Lp 7: Cultivarea virusurilor, rickettsiilor si chlamydiilor

Obiective:
1. Definirea virusurilor - particularitile de cultivare a acestora.
2. Prezentarea regulilor de prelevare a produselor patologice.
3. Izolarea virusurilor n culturi de celule, pe ou embrionate sau pe animale de laborator
(etape, urmrirea replicrii/prezentei virusurilor, cuantificarea ncrcturii virale)
4. Cultivarea rickettsiilor
5. Cultivarea chlamydiilor
1. Virusuri = particule infecioase acelulare, formate dintr-un singur tip de acid nucleic
(ARN/ADN), metabolic inerte, lipsite de orice mecanisme necesare producerii i stocrii
de energie.

nu cresc
nu se divid

Parazite intracelulare absolute

=
Cultiv numai n celule receptive capabile s le replice

2. Reguli de prelevare a produselor patologice

-

Alegerea produsului patologic n funcie de sindromul investigat putem examina:

aspirate (exsudate, secreii, excrete)
lichid de spltura nazal sau/i faringian
materii fecale
secreii prelevate cu tamponul de pe mucoase i din leziuni cutanate
fragmente de esuturi
snge
LCR, etc

Alegerea metodei de recoltare i a momentului prelevrii

probele pentru diagnosticul virusologic direct trebuie examinate ct mai precoce,
n faza acut a bolii (primele 2-3 zile de boal) Explicaie: depistarea virusului la
poarta de intrare

Asigurarea condiiilor optime de transport i conservare:

meninerea viabilitii virusurilor
mpiedicarea dezvoltrii altor microorganisme

Necesitatea mediilor de transport (la care se adaug antibiotice i antifungice)

Refrigerarea probelor (cu unele excepii)
3. IZOLAREA I IDENTIFICAREA VIRUSURILOR
Sisteme de diagnostic:
1

culturi de organ sau culturi de celule;

cultivarea pe embrioni, n dezvoltare;
izolarea pe animale de laborator susceptibile;

I. Izolarea virusurilor n culturi de celule

Tipuri de culturi de celule:
Culturi primare

obinute din esuturi adulte

supravieuiesc 5-6 cicluri de subcultivare

Linii de celule diploide

Linii permanente

obinute din esuturi embrionare

au morfologie i cariotip normal
pot fi subcultivate 40-50 de generaii

provin din tumori canceroase sau din celule normale transformate malign
au morfologie alterat
pot fi subcultivate indefinit

Etape:
Pregtirea suspensiei virale

Inocularea filmului celular

Incubarea

Depistarea i cuantificarea virusului replicat:

a. efectul citopatic rotunjirea i desprinderea celulelor de pe suport, apariia de sinciii,
etc
cuantificarea virusurilor prin metoda plajelor uniti formatoare de plaje
b. apariia n supernatant a unor proteine codificate de virus (e.g., hemaglutinine)
c. adsorbia eritrocitelor pe membrana modificat a celulelor care au replicat virus
d. incluziuni virale = acumulri de virioni sau componente virale n aria celular de
replicare i asamblare a unor virusuri (citoplasm, nucleu) ; ex.: formaiuni rotunde sau
ovalare, bazofile sau acidofile, IC sau/i IN.
e. interferena viral = replicarea virusurilor care cultiv fr efect citopatic este
depistat indirect prin incapacitatea celulelor infectate de a replica un virus cunoscut
citopatogen.
2

f. Depistarea antigenelor prin IF (reactii antigen-anticorp car efolosesc marcajul cu

fluorescein)
g. transformarea celulelor normale n celule canceroase printr-un virus oncogen.
II. Izolarea pe ou embrionate n dezvoltare
Indicat pentru izolarea virusurilor gripale, paragripale, herpetice, poxvirusurilor.
Etape:
n cavitatea amniotic (adaptare)

Inocularea embrionilor
(n vrst de 6-14 zile)

Pe membrana corioalantoid
n cavitatea alantoid (LA produs final pentru indentificare)
pasaje repetate

Incubare la 35 C, 3-5 zile

Depistarea virusului replicat:

moartea embrionului (viabilitatea embrionilor a fost verificat anterior la ovoscop)
apariia de pustule pe membrana corioalantoid (MCA) - poxvirusuri
acumularea de virus (hemaglutinine) n lichidul amniotic / alantoidian RH
(evideniere i titrare de antigen hemaglutinant) virusuri gripale, unele
paramyxovirusuri
Cuantificarea virusului replicat:
- titrarea antigenului viral (H) n lichidul alantoidian (prin RH)
- numrul de pustule formate pe MCA
Identificarea virusului = prin reacia de inhibare a hemaglutinrii (RIH) sau, in cazul unei
tulpini noi: vizualizarea prin ME (ex. SARS un nou coronavirus)
III. Izolarea pe animale de laborator de mici dimensiuni (oarece alb, hamsteri, etc sau
gazde unice: maimue, cimpanzei); rar utilizate (vezi dezavantaje)
Produsul patologic recoltat in funcie de sindromul clinic, prelucrat, se inoculeaz utiliznd
diferite ci de inoculare (de regul, la fel ca poarta natural de intrare): ic, sc, im, etc
Urmrirea replicrii virusului:
Moartea animalului
Reproducerea bolii la animal (ex.: paralizii, tremor determinat de enterovirusuri)
Evidenierea de leziuni histopatologice caracteristice la nivelul organelor int; in
lichidele sau pp recoltate de la animal se evideniaz prezena virusului prin reacii Ag-Ac,
ME (pentru virusurile nou izolate, cercetare, etc)
Cuantificarea virusului replicat msurarea dozei infectante sau letale 50% pentru animale
(DI50 / DL50)= reciproca diluiei de suspensie viral care determin efectul urmrit
(infecie/moarte) la 50% din animalele inoculate.
3

Identificarea = prin reacii Ag-Ac (RN, RIH, RFC)

Dezavantaje:
- Costuri ridicate (infrastructur special, personal, hran, etc)
- Timp ndelungat pentru rezultatul final
- Infecii virale latente cu propriile virusuri
- Reactiviti diferite
- Producerea de Ac care mpiedic expresia clinic
4. Cultivarea rickettsiilor
o sunt bacterii pleomorfe (bacili, cocobacili) cu perete de tip gram-negativ, care se
nmulesc prin diviziune, obligat intracelular, la vertebrate sau artropode;
o cultiv numai n gazde vii: animale de laborator, sacul vitelin al embrionului de gin,
culturi de celule;
o temperatura optim de cultivare n sacul vitelin este de 32 C;
o odat cu creterea temperaturii, rata multiplicrii scade;
o gazdele mai sensibile pentru izolare sunt, n funcie de specie, cobaiul i oarecele.
Diagnostic:
- microscopie: coloraii speciale (pe amprente sau seciuni histologice
din probe bioptice sau necroptice, rickettsiile apar ca fini bacili sau
cocobacili, intracelulari, albatri-purpurii n coloraia Giemsa sau roii
(pe fondul albastru al citoplasmei) n coloraia Macchiavello.
- IF - biopsia tegumentar sau valve cardiace la decedai
Izolarea i identificarea:
- inocularea intraperitoneal, la animalele receptive, a prelevatelor
necontaminate;
- inocularea se face la patul bolnavului;
- dac intervalul de timp se prelungete peste o or, se congeleaz proba
la - 25 C.
- probele contaminate (sput, urin, lapte, suspensii de placent) se
inoculeaz dup tratarea cu penicilin;
Concluzie: datorit dificultilor diagnosticului direct i al infeciozitii crescute, se prefer
diagnosticul serologic (indirect)
5. Cultivarea chlamydiilor
o bacterii cocoide, imobile, adaptate la parazitismul intracelular, au devenit total
dependente energetic de gazd;
o sunt parazii energetici;
o ciclul reproductiv particular (vezi curs)
o cultiv numai n sacul vitelin al embrionului de gin sau n culturi de celule;
o cele mai multe chlamydii cultiv n culturi de celule numai n condiii speciale, care
faciliteaz iniierea infeciei i nmulirea:
Chlamydia trachomatis
i. diagnosticul este n special direct: microscopic, izolare pe culturi de
celule, metode moleculare;
Chlamydophila pneumoniae
ii. diagnosticul direct presupune recoltarea ca PP a exsudatului faringian.

iii. izolare n sacul vitelin (OE) sau pe CC (HeLa, culturi de celule de

maimu -cultiva dificil); dupa incubare 3 zile la 35C se identifica prin
IF (cu Ac monoclonali specific de grup sau specie).
iv. Micro IF mai sensibil
v. diagnosticul, n principal indirect

Chlamydophila psittaci
PP: sput (de regul dup stimulare), exsudat nasofaringian, snge, esut pulmonar
(deces).
Transportul probelor se face n mediu protector adiionat cu antibiotice i antifungice
Microscopia directa si cultivarea: dificile.
Identificare: ELISA cu sensibilitate relative redus, 70-80%; specificitate foarte bun.
PCR: foarte util.
diagnosticul serologic (indirect) mai util