de exigenele nutritive bacterii
pretenioase/nepretenioase), aspectul coloniilor (dimensiune, circumferin,
contur, suprafa, transparen, relief, culoare, consisten, aderen la mediu) i
eventuale modificri ale mediilor de cultur induse de cultur. Permit
identificarea de regul pn la nivel de gen (foarte rar pn la specie ex.
Pseudomonas aeruginosa cnd se manifest tipic).
3. Biochimice (metabolice) n cursul multiplicrii, microorganismele atac, prin
enzimele lor, diferite substrate nutritive; spectrul de activiti enzimatice difer de
la o specie la alta i de la un gen la altul; activitatea enzimelor microbiene este
urmrit prin modificrile pe care le produc asupra substratului corespunztor
nglobat, de obicei, ntr-un mediu de cultur (mediu de identificare, vezi definiia
la medii cultur). Permit identificarea speciei cu un anume grad de
probabilitate.
4

4. Caractere antigenice - microorganismele conin proteine i carbohidrai specifici

pentru o anumit specie sau grup de organisme din cadrul speciei. Pentru a
identifica antigenul se folosesc reacii antigen-anticorp cu seruri hiperimune
(conin anticorpi cunoscui, specifici pentru antigenele bacteriene de identificat vezi pentru detalii LP 6). Caracterele antigenice permit identificarea pn la
nivel de specie sau subspecie a unui microorganism.
5. Caractere genetice determinate prin tehnici moderne de biologie
molecular hibridizare, PCR.

II.

TESTAREA SENSIBILITII BACTERIILOR LA ANTIBIOTICE

A. ANTIBIOTIC
Definiie: este o substan medicamentoas, administrat n terapia infeciilor
bacteriene care produce un efect de inhibare (bacteriostatic) sau de omorre
(bactericid), a crei caracteristic major este toxicitatea selectiv: maxim fa de
microorganisme, minim fa de celulele organismului tratat.
Caliti ideale: s nu fie toxic, s realizeze concentraii active n esuturi, s nu
favorizeze dezvoltarea rezistenei secundare, s aib un spectru suficient de larg, s
nu determine fenomene de sensibilizare, s nu interacioneze cu alte medicamente
admninistrate concomitent i s aib un pre sczut.
inte de aciune:
o inhibarea sintezei peretelui bacterian,
o lezarea membranei citoplasmatic,
o Inhibarea sintezei proteice (ribozomii bacterieni)
o Inhibarea sintezei ADN-ului bacterian.
B. RELAIA BACTERIE ANTIBIOTIC
In vitro este definit prin 2 mrimi:
1. Concentraia minim inhibitorie (CMI) = cea mai mic concentraie de
antibiotic care determin inhibarea vizibil a creterii a unei tulpini bacteriene
(comparativ cu martorii pentru cultivarea tulpinii i sterilitatea mediului). CMI
este constant pentru o tulpin dat?
2. Concentraia minim bactericid (CMB) = cea mai mic concentraie de
antibiotic care omoar cel puin 99,9% din indivizii tulpinii bacteriene testate.
De ce doar 99,9 %?
In vivo pe lng bacterie i antibiotic se adaug n relaie focarul de infecie, mai
exact ne intereseaz s obinem o concentraie activ de antibiotic n focarul de
infecie n urma administrrii acelui antibiotic. Care sunt factorii care condiioneaz
concentraia activ de antibiotic n focarul de infecie?
Pentru necesitile terapeutice curente definim o bacterie n raport cu un antibiotic:
sensibil, intermediar sau rezistent:

Sensibil: atunci cnd CMI a bacteriei la acel antibiotic este cel puin de 2-4x mai
mic dect concentraia medie a acelui antibiotic realizabil n focarul de infecie dup
administrarea de doze uzuale a acelui antibiotic.
Rezistent: atunci cnd CMI a bacteriei la acel antibiotic este mai mare dect
concentraia medie a acelui antibiotic realizabil n focarul de infecie dup
administrarea de doze uzuale a acelui antibiotic.
Intermediar: atunci cnd CMI a bacteriei la acel antibiotic este apropiat de
concentraia medie a acelui antibiotic ce se poate realiza n focarul de infecie dup
administrarea de doze uzuale a acelui antibiotic.

C.

TESTAREA SENSIBILITII LA ANTIBIOTICE (ANTIBIOGRAMA)

Definiie: reprezint cultivarea bacteriei de testat (bacteria cu semnificaie clinic

izolat n cultur pur = tulpina de testat) n condiii standard (inoculum, condiii de
cultivare mediul de cultur, condiii de incubare) n prezena unor cantiti
descresctoare de antibiotic.
n funcie de modul de realizare a gradientului de concentraii de antibiotic,
exist 2 metode de a efectua antibiograma:
Metoda diluiilor: utilizeaz concentraii discontinui descresctoare de
antibiotic, care se obin prin diluii duble succesive n mediu lichid/ mediu solid;
Metoda difuzimetric: utilizeaz concentraii continuu descresctoare de
antibiotic ce se obin prin difuzia antibioticului dintr-un microcomprimat plasat pe
suprafaa unui mediu agarizat.

D. ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRIC
Indicaie metoda standard de testare pentru o bacterie cu cretere rapid, aerob/
facultativ anaerob
Principiu testarea concomitent a mai multor tipuri de antibiotic sub form de
microcomprimate plasate pe suprafaa unui mediu agarizat (mediul standard = agar
Mueller-Hinton) prensmnat n pnz cu bacteria de testat.
Etape
1. Pregtire materiale necesare tulpina de testat (din care realizez inoculum
standard), tulpinile de referin (tulpini de colecie, care nu i-au modificat spectrul
natural de sensibilitate la antibiotice ex. ATCC American Type Culture
Collection), microcomprimate de antibiotice (n concentraii standard), mediu de
cultur standard (agar Mueller-Hinton) i termostat pentru incubarea culturilor n
condiii standard (temperatur, atmosfer, timp);
2. Inoculum prelevm 4-5 colonii ale tulpinii cu seminificaie clinic pentru relizarea
unei suspensii n ser fiziologic cu o densitate de aproximativ 108 UFC/mL, etalonat
cu ajutorul etalonului 0,5 McFarland (scal nefelometric) sau prin utilizarea unui
densimat electronic.
6

3.

4.
5.

nsmnarea se face cu un tampon de vat impreganat cu suspensia bacterian

etalonat (inoculum) pe suprafaa mediului Mueller-Hinton agarizat repartizat n
plci Petri (insmnare n pnz),
Depunerea microcomprimatelor cu antibiotic pe suprafaa mediului nsmnat;
Incubare 37C, aerob, timp de 24 de ore.

n jurul microcomprimatelor de antibiotic se vor forma zone circulare de inhibiie a

creterii. Diametrul zonei de inhibiie este cu att mai mare cu ct CMI al tulpinii
testate (bacteriei) la acel antibiotic este mai mic.
Citirea antibiogramei: se msoar diametrele zonelor de inhibiie pentru fiecare
antibiotic n parte.
Interpretarea antibiogramei difuzimetrice: diametrele msurate pentru fiecare
antibiotic n parte se convertesc n criterii de sensibilitate (S, R, I) cu ajutorul
tabelelor interpretative furnizate de standardul de testare utilizat (CLSI, EUCAST);
Controlul de calitate al antibiogramei difuzimetrice: testarea simultan, n aceleai
condiii, a unei tulpini de referin (ex. ATCC); De reinut! Dac diametrele zonelor
de inhibiie la tulpina de referin se ncadreaz n limitele admise de standard,
putem interpreta rezultatele obinute la tulpina testat, izolat de la pacient.