TEHNICA HISTOPATOLOGIC

PENTRU INCLUDERA LA PARAFIN

1 Recoltarea
Pentru a realiza o recoltare n condiii optime, instrumentarul folosit trebuie s fie bine
ascuit, evitnd astfel strivirea esuturilor.
Locul din care se recolteaz proba va fi ales n funcie de contextul lezional i de scopul
investigaiilor. Se prefer zonele reprezentative de la marginea leziunii, n aa fel nct
fragmentul s cuprind att esut modificat ct i normal. Dimensiunile prelevatului vor fi de
aproximativ 1cm3 : 15mm lungime, 10 mm lime i 5- 7mm grosime, pentru ca fixatorul s
ptrund repede n toat proba. Dup o fixare de 24-48 ore, probele vor fi fasonate cu lame
ascuite, noua grosime fiind de 4-5 mm, apoi vor fi introduse n fixator proaspt.
2 Fixarea
Fixarea histologic are un triplu scop:
1. oprirea fenomenelor vitale din esuturile fixate, pentru a surprinde microscopic
aspectele histopatologice existente n pies n momentul respectiv i pentru a preveni
fenomenul de autoliz;
2. ntrirea pieselor fixate n vederea operaiunilor histologice ulterioare;
3. sterilizarea pieselor, majoritatea fixatorilor chimici fiind buni dezinfectani.
Fixarea se realizeaz n flacoane de sticl de 100-200 ml, n care volumul fixatorului
trebuie s depeasc de aproximativ 20 ori pe cel al pieselor din interior.
S-a utilizat ca fixator chimic simplu formaldehida (formol) 10% soluie apoas. S-a
preferat acest fixator pentru capacitatea de fixare prin coagulare a proteinelor structurale, bun
viteza de penetrare, tolerana i intervalul de timp foarte mare pe durata cruia asigur
conservarea.
Pentru extragerea srurilor de calciu (demineralizare) s-a utilizat lichidul Bouin n
compoziia cruia intr 15 pri acid picric, 5 pri formol i o parte acid acetic glacial.
3. Includerea la parafin
Acest timp operator se deruleaz n patru faze succesive:
I. Deshidratarea
Deshidratarea este necesar pentru eliminarea apei din esuturi, n vederea impregnrii
ulterioare n parafin, a pieselor.
1

Deshidratarea s-a executat trecnd piesele prin trei bi cu alcool n concentraii

progresiv crescnde: 80%, 90% i alcool absolut. Durata de meninere a fragmentelor n
fiecare baie a fost de dou ore.
II. Clarificarea
A fost executat n vederea extragerii etanolului din piese, acesta nefiind miscibil cu
parafina.
Operaiunea a fost executat cu dou bi de aceton i apoi dou bi cu benzen, n
fiecare baie cte dou ore.
III. Impregnarea cu parafin
Obiectivul acestui timp operator este de a aduce piesa ntr-o stare de rigiditate i de
omogenitate optim n vederea secionrii.
Operaiunea se realizeaz n termostatul de includere n parafin, la temperatura de
560C, n trei bi de parafin lichid, cte dou ore n fiecare baie.
IV. Includerea propriu-zis
Includerea propriu-zis sau turnarea blocului are drept scop ncorporarea piesei
impregnat cu parafin ntr-un bloc din acelai material.
Turnarea blocului se poate realiza cu ajutorul unor forme din aluminiu care au permis
includerea simultan a 10-12 piese sau n casete speciale cu dimensiuni diferite funcie de
mrimea pieselor de inclus.
4. Secionarea
Secionarea histologic se realizeaz cu ajutorul microtomului (manual sau
semiautomat) pentru parafin care ofer condiii pentru obinerea unor seciuni cu
grosimea de 5-6 m.
n timpul secionrii esuturile incluse n parafin vor fi uor comprimate i vor apare
pliuri, ambele fenomene fcnd seciunile improprii pentru examenul microscopic. Pentru
eliminarea acestui inconvenient se recurge la etalarea secionrilor pe lame de sticl portobiect.
4.1. Etalarea seciunilor
Etalarea se poate realiza, utiliznd acele de disociere, prin dou procedee:
- direct pe lama port-obiect, pe o pictur de ap nclzit la becul de gaz;
- prin scufundarea seciunilor ntr-o baie de ap la 400 -5 00C i preluarea lor de pe
suprafaa apei direct cu lama port-obiect;
2

5. Colorarea
Seciunile au fost colorate prin urmtoarele metode de colorare histologic, n funcie
de scopul urmrit:
- Hematoxilin-Eozin- Albastru de metil (HEA), pentru orientare general;
- Acid Periodic- Fuxin Schiff (PAS), pentru mucopolizaharide i micei.
- coloraia Azan, pentru evidenierea fibrinoidului (rou-portocaliu);
- coloraia Perls, pentru evidenierea compuilor feruginoi (albastru-verzui);
- coloraia Kossa, pentru evidenierea calciului (galben-brun)
1. Metoda Hematoxilin-Eozin- Albastru de metil (HEA) pentru orientare
general
I. Deparafinare:
1. Benzen I - 10 minute
2. Benzen II - 10 minute
3. Benzen III - 10 minute
4. Benzen IV - 10 minute
5. Benzen V - 10 minute
II. Rehidratare
1. Alcool etilic absolut - 10 minute
2. Alcool etilic 90% - 10 minute
3. Alcool etilic 80% - 10 minute
4. Apa robinet - 10 minute
5. Ap distilat - pasaj
III. Colorare
1. Hematoxilin Mayer - 10 minute
2. Ap robinet - pasaj
3. Ap litinat - 10 minute
4. Ap distilat - pasaj
5. Eozin - 10 minute
6. Ap distilat - pasaj
7. Acid fosfomolibdenic 1% - 10 minute
8. Ap distilat - pasaj
9. Albastru de metil 1% - 3 minute
10. Ap distilat - pasaj
3

IV. Deshidratare
1. Alcool etilic 80% - 10 minute
2. Alcool etilic 90% - 10 minute
3. Alcool etilic absolut - 10 minute
V. Clarificare
1. Benzen I - 10 minute
2. Benzen II - 10 minute
3. Benzen III - 10 minute
4. Benzen IV - 10 minute
5. Benzen V - 10 minute
2. Metoda Acid Periodic - Fuxin Schiff (PAS)
I. Deparafinare
II. Rehidratare
III .Colorare
1. Acid periodic 1% - 10 minute
2. Ap robinet - 5 minute
3. Ap distilat - pasaj
4. Reactiv Schiff - 15 minute
5. Ap sulfuroas - 3 minute
6. Ap sulfuroas - 3 minute
7. Ap sulfuroas - 4 minute
8. Ap robinet - pasaj
9. Hematoxilin Mayer - 4 minute
10. Ap robinet - pasaj
11. Ap litinat - 5 minute
12. Ap distilat - pasaj
IV. Deshidratare
1. Alcool etilic 80% - 3 minute
2. Alcool etilic 90% - 3 minute
3. Alcool etilic absolut - 10 minute
V. Clarificare
3. Metoda May- Grnwald- Giemsa (MGG)
I. Deparafinare
II. Rehidratare
4

III. Colorare
1. Soluia May- Grnwald - 5 minute
2. Soluie Giemsa - 15 minute
3. Ap distilat - pasaj
4. Ap acetat 0,5% - 20 secunde
5. Ap distilat - pasaj
6. Alcool metilic 80% - pasaj
IV. Deshidratare
V. Clarificare
6. Montarea. Dup clarificare seciunile se monteaz cu balsam de Canada i apoi se
examineaz la microscopul fotonic.