Sunteți pe pagina 1din 6

UNIVERSITATEA DE VEST VASILE GOLDI, ARAD

FACULTATEA DE MEDICINA GENERAL


MASTER: ANALIZE DE LABORATOR UTILIZATE N DOMENIUL BIOMEDICAL

REFERAT
DISCIPLINA: TEHNICI I METODE DE ANALIZ
DIN PROBE BIOLOGICE
Citometria in flux si aplicabilitatea metodei.
Hematologie

Cadru didactic: Prof. univ. dr. BRATOSIN DANIELA

Masterand: Florea Anca Maria

ARAD
-2016-

Citometria in flux si aplicabilitatea metodei.


Hematologie.

I.

Perspective
Citometria in flux ofera actual posibilitatea evaluarii rapide si simultane a unor parametrii

moleculari la nivel cellular, aflati in suspensii celulare heterogene.


S-a ajuns la aceasta performanta, pornind de la principiul Coulter de numarare si
masurare a particulelor aflate in suspensie intr-o solutie electrolitica (Coulter si Hogg, 1971).
Principiul este valabil si astazi si este intens utilizat in laboratoarele de hematologie dar si in alte
domenii ce necesita numararea de particule.
Primele citometre in flux au avut la baza acest principiu. Astazi se mai foloseste doar
pentru acuratetea informatiei in ceea ce priveste numarul si marimea anumitor celule.
Primul citometru a fost inventat de Mark Fulwlyer denumit atunci ca fiind separator de
celule (Fulwlyer, 1965). De atunci variante imbunatatite au aparut ajungandu-se la performantele
moderne nu doar de separare, ci si de sortare in functie de anumiti parametrii sau caracteristici.
Aceasta metoda moderna a fost dezvoltata pe ramurile aplicative ale hematologiei si
oncologiei, dar a inceput sa fie folosita si in cadrul altor arii precum: farmacie, toxicologie,
ecologie, bacteriologie si virusologie.
II.

Principiu metoda
Citometria in flux permite analiza multiparametrica simultana a unui numar mare de

particule: 5-10000 particule/secunda. Celulele sunt analizate din punct de vedere al


caracteristicilor chimice sau fizice.
Cu ajutorul citometriei in flux sunt obtinute date despre fiecare particula detectata din
suspensia celulara, astfel incat pot fi sortate in fuctie de particularitatile lor metabolice.
Citometrul prezinta mai multe componente:
Sistemul fluidic reprezentat de celulele aflate in suspensie aliniate una dupa alta.
Volumul minim al probei trebuie sa fie de 100 l, iar concentratia suspensiei

celulare trebuie sa fie cumprinsa intre 5*104 si 107 celule/ml.


Sistemul optic format din una sau mai multe surse de lumina (de obicei lumina
laser, dar exista si lampa de mercur) si o serie de lentile pentru focusarea
fasciculului de lumina pe sistemul fluidic (Comas-Riu si Rius, 2009).

Sistemul electronic care receptioneaza impulsurile detectorilor, prelucreaza


semnalul si reda rezultatele sub forma de histograme.

Inauntrul citometrului in flux, celulele in suspensie sunt aflate intr-un curent de fluid
izotonic care transporta celulele aliniate, catre zona de detectie. Aceasta zona reprezinta locul de
interactiune al celulelor cu fasciculul de lumina monocromatic (lumina laser). Lumina emisa este
difuzata de celula in toate directiile, fiind colectata de lentile care o directioneaza care o serie de
filtre ce izoleaza lungimile de unda specifice. Semnalele luminoase sunt detectate simultan de 4
fotodetectori, transformate in semnale electrice, aplificate si convertite in semnale digitale.
Datele digitale sunt analizate cu ajutorul unor computere si programe specifice, informatia
rezultata fiind convertita in histograma. (Brown si Wittwer, 2000)
Citometria in flux furnizeaza informatii despre celule prin doua tipuri de fenomene fizice:
Light scattering reprezentat de difuzia luminii laser la trecerea celulei
In ax (FSC) furnizeaza date despre marimea celulelor, chiar daca nu

exista o corelatie clara intre marimea lor si FSC ( Julia si colab., 2000)
La 900 (SSC) furnizeaza date despre morfologia celulelor (Comas-Riu si
Rius, 2009)

Un exemplu al aplicarii acestui fenomen reprezinta investigarea celulelor din


proba de sange in hematologie:

Granulocitele de dimensiuni mari si cu granulatie puternica formeaza

populatie cu FSC mare si SSC mare.


Monocitele de dimensiuni mari dar cu granulatie mica formeaza

populatie cu FSC mare si SSC mic.


Limfocitele si limfoblastele de dimensiuni reduse formeaza populatie
cu FSC mic si SSC mic.

Rezulta ca doar prin aplicarea acestui fenomen, celulele pot fi separate in


diverse populatii in functie de marime, granulozitate, densitate, etc.

Emisia de fluorescenta a fluorocromilor fixati pe celula, respectiv pe proteina de


interes. La trecerea prin zona de detectie flurocromii emit fluorescenta intrinseca
cu lungime de unda superioara fascicului de lumina laser. Utilizarea
fluorocromilor multipli cu lungimi de unda emise diferite, dar cu aceleasi lungimi

de unda de excitatie permit masurarea simultana a diferitelor proprietatii ale unei

celule (Brown si Wittwer, 2000)


Exista numerosi coloranti (propidium iodide, ficoeritrina, fluoresceina), dar si
numeroase metode de colorare precum: coloratia directa (anticorpul primar este
conjugat la fluorocrom), indirecta (anticorpul primar este recunoscut de un
anticorp secundar specific conjugat la fluorocrom), coloratie intracelulara.

III.

Parametrii masurati prin intermediul citometriei in flux


Lista parametrilor ce pot fi masurati prin intermediul citometriei in flux este in continua

expansiune, metoda dezvoltandu-se de-a lungul timpului.

Marimea celulelor prin FSC, morfologia celulelor prin SSC.

Pigmenti celulari: clorofila, ficoeritrina

Studiul ADN

Studiul ARN

Analiza cromozomilor, a cromatinei si a ciclului cellular

Expresia proteinelor si localizarea lor


Evidentierea si cuantificarea antigenelor de suprafata si intracelulare (cytokine,

mediatori secundari)
Activitate enzimatica
Masurarea potentialul membranar celular, mitochondrial
pH, Ca si Mg intracellular si schimburile ionice
Viabilitatea celulelor si apoptoza
Activitatea de oxido-reducere
Aderenta celulelor (aderenta pathogen-celula gazda)
Rezistenta multipla medicamente in celulele canceroase
IV. Aplicabilitate

Citometria in flux prezinta un spectru larg al aplicabilitatii fiind utilizata in diverse


domenii precum:
Biologie medicala: hematologie, imunologie, oncologie, virusologie,
parazitologie, bacteriologie, endocrinologie
Farmacologie si toxicologie: efectul agentilor imunoterapici, chimioterapici,
antibiotici
Biologie vegetala
Biologie marina
Biotehnologii
V.

Aplicatii de imunofenotipare in hematologie

Dezvoltarea citometriei in flux permite analiza elementelor figurate (eritrocite, leucocite,


trombocite) prin intermediul proteinelor de suprafata si a glicoproteinelor, dar si analiza
markerilor intracelulari cu ajutorul proteinelor intracelulare (Brown si Wittwer, 2000).
Citometria in flux este folosita in mod curent pentru detectarea si cuantificarea
elementelor straine din sange, a unor celule modificate genetic sau a celulelor tinere in raport cu
celulele aflate in stadiul de senescenta.
Un exemplu este reprezentat de identificarea eritrocitelor fetale prezente in sangele
mamei la nastere prin diferentierea lor de celulele F adulte (Bayliss si colab., 1991). Aplicatia are
importanta in cazurile in care mama este detectata ca avand Rh -, cantitatea de hematii fetale
determinand cantitatea de globulina Rh-imuna ce va fi administrata.
Al doilea exemplu il reprezinta diferentierea reticulocitelor si numararea lor. Aceasta
aplicatie a inlocuit tehnica traditionala de numarare a reticulocitelor cu realizare de frotiu, prin
legarea la ARN-ul din celulele mononucleate immature a colorantilor fluorescenti (Davis si
colab., 1995) . Un astfel de colorant este thiazole-orange care leaga molecula de ARN atat din
reticulocite, cat si din plachetele sangvine imature, putand fi astfel determinat gradul de
trombopoieza ( Kienast si Schmitz, 1990).
Insa cel mai bun exemplu in citometria in flux o reprezinta imunofenotiparea utilizata
pentru diagnosticul leucemiilor, a limfoamelor si a HIV. Limfoamele si leucemiile se
diferenteaza prin profilul antigenic ceea ce le face ideale pentru studiul cu ajutorul citometriei in
flux. Interpretarile diagnostic depind de combinatia de antigene, cantitatea de antigen si
intensitatea fluorescentei. Cele mai studiate antigene in leucemii si limfoame sunt CD45, CD4,
CD8, CD20, iar in cadrul HIV CD4 legat la limfocitele T care indica mai multi parametric
precum: statusul imun al pacientului, cantitatea de virus, raspunsul la tratement.

Bibliografie

Bayliss, K.M., Kueck, B.D., Johnson, S.T., Fueger, J.T., McFadden, P.W., Mikulski, D.,
1991. detecting fetomaternal hemorrhage: a comparison of five methods. Transfusion
31:303-7.
Brown, M., Wittwer, C., 2000. Flow cytometry: Principles and Clinical Application in
Hematology. Clinical Chemistry, vol. 46 no. 8 1221-1229.
Comas-Riu, J., Rius, N., 2009. Flow cytometry applications in the food industry. J Ind.
Microbiol. Biotechnol. Aug;36(8):999-1011.
Coulter, W., Hogg, W.R., 1971. Apparatus and method for measuring a dividing particle
size of a particulate system; United States Patent 3557352
Davis, B.H., Ornvold, K., Bigelow, N.C., 1991. Flow cytometric reiculocyte maturity
index: a useful laboratory parameter of erythropoietic activity in anemia. Cytometry
22:35-9.
Fulwyler, M.J., (1965). "Electronic separation of biological cells by volume", Science
150 (3698): 910911
Julia, O., Comas, J., Vives-Rego, J., 2000. Second-order functions are the simplest
correlations between flow cytometric light scatter and bacterial diameter., J Micrbiol
Methods, Mar; 40(1):57-61.
Kienast, J., Schmitz, G., 1990. Flow cytometric analysis of thiazole orange uptake by
platelets: a diagnostic aid in the evaluation of thrombocytopenic disorders. Blood
75:116-21.