Incidencias y Mantenimiento en HPLC PDF

Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Traduccin Grupo Biomaster 2009
Crawford Scientific 2007
-1-

1
INTRODUCCIN ................................................................................................................... - 4 -
EL CROMATGRAFO LQUIDO BSICO ....................................................................... - 6 2.1 VOLUMEN EXTRA EN COLUMNA(V0) .......................................................................................... - 9 2.2 CRITERIOS PARA UN MANTENIMIENTO LGICO .................................................................... - 11 2.3 REGLAS DE ORO EN EL DIAGNSTICO DE AVERAS ............................................................... - 12 2.4 PROBLEMAS TPICOS EN HPLC ............................................................................................. - 12 -
LA FASE MVIL .................................................................................................................. - 14 3.1

3.2
3.3
3.4
COMPATIBILIDAD DEL DISOLVENTE Y EQUILIBRADO DEL SISTEMA ...................................... - 14 PREPARACION DE LA FASE MOVIL.............................................................................................-19
DESGASIFICACIN DE LA FASE MVIL .................................................................................. - 33 FILTRACIN DE LA FASE MVIL ........................................................................................... - 40 -
SISTEMAS DE BOMBEO .................................................................................................... - 46 4.1

4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
FUNCIONES DE LA BOMBA .................................................................................................... - 46 BOMBA RECPROCA DE PISTN SIMPLE ................................................................................ - 47 LA BOMBA RECPROCA DE DOBLE PISTN ........................................................................... - 49 LA BOMBA BINARIA DE GRADIENTE ..................................................................................... - 50 LA BOMBA CUATERNARIA DE GRADIENTE ........................................................................... - 51 FORMACIN DE GRADIENTES Y TIEMPO MUERTO (DWELL-TIME) .................................... - 52 INCIDENCIAS DE LA BOMBA .................................................................................................. - 55 -
TUTORIAL 1 ................................................................................................................................... - 61 5 INYECTORES ............................................................................................................................. - 65 5.1

5.2
5.3
COMPONENTES DEL SISTEMA DE INYECCIN ........................................................................ - 65 AUTOMUESTREADORES ......................................................................................................... - 71 INCIDENCIAS DEL AUTOMUESTREADOR ................................................................................ - 76 -
6 COLUMNAS ................................................................................................................................ - 86 6.1
LIMPIEZA, PURGA Y ALMACENAMIENTO DE LA COLUMNA ................................................... - 86 -
6.2
INCIDENCIAS DE LA COLUMNA........................................................................................................................-90-
7. PICOS CON COLA .................................................................................................................... - 96 8. PICOS CON FRENTE .............................................................................................................. - 101 TUTORIAL 2 ................................................................................................................................. - 102 9
DETECTORES .................................................................................................................... - 104 9.1

9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
EL DETECTOR IDEAL ........................................................................................................... - 104 EL DETECTOR UV/VISIBLE ................................................................................................. - 107 INCIDENCIAS Y MANTENIMIENTO DEL DETECTOR UV/VISIBLE .......................................... - 109 PICOS NEGATIVOS............................................................................................................................................-114EL DETECTOR DE LIGHT SCATTERING EVAPORATIVO ......................................................... - 116 EL DETECTOR ESPECTROMTRICO DE MASAS ..................................................................... - 118 -
TUTORIAL 3 ................................................................................................................................. - 125 10.1 LNEAS DE BASE ................................................................................................................ - 128 10.1.1 LNEAS DE BASE ERRTICAS ............................................................................................. - 128 10.1.2
LNEA DE BASE CCLICA (CORTA FRECUENCIA) ........................................................ - 130 10.1.3
LNEA DE BASE CCLICA (LARGA FRECUENCIA)........................................................ - 133 10.1.4
LINEAS DE BASES CON DERIVA ................................................................................. - 136 10.1.5
LNEAS DE BASE CON RUIDO ..................................................................................... - 138 10.2 FORMAS DE PICO .............................................................................................................. - 140 10.2.1
ENSANCHAMIENTO DE LOS PICOS .............................................................................. - 140 10.2.2
DESDOBLAMIENTO DE PICOS Y HOMBROS ................................................................. - 143 10.2.4
PICOS CON FRENTE .................................................................................................... - 151 10.2.5
EFECTO MEMORIA Y PICOS FANTASMA ..................................................................... - 152 10.2.6
PICOS NEGATIVOS ..................................................................................................... - 154 10.3 TIEMPO DE RETENCIN..................................................................................................... - 156 Traduccin Grupo Biomaster 2009
-2-

10.3.1
10.3.2
10.3.3
10.4
10.5
TIEMPOS DE RETENCIN FLUCTUANTES .................................................................... - 156 DECRECIMIENTO DEL TIEMPO DE RETENCIN ........................................................... - 160 AUMENTO DEL TIEMPO DE RETENCIN ..................................................................... - 162 INCIDENCIAS CON LA PRESIN .................................................................................. - 162 SENSIBILIDAD............................................................................................................ - 166 -
-3-
Introduccin
El objetivo de esta seccin es:
Proporcionar una visin general

mantenimiento en HPLC.
Detallar el contenido del curso.
del
curso
de
incidencias y
Contenidos del curso

El Cromatgrafo Lquido Bsico
Criterios para un mantenimiento lgico
Incidencias y Mantenimiento
Buenas prcticas de mantenimiento para;
Fase Mvil
Bomba
Sistemas de Inyeccin
Columnas
Detectores
Diagnstico desde una perspectiva sintomtica

Diagnsticos empleando el cromatograma
parmetros de operacin del sistema;
observando
los
Apariencia de la lnea de base Cromatogrfica.

Apariencia de la forma de los picos
Variacin de los Tiempos de Retencin.
Alteraciones de la presin.
Sensibilidad.
Recuperacin.
-4-
-5-
El Cromatgrafo Lquido Bsico
El objetivo de esta seccin est destinado a:
Ilustrar y describir los fundamentos en cromatografa lquida.

Describir los enfoques para resolver de forma lgica las incidencias en
cromatografa lquida.
Enumerar las "Reglas de Oro" en la resolucin de problemas en HPLC.
Describir los problemas tpicos en HPLC.
La figura anterior muestra los componentes modulares y el recorrido tpico

del flujo en un cromatgrafo lquido. Los mdulos del sistema HPLC estn
conectados a travs de tubos capilares fabricados en material polimrico,
Polieter-eter-cetona (PEEK), o en acero inoxidable.
Para eliminar
volmenes extra en columna que generen picos cromatogrficos anchos, los
mdulos deben conectarse entre s empleando la mnima longitud de tubo
posible.
Botellas de Disolvente
Los disolventes que conforman la fase mvil estn contenidos en botellas
que generalmente se encuentran en la parte superior del sistema HPLC.
Dicha disposicin mejora su suministro, ya que se consigue un descenso
natural de la fase lquida por efecto sifn bajo influencia de la gravedad.
Las botellas de los disolventes deben estar cerradas hermticamente a fin
de prevenir la prdida de solventes orgnicos por evaporacin, aunque
siempre debe existir una pequea abertura para evitar la formacin de vaco
-6-

que dificulte el cebado de la lnea. En un anlisis de larga duracin, la
prdida de solventes orgnicos por evaporacin en el espacio en cabeza
disminuir la fuerza efectiva de elucin de la fase mvil, lo que provocar
cambios en la retencin del analito. Por tanto, debido a efectos por
gradientes en la concentracin y evaporacin parcial de la fase mvil, se
pueden producir cambios a lo largo del tiempo, que provocarn que las
caractersticas de la fase mvil varen de las inicialmente preparadas. Una
buena prctica consiste en cambiar el disolvente usado por disolvente
fresco, en lugar de extremar su consumo a largos periodos que tiempo hasta
casi agotarlos.
Se debe evitar el empleo de film de laboratorio (Parafilm, etc...) para
cubrir las botellas de los disolventes. El material del film contiene ftalatos
y polmeros, que pueden migrar por extraccin con el solvente en el espacio
en cabeza, incrementando el ruido en la lnea de base del cromatograma. El
Espectrmetro de Masas es especialmente sensible a este tipo de
contaminantes que generan picos en la lnea de base de un espectro de
masas obtenido por LC-MS.
La filtracin de los disolventes antes de su uso, especialmente si

estos contienen aditivos como sales tampn y/o reactivos de pares de
iones, asegura la eliminacin de material particulado que puede
daar los componentes del sistema. Adems, es recomendable
instalar en las lneas de disolvente un sistema de filtracin que
prevenga la entrada de partculas al sistema HPLC. Estos filtros estn
hechos a menudo de vidrio; cuando se deba eliminar contaminacin
se lavar primero con cido ntrico concentrado (6M), despus se har
un lavado con H2O, el siguiente lavado se har con MeOH y despus se
har pasar H2O de nuevo, antes de volver a reinstalar el sistema. Los
filtros no deben sonicarse pues el vidrio sinterizado se podra romper
y astillar, bloqueando los filtros y disminuyendo la eficacia del
sistema.
El reciclado de la fase mvil est limitado nicamente a las separaciones
que trabajen en isocrtico, y es ms til en los mtodos empleados para
anlisis de rutina que contengan bajas concentraciones de muestra, como es
el caso de laboratorios de Control de Calidad (CQ). Los componentes de la
muestra se diluyen en la fase mvil de forma que se requieren largos
periodos de tiempo para apreciar trazas significativas de los compuestos en
el cromatograma. Generalmente esto se evidencia como un aumento en la
Lnea de Base y/o Fondo, lo que se traduce en prdida de sensibilidad para
el analito.
-7-
Desgasificador
La eliminacin de gases disueltos en la fase mvil ayuda a prevenir la
formacin de burbujas en el sistema HPLC. Burbujas de aire en la bomba
pueden provocar prdida de eficacia en el cebado de sta, errores en la
formacin de gradientes de disolventes y ruido en la lnea de base debido a
fluctuaciones en la presin. Las columnas del HPLC pueden perder
rendimiento si circulan burbujas de aire a travs de estas debido a la
formacin de canales por presin, estos se saturarn rpidamente con
molculas de analito lo que har perder capacidad de retencin de la
columna por perdida de superficie activa. Las burbujas de aire formadas por
desgasificacin en la celda del detector pueden contribuir al ruido de la
lnea de base, lo que reduce los lmites de deteccin esperados y/o los
lmites de cuantificacin.
La figura anterior muestra los efectos por canalizacin de la columna en

la retencin del analito.
Los disolventes pueden ser desgasificados fuera de lnea antes de su uso, o
como suele ser ms frecuente, mediante incorporacin de un desgasificador
en lnea que permite la desgasificacin in situ de los disolventes.
Bomba HPLC
La bomba del HPLC, o sistema de suministro de disolvente, es la responsable
de conseguir una composicin exacta de la fase mvil a velocidades de flujo
constantes y proporcionar la fuerza necesaria para el transporte de dicha
fase a travs del relleno de la columna. Lo ideal sera que la bomba no
produjese impulsos impredecibles en la presin, por ello la mayora de los
sistemas acostumbran a estar dotados de un mecanismo integrado de
amortiguacin para la presin (Damper) que ayuda a corregir dicho efecto.
-8-
Automuestreador
Es necesario un sistema automatizado que inyecte la muestra en cabeza de
columna del HPLC, sin detener o distorsionar el flujo de la fase mvil.
El muestreador automtico debe minimizar el efecto memoria del analito
entre inyecciones, e incrementar la productividad gracias a funciones
adicionales tales como la capacidad de derivatizar la muestra antes de la
columna, adicin de soluciones de estndar interno, etc
Columna
La separacin cromatogrfica de los componentes de la muestra tiene lugar
a travs de la interaccin especfica entre el analito y la fase estacionaria
de la columna. Para largos periodos de tiempo entre usos, la columna del
HPLC debe almacenarse en condiciones correctas. Las columnas no deben
ser sometidas a excesivo estrs fsico, as como a golpes o cadas, que
pueden alterar el relleno de la fase estacionaria empobreciendo su
rendimiento. Para minimizar variaciones en los tiempos de retencin
absolutos es habitual termostatizar la columna a fin de evitar los efectos
fluctuantes de la temperatura ambiente.
Detector
Existe una gran variedad de detectores, aunque debido a su costo, robustez,
lmites de deteccin y facilidad de uso, el detector ms utilizado es el de
absorbancia UV. Los detectores UV estn disponibles en una sola longitud de
onda, mltiples longitudes de onda o en configuracin de diodo array, que
por su capacidad de analizar la de pureza de picos y de realizar bsquedas
frente a bibliotecas de espectros UV ha llegado a ser muy popular.
Para anlisis que requieran alta sensibilidad y selectividad es preferible el
uso de detectores de fluorescencia, electroqumicos o espectrmetros de
masas. Los detectores de ndice de refraccin son solo aconsejables si el
resto de detectores no son aplicables o si la concentracin del analito es
alta.
2.1 Volumen Extra en Columna(V0)

Una consideracin importante en el diseo de un sistema HPLC es el
volumen extra en columna. El volumen extra en columna representa el
volumen total de todos los componentes del sistema y conducciones
capilares que no estn directamente involucrados en el proceso de
separacin, desde el punto de inyeccin de la muestra hasta la deteccin.
Este volumen extra debe ser minimizado a fin de evitar la formacin de
picos anchos y una disminucin en la eficacia de la columna adems de
perder resolucin cromatogrfica. Por lo tanto;
-9-
Cada mdulo debe ser conectado con la mnima longitud de tubo

capilar y el mnimo dimetro interno posible.
Los sistemas de inyeccin y los detectores deben ser diseados para
tener el volumen interno ms pequeo posible.
La columna debe tener un relleno lo ms uniforme posible con la
distribucin de tamaos de partcula ms estrecha permisible.
Ancho de Pico provocado por un incremento de Volumen-Extra en

Columna
- 10 -
2.2 Criterios para un Mantenimiento Lgico

Hay dos enfoques que pueden ser utilizados para identificar problemas en
cromatografa lquida:
Perspectiva desde los Componentes

Tras identificar el problema, cada componente que pueda contribuir a ello o
ser la causa del fallo, se examina de nuevo. Cada componente examinado
se limpia o se reemplaza segn convenga y mediante el sistema de chequeo
del HPLC en cada etapa se identifica si el problema ha sido corregido o no.
Este enfoque en la resolucin de problemas permite conseguir una
familiarizacin del analista con el equipamiento del HPLC, an as, puede
perderse mucho tiempo en localizar y corregir componentes defectuosos.
Este enfoque puede orientarse hacia la bsqueda de pistas visualmente
como fugas o altas presiones y as poder localizar problemas en los
componentes fsicos del sistema.
Perspectiva Sintomtica
Este enfoque en la identificacin de problemas se refiere especficamente a
los efectos que el analista puede ver. Generalmente incluye un examen
visual de la lnea de base o de la forma y/o apariencia de los picos
cromatogrficos a fin de encontrar indicios de problemas en la selectividad
de la separacin o en los componentes del sistema.
Variaciones en los tiempos de retencin, cambios en la presin del sistema,
perdidas de sensibilidad o en las recuperaciones del analito, se pueden
estudiar a travs de ambas perspectivas.
- 11 -
2.3 Reglas de Oro en el Diagnstico de Averas

La combinacin de ambos diagnsticos, a partir de los componentes y a
partir de los sntomas, nos permite formular una serie de Reglas de Oro en
el Diagnstico de Averas con un carcter emprico:
1.
2.
3.
4.
5.
Hacer slo un cambio por operacin.

Asegurarse de que el problema realmente existe.
Confirmarlo como mnimo dos veces.
Colocar correctamente de nuevo los componentes.
Si no se encontr ningn fallo reinstalar correctamente las partes
reemplazadas durante la sustitucin de los componentes,
Desechar los componentes defectuosos.
No almacenar componentes que se sabe son defectuosos; desecharlos
para eliminar toda posibilidad de utilizacin posterior.
Anotar siempre los componentes reemplazados.
Generar un registro de histricos de reparacin y mantenimiento del
sistema HPLC. Esto permite una accin realmente preventiva al
realizar un mantenimiento programado de todo el sistema que
elimina la necesidad de responder slo ante posibles situaciones de
fallo. Dicho registro, adems, ayudar al ingeniero de servicio
tcnico cuando tenga que diagnosticar un problema en el sistema.
2.4 Problemas Tpicos en HPLC

Existen tres enfoques principales para localizar e identificar problemas en
HPLC, incluyendo:
1.
Examen de los parmetros operativos del sistema. Uno de los

parmetros que ms informacin aporta y que puede ser observado a
travs del monitor es la Presin del sistema.
Segn vare la lectura de la presin se puede deducir que:
Es demasiado alta debido a un bloqueo en el sistema
Es demasiado baja debido a fugas en el sistema
Hay fluctuaciones.
2.
Examen visual del sistema HPLC que especificar que componentes

son susceptibles de fallo. Las fugas en las conexiones de accesorios,
al final de la columna, en la celda del detector, en el
automuestreador, en el cabezal de la bomba, etc pueden ser
debidas a sobrepresin del sistema y ser la causa de una prdida de
presin del mismo.
- 12 -

3.
Examen del Cromatograma resultante.

Lnea de Base
La lnea de base cromatogrfica es plana, o flucta

cclicamente?
La lnea de base cromatogrfica muestra ruido en exceso?
Examinando la lnea de base se puede obtener gran cantidad de
informacin del estado del sistema HPLC siendo de gran ayuda
en el diagnstico problemas.
Picos
La forma de los picos cromatogrficos es simtrica, o

presentan colas y/o desdoblamientos apreciables?
Los Tiempos de Retencin Absolutos de los picos
cromatogrficos varan entre inyecciones?
La sensibilidad frente al analito ha disminuido?
Monitorizando los cambios en la forma de los picos
cromatogrficos y en los tiempos de retencin se puede
obtener una considerable informacin sobre el estado del
sistema HPLC.
- 13 -
La Fase Mvil
El objetivo de esta seccin es;
Explicar la importancia de asegurar la compatibilidad del disolvente.

Describir un protocolo genrico para la preparacin de las fases
mviles.
Explicar la importancia de la desgasificacin de la fase mvil.
Enumerar y describir los modos en los que la desgasificacin de la
fase mvil pueden realizarse.
Explicar la importancia en la filtracin de la fase mvil.
3.1 Compatibilidad del Disolvente y Equilibrado

del Sistema
Es importante tener en cuenta la miscibilidad de un disolvente con otro. Los
disolventes que no son miscibles se particionarn en dos fases, dando como
resultado una eliminacin incompleta del disolvente original del sistema
HPLC. Componentes del sistema como la vlvula de proporcin, las cmaras
del pistn del cabezal de la bomba, los poros del relleno de la columna y la
celda del detector continuarn liberando pequeas gotas del disolvente
anterior incluso despus del proceso de purga, lo que har que stas migren
a travs del sistema creando perturbaciones
en la lnea de base
cromatogrfica, as como burbujas del disolvente que se comportarn de
manera anloga a burbujas de aire que pasan a travs de la celda del
detector. El ruido en la lnea de base afectar a la sensibilidad del analito,
as como a los lmites de cuantificacin o deteccin que se vern
incrementados dando como resultado:
Ruido en la lnea de base causado por la presencia de aire

en la clula de flujo.
.
Una lnea de base ruidosa afectar a la sensibilidad frente a los analitos, y
se aumentarn los lmites de deteccin y de cuantificacin.
- 14 -

La tabla siguiente muestra la compatibilidad de disolventes. Se debe tener
en cuenta la fuerza de los disolventes que estn siendo usados: si hay
grandes desajustes en la fuerza de los disolventes, las sales de las soluciones
tampn o incluso las muestras podran precipitar en el inyector o en la
columna, provocando un incremento de contrapresin operativa en el
sistema.
La tabla muestra la miscibilidad de los disolventes ms comunes en HPLC

El estudio de compatibilidad de varios disolventes para HPLC muestra una
gran variedad de solventes universales, como el tetrahidrofurano (THF)
que es miscible con la mayora del resto de disolventes. El disolvente de uso
ms frecuente en limpiezas es con diferencia el isopropanol (IPA) debido a
su miscibilidad con el resto de solventes en todos los rangos de
concentraciones. Ello hace del isopropanol una eleccin muy popular como
solvente intermedio cuando hay cambio de eluyentes de fase reversa a fase
normal y viceversa.
Un cambio entre solventes que son inmiscibles, o una mala sustitucin de la
fase mvil previamente usada por sistema HPLC, hacen que la composicin
del eluyente en la columna no sea uniforme. Esto puede provocar
variaciones en los Tiempos de Retencin, especialmente durante las
primeras inyecciones de muestras.
- 15 -
Fluctuaciones en los Tiempos de Retencin debido a un pobre

equilibrado de la fase mvil o al uso de solventes inmiscibles
Tambin se pueden observar derivas o ruido en la lnea de base debido a
variaciones en el detector entre una fase mvil nueva y la anterior:
Ejemplo de una lnea de base con deriva (figura superior) y una lnea de
base errtica (figura inferior) que pueden verse en un sistema no
equilibrado
- 16 -
Cada vez que se cambie el disolvente es necesario hacer pasar por

todo el sistema un volumen del solvente nuevo equivalente a 10 veces
el volumen de la columna.
Para calcular este volumen
empricamente hay que determinar antes el volumen vaco efectivo
de la columna. Si las dimensiones de la columna fueran 150 x 4,6 mm
de dimetro interno (DI), el volumen interno se puede calcular
multiplicando el rea por la longitud. Como regla general el volumen
vaco de la columna ser aproximadamente el 68% del total de esta,
siendo el resto el ocupado por el material de relleno.
Aplicando la siguiente ecuacin y estando todas las dimensiones en
milmetros, se obtiene el volumen vaco efectivo de la columna en
microlitros;
Volumen Vaco Columna = r2 x L x 0.68
Volumen Vaco Columna = (2.3)2 x 150 x 0.68
Volumen Vaco Columna 1,700L (1.7mL)
Por tanto, si el flujo fuera 1.0mL/min, seran necesarios aproximadamente
17 min para haber pasado 10 volmenes de la columna en el cambio.
Use siempre gradientes para pasar de un disolvente al siguiente. La
siguiente secuencia de intercambio entre solventes es necesaria para
realizar la conversin entre fase reversa y fase normal a fin de eliminar la
posibilidad de inmiscibilidades entre los disolventes, o precipitaciones de la
muestra o las sales tampn;
Fase mvil
Elimina de la columna todos los analitos retenidos.
H2O
Cualquier tampn usado debe ser reemplazado solo con agua, por
ejemplo, en una separacin isocrtica con 50:50 MeOH:50mM de
KH2PO4, entonces los 50mM de KH2PO4 deben ser intercambiados por
H2O y el sistema deber ser purgado adecuadamente.
H2O
Retirar la columna del sistema y purgar solo con H2O al 100% para
eliminar todas las posibles trazas de sales tampn.
Isopropanol
Isopropanol:Hexano (u otros disolventes no localizadores(*)) 50:50
Elucin en Fase Normal
Nota: El Acetonitrilo y el Hexano son INMISCIBLES!

(*) que no tengan la capacidad de interactuar con grupos especficos de la
fase estacionaria)
- 17 -

Nota: Los mtodos que usan reactivos formadores de pares de iones
requieren normalmente tiempos largos de equilibrado. Suele ser necesario
purgar con un mnimo de 20 volmenes equivalentes al volumen de la
columna.
Protocolo genrico de Arranque para un sistema HPLC

Para evitar los problemas asociados a un mal equilibrado del sistema se
sugiere el protocolo de arranque descrito a continuacin:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Encender los mdulos del equipo.

Preparar los disolventes, incluyendo filtracin y desgasificacin.
Cebar las lneas de los solventes y la bomba.
Establecer la composicin de la fase mvil y el flujo tal y como lo
especifique el mtodo.
Purgar el sistema sin la columna durante 5 min, chequeando si hay
fugas.
Detener el flujo e instalar la columna.
Purgar el sistema con la columna en su sitio durante un tiempo para
dicho flujo que sea equivalente a mnimo 10 volmenes de la
columna, chequeando si hay fugas.
Equilibrar el sistema durante 10 min, controlando contrapresiones en
el sistema.
Si procede, purgar el automuestreador y volver a equilibrar durante
10 min
Inyectar la/s muestra/s de chequeo si el sistema est estabilizado
Evaluar para confirmar si el sistema HPLC es apto para la finalidad

prevista
- 18 -
3.2 Preparacin de la Fase Mvil

Influencia del pH
El pH de la fase mvil influye directamente sobre el estado de ionizacin y
en consecuencia sobre el tiempo de retencin del analito.
El pH y la capacidad tamponadora de cualquier fase mvil requieren de una

medicin y una preparacin exacta respectivamente, de lo contrario la
selectividad en la separacin variar dando como resultado tiempos de
retencin irreproducibles y formas de pico variables.
El cromatograma siguiente muestra la separacin de seis analitos de cido
dbil en una fase mvil de pH 5.10. A ese pH los seis componentes quedan
resueltos adecuadamente, con una resolucin de 1.50 para el par de picos
crticos 1 y 2 separacin mnima de pico recomendada en anlisis
cuantitativos
- 19 -
Sin embargo, si el pH de la fase mvil se ajusta incorrectamente, o el error

de medida en la calibracin del pH es del orden de 0.10 unidades, la
separacin cromatogrfica de los seis analitos anteriores presentara el
siguiente cromatograma;
A un pH de 5.20 los seis analitos no se resuelven correctamente, con una

resolucin de tan solo 0.58 en la separacin de los picos 5 y 6. Dicho valor
es considerablemente menor a 1.50 y por consiguiente el rea de cada pico
no puede ser integrada correctamente para la cuantificacin.
- 20 -

Cuando se cromatografan compuestos ionizables es una ventaja mantener
los compuestos en su forma no ionizada. Los compuestos ionizados
representan analitos altamente polares, que en condiciones de fase reversa
eluyen rpidamente de la columna, lo que reduce las posibilidades de
separarlos del resto de analitos ionizados.
Usando soluciones tampn y ajustando el pH para forzar que los compuestos
estn en forma no ionizada, los cidos y bases dbiles pueden separarse
eficientemente en condiciones de fase reversa.
10
9
8
O
R C O
H
Weakly Basic
6
5
Weakly Acidic
3
2
1
0
pH = pK
O
R C
O
pH
El pKa de una molcula puede usarse para determinar a que pH debe

tamponarse la fase mvil para asegurar una buena reproducibilidad en los
tiempos de retencin:
Para cidos orgnicos el pH se ajusta 2 unidades por debajo de su pKa

Para bases orgnicas el pH se ajusta 2 unidades por encima de su pKa.
- 21 -
Fuerza Tamponadora
El cromatograma siguiente muestra el efecto de un cambio en la fuerza
tamponadora durante una separacin isocrtica de seis aditivos
alimentarios; cido ascrbico, sorbato potsico, benzoato sdico, vainillina,
cumarina y etil-vainillina, picos del 1 al 6 respectivamente.
El primer cromatograma muestra la separacin de seis analitos mediante un
tampn de concentracin 60mM. La pareja de picos 4 y 5 se separa con una
resolucin de 1.65, separacin suficiente para poder cuantificarlos.
El segundo cromatograma muestra la separacin de los mismos seis analitos

con un tampn de concentracin 57 mM. Con tan solo una ligera reduccin
en la concentracin del tampn, la resolucin en la separacin de la pareja
de picos 4 y 5 pasa a ser de solo 0.97, separacin insuficiente para una
correcta cuantificacin.
Un cambio de 3mM en la concentracin del tampn tiene efectos notables

en la selectividad del sistema de separacin. El resultado es una pareja de
picos inadecuadamente separados y la imposibilidad de su anlisis
cuantitativo lo que nos demuestra la importancia de una pesada exacta.
- 22 -
Determinacin del Peso y Pesada

Cualquier pesada estar sujeta a errores que deben ser minimizados para
asegurar la menor desviacin posible en la cuantificacin final obtenida. Se
conseguirn mnimos errores siguiendo los siguientes criterios:
- 23 -
Uso del equipo de medicin adecuado:

El equipo de medicin funciona correctamente, es decir, es
adecuado para el fin previsto y est calibrado correctamente de
manera que la fiabilidad de la medida obtenida es alta.
El procedimiento de medida y de registro utilizado es correcto.
El Lmite Funcional de Exactitud (FAL, del ingls Functional Accuracy
Limit) de cualquier balanza utilizada en el pesaje de sales para la solucin
tampn u otros aditivos, est aceptado generalmente como un 0.1%, siendo
este el % de error permitido en la medida.
Es necesario determinar de antemano que tipo de lectura tendr la balanza
que va a ser utilizada, y por tanto La Cantidad Mnima Permisible que
puede ser pesada (MAQ, del ingls Minimum Allowable Quantity). La MAQ
para una balanza puede ser determinada del siguiente modo:
MAQ = 100% / FAL (%) x lectura de la balanza.
Es decir, para una balanza de cuatro cifras (de lectura 0.0001g) se tendr
una MAQ igual a:
MAQ = 100% / 0.1% x 0.0001 = 0.1g (100mg)
Por lo tanto, para determinaciones de peso con precisin para el ejemplo
anterior, el lmite inferior seran 100mg para una balanza de cuatro dgitos.
Balanza de 6 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1mg
MAQ (FAL = 0.1%) = 100mg
MAQ (FAL = 0.1%) = 1g
- 24 -

Las tolerancias tpicas en el pesaje para los tres modelos de balanzas
descritos son:
Tolerancias Tpicas en el Pesaje para los modelos de Balanzas descritos
Modelo de Balanza
Plato de Carga Superior
Semi-micro analtica
Micro analtica
Peso Mximo
Tolerancia
(g)
(mg)
3,200
10
5,200
10
8,200
100
60
0.015
230
0.025
2.1
0.00025
5.1
0.0010
21
0.0020
Los slidos ya pesados deben ser transferidos al vidrio adecuado - matraz

aforado o probeta - y ser disueltos en un agitador magntico y/o
ultrasonidos sin llegar a enrasar. Se deben evitar calentamientos pues
pueden afectar la composicin del disolvente.
Eleccin del Recipiente para el Pesaje
Es muy importante que el recipiente usado para pesar sea el

apropiado a la muestra o material que estn siendo pesados, es decir,
sera inapropiado pesar 0.01g en un recipiente de 1Litro.
Utilizar siempre vidrios limpios y secos esto es especialmente
importante para los vidrios de reloj, donde las contaminaciones del
material y la adsorcin de la muestra por el vidrio pueden causar
errores.
Fuentes de Deriva
La precisin en la medida del peso con la balanza analtica puede sufrir
deriva. Las fuentes de deriva incluyen:
Avera en el plato de la balanza analtica o en su sensor.

Cambios en los sensores mecnicos o de presin de la balanza debidos
a averas y cambios en la temperatura.
Exposicin del mecanismo de la balanza a un exceso de carga esttica
Cambios en el calibrado interno del aparato.
Cambios en la presin y temperatura ambiente.
- 25 -

Debido a esta inherente susceptibilidad a la deriva es necesario calibrar
regularmente las balanzas.
Efectos Estticos
El mecanismo por el que la balanza percibe el peso mediante sensores de
presin y sus sistemas electrnicos internos, pueden alterarse
sustancialmente por la electricidad esttica de los envases o recipientes, as
como la carga de las muestras o las sustancias que estn siendo pesadas. Los
contenedores de vidrio plstico son particularmente susceptibles a este
efecto ya que la densidad de la carga no se elimina fcilmente debido a su
baja conductividad. El ltex y los guantes de plstico son tambin conocidos
transmisores de carga electrosttica al plato de las balanzas.
Las balanzas afectadas por electricidad esttica presentan generalmente
problemas de lecturas muy inestables o derivas continuas.
Hay varias recomendaciones a seguir para contrarrestar este efecto:
Se pueden adquirir balanzas con plato recubierto anti-estticamente.

Se puede poner un vaso de agua en el compartimento de la balanza
para aumentar la humedad ambiente (Nota: Este mtodo NO es
recomendable si el aumento de la humedad afecta a la muestra por
ser higroscpica (ver seccin siguiente).
Se puede adquirir una pistola ionizante y colocarla cerca del
compartimento de la balanza a fin de neutralizar mediante iones con
carga opuesta.
Manipular los envases con pinzas o tenazas usar solo los guantes de
ltex cuando se manipulen muestras txicas.
Muestras Higroscpicas
Algunas muestras son particularmente susceptibles atraer o absorber

humedad. El acetato de amonio, un tampn muy usado en LC-MS, es
extremadamente higroscpico.
Un sntoma de muestras higroscpicas es un constante aumento del
peso debido a la absorcin de humedad.
Cualquier muestra que se sepa que es higroscpica puede pesarse en
una balanza usando un vaso de precipitados con un tamiz molecular
para reducir la humedad presente o procurando minimizar su
exposicin ambiental.
Las huellas dactilares en los envases de las muestras pueden
favorecer la adsorcin de la humedad. Por ello es importante que los
envases o los recipientes no se manipulen directamente, sino que se
usen esptulas o pinzas para manipularlos.
Si las muestras o los recipientes requieren enfriamiento previo para
ser pesados, estos deben ser enfriados en un desecador para evitar la
absorcin de humedad.
- 26 -
Muestras Voltiles
Esta situacin es la opuesta a tener muestras higroscpicas. Las

muestras voltiles tienden a perder peso, obtenindose una
disminucin constante en la lectura del peso. Muchos tampones y
aditivos usados en LC-MS son voltiles, dicha volatilidad ayuda a
prevenir contaminacin o suciedad en la fuente de iones.
Es posible pesar muestras en recipientes cerrados con tapa, si esta se
manipula con precaucin. Cualquier lquido que condense en la tapa
puede crear alteraciones en pesadas sucesivas. Se deben usar siempre
recipientes tapados cuando se pesen lquidos.
Para todos los pesajes es mejor minimizar el rea superficial de la
muestra que est siendo pesada. Este enfoque minimiza la exposicin
atmosfrica de la muestra, reduciendo la volatilizacin potencial.
- 27 -
Efectos de la Temperatura
Como regla general, la muestra a pesar debe acondicionarse a la

temperatura de la balanza. Es el nico modo de evitar errores por
ascensin del aire y desviaciones causadas por corrientes en la
superficie de la muestra. Dado que estos efectos aumentan
proporcionalmente al volumen y a la superficie de la muestra, se
debe asegurar que el tamao del recipiente seleccionado est en
proporcin adecuada al tamao de la muestra a pesar, ello ayudar a
minimizar dicho efecto.
En todos los casos las medidas fundamentales son:
Obtener tanta informacin como sea posible de la muestra a pesar.

Evitar
potenciales
efectos
electrostticos
mencionados
anteriormente.
Equilibrar la temperatura del envase y la muestra con el ambiente de
la balanza.
Minimizar el rea superficial de la muestra expuesta a la atmsfera.
El pH Metro y el Ajuste de pH
El pH es uno de los parmetros ms comnmente determinados en
soluciones tanto acuosas como no acuosas. Variaciones en el pH pueden
provocar cambios significativos en la velocidad de reaccin as como
cambios en la solubilidad y biodisponibilidad de muchos principios activos
con fines farmacuticos. Como se ha descrito anteriormente, las
caractersticas en la retencin de muchas especies de analitos pueden
cambiar por variaciones en el pH de la fase mvil y por tanto contribuir a
formas de picos anormales, es decir, desdoblamientos y colas.
El pH es un parmetro que indica la acidez o alcalinidad de una solucin, se
mide en una escala de 0 a 14, donde un valor de pH igual a 0 es muy cido
y un valor de 14 es muy bsico. El pH mide la concentracin, o ms
exactamente la actividad del Ion oxonio H3O+, aunque en la solucin el Ion
oxonio est representado como un protn o Ion hidrgeno, H+.
Generalmente se ajusta primero el pH del disolvente de la fase mvil antes
de aadir el volumen de disolvente orgnico necesario. Este enfoque
sistemtico asegura exactitud en la concentracin del Ion oxonio. Para
asegurar homogeneidad mientras se adiciona el reactivo en el ajuste del pH,
la solucin puede ser agitada en una placa magntica, aunque se debe
evitar calentamientos que puedan afectar la composicin del disolvente.
El reactivo para ajustar el pH puede aadirse gota a gota usando material
plstico, vidrio o pipetas dispensadoras automticas.
El empleo de vidrio propicia la introduccin de iones metlicos. Los iones
Al3+ y Fe2+ inducirn actividad en los grupos silanol residuales de la columna
analtica. La consecuencia de esto es la observacin de colas en los picos
- 28 -

cromatogrficos, especialmente para aquellas especies de analitos que
tienen grupos funcionales bsicos. Los iones aducto Na+ y K+ pueden
predominar en LC-MS, llegando a ser los picos base y ms abundantes incluso
que el ion protonado pseudo-molecular. Esto puede influir de manera
considerable en la cuantificacin.
Determinacin del pH
El sistema de medicin del pH consta de tres componentes:
Un electrodo de pH.
Un electrodo de referencia.
Un pH metro de alta impedancia.
En la mayora de los sistemas para medir el pH los electrodos de pH y de

referencia estn montados en el mismo dispositivo, conocido como
electrodo combinado.
Electrodo de Referencia
El electrodo de referencia consiste en un cable de plata recubierto en
cloruro de plata, una solucin de relleno y una junta permeable
(generalmente fritas de cermica o membranas), a travs del cual la
solucin de relleno migra lentamente dentro de la muestra que est siendo
medida. En algunas partes de la frita apenas hay flujo neto de la solucin de
relleno, dicha regin se llama junta de difusin.
Electrodo de pH
El electrodo de pH est hecho de un vidrio de composicin especial, que es
sensible a la concentracin de iones hidrgeno. Dicho vidrio est compuesto
generalmente por un metal alcalino que sostiene una reaccin de
intercambio de iones con los Iones hidrgeno de la solucin test para
generar una diferencia de potencial.
Electrodos de pH Combinados
Los electrodos combinados contienen los dos electrodos descritos
anteriormente en un nico cuerpo de vidrio. El potencial generado en la
zona de unin se debe a los iones libres de hidrgeno presentes en la
muestra. El potencial de referencia es generado por un elemento interno
de Ag/AgCl que est en contacto con la solucin relleno de referencia. El
electrodo de medida emite un voltaje variable y el electrodo de referencia
un voltaje constante para el medidor.
El sistema funciona de manera anloga a la medida del voltaje de una
batera por un voltmetro. El cable interior del electrodo de pH tiene la
misma finalidad que el primer cable que va desde la batera hasta el
- 29 -

voltmetro. El electrodo de referencia equivale al segundo cable que
completa el circuito y permite medir el voltaje. La solucin de relleno fluye
del electrodo de referencia hasta la solucin test, completndose el
circuito con el electrodo de pH.
Electrodo de pH
Combinado ROSS
Agujero de Relleno: Solucin

relleno de KCl
Electrodo de referencia Ag/AgCl

Unin de frita cermica referencia
Bulbo detector de pH
Para que el electrodo de pH combinado trabaje correctamente es

importante que el bulbo detector se guarde limpio y sin restos de tampones,
de lo contrario los iones libres que fluyan a travs del bulbo sern inhibidos
y por tanto las medidas de pH sern incorrectas. Debe asegurarse que la
solucin relleno de KCl est en el nivel correcto y que el agujero del relleno
no est tapado mientras se mide el pH.
El pH-metro
El electrodo de pH tiene una resistencia interna muy alta, haciendo muy
difcil la medida de los pocos milivoltios de salida que provocan los cambios
de pH. Un pH-metro es bsicamente un amplificador de alta impedancia que
mide con precisin los diminutos cambios de voltaje del electrodo,
mostrando el resultado directamente en unidades de pH o en milivoltios.
- 30 -
Soluciones Tampn y Caractersticas del Electrodo de pH

Soluciones Tampn
Los tampones son soluciones que mantienen un valor constante de pH con
capacidad de resistir a los cambios de ste. Se utilizan para calibrar el
electrodo de pH y el pH-metro. Se emplean para compensar las pequeas
diferencias que se observan entre la seal de producida por diferentes
electrodos, as como los cambios producidos en los electrodos con el paso
del tiempo.
En consecuencia, el sistema debe ser calibrado peridicamente. Los
tampones disponen de un amplio rango de valores del pH, viniendo estos en
forma lquida premezclada o como polvo seco encapsulado segn sea
necesaria su preparacin. Generalmente una solucin tampn especfica
calibrar con una tolerancia menor a 0.02 unidades de pH medido a 20C.
La mayora de los pH-metros requieren calibraciones a varios valores
especficos de pH. Generalmente se realiza una calibracin cerca del punto
isopotencial la seal emitida por un electrodo a pH 7 y a 25C son 0mV y
tpicamente se hace una segunda medida a pH 4 o a pH 10. Es bueno elegir
un tampn con un pH tan prximo como sea posible al valor del pH de la
muestra a determinar, pues se asegura la mayor exactitud posible.
- 31 -
Adicin del Disolvente

Cuando se prepare una fase mvil mezcla de disolventes acuosos y
orgnicos, el procedimiento correcto ser adicionar el volumen de solvente
orgnico necesario al volumen de solvente acuoso necesario.
Si el volumen necesario de la fase mvil se prepara simplemente por adicin
de la fase acuosa con el solvente orgnico o viceversa, entonces los errores
en la composicin pueden deberse a contraccin o expansin del volumen de
la mezcla respecto a los volmenes individuales de los disolventes. Este
efecto se traducir en cambios crecientes en los tiempos de retencin de la
muestra y en los factores de capacidad.
La tabla siguiente muestra el efecto anterior sobre las caractersticas de
retencin del tolueno. Muestra que hay una variacin significativa en el
tiempo de retencin del tolueno entre una fase mvil 60:40 MeOH:H2O
preparada por adicin de cada disolvente segn haya:
Suficiente MeOH para 40mL de H2O

o
Suficiente H2O para 60mL de MeOH
en comparacin al procedimiento correcto de adicin de 60mL MeOH a 40mL

H2O.
En el procedimiento correcto se obtiene una fase mvil de composicin y
fuerza de elucin intermedia, prueba de ello es el cambio en el tiempo de
retencin y el factor de capacidad del tolueno al preparar la fase mvil de
este modo y los otros dos anteriores.
Resultado segn la Tcnica de Preparacin de la Fase Mvil sobre la
Retencin del Tolueno
Fraccin
MeOH
Volumtrica
del
Tiempo de Retencin
Factor de Capacidad
(min)
k'
60
5.40
2.72
62*
4.82
2.32
58**
5.87
3.05
(%)
* 40mL de H2O llevados hasta 100mL con 60mL MeOH, Calculado el k'
** 60mL de MeOH llevados hasta 100mL con 40mL H2O, Calculado el k'
- 32 -
3.3 Desgasificacin de la Fase Mvil

La eliminacin de gases, o desgasificacin, es un fenmeno al que se
someten todos los disolventes tanto orgnicos como acuosos usados en
cromatografa. Cuando el HPLC est sometido a altas presiones la
solubilidad de los gases atmosfricos O2 y N2 aumenta. Cuando los
disolventes experimentan una brusca cada de presin, generalmente
durante la mezcla en una vlvula de proporcin cuaternaria, un mezclador
esttico de un sistema binario, o al entrar en la celda del detector, los gases
disueltos se desprenden de la solucin formando burbujas.
La generacin de dichas burbujas puede ser perjudicial tanto para la
columna como para el proceso cromatogrfico.
Los sistemas de bombeo ms modernos estn centrados en el diseo de
doble pistn. Las burbujas de aire pueden retenerse en las vlvulas
antirretorno o en las cmaras de los pistones del cabezal de la bomba. Se
observar una lnea de base sinusoidal como resultado de aire retenido en el
cabezal de la bomba:
Lnea de Base Sinusoidal generada por aire retenido

en el cabezal de la bomba.
En estos casos es importante eliminar las burbujas de aire antes de que
estas pasen a la columna. La bomba debe purgarse inmediatamente y el
flujo incrementarse a 5ml/min para eliminar el aire del cabezal de la
bomba.
- 33 -

Una burbuja que entra en la columna forzar su recorrido a travs del lecho
de relleno de la fase estacionaria, provocando la formacin de canales.
Dicha canalizacin disminuye rpidamente el rendimiento de la columna ya
que los analitos son capaces de atravesar la columna por dichos canales, lo
que se traduce en un menor tiempo de retencin sobre la fase estacionaria,
saturndose rpidamente dichos huecos por molculas de analito.
Tal efecto conduce generalmente a la formacin de frentes en la forma de
los picos cromatogrficos.
Frentes y picos anchos observados en una columna daada
- 34 -
El paso de burbujas de gas al HPLC afectar a la lnea de base

cromatogrfica generando ruido que se traduce en la presencia de picos
fantasma.
Adems, si una burbuja de gas queda atrapada en la celda del detector, se
generar ruido de forma aleatoria en forma de picos en el registro de la
lnea de base. El efecto neto ser una disminucin en la relacin seal-ruido
(S/N), con su correspondiente aumento en los lmites de deteccin (LoD) y
los lmites de cuantificacin (LoQ) del mtodo.
En cuanto la fase mvil entra en la celda de flujo del detector se produce
una cada en la presin. Como resultado de esta cada en la presin, una
pequea cantidad del aire retenido en la fase mvil puede liberarse en la
celda del detector. Dicha liberacin de gas se traduce en un incremento del
ruido en la lnea de base:
Incremento del ruido en la lnea de base (figura superior) y Spikes

(figura inferior) causados por burbujas de aire retenido y liberado en la
celda del detector
- 35 -

Es una prctica muy comn ajustar la contrapresin mediante reguladores a
la salida de la celda del detector a fin de mantener valores altos en la
presin que minimicen la desgasificacin hasta que el flujo de la fase mvil
est suficientemente a distancia para prevenir el atrapamiento de las
burbujas de aire formadas. Si el regulador de la presin no es un accesorio
integrado del detector, suele ser suficiente la conexin de un tubo PEEK de
50cm de longitud y 0.17mm de dimetro interno antes del tubo de salida de
desechos.
Adems, una pobre desgasificacin de la fase mvil se traducir en un mal
cebado de la bomba y una pobre reproducibilidad de gradientes, lo que
llevar a variaciones en los tiempos de retencin del analito.
- 36 -
Mtodos de Desgasificacin
Hay cuatro modos aceptados para desgasificar la fase mvil:
Borboteo por Helio

Desgasificacin por Vaco
Ultrasonidos
Reflujo
El filtrado de la fase mvil a vaco es el procedimiento que se emplea

generalmente cuando se elimina materia particulada de una solucin antes
de su uso, dicho proceso desgasifica la fase mvil de manera indirecta.
Aunque es una medida necesaria, especialmente cuando se usan soluciones
tampn o fases mviles que contienen reactivos de par de inico, se debe
tener cuidado en evitar prdidas selectivas de cualquier solvente orgnico
que pueda conducir a variaciones en el tiempo de retencin del analito.
Borboteo por Helio

El Borboteo por Helio elimina aproximadamente el 80% de los gases
disueltos. El mecanismo de borboteo puede construirse simplemente
conectando a un cilindro de helio un tubo de PTFE con una frita al final.
Hay que sumergir la frita dentro de la fase mvil y ajustar el regulador para
liberar una suave corriente de burbujas.
En general, un litro de fase mvil se desgasificar por completo con un litro
de helio. Una excesiva desgasificacin con helio puede provocar la prdida
de la mayora de los componentes voltiles de la fase mvil, generando
variaciones en los tiempos de retencin.
La principal finalidad del borboteo por helio es disolver el N2 y el O2 que se
extraen de la fase mvil gracias a su elevada solubilidad en helio. El helio
tiene una solubilidad muy baja en la mayora de las fases lo que permite la
disolucin de N2 y O2 en el gas borboteado, dando como resultado una
solucin relativamente libre de gases.
Cuando se est usando el borboteo por helio hay que ser consciente de los
potenciales cambios que pueden tener lugar en la composicin de la fase
mvil debido a la volatilidad selectiva de cualquier aditivo de la fase mvil,
p.ej., cido Trifluoroactico (TFA).
Se debe evitar un borboteo por helio vigoroso ya que puede provocar
perturbaciones excesivas en la superficie de la fase mvil, dando como
resultado la introduccin de ms aire que el que es eliminado.
- 37 -
Desgasificacin por Vaco.

La desgasificacin por vaco se puede llevar a cabo de tres maneras:
En discontinuo
Incidental
Desgasificacin en lnea
La desgasificacin en discontinuo tiene lugar en un matraz a vaco que

contendr la fase mvil a la que se someter un proceso continuo de vaco,
bien generado por aspiracin con agua, o simplemente con una bomba de
vaco.
La desgasificacin incidental se lleva a cabo haciendo pasar la fase mvil a
travs de un filtro de membrana. Puesto que el lquido se microdispersa
mientras est expuesto a un ligero proceso de vaco, se produce la
desgasificacin. La desgasificacin incidental es ms bien un tratamiento
secundario cuando se necesite eliminar materia particulada de la fase mvil
por vaco antes de su uso.
- 38 -

La desgasificacin en lnea es el mtodo ms empleado actualmente. La
fase mvil est encerrada en un tubo permeable a los gases mientras
atraviesa la unidad de desgasificacin. El gradiente de vaco generado hace
expulsar los gases retenidos en la fase mvil, atravesando stos la
membrana del tubo.
Ultrasonidos
Este es el menos eficiente de todos los mecanismos de desgasificacin ya
que solo elimina aproximadamente el 30% de los gases disueltos. La fase
mvil se desgasifica por sonicacin de forma que los gases disueltos se
aglomeran formando burbujas con el suficiente tamao para flotar hasta la
superficie del lquido. Dicha tcnica es limitada, pues se lleva a cabo fuera
del sistema y el calor generado en el proceso de sonicacin puede provocar
la prdida de los compuestos ms voltiles de la fase mvil por evaporacin
selectiva. Sus limitaciones se compensan generalmente por sus ventajas en
simplicidad y bajo coste.
En consecuencia el ultrasonidos no es muy recomendable y si es usado debe
serlo durante el mnimo tiempo posible y preferiblemente con un bao de
agua que controle la temperatura.
La figura anterior muestra la eficacia relativa de los diferentes mtodos

de desgasificacin, tomando como criterio el porcentaje de oxgeno
eliminado de un volumen de metanol determinado en funcin del
tiempo.
- 39 -
3.4 Filtracin de la Fase Mvil

La filtracin elimina el polvo adems de otras partculas y contaminantes,
siendo por tanto una etapa fundamental en la preparacin de cualquier fase
mvil tampn. Las partculas pueden alojarse en el sistema de aporte de
disolvente, provocando desgaste en los componentes del cabezal de la
bomba, generando fugas, flujos irregulares y cambios en la composicin de
la fase mvil. Las partculas pueden tambin alojarse en la vlvula de
inyeccin generando fugas cruzadas entre los puertos de la vlvula que dan
como resultado reas y/o alturas de picos irreproducibles y causan una
disminucin de la vida til de sta.
La filtracin de la fase mvil tambin ayuda a prevenir la obstruccin de la
lnea, o de la guarda columna si la hubiere, evitando los cambios continuos
de stas y reduciendo prdidas de tiempo y costes. El filtro en lnea debe
instalarse despus del sistema de inyeccin pero antes de la columna
analtica. De este modo cualquier partcula generada por el desgaste de los
componentes del asiento del rotor procedentes de la vlvula de
conmutacin del inyector ser retenida de modo eficaz.
Sin filtracin de la fase mvil y sin aadir un sistema protector de filtro en
lnea, las partculas que entran en el HPLC pueden acumularse en cabeza de
columna traducindose en una amplia variedad de problemas
cromatogrficos.
Un bloqueo parcial en la entrada de la columna se traduce en un aumento
de la presin y por tanto en deterioro de la forma de los picos
cromatogrficos, efecto que queda patente en desdoblamientos, frentes o
colas en los picos. La figura siguiente muestra el efecto de una frita
parcialmente bloqueada a la introduccin de muestra en la columna. Sin
bloqueo, la muestra sale de los tubos de conexin, distribuyndose
uniformemente dentro de la frita de entrada y despus en cabeza de
columna.
Cuando hay un bloqueo parcial se impide la distribucin homognea de la
muestra en cabeza de columna, obtenindose anomalas en las formas de
pico.
- 40 -

En ocasiones tambin puede haber cambios en los tiempos de retencin del
analito (TR), el factor de capacidad del analito (k), disminucin en la
selectividad de la separacin, presencia de picos falsos o adsorcin
irreversible del analito en la columna con la consecuente reduccin de la
vida til de esta.
Usar filtros mezcla de ster celulosa acetato y nitrato de celulosa
(0.22m de tamao de poro) para disolventes acuosos tamponados, p.ej.
Whatman Membra-Fil.
Usar Teflon (Polytetrafluoroetileno PTFE) (0.22m de tamao de poro)

para solventes orgnicos. Es frecuente que la membrana de PTFE est
laminada sobre una trama de polipropileno como soporte para aumentar su
durabilidad.
Es muy recomendable reservar material de vidrio especfico que solo se

utilice para el proceso de filtracin de la fase mvil y as prevenir
contaminacin imprevista.
Un conjunto de vidrio debe dejarse solo para solventes acuosos tamponados
y otro distinto para solventes orgnicos.
Cualquier vidrio debe ser inspeccionado ante la posible presencia de
material particulado para prevenir contaminacin accidental de las fases
mviles pre-filtradas
- 41 -

Es una buena prctica el filtrar cualquier disolvente que no sea de grado
para HPLC antes de mezclarlo y emplearlo en la preparacin de fase mvil.
Cuando se filtran mezclas de disolventes, las diferencias entre las presiones
parciales de cada solvente pueden ser causa de cambios en la composicin.
En consecuencia, el usuario debe ser consciente de los cambios en la
concentracin de los solventes - y ser consecuente con los PNT
(Procedimientos Normalizados de Trabajo).
Generalmente no es aconsejable filtrar los disolventes de calidad HPLC
suministrados por el fabricante. Estos disolventes se suministran ya
eficazmente filtrados a 0.22m y posteriormente embotellados bajo
condiciones de sala-limpia. En consecuencia, el riesgo de introduccin de
materia particulada o contaminantes aumenta considerablemente cuando se
realiza de nuevo la filtracin en el laboratorio.
Los filtros pueden estar revestidos o contener materiales como tensioactivos
o glicerina, que podran arrastrarse como contaminacin a la fase mvil. Por
tanto, es una buena prctica pre-lavar los filtros y desechar los primeros
lavados.
- 42 -
Filtros de Disolventes en lnea

El uso de disolventes de alta calidad para HPLC suele eliminar la necesidad
de filtracin manual. Sin embargo, la mayora de fabricantes recomiendan el
uso de filtros para disolventes en lnea:
Generalmente los filtros estn hechos de vidrio sinterizado o acero

inoxidable, que deben ser limpiados o reemplazados mensualmente. El
bloqueo de uno de los filtros causar pequeos cambios en la composicin
de la fase mvil, provocando fluctuaciones en los tiempos de retencin:
Fluctuaciones en los tiempos de retencin debido

al bloqueo de un filtro en lnea.
El mejor mtodo de limpieza para los filtros de acero inoxidable es por
ultrasonidos en isopropanol (IPA). Los filtros de vidrio sinterizado nunca
deben ser lavados por ultrasonidos, siendo el mejor mtodo la inmersin en
IPA durante 24 horas.
- 43 -
Crecimiento microbiolgico
Los disolventes contaminados o el crecimiento microbiano en las botellas de
disolvente, pueden taponar los filtros y perjudicar al funcionamiento de la
bomba. El crecimiento microbiano tambin puede bloquear el
automuestreador, provocando variaciones en los volmenes inyectados o
recubriendo las ventanas de la celda de flujo provocando as lneas de base
errticas y reduciendo la sensibilidad.
Una lnea de base errtica causada por crecimiento

microbiano en la fase mvil
Es recomendable tomar las siguientes precauciones:
Si es posible usar botellas estriles para los disolventes.
Reemplazar disolventes acuosos y tamponados cada dos das.
Evitar la exposicin directa al sol o usar botellas de vidrio mbar.
Otras Consideraciones para la Fase Mvil:

Rango del pH

Rango del pH del equipo 2.3 9.5

Rango del pH extendido 2.3 12.5
Corrosivos para el acero inoxidable

cido clorhdrico
cidos inorgnicos y cidos fuertes
Haluros Bsicos (Cloruro de Sodio, Ioduro de Litio)
Tetracloruro de Carbono con 2-propanol o THF
Agentes acomplejantes (EDTA, cido ctrico, cido actico)
Ataque al cuarzo y vespel
Soluciones alcalinas, pH>11
Si se usan los compuestos anteriores ser necesario un mantenimiento ms frecuente del HPLC.
Cuando se usen, al finalizar el anlisis la bomba u otros componentes del HPLC deben ser purgados a
fondo.
- 44 -

Otra cuestin relativa al uso de filtros es la filtracin de las muestras antes
de inyectarlas. Aunque filtrar la muestra permite eliminar partculas, existe
la posibilidad de perder analitos por ser absorbidos irreversiblemente en la
membrana de los filtros. El efecto inmediato sera la obtencin de reas y/o
alturas de picos irreproducibles.
Por tanto, es aconsejable realizar de una serie de pruebas previas que
controlen la recuperacin de los analitos a los niveles de concentracin
esperados cuantificando a partir de soluciones fortificadas, a fin de
determinar si el filtro es compatible y no retiene los compuestos en
cuestin. Dicho proceso se ilustra a continuacin:
- 45 -
Sistemas de bombeo
Describir la funcin de la bomba

Describir los principios de funcionamiento del sistema de bombeo
Describir los dos procesos por los cuales se forma el gradiente de
fase mvil
Enumerar y describirlas incidencias y los procesos de mantenimiento
ms comunes
4.1 Funciones de la Bomba

La misin de la bomba es enviar continuamente un flujo fase mvil libre de
pulsos al inyector, columna y detector, independientemente de la
contrapresin del sistema.
Cada sistema de bombeo debe cumplir los siguientes requisitos:
Todas las partes de la bomba en contacto con fluidos han de ser de

materiales inertes
El rango normal de presiones en HPLC es de 100 6000 psi (14.2 psi =
1 Bar) dependiendo del equipo utilizado. Esto correspondera a unos
flujos de rango 0.5 - 10mL/min, dependiendo de la geometra y
relleno de la columna, etc. La mayora de las bombas estn
preparadas para alta presin, pero se utiliza un sistema limitador de
presin (Cut-off) para evitar daos en otros componentes del
sistema como la celda de flujo del detector.
Algunas bombas de tipo flujo constante pueden producir un perfil de
presin pulsado. Si el detector usado es sensible al flujo se puede
producir ruido u ondulaciones de la lnea de base. Tales variaciones
de flujo son normalmente amortiguadas usando un volumen muerto
comprimible situado entre la bomba y el inyector (Damper). El
fabricante normalmente incorpora el dmper en el propio mdulo
de bombeo.
El volumen interno de la bomba debera ser lo ms pequeo posible.
Esto garantiza que los cambios en la composicin de la fase mvil
puedan ser rpidos durante el gradiente de elucin. Se evita de esta
forma que los tiempos de re-equilibrio resulten el paso limitante en
cualquier anlisis.
Los sellos de las bombas, arandelas, juntas y ocasionalmente los
pistones del cabezal de la bomba necesitan ser reemplazados, por lo
que deben ser de fcil acceso. Los asientos de las vlvulas
antirretorno tienen tendencia a desgastarse y necesitarn sustituirse
si se bloquean o quedan pegados. La forma ms efectiva de prolongar
el tiempo entre mantenimientos es filtrar la fase mvil y usar unos
procedimientos correctos de puesta en marcha y apagado
- 46 -
4.2 Bomba Recproca de Pistn Simple

El mayor reto de cualquier fabricante de bombas de HPLC es proporcionar
un flujo de fase mvil libre de pulsaciones. La simplicidad del cabezal de la
bomba de pistn simple es ideal para separaciones isocrticas, que
requieren un flujo fijo de un nico solvente durante todo el anlisis. La
incorporacin de un amortiguador de pulsos (damper) de bajo volumen
permite obtener un flujo libre de pulsaciones.
Adems de minimizar las pulsaciones de flujo gracias a la incorporacin de
un amortiguador de pulsos, los equipos de HPLC modernos pueden variar la
velocidad del pistn del cabezal de la bomba, de forma que su velocidad sea
menor en la etapa de dispensacin que en la etapa de llenado del pistn,
minimizando de esta forma los efectos de la pulsacin.
Principio de Operacin
Las vlvulas antirretorno (Check-Valves) vlvulas de Bola y Asiento
estn diseadas para permitir nicamente un flujo unidireccional de fase
mvil. La bola, hecha de un material qumicamente inerte como el rub,
se asienta en un asiento de zafiro sinttico.
En funcin de la posicin del pistn en un determinado momento la bola se
encuentra situada directamente contra el asiento, deteniendo de forma
efectiva el flujo de la fase estacionaria, o suspendida en el cuerpo principal
de la vlvula, donde ofrece poca resistencia al flujo de la fase mvil,
permitiendo su paso al sistema de HPLC.
- 47 -
Las imgenes ilustran el funcionamiento de las vlvulas de entrada y

salida durante los periodos de llenado y dispensacin de una bomba
recproca de pistn simple.
Aunque las vlvulas antirretorno proporcionan miles de horas de
funcionamiento ininterrumpido, son componentes consumibles, y como
tales requerirn de limpieza o sustitucin despus de un uso prolongado. Las
fases mviles sin filtrar, corrosivas o altamente tamponadas reducirn
considerablemente el tiempo de vida de las vlvulas antirretorno.
- 48 -
4.3 La Bomba Recproca de Doble Pistn

Comparndola con la bomba de pistn simple, el diseo de la bomba
recproca de doble pistn ofrece flujos ms reproducibles con la
correspondiente reduccin de las fluctuaciones de presin. Sin embargo, la
mayor complejidad del diseo de la bomba de doble pistn aumenta
tambin sus requerimientos de mantenimiento, puesto que el pistn
adicional y los sellos del mismo estn sometidos tambin a desgaste y
requieren sustitucin.
Principio de Operacin
Este diseo de la bomba es muy eficiente, porque mientras un pistn se est
llenando con fase mvil, el segundo pistn est entregando fase mvil al
sistema de HPLC. Este desfase de 180 en el funcionamiento del pistn
produce un flujo de fase mvil virtualmente libre de picos, y permite gran
reproducibilidad en gradientes de fase mvil. Este diseo se utiliza a
menudo junto con un amortiguador de pulsos, para obtener la menor
fluctuacin de presin posible durante la dispensacin de la fase mvil.
La imagen ilustra el principio de funcionamiento de la bomba recproca

de doble pistn.
- 49 -
4.4 La Bomba Binaria de Gradiente

Las bombas isocrticas sirven para atender las necesidades bsicas del
cromatografista moderno. Sin embargo, cuando se requiere un gradiente de
fase mvil, durante el cual se introduce gradualmente en la fase mvil un
solvente ms fuerte para eluir de la columna los analitos fuertemente
retenidos, se requiere un diseo de bomba ms sofisticado.
Hay dos formas bsicas de conseguir un gradiente en la fase mvil. La
primera es emplear dos bombas reciprocas trabajando al unsono esto se
denomina bomba binaria de gradiente. Las bombas binarias consisten en dos
canales de solvente, donde cada canal est conectado a una bomba
recproca idntica y el flujo de disolvente procedente de cada bomba se
combina en una cmara de mezcla de bajo volumen, un amortiguador de
pulsos, y finalmente una segunda cmara de mezcla.
Los flujos individuales de bombeo o ratio volumen/flujo- de cada una de
estas bombas recprocas estn controlados electrnicamente, permitiendo
mezclar proporcionalmente el solvente de los dos canales. Por lo tanto, si se
necesita un gradiente con la composicin de 50% del solvente A y 50% del
solvente B, las bombas trabajarn a flujos iguales, y si el flujo total deseado
es de 1mL/min, cada bomba entregar el solvente a 0.5mL/min.
Puesto que la mezcla de solventes se produce despus de las bombas, se
denomina mezcla a alta presin.
La imagen ilustra el principio de operacin de la bomba de gradientes de

doble pistn recproco
- 50 -
4.5 La Bomba Cuaternaria de Gradiente

Una solucin alternativa para la formacin de un gradiente de fase mvil es
usar solamente una bomba de doble pistn conectada a una vlvula
proporcional de cuatro canales controlada por el software. La vlvula
proporcional se encuentra entre el desgasificador y la bomba, y permite
introducir volmenes exactos de cada solvente en una cmara de mezcla,
suministrando despus la mezcla de solventes formada al sistema de HPLC.
Cada puerto de la vlvula solenoide permanece abierto slo una fraccin de
lo que se denomina ciclo de trabajo de la bomba. El gradiente de elucin
se consigue alternando la fraccin de este ciclo en que cada solenoide
permanece abierto, permitiendo que la fuerza de elucin efectiva de la fase
mvil cambie en funcin del tiempo. Por lo tanto, si el ciclo de la bomba es
de un segundo y la composicin del gradiente deseada es del 25% de
solvente A, 25% del solvente B, 25% del solvente C y 25% del solvente D,
cada solenoide permanecer abierto un cuarto de segundo, permitiendo a
las alcuotas de cada uno de los cuatro solventes mezclarse en igual
proporcin.
Las caractersticas individuales de viscosidad y compresibilidad de cada
solvente afectarn al funcionamiento de la vlvula de proporcin, y pueden
ajustarse convenientemente desde el software del instrumento.
En comparacin con la bomba de gradiente binario, donde la mezcla del
solvente ocurre despus de la bomba y se denomina mezcla a alta
presin, la bomba de gradiente cuaternario mezcla el solvente antes de la
bomba y se denomina mezcla a baja presin. Esta mezcla no es tan
efectiva como la producida a alta presin, y muestra:
Menor reproducibilidad del gradiente

Cuando se trabaja a flujos menores de 1.0mL/min p.ej., las bombas
de gradiente binario ofrecen mayor precisin y reproducibilidad que
las bombas cuaternarias. Adems, si existe una diferencia apreciable
en la proporcin relativa de los solventes mezclados, por ejemplo del
98% de solvente A y 2% del solvente B, de nuevo se obtendr mayor
reproducibilidad con un sistema de mezcla a alta presin que con uno
que emplee vlvula de mezcla a baja presin.
Efectos de Cavitacin
Durante la mezcla de disolventes en la vlvula proporcional pueden
generarse burbujas. Esto es debido a que los gases disueltos tienen
menor solubilidad en la mezcla final que en los solventes iniciales.
Lneas de base ruidosas y errticas

Durante la mezcla a baja presin podra producirse inmiscibilidad
entre los disolventes y formacin de burbujas. Estos efectos
producen cadas de presin en la mezcla, variacin de los flujos, y
contribuyen a lneas de base errticas y ruidosas.
- 51 -
La imagen muestra el funcionamiento de la vlvula proporcional en una

bomba recproca de doble pistn
4.6 Formacin de Gradientes y Tiempo Muerto

(Dwell-Time)
El volumen interno de una bomba de HPLC debera ser idealmente lo ms
pequeo posible, esto permite una rpida formacin del gradiente y adems
una transferencia efectiva de los mtodos con gradiente entre sistemas
intra- e inter-laboratorio. El tiempo que se necesita entre la formacin del
gradiente de solvente hasta que ste llega al comienzo de la columna
analtica se denomina tiempo muerto del sistema (tD).
El tiempo muerto del sistema se calcula determinando primero el volumen
muerto del sistema (VD), que es caracterstico del volumen extra-columna
mostrado por la bomba y la longitud total de los conectores entre el HPLC, y
se determina como sigue:
- 52 -
Clculo del Volumen Muerto del Gradiente

1.
Quitar la columna y conectar el inyector al detector mediante una

pequea unin de 0.010-in. d.i. (o menor) esto se suele denominar
capilar de restriccin. Un regulador de contrapresin despus del
detector ayudar a mantener la suficiente presin en el sistema para
un buen funcionamiento de la vlvula antirretorno (Check-Valve).
2.
Como solvente A usar agua calidad HPLC, y como solvente B aadir

alrededor de 0.1% de acetona a agua HPLC (tambin puede usarse
metanol o acetonitrilo en lugar de agua).
3.
Ajustar la longitud de onda a la mxima absorbancia del compuesto

aadido (265nm para la acetona).
4.
Realizar un cromatograma a 100% de A y otro a 100% de B, ajustando la

escala de absorbancia en los datos del sistema, para que ambas seales
del solvente muestren una seal dentro de la escala
5.
Programar un gradiente lineal de 0-100% B en 10min a 2mL/min. Las

condiciones exactas no son crticas, simplemente asegrese que el
volumen total del gradiente es al menos de 20mL. Mantenga una etapa
isocrtica al 100% B durante al menos 5min al final.
El cromatograma resultante debera aparecer aproximadamente como
en la figura superior. La etapa isocrtica al principio de la grfica
representa el volumen muerto del sistema (VD), seguido por la etapa
de gradiente, y finalmente la etapa isocrtica mantenida hasta el final.
La curvatura del cromatograma debera ser mnima al final del
gradiente, y debera ser lineal excepto al principio y al final.
- 53 -

6.
Determinar en primer lugar el tiempo de retencin del sistema

situando el tiempo a mitad de gradiente (t1/2) la mitad de la
distancia vertical entre el inicio y el final de los segmentos isocrticos;
9.2min para el cromatograma descrito.
Restar a continuacin la mitad del tiempo de gradiente; 10min/2 =
5min para este ejemplo de (t1/2)
El resultado es el tiempo muerto del sistema (tD); 9.2min 5min =
4.2min.
Finalmente transformar tD en volmen muerto (VD) multiplicando por
el flujo empleado en el mtodo p.ej. 4.2min x 2mL/min = 8.4mL.
Es esencial que los tiempos de equilibrio de la columna y del sistema se

controlen durante el re-equilibrio del gradiente. Esto es, en este ejemplo,
el tiempo total de equilibrio usando una columna de 150 x 4.6mm a un flujo
de 2mL/min sera:
4.2 min (tD) + (1.7ml (volumen muerto de la columna) / 2ml/min x
nmero de volmenes de columna)
O para un re-equilibrio de 5 volmenes de columna:
4.2 + ((1.7/2) x 5 = 8.45min
O para un re-equilibrio de 10 volmenes de columna:
4.2 + ((1.7/2) x 10) = 12.7min
Los sistemas de mezclado a alta presin con bombas binarias pueden
conseguir volmenes extra-columna muy pequeos. Las mezclas a alta
presin proporcionan los menores volmenes muertos ya que el gradiente se
forma despus de la bomba, esto se traduce en un menor tiempo de
retencin cuando se requieren gradientes rpidos o muy rpidos. Quitar la
segunda cmara de mezcla reduce an ms el volumen de retencin.
El volumen efectivo de mezcla de un sistema de gradiente cuaternario a
baja presin necesita ser mayor que para un sistema de gradiente binario a
alta presin para asegurar una correcta mezcla de solventes. Este hecho
incrementa el volumen muerto, haciendo que la respuesta de estos sistemas
se alargue y los cambios en el gradiente se muestren apreciablemente ms
lentos.
Ajustar el volumen de retencin (VD) a su HPLC le permitir una
transferencia del mtodo ms eficaz. Compensando los diferentes
volmenes muertos en diferentes sistemas, los tiempos de retencin de los
analitos y por lo tanto el perfil del cromatograma pueden mantenerse
idnticos.
- 54 -
4.7 Incidencias de la Bomba

La Vlvula de Purga
La causa ms probable de un incremento de presin en el sistema es un
bloqueo parcial en la primera frita despus del sistema de inyeccin El
filtro In-Line o la pre-columna- sin embargo si ninguno de estos dos
elementos estn instalados, el problema puede venir de la cabeza de la
propia columna. Si tales aumentos de presin son comunes, es
recomendable seguir algunas medidas preventivas adicionales, como instalar
un filtro de lnea o someter a las muestra a una filtracin previa antes de su
inyeccin.
El conjunto de vlvula de purga contiene PTFE como frita en la mayora de
los sistemas de HPLC. Est diseado para eliminar los depsitos que puedan
provenir de los sellos de los pistones arrastrados por la fase mvil. Cuando
esta frita se bloquea se produce un incremento en la contra presin del
sistema. Si esta presin llega aproximadamente a los 10 Bar mientras se
bombea fase mvil con la vlvula de purga abierta, debe cambiarse la frita
No sustituir la frita puede dar como resultado una lnea de base errtica
- 55 -
El material del sello del Pistn puede ser arrastrado hasta bloquear la frita
y la parte superior de la columna analtica. Los bloqueos en este punto
retrasan la entrada de los analitos en la columna, produciendo picos no
uniformes con hombros. Este tipo de picos tambin pueden originarse por
otro tipo de anomalas, pero una frita de columna bloqueada, a menudo
provocar hombros en todos los picos cromatogrficos
Una frita de Columna bloqueada por restos del sello de los pistones
produciendo picos con hombro
Pistn y Sellos
Los sellos del Pistn estn diseados para desgastarse con el uso, siendo su
vida til muy dependiente del tipo y de la concentracin de las fases
mviles tampn que se utilicen.
Una fuga en el sello del pistn provoca fluctuaciones en la lnea de base

como podemos observar en el grfico:
Lnea de base sinusoidal indicativa de un pistn rallado o sello con fugas

- 56 -

Cualquier cambio del sello del pistn deber implicar una inspeccin visual
del mismo, ya que si existen araazos en la superficie del pistn, pueden
llevar prematuramente al fallo del nuevo sello reemplazado. Antes de la
inspeccin del pistn se deben limpiar los posibles depsitos de sales,
principalmente los restos de los tampones o del sello, utilizando un trapo
limpio, sin pelusas, empapado con una mezcla 1:1 de H2O:MeOH , y solo en
una direccin , desde la base hacia el extremo.
Luego, lo examinaremos con luz brillante y con la ayuda de una lupa para
verificar que no hay presente ningn araazo o estras.
Los sellos del Pistn estn diseados con frecuencia para deformarse con el
fin de ajustarse al pistn con el que estn emparejados. En consecuencia es
posible que haya que sustituir el pistn y el sello al mismo tiempo.
Nota: Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen e incluyen accesorios
integrados para la limpieza continua de los sellos facilitando as la
eliminacin de los depsitos de cristal que proviene de los tampones
alrededor de los sellos. Con estos accesorios se hace pasar una solucin de
lavado por los sellos de pistones para aumentar la vida til de los mismos.
Una buena solucin para lavado es la formada por un 10% de isopropanol en
agua.
En algunos casos esta solucin de lavado tambin sirve para lubricar el
movimiento del pistn a travs de un segundo conjunto de sellos residente
en el propio hardware del sello. En ese caso debe usarse siempre una
solucin de lavado, incluso aunque no se empleen tampones como fase
mvil.
- 57 -
Vlvulas Antirretorno
La cristalizacin de los tampones, el crecimiento microbiano en las botellas

de los disolventes y el aire pueden perjudicar el sellado entre la bola de
rub y el soporte o asiento de zafiro en la vlvula antirretorno. La
sedimentacin y el crecimiento microbiolgico pueden provocar que este
problema permanezca constantemente. En estos casos puede observarse una
lnea base con fluctuaciones caractersticas y repetitivas:
Tpica lnea de base producida por una vlvula antirretorno defectuosa

Para regenerar una vlvula antirretorno pegada o parcialmente bloqueada,
se puede seguir el siguiente proceso de limpieza:
Sonicar durante 10mins en una mezcla 1:1 de H2O:MeOH (1:1)
Sonicar durante 10mins en 0.1M HNO3.
Sonicar durante 5mins in MeOH antes de reinstalarla
- 58 -
Burbuja(s) de Aire en el Cabezal de la Bomba

La captura de aire es un problema relativamente comn en bombas de
pistn recproco, producindose en aquellos componentes del sistema que
estn contacto directo con la fase mvil como las vlvulas de entrada y
salida, pistn, sello del pistn, y cabezal de la bomba.
Las burbujas en el interior de los cabezales de la bomba a menudo generan
una lnea de base de tipo sinusoidal:
Las burbujas de aire, si no se introducen directamente en el sistema por una

deficiente desgasificacin de la fase mvil, pueden formarse por la creacin
de un ligero vaco en el cabezal durante el ciclo de succin (llenado) de la
bomba. La combinacin de baja presin, permitiendo la desgasificacin, y
los puntos de nucleacin de la superficie de de los componentes son
ideales para la creacin de burbujas.
La vlvula proporcional, utilizada para la mezcla en los sistemas a baja
presin
para la creacin las condiciones isocrticas o en gradiente
requeridas, puede tambin introducir burbujas debido a la menor
solubilidad del aire en la mezcla de solventes comparada con la de los
solventes puros individuales. Este efecto se denomina cavitacin.
Una vez que la pequea burbuja se ha formado puede actuar en realidad
como un amortiguador de presin, amortiguando el efecto de succin y
dispensacin de la bomba, haciendo que sta proporcione un flujo bajo y a
menudo errtico. Aflojar ligeramente las conexiones de las vlvulas de
salida y dejar fluir fase mvil del cabezal de la bomba puede servirnos para
purgar las burbujas de aire. En la mayora de las ocasiones simplemente
abrir la vlvula de purga y aumentar el flujo de fase mvil - a flujos de hasta
5mL/min- ser suficiente para eliminar las burbujas de aire presentes.
- 59 -
Una disminucin de la presin de trabajo generalmente implica una fuga en

el sistema. Debe corregirse apretando, reajustando o cambiando el conector
defectuoso. Los fabricantes a menudo incorporan un test especfico para el
diagnstico de fugas, que puede realizarse para verificar la integridad del
cabezal de la bomba y otros componentes del sistema. El fallo en alguna
parte del test puede relacionarse con el mal funcionamiento de algn
componente especfico del sistema cromatogrfico reducindose as el
tiempo en que el instrumento queda fuera de operacin al detectarse ms
rpidamente la avera.
- 60 -
Tutorial 1
Pregunta 1
Del siguiente listado de componentes selecciona aquellos que contribuyen a
un ensanchamiento de las bandas cromatogrficas, es decir, disminuyen la
eficiencia en un sistema tpico de HPLC
Componente HPLC
Si/No
Tubos de conexin
Filtro de Lnea
Cabezales de la bomba
Guarda-columna
Inyector
Conexiones-uniones
Celda de flujo del Detector
Botellas de disolvente
Columna Analtica
- 61 -
Pregunta 2
La ilustracin siguiente es el diagrama esquemtico de un cabezal de doble
pistn recproco. Identifica y etiqueta cada componente.
Usando la tabla siguiente, explica cual es la funcin de cada uno de los

componentes e indica cul es su fallo asociado ms frecuente
Componente
del Equipo
Funcin
Incidencia
- 62 -
Pregunta 3
Evaluar el problema propuesto en el siguiente cromatograma y sugerir las
posibles causas y cmo podemos corregirlo
Pregunta 1
Observaciones:
Posible(s) Causa(s) y Solucin(es):
- 63 -
Pregunta 4
Un gas disuelto en la fase mvil puede provocar mltiples problemas
cromatogrficos. Considera stos y completa la siguiente tabla.
Problema Observado
Causa
Accin Correctora
- 64 -
Inyectores
El Objetivo de esta seccin es:
Describir la funcin del sistema de inyeccin del HPLC.

Explicar los principios de operacin de los sistemas de inyeccin HPLC
ms comunes.
Enumerar y describir las incidencias ms frecuentes y los
procedimientos de mantenimiento.
5.1 Componentes del Sistema de Inyeccin

El sistema de inyeccin se encuentra situado despus de la bomba, estando
por lo tanto localizado en la parte alta presin del sistema de suministro de
solventes. La inyeccin de una muestra (a baja presin) en el sistema
representa una etapa crtica del proceso cromatogrfico. Las vlvulas de
inyeccin de muestra, o vlvulas de conmutacin, permiten la introduccin
de cantidades precisas de muestra en el sistema y en la columna.
Inyectando directamente en el flujo de fase mvil a alta presin se elimina
la necesidad de parar el flujo de fase mvil, minimizando as de forma
efectiva cualquier perturbacin en la lnea de base cromatogrfica
realizando un cambio, esencialmente libre de pulsaciones, en la direccin
del flujo de fase mvil.
La figura siguiente muestra la vlvula de conmutacin Rheodyne de 6
puertos y dos posiciones, cuyo diseo conforma la base para todas las
vlvulas de inyeccin. La vlvula se compone de una parte esttica
(stator) enfrentada a un sello giratorio (rotor seal), en el que se han
mecanizado unos canales entre los puertos que permiten que el flujo de
fase mvil evite el loop(*) de inyeccin (by-pass) para la carga de muestra
(load), o vaya hacia l (inject) para la inyeccin de la muestra.
En la posicin intermedia entre load e inject, el sello del rotor bloquea
momentneamente el flujo de fase mvil hacia la columna. Este bloqueo
causa un pulso de presin en cabeza de columna, porque por un tiempo
finito el flujo efectivo de fase mvil cae a cero. Puesto que tales pulsos no
son deseables, la vlvula debe girarse lo ms rpidamente posible para
minimizar cualquier pulso de flujo y presin. Adems, estos repetidos
choques de presin pueden daar la columna, comprimiendo su fase
estacionaria y provocando la aparicin de volmenes muertos que
producirn formas de pico cromatogrfico defectuosas, ejemplificadas por
la aparicin de hombros y desdoblamiento en los picos.
(*) La traduccin de LOOP es BUCLE pero ha preferido mantenerse la palabra
inglesa original por la generalizacin de su uso en el argot cromatogrfico.
- 65 -
Componentes de una vlvula de conmutacin Rheodyne de 6 puertos

El Rotor es un disco fabricado normalmente en material polimrico Vespel.
Esta poliimida confiere al rotor unas caractersticas de bajo desgaste y alta
Resistencia, admitiendo un rango de pH de 010.
Figura mostrando rotores de inyeccin de Vespel

.
Para fases mviles con pH sobre 10 se recomienda un Rotor Seal compuesto
de material polimrico Tefzel o PEEK, ya que ambos proporcionan mayor
resistencia qumica y versatilidad en el rango completo de pH de 114. Los
cidos oxidantes fuertes, como el cido Ntrico o el Sulfrico no son
compatibles con PEEK.
- 66 -
Figura mostrando el rango de pH de los diferentes materiales

NB: los colores de pH mostrados son slo con fines ilustrativos
El rotor est situado internamente en el cuerpo de la vlvula de inyeccin, y
hace un cierre a alta presin contra la cara del esttor. Como el rotor gira
fsicamente en cada secuencia de inyeccin, y sufre un deterioro de los
canales entre los puertos por la exposicin a un pH alto y por las raspaduras
producidas por la fase mvil o partculas contenidas en los solventes, se
desgastar con el uso. En consecuencia, este es uno de los componentes del
HPLC que necesitarn una sustitucin rutinaria.
La cara del esttor y el cabezal permiten la introduccin y expulsin de la
fase mvil a travs de los puertos capilares especficos de entrada y salida.
El puerto de inyeccin facilita el llenado del loop de muestra con una
jeringa, mientras que el puerto de desechos (waste) ventea el loop
permitiendo que se elimine el exceso de muestra.
Existen varias configuraciones para la inyeccin de un determinado volumen
de la solucin de muestra en la fase mvil; uno, muy ampliamente utilizado
emplea un loop de inyeccin de volumen pre-determinado. Este loop puede
llenarse de dos formas distintas:
Llenado Completo del Loop

Puesto que el loop contiene fase mvil, la solucin de muestra introducida
se mezclar y se diluir necesariamente con esta fase mvil residente
mientras la desplaza. Por tanto, para que el loop se rellene de forma
homognea, debe inyectarse un volumen de solucin de muestra de entre 2
y 5 veces el volumen del loop, eliminando as cualquier posible efecto de
dilucin.
Aunque el loop controle efectivamente el volumen de muestra inyectada,
haciendo que la cantidad de muestra introducida por la jeringa no sea un
parmetro critico, para obtener mxima precisin y linealidad es una
prctica recomendada cargar siempre el loop con el mismo volumen de
muestra p.ej. 3x volumen del loop 10%, En consecuencia, para un loop de
100L se correspondera con un volumen de 270330L por inyeccin. La
- 67 -

reproducibilidad es esencial para mantener la precisin y exactitud; El
volumen absoluto inyectado es de menor importancia.
Llenado Parcial del Loop

La tcnica de llenado parcial del loop se utiliza habitualmente cuando es
importante ahorrar una muestra valiosa o limitada. Para obtener la mejor
precisin posible el volumen de muestra inyectada no debe superar el 50%
de la capacidad del loop del inyector. Durante la carga del loop, la muestra
introducida empuja a la fase mvil de su interior envindola fuera a
travs de la salida de desechos (waste), y durante ese proceso de
intercambio el frente de muestra se diluye.
Este efecto de dilucin est causado por el perfil de flujo parablico de un
lquido en movimiento por el interior de un segmento de tubo ya que
debido al flujo laminar, el centro de la corriente de fluido se mueve ms
deprisa que la capa de lquido que est cerca de la pared del tubo. Una
forma de evitar la citada discriminacin durante la inyeccin es inyectar una
burbuja de aire inmediatamente delante del volumen de muestra inyectado.
De esta forma se evita cualquier posible mezcla de la solucin de muestra
con la fase mvil contenida en el loop.
La consecuencia de este fenmeno es que la muestra diluida ocupa en
realidad unos 2L del volumen del loop por cada 1L de la muestra cargada
con la jeringa. Por lo tanto, asegurndonos de cargar <50% del volumen
efectivo del loop, evitamos que el frente de la banda de muestra diluida
salga del loop y provoque errores relacionados con la precisin y a la falta
de reproducibilidad.
Este efecto se muestra en el siguiente conjunto de figuras, que ilustra los
efectos de la dilucin de muestra en el rea de pico obtenida:
- 68 -
1.
Injeccin de 1L de muestra en un loop de volumen fijo de 20L. Los

efectos de flujo laminar crean un tamao de muestra diluida de 2L.
2.

3.

4.
Inyeccin de 20L de muestra en un loop de volumen fijo de 20L. El

volumen de inyeccin es el mismo que un llenado completo del loop.
Los efectos de flujo laminar crean un volumen de muestra
ligeramente diluido.
- 69 -
La figura anterior muestra los efectos de dilucin representando el rea

obtenida frente a los diferentes volmenes de inyeccin en un loop de
volumen fijo de 20
L.
Cuando se carga un volumen <10L de muestra existe una relacin lineal
entre el volumen introducido en el loop y la cantidad de muestra inyectada
en columna. Cuando se cargan >40L, el volumen real inyectado es 5% del
volumen del loop.
Sin embargo, en el rango entre 1040L se observa una relacin no-lineal
diferente.
Despus de la inyeccin son necesarios 510 volmenes de loop para
desplazar completamente la muestra del mismo. Se recomienda por tanto,
mantener el inyector en la posicin "inject" (paso principal) el tiempo
necesario para permitir que la fase mvil fluya a travs del loop arrastrando
completamente la muestra.
- 70 -
5.2 Automuestreadores
Los automuestreadores son ampliamente utilizados en los laboratorios de
anlisis para aumentar el n de muestras analizadas, mejorar la precisin,
eliminar la necesidad de que haya personal presente para hacer las
inyecciones manuales y reducir los costes laborales asociados al anlisis
rutinario.
Aunque los fabricantes han diseado automuestreadores bajo diferentes
principios y estrategias, todos ellos incluyen cuatro componentes esenciales
que permiten el automatismo mecnico del sistema de inyeccin manual:
1.
2.
3.
4.
Las muestras se mantienen en viales de tamao estndar. Cada vial

est sellado con un septum, que, o bien es parte integral del tapn, o
se ajusta en su lugar gracias a ste, evitando la evaporacin selectiva
del disolvente de la muestra y los consiguientes de cambios en su
concentracin.
Los viales estn situados en gradillas que permiten un orden de
inyeccin aleatorio o en serie. Dichas gradillas pueden ser
termostatizadas para evitar la degradacin de las muestras
trmicamente lbiles.
Se emplea una aguja de inyeccin para penetrar el septum, y tomar el
volumen de muestra requerido para la inyeccin. Dependiendo del
automuestreador, dicha aguja puede ser fija o intercambiable.
Una vlvula de inyeccin commutable que permite la introduccin de la
muestra en el loop previamente a la inyeccin. La conmutacin de
dicha vlvula de inyeccin se realiza bien por un actuador neumtico o
elctrico.
La mayora de automuestreadores emplean alguna de las tres

configuraciones de carga siguientes, en las que la muestra es o bien
extrada o empujada hacia un loop de volumen fijo, o bien la aguja de
inyeccin es parte integral del loop de inyeccin.
5.2.1
Automuestreador
Llenado
de
Extraccin-
Este diseo de automuestreador extrae la muestra en la direccin del loop

por succin con la jeringa. Debido a su simplicidad y fiabilidad fue muy
popular, pero actualmente es redundante debido a los otros dos diseos.
A continuacin se muestra el esquema de operacin de este tipo de
automuestreador. Se une una jeringa al puerto de desechos y una aguja,
por medio de tubos de conexin, al puerto de inyeccin. La aguja se inserta
en el vial y extrae muestra de ste hasta que se ha llenado el loop con el
volumen de inyeccin especificado. El giro posterior del rotor de la vlvula
de inyeccin permite arrastrar la muestra contenida en el loop hacia la
cabeza de columna.
- 71 -
Load
Position
Inject
Position
Aunque es a la vez simple y fiable, este diseo de automuestreador adolece

de una excesiva prdida de muestra durante la secuencia de inyeccin.
Como muestra la figura, es necesario mucho volumen de muestra para llenar
la aguja y sus tubos de conexin antes de llegar al loop, y en consecuencia
se pierden entre 10100L de muestra por inyeccin.
- 72 -
5.2.2
Automuestreador de Empuje-Llenado
En este diseo de automuestreador la aguja se mueve hacia el vial, toma el

volumen requerido de muestra y se mueve entonces hacia el puerto de
inyeccin para empujar la muestra al interior del loop. El llenado y
vaciado de la jeringa se controla con un motor de pasos que es capaz de
ofrecer una dispensacin de volumen precisa y reproducible.
Aunque generalmente queda un pequeo volumen residual de muestra en la
aguja y su capilar de conexin, ste diseo no presenta el gran desperdicio
de muestra mostrado por el diseo extraccin-llenado, y en consecuencia
requiere un menor volumen extra de muestra. Esta caracterstica es una
ventaja para el anlisis de trazas, donde a menudo el volumen de muestra
disponible es limitado.
Load
Position
Wash
Step
Inject
Position
- 73 -
5.2.3
Automuestreador de Loop Integrado
Aunque es ms complicado de operacin que los dos diseos previos, las

caractersticas del diseo del automuestreador de loop integrado aseguran
que no haya prdidas de muestra y como consecuencia de ello haya ido
aumentando su popularidad.
La serie de figuras mostrada a continuacin ilustra la secuencia de eventos
de carga e inyeccin de muestra:
1.
Se dispensa y/o succiona un disolvente de lavado a travs del loop, con

la aguja asentada firmemente en un asiento de aguja de alta presin.
2.
Despus de lavar la aguja, sta se mueve hacia el vial, donde se extrae

el volumen especificado de muestra directamente hacia el loop por
medio de un sistema de medida calibrado. El sistema de medida se
compone de un pistn y su sello, que pueden desgastarse produciendo
fugas y volmenes de inyeccin no reproducibles.
3.
La aguja se inserta de nuevo en el asiento de inyeccin de alta presin

y el rotor de la vlvula de inyeccin se mueve hacia su posicin de
inyeccin con lo que la muestra es arrastrada hacia la cabeza de
columna.
Puesto que la muestra se encuentra completamente contenida en la porcin

del loop barrida por la fase mvil, se inyecta toda la muestra que fue
extrada del vial. Adems, el lavado continuo de la vlvula de inyeccin y el
loop, que se produce tras la inyeccin, elimina los efectos de memoria
(sample carry-over).
El volumen mximo que puede inyectarse es funcin del tamao del loop
integrado, tpicamente 100L. Los fabricantes ofrecen tambin una
funcin de multi-extraccin (multidraw option) para compensar esta
limitacin en el volumen de inyeccin. Cuando se emplea esta opcin se
permite que varios volmenes de 100L sean combinados hasta un mximo
de 1.400mL aumentando as el volumen de inyeccin y ayudando al anlisis
de trazas.
La parte ms dbil de este diseo de automuestreador es el sello de alta
presin, que tras las repetidas inserciones de la aguja eventualmente se ir
desgastando y fugar siendo necesaria su sustitucin.
- 74 -
La ruta que sigue la fase mvil en su

paso por el automuestreador se
denomina a veces main pass o
camino principal
El sello del Rotor gira para permitir a la

aguja que entre en el vial de muestra y al
pistn que extraiga sta hacia el loop.
La Fase Mvil evita (by-pass) los
principales componentes del sistema de
inyeccin. Esta posicin se conoce
frecuentemente como posicin de bypass
o de cargaLoad
Posicin de
Carga
El Rotor vuelve a su posicin inicial

(main pass) y la Fase Mvil empuja
la muestra contenida en el loop
hacia la columna
Posicin de
Inyeccin
- 75 -
5.3 Incidencias del Automuestreador

La tabla siguiente muestra los problemas citados con ms frecuencia sobre
los automuestreadores:
Problema
% del Total
Obstruccin de la aguja de muestra
22
Mala precisin y reproducibilidad
17
Problemas mecnicos
14
Posicin de la Gradilla e
Identificacin de la muestra
12
Efecto Memoria
Fugas
Sellos
Prestaciones
Otros
Fuente LC-GC Europe Volume 4, No.5 (1986) Pg. 416420
La aguja de muestra
La obstruccin de la aguja de muestra es el problema ms frecuente que
presentan los automuestreadores. Una preparacin adecuada de la muestra
ayudar por lo general a reducir el nmero de problemas creados por
partculas, bien filtrando o centrifugando las muestras antes de su
inyeccin.
Para desbloquear una aguja obstruida se recomienda la siguiente secuencia
de limpieza:
1.
2.
3.
Empape la aguja con un disolvente apropiado p.ej. isopropanol.

No sonique la aguja si est soldada al capilar ya que existe la
posibilidad de que se fracture o se rompa por la unin.
Intente desplazar la obstruccin con un alambre.
Conecte la aguja a la bomba por medio de un capilar y haga fluir
disolvente con presiones progresivamente crecientes para reventar la
obstruccin.
- 76 -
El asiento y el capilar de alta presin
Las fugas en esta zona son por lo general

detectables a simple vista y bastante evidentes.
El asiento de la aguja se deformar para ajustarse
a la forma exacta de la aguja, por lo que la aguja
y el asiento debern cambiarse al mismo tiempo
La muestra y la fase mvil comienzan a mezclarse justo despus del asiento

de aguja de alta presin. Este capilar es propenso a obstruirse bien por
partculas de desolvatacin de las muestras o de los tampones slidos. El
ruido espordico (Spikes) en la inyeccin es un indicador de tales
obstrucciones.
El Rotor Seal
El Efecto memoria, junto a una mala precisin en areas y alturas, son
indicios de un rotor seal agotado. El rotor seal debe revisarse para buscar
sntomas de desgaste, especialmente un ahondamiento en los microcanales
entre los puertos que puede generar puntos de retencin de muestra
localizados. Estos puntos se limpian en la siguiente inyeccin produciendo
un mini-cromatograma o picos fantasma.
Un pico fantasma causado por contaminacin en el rotor seal
- 77 -
Figura mostrando la adsorcin y efecto memoria de un rotor seal

Algunos materiales de rotor pueden adsorber menos la muestra que otros
por lo que puede merecer la pena investigar si el efecto se reduce o se
elimina cambiando entre Vespel, Tefzel y PEEK.
El lavado regular con fase mvil puede ayudar a minimizar la contaminacin
del rotor seal.
- 78 -
Ajuste del volumen de inyeccin al poder de elucin del

disolvente de la muestra
En condiciones ideales el poder de elucin del disolvente de la muestra no
debera afectar a la separacin cromatogrfica, ya que ste se diluira de
forma instantnea hasta tener la misma composicin que la fase mvil.
Sin embargo, esta dilucin del disolvente de la muestra lleva en la prctica
un periodo de tiempo finito para que la fase mvil la realice.
Las siguientes figuras ilustran el deterioro de la forma de pico debido a una
inadecuada combinacin de disolvente de muestra y fase mvil, mostrando
la inyeccin de una mezcla test de cuatro componentes disueltos en
diferentes disolventes y separados en una columna C18 de fase reversa en
condiciones isocrticas de MeOH:H2O 60:40 (v/v).
En cada cromatograma la mezcla test estaba disuelta en:
(a) Fase Mvil

(b) Tetrahidrofurano
(c) Etanol
(d) Butanol
La siguiente tabla proporciona unas guas para elegir el volumen de

inyeccin en funcin del poder de elucin de los disolventes de la muestra
con respecto a la fase mvil.
Fuerza Eluotrpica del Disolvente
Volumen Mximo de Inyeccin
100% Disolvente Fuerte
10L
Algo ms fuerte que la Fase Mvil
25L
Fase Mvil
15% del volumen de pico
Ms dbil que la Fase Mvil
Grande
- 79 -
100% Disolvente Fuerte

En esta exigente situacin es necesario mantener el volumen de inyeccin lo
ms bajo posible para evitar la distorsin de los picos. La recomendacin es
no superar los 10L. Cuando el disolvente de la muestra es ms fuerte que
el 80% de Fase Mvil se pueden inyectar volmenes mayores puesto que la
diferencia de composicin entre el disolvente de la muestra y la fase mvil
es proporcionalmente menor.
Ms Fuerte que la Fase Mvil

Cuando el disolvente de la muestra no es ms de un 25% ms fuerte que la
fase mvil, es posible inyectar volmenes de hasta 25L. Observe no
obstante el cromatograma para vigilar la posible distorsin en los picos dada
la interrelacin existente entre esta regla y la anterior.
En general, los problemas de solubilidad de los analitos son la razn
principal para aumentar el poder de elucin de los disolventes de muestra
empleados. Para minimizar las variaciones de poder elucin en la inyeccin,
se recomienda disolver el analitos en una alta concentracin del disolvente
de mayor poder de elucin y despus, diluirlo con el disolvente ms dbil
para corregir progresivamente la diferencia de fuerza eluotrpica. En el
peor escenario posible hay que disolver la muestra en un 100% de disolvente
fuerte y mantener el volumen de inyeccin al mnimo posible.
Fase Mvil
La mejor situacin posible es que el disolvente de la muestra y la fase mvil
sean iguales, tanto en poder de elucin como en pH. En esta situacin,
debido a la homogeneidad de disolventes, no hay que preocuparse por los
efectos de dilucin.
Sin embargo, el volumen de inyeccin es limitado. La contribucin del
volumen de inyeccin al ensanchamiento del pico cromatogrfico puede
determinarse con la siguiente ecuacin:
Vol. Muestra.Inyectada2 + Vol.PicoColumna2 = Vol.PicoTotal2
Si el pico ms estrecho (p.ej. el primero) fuese de 30 de anchura a lnea de
base, Su volumen de pico en columna (Vol.PicoColumna) a un flujo de 1mL/min
sera igual a,
(1mL/min / 60) x 30 = 500L
En consecuencia, el volumen mximo de muestra que puede inyectarse sin
aumentar el ancho de pico ms de un 1% sera igual a,
Vol.
Vol.
Vol.
Vol.
Vol.
Muestra.Inyectada2 = Vol.PicoTotal2- Vol.PicoColumna2

Muestra.Inyectada2 = (505L)2 (500L)2
Muestra.Inyectada2 = 5025
Muestra.Inyectada = 5025
Muestra.Inyectada = ~70L
- 80 -
Ms Dbil que la Fase Mvil

Para establecer el efecto del poder de elucin de la fase mvil hay que
considerar la Regla de Tres, que establece que un cambio del 10% en el
disolvente fuerte producir aproximadamente un cambio de tres veces en el
tiempo de retencin de los analitos.
Por lo tanto, si un pico cromatogrfico tiene un tiempo de retencin de
5min en una fase mvil 40:60 agua:acetonitrilo, en una fase mvil de 60:40
agua:acetonitrilo su tiempo de retencin aumentar hasta aproximadamente
45min (3 x 3 x 5min = 45min).
En consecuencia, si la muestra se inyecta en 60:40 agua:acetonitrilo, las
molculas de analito viajarn ms lentamente a travs de la columna, hasta
que el disolvente de muestra sea completamente diluido por la fase mvil.
Las bandas cromatogrficas que se mueven ms lentamente que la fase
mvil tienden a comprimirse, debido a que la fase mvil alcanza a las
molculas de analitos en la cola del pico tendern a moverse ms rpido
en la columna, cazando a las molculas de analito adelantadas que se
encuentran en la fase mvil de menor poder de elucin.
Cuando la diferencia entre la fuerza eluotrpica del disolvente de la
muestra y la de la fase mvil aumenta, es posible aumentar
progresivamente cada vez ms el volumen de inyeccin. Este aumento
permite un enfoque, o concentracin de los analitos en la columna y se
emplea a menudo en anlisis medioambientales para facilitar la deteccin
de trazas de pesticidas.
Excepciones a lo anterior son los casos en que la fase mvil contenga
aditivos a nivel de traza, en ese caso se recomienda siempre inyectar las
muestras disueltas en fase mvil. P.ej. las separaciones por par-inico se
basan en el equilibrio entre el reactivo de par-inico entre la fase mvil y la
estacionaria. Si se inyecta la muestra en un disolvente que no contenga el
par-inico este equilibrio se desplaza a la fase mvil provocando distorsin
en los picos.
Aunque las inyecciones de loop parcial son generalmente menos precisas
que las que realizan el llenado completo del loop, este problema se reduce
con los automuestreadores gracias a que su elevada precisin en la
inyeccin hace que este error sea constante.
En condiciones normales la lnea de desechos (waste) de los a
automuestreadores de loop integrado nunca se utiliza. Pueden aparecer
problemas de precision cuando la lnea de desechos se obstruye
parcialmente con sales de los tampones o cualquier otro residuo de la
evaporacin del disolvente de la muestra. Se recomienda lavar la lnea de
desechos regularmente, lo que ser una prctica habitual de la operacin
con automuestreadores.
- 81 -

Debe considerarse la viscosidad del disolvente de la muestra. Si la aguja de
inyeccin intenta extraer a demasiada velocidad el volumen de un
disolvente viscoso, puede que el volumen de inyeccin seleccionado no
entre completamente en el loop. Este fenmeno se denomina cavitacin,
y produce formacin de burbujas, comprometiendo la repetibilidad del
automuestreador.
Pueden aparecer tambin problemas de precisin si el vial de muestra se
llena en exceso. En estas circunstancias se produce un vaco parcial, que es
suficiente para producir cavitacin cuando se extrae la muestra. Se
recomienda no llenar los viales a ms de tres cuartos de su capacidad para
minimizar el impacto de dichos efectos.
- 82 -
Problemas Mecnicos
Una operacin fiable del automuestreador requiere que se mantenga limpio
y se compruebe regularmente su adecuado ajuste. Hay que limpiar
rpidamente todas las salpicaduras de tampones y/o reactivos para prevenir
la creacin depsitos, que pueden corroer o restringir el movimiento del
automuestreador. Por esta razn los viales de muestra nunca deben
rellenarse cerca del autoinyector.
Debe comprobarse peridicamente el alineamiento de la gradilla de
muestras, muchos fabricantes incorporan mensajes de error en sus softwares
para avisar que la gradilla no est o est incorrectamente colocada.
Muy importante, el automuestreador es una parte del sistema HPLC que
debe lavarse exhaustivamente con fase mvil despus de anlisis de
muestras con tampones o fases mviles tamponadas. Reemplazar en primer
lugar el componente tampn de la fase mvil por H2O para eliminar
cualquier depsito de sales potencialmente corrosivas en la vlvula de
inyeccin, aguja del inyector y capilares. Despus, extrayendo la columna si
fuera necesario, lavar con H2O para asegurar que todas las trazas de las
sales del los tampones se eliminan completamente.
Posicin de la Gradilla e Identificacin de Muestra

Las
muestras
incorrectamente
identificadas
pueden
provocar
potencialmente consecuencias graves en los resultados reportados. Aunque
las imprecisiones de la inyeccin se pueden corregir con un apropiado
estndar interno y un bloqueo o fallo mecnico se evidencia porque no se
realiza la inyeccin de la muestra, el posicionamiento del automuestreador
es crucial para una inyeccin correcta. Los automuestreadores emplean
sensores pticos o mecnicos para asegurar la adecuada seleccin del vial, y
stos deben mantenerse limpios y en adecuado funcionamiento.
Una rpida revisin visual de los cromatogramas y los datos de muestra
asociados para comprobar si los estndares se correlacionan
adecuadamente, antes de sacar ningn vial del automuestreador, permitir
la identificacin de cualquier muestra que requiera un re-anlisis.
- 83 -
Efecto Memoria
El Efecto Memoria aparece cuando la inyeccin de un blanco de disolvente

produce una mini versin del cromatograma inyectado previamente. En la
mayora de los casos este efecto se produce en la vlvula de inyeccin
debido a adsorcin de muestra.
El Efecto Memoria entre inyecciones puede eliminarse de diferentes formas:
Implementando un rgimen de lavado de la aguja entre inyecciones.

Los automuestreadores de loop integrado estn configurados para
mantener la orientacin de la inyeccin de muestra, permitiendo as
el lavado continuo del sistema de inyeccin y de la vlvula de
inyeccin durante todo el cromatograma y reduciendo o eliminando
de esta forma el efecto memoria.
Otros diseos de automuestreadores permiten lavados de aguja y/o
de jeringa entre las inyecciones. Esta solucin de lavado puede
provenir de una fuente externa rellenada independientemente, o bien
puede encontrarse en la propia gradilla del automuestreador en una
posicin definida por el usuario.
Minimizando el impacto del Efecto Memoria

La dilucin de muestra, adems de mejorar la precisin del
automuestreador como se estudi anteriormente, reduce el efecto
memoria porque los automuestreadores tienen un volumen muerto
finito p.ej. 0.1L, que representa el volumen de muestra residual.
Por lo tanto, con una inyeccin de muestra de 10L este volumen
residual generara un 1% de efecto memoria, pero sera solo del 0.1%
para una inyeccin de 100L.
Como alternativa a la dilucin se recomienda ordenar las muestras de
menor a mayor concentracin, ya que un efecto memoria de volumen
fijo generar menos problemas cuando a una concentracin baja le
sigue una mayor que al revs.
- 84 -

El Efecto memoria, junto a una mala precisin en reas y alturas, son
indicios de un rotor seal agotado. El rotor seal debe revisarse para buscar
sntomas de desgaste, especialmente un ahondamiento en los microcanales
entre los puertos que puede generar puntos de retencin de muestra
localizados. Estos puntos se limpian en la siguiente inyeccin produciendo
un mini-cromatograma o picos fantasma.
El Efecto memoria o los picos fantasma tambin pueden ser consecuencia de
materiales adsorbidos provenientes de la inyeccin previa que han sido
desorbidos en la nueva solucin de muestra inyectada. Tal adsorcin puede
ocurrir en varios puntos del sistema de inyeccin, y puede comprobarse
lavando ste con 10 x 5 volmenes de loop para a continuacin re-inyectar
un blanco. Si no aparecen picos hay que optimizar la rutina de lavado o
investigar posibles modos de adsorcin de los componentes de la muestra en
la superficie de los componentes del inyector y corregirlos cuando sea
necesario.
Algunos materiales de rotor pueden adsorber menos la muestra que otros
por lo que puede merecer la pena investigar si el efecto se reduce o se
elimina cambiando entre Vespel, Tefzel y PEEK.
Fugas
El Aire puede introducirse potencialmente en el sistema a travs de las
paredes permeables de los tubos de PTFE empleados en el automuestreador.
Esto no representa problemas si se utilizan en su lugar tubos de acero
inoxidable o PEEK en la seccin de toma de muestra de la unidad.
Una tuerca conectada o parcialmente apretada en la conexin del loop de
muestra con la aguja de inyeccin puede tambin provocar la entrada de
aire cuando la muestra se succiona desde el vial.
Un cuerpo de la vlvula de inyeccin mal montado, o un componente
sospechoso pueden producir tambin fugas en el cuerpo de la vlvula.
Desmonte la vlvula y vuelva a montarla segn las instrucciones del
fabricante para solucionarlo.
Debido a su creciente complejidad, los inyectores ms caros tienen ms
reas con fallos potenciales, y por lo tanto, mayor mantenimiento. Sin
embargo, tambin disponen de sistemas mejorados de deteccin de fugas
y/o burbujas y una mayor precisin en la inyeccin de volumen variable.
- 85 -
Columnas
Los objetivos de esta seccin son:
Describir los procesos generales de limpieza, purga y almacenamiento

de las columnas HPLC.
Relacionar y describir los procedimientos de diagnstico y
mantenimiento ms comunes.
6.1 Limpieza, Purga y Almacenamiento de la

Columna
Limpieza
Las columnas deben limpiarse antes de su purga y almacenamiento ya que
este proceso permite regenerar la superficie de la fase estacionaria despus
de un uso prolongado, asegurando as la eliminacin de contaminantes o
aditivos de la fase mvil que pudieran haber quedado fuertemente
retenidos. Este proceso tiene la misma importancia tanto si la columna se
ha utilizado para una nica aplicacin o analito en particular, como si ha
sido empleada para la separacin de analitos o mtodos diferentes.
La limpieza de columna debe realizarse rutinariamente al final de cada lote
de muestras cuando se emplea una separacin isocrtica para prevenir de
esta forma la acumulacin de contaminantes provenientes de las muestras.
Los mtodos que empleen anlisis en gradiente en cambio, limpian ya la
columna cuando la proporcin del disolvente de mayor poder de elucin se
aumenta al final de cada anlisis. Limpiar exhaustivamente una columna nos
asegura que el siguiente usuario no experimentar tiempos de equilibrio
prolongados
ni deber realizar un gran nmero de inyecciones de
acondicionamiento.
Purga de la Columna
Despus de la Limpieza, la columna debe ser convenientemente purgada
para eliminar cualquier traza de sales (tampones)
y/o aditivos
provenientes de la fase mvil. Estas sales pueden precipitar introduciendo
partculas que causarn bloqueos provocando el aumento de la presin de
trabajo. En ocasiones, algunas sales empleadas como tampones, pueden
ser de naturaleza corrosiva pudiendo provocar daos en la superficie
metlica del interior de la columna si quedasen retenidas en el ella varios
das, generando as un aumento del ruido de lnea de base o incluso
produciendo fugas.
- 86 -
Almacenamiento de la Columna
La lectura de la documentacin proporcionada por el fabricante de la
columna nos indicar cul es el disolvente apropiado para su
almacenamiento. Si se requiere cambiar de disolvente a otro no miscible
con el que actualmente contiene la columna, deber emplearse un
disolvente intermedio que sea miscible con ambos.
Al desconectar la columna del equipo deben apretarse convenientemente
los tapones para evitar la evaporacin del disolvente de almacenamiento y
el consiguiente secado de la fase estacionaria.
A continuacin se
almacenamiento que
estacionarias con base
del fabricante para
columna.
describe un protocolo genrico de purga y

puede utilizarse con la mayora de las fases
de slice. Por favor, consulte la literatura especfica
comprobar requerimientos especiales para cada
1.
Sustituya la fase mvil que contiene el tampn por H2O, y cambie a una
composicin idntica de H2O: orgnico a la utilizada en el mtodo de
separacin original. Esta etapa limpia de forma muy eficiente la
columna y el sistema dejndolos libres de cualquier sal de los tampones
que pudiera precipitar.
Por ejemplo, Si la fase mvil es 50mM KH2PO4 y Acetonitrilo 60:40
(v/v), sustituiremos el 60% de tampn KH2PO4 con Agua purgando
abundantemente.
Se recomienda utilizar tpicamente 10 volmenes de columna, aunque
si se han empleado reactivos formadores de pares de iones, pueden ser
necesarios de 30 a 50 volmenes para asegurar la limpieza correcta.
2.
Despus de la purga pasar a 95:5 (v/v) H2O: orgnico. Este proceso

puede realizarse a una velocidad de cambio del 10% de orgnico por
minuto, de forma que el alto contenido de H2O elimine todas las trazas
de sales tampn, eliminado as la posibilidad de precipitados
posteriores al pasar eluyentes que contengan una alta concentracin de
orgnico.
Se recomienda en esta etapa purgar con 5 volmenes de columna.
Nunca se deben usar las columnas de fase reversa a un 100% H2O o

podran quedar desactivadas por un colapso de fase. El colapso de fase
se produce habitualmente cuando la fase mvil tiene un contenido de
agua mayor del 95%, y se describe como una auto-asociacin de los
ligandos hidrofbicos alquil y aril de la fase estacionaria en un intento
de evitar a un eluyente altamente polar.
- 87 -

Como consecuencia de este proceso la superficie de la slice se
desactiva con respecto a los analitos no polares y sus tiempos de
retencin se reducen con la consiguiente prdida de resolucin.
La Figura muestra la auto-asociacin de los ligandos de la fase

estacionaria en presencia de una fase mvil altamente acuosa.
Solo debe emplearse un 100% H2O si la columna ha sido diseada por el
fabricante como compatible con fases mviles 100% acuosas. Las
columnas que son capaces de trabajar a 100% de agua tienen
tpicamente una fase estacionaria modificada en la que los ligandos se
han protegido del colapso de fase incorporndoles un grupo funcional
polar en el interior de su estructura. La misin de ese grupo funcional
es adsorber una capa de H2O de forma que se site bajo la porcin
hidrofbica del ligando eliminndose as la posibilidad de un colapso de
fase.
La Figura muestra la activacin de la fase estacionaria en presencia

de un solvente orgnico.
3.
Pase a 100% de solvente orgnico y lave el sistema y la columna

exhaustivamente para eliminar los contaminantes, incluyendo aquellos
fuertemente absorbidos provenientes de la matriz de las muestras.
Este proceso puede realizarse a 10% orgnico por minuto. Se
recomiendan tpicamente cambios de 5 volmenes de columna.
- 88 -

4.
Cambie la composicin a 40:60 (v/v) H2O:orgnico como disolvente

genrico de almacenamiento para columnas HPLC con base de slice.
Esta composicin de la fase mvil evita el riesgo de crecimientos
microbianos, mantiene la superficie de la slice empapada y evita la
formacin de clulas electrolticas que podran crear depsitos de iones
metlicos provenientes de las fritas en la slice del relleno, provocando
la activacin de silanoles residuales e introduciendo efectos de
columna secundarios.
Se recomienda utilizar tpicamente 5 volmenes de columna.
Este protocolo tambin es adecuado para el almacenamiento del
instrumento.
A continuacin se muestra de forma esquemtica el proceso de purga y

almacenamiento. Si la presin de trabajo del sistema lo permite, el flujo
puede aumentarse a 2 mL/min para realizar un cambio ms rpido en la
composicin H2O:organico. El protocolo completo puede programarse en un
mtodo de purga, que puede ejecutarse al final de cada secuencia o lote de
muestras.
- 89 -
6.2 Incidencias de la Columna

El diagnstico de las columnas se realiza habitualmente a partir del estudio
del cromatograma y de los picos cromatogrficos. Los parmetros de
operacin del sistema tambin proporcionan informacin til para el
diagnstico (la perspectiva de los componentes).
Siempre es recomendable proteger a las columnas de deterioro debido a la
obstruccin por partculas o muestras fuertemente retenidas. stas pueden
bloquear eventualmente la frita de entrada u ocluir la fase estacionaria
provocando un aumento en la presin de trabajo o una pobre forma del pico
cromatogrfico respectivamente. Es muy recomendable por tanto la
instalacin de filtros de lnea y/o guardacolumnas en el sistema. Las
partculas y las especias fuertemente adsorbidas pueden provenir
potencialmente de:
Sellos de los pistones
Sello del rotor de la vlvula de inyeccin.
Sales de los tampones precipitadas o no disueltas.
Matrices de las muestras contaminadas.
La tabla siguiente relaciona los problemas ms frecuentes con las columnas:
Problema con la columna
% de frecuencia
Problemas con la presin
24
Mala reproducibilidad
16
Recuperacin de la muestra
14
Prdida de resolucin
13
Inestabilidad
11
Formacin de volmenes muertos
8.1
Fugas en las conexiones
4.8
Rango de pH
2.0
Baja eficacia
2.0
Saturacin de las columnas
2.0
Costes
1.7
Otros
1.5
Fuente LC-GC Europe (1994)
- 90 -
Uso de las columnas

Una vez se ha usado una columna para la separacin de muestras reales la
selectividad proporcionada sta variar necesariamente de la ofrecida por
una columna nueva de la misma marca y referencia. Las Columnas pueden
llegar a modificarse de diversas formas una vez se utilizan de forma
experimental:
En condiciones de pH bajo, la columna puede perder las especies activas

o ligandos (endcapping).
Algunos materiales fuertemente retenidos pueden enlazarse de forma
irreversible a la cabeza de columna provocando un aumento de la
presin del sistema.
Los analitos de naturaleza fuertemente bsica pueden quedar enlazados
irreversiblemente a los grupos silanol libres de la fase estacionaria. Este
ionizacin de los silanoles puede reducirse realizando las separaciones a
bajo pH, ya que habitualmente stos grupos muestran valores de pka
entre 3.84.1.
Puesto que cada mtodo HPLC opera en diferentes condiciones analticas y

se utiliza para diferentes tipos de muestras, los cambios que potencialmente
puedan producirse en la columna sern nicos para cada mtodo. Por lo
tanto, una vez que una columna haya sido usada para una determinada
aplicacin, puede no volver a ofrecer nunca una separacin idntica a la
obtenida en una columna equivalente nueva, observndose a menudo
importantes diferencias cromatogrficas entre ellas.
Este hecho tambin puede observarse cuando se utiliza una misma columna
con diferentes mtodos y analitos. En este caso pudiera ser necesario
realizar varias inyecciones de acondicionamiento (priming injections) con
el nuevo analito para llegar a conseguir una cromatografa reproducible. Los
tiempos de equilibrado de la columna debern a menudo aumentarse para
adecuar la columna a los cambios en la selectividad.
Con el fin de evitar en lo posible la aparicin de tales variaciones, se
recomienda que cada columna se dedique a un mtodo y tipo de analtico
especfico. El intercambio indiscriminado de columnas para el desarrollo de
mtodos puede producir una separacin cromatogrfica no representativa
una vez se traslade a una columna nueva, que no habra sido expuesta a la
variedad de muestras de su predecesora.
Estas variaciones pueden
reducirse si se emplea un procedimiento adecuado de lavado de la columna.
Filtros de Lnea
Una de las causas ms comunes del deterioro de la columna es el aumento
excesivo de la presin de trabajo. Este aumento de la presin se produce
habitualmente por la acumulacin de material particulado en la frita de
entrada a la columna, y una de las formas ms econmicas y efectivas de
aumentar la vida de sta es incorporar un filtro de lnea de alta presin
- 91 -

entre el Automuestreador y la Columna. Un filtro de lnea situado en esa
posicin evita que las partculas provenientes de la muestra o del rotor de la
vlvula de inyeccin del automuestreador alcancen la cabeza de la columna.
Es MUY recomendable incluir un filtro de lnea de alta presin en todos los
sistemas HPLC con la nica excepcin de los sistemas de volumen muerto
extremadamente pequeo, en los que el incremento extra en el volumen
de columna puede contribuir al ensanchamiento y dispersin de los picos.
Fuera de este escenario no se observarn cambios apreciables en el
cromatograma.
El filtro de lnea puede examinarse visualmente para observar si hay
depsitos de contaminacin o cambios en el color de su superficie cuando la
presin del sistema aumenta apreciablemente. El tamao ms habitual de
poros para estos filtros est alrededor de 0.5m.
Limpio el filtro puede reinsertarse para su uso.
Sucio El filtro ha cambiado de color o muestra

depsitos en su superficie. Descartar y reemplazar.
Figura mostrando filtros de lnea limpio y contaminado.
Guarda Columnas/Discos
Una guarda columna es una columna corta tpicamente de 10-20 mm de
longitud- que contiene la misma fase estacionaria que la columna analtica.
Si se utiliza un sistema de cartuchos, entonces es necesario utilizar un
soporte de cartuchos adecuado. Los discos guarda columna son pequeos
discos fritados que cuando se alojan en su soporte se enroscan directamente
en la columna analtica. En comparacin con un filtro de lnea, una guarda
columna o disco debe utilizarse solamente como filtro qumico, para
asegurar la eliminacin de cualquier material potencialmente retenido o
agresivo evitando as el posterior fallo posterior de la columna analtica.
En algunos casos una guardacolumna puede proporcionar suficiente
proteccin como para eliminar el clean up (preparacin de muestra
previo) de la muestra. Sin embargo, ya que una guarda columna puede
quedar contaminada con una gran variedad de materiales fuertemente
retenidos, es un requisito obligatorio que cuando se lave con un disolvente
fuerte se haga sin conexin con la columna analtica, evitando as que las
- 92 -

especies peligrosas pasen inadvertidamente a la cabeza de la columna
analtica.
Nunca debe usarse una guarda columna como columna de saturacin de
slice, ya que cualquier volumen muerto generado en la guarda columna
comprometer necesariamente la cromatografa. Si la columna saturadora
se estima necesaria para una aplicacin en particular (p.e. Fase Mvil de
alto pH), debe ser instalada antes del inyector y con un filtro de lnea
inmediatamente despus para retener las pequeas partculas de slice
resultantes de la disolucin de la slice.
La Figura muestra el efecto negativo de formacin de un volumen muerto

en la guardacolumna con el consiguiente deterioro de la forma de pico.
Tanto la incorporacin al sistema de HPLC de un filtro de lnea como la de
una guarda columna, provocan una aumento del volumen extra-columna,
que podra contribuir a un mayor ensanchamiento de pico en sistemas con
un volumen muerto extremadamente pequeo.
Figura mostrando guarda columnas y cartuchos tpicos.
Figura mostrando un disco guarda tpico.
- 93 -

Cundo se debe sustituir una guarda columna? Existen tres procedimientos
fundamentales para determinar cundo sustituir una guarda columna:
1.
No se recomienda esperar al deterioro de la separacin

cromatogrfica!
Si es posible, se puede monitorizar la separacin de una pareja de
picos del cromatograma que estn peor resueltos que los picos de
inters, estableciendo un criterio para predecir el momento adecuado
antes de que la guarda columna potencialmente falle.
Esto se muestra en el cromatograma de abajo, que muestra la
separacin de un grupo de herbicidas. La pareja crtica, los picos
cromatogrficos que estn peor resueltos uno del otro, estn marcados
como 1 y 2. Los picos cromatogrficos de inters estn marcados como
3 y 4. Si monitorizamos la separacin entre los picos 1 y 2 a lo largo del
tiempo, puede establecerse un criterio de valoracin que nos permita
cambiar la guarda columna sin comprometer el anlisis con respecto a
los picos de inters 3 y 4.
2.
3.
Monitorizar el nmero de muestras inyectadas con la guarda columna

instalada hasta que el sistema deje de proporcionar una separacin
satisfactoria.
Modificar el PNT de forma que la guarda columna se sustituya
aproximadamente al 80% del tiempo de vida esperado sea proactivo
en lugar de reactivo!
Monitorizar la vida efectiva de la columna en funcin del volumen de
eluyente empleado o de la fecha en la que la guarda columna fue
instalada.
- 94 -
Limpieza (Clean-up) de la muestra

En el contexto de la limpieza de muestra siempre existe un balance entre
los costes del citado proceso de limpieza frente a los costes de sustitucin
de la columna.
Consideremos un ejemplo bioanaltico en el que se desea medir la
concentracin de un frmaco en plasma. La precipitacin de las protenas
por medio de la adicin de acetonitrilo al plasma, agitacin en Vortex,
centrifugacin e inyeccin del sobrenadante producirn muestras
razonablemente sucias permitindonos quizs entre 100 y 500
inyecciones. Por el contrario, una muestra mucho ms limpia obtenida tras
un procedimiento de limpieza por Extraccin en Fase Slida (SPE), nos
permitir obtener una vida media de unas 1000-2000 inyecciones. Este
proceso SPE y posterior inyeccin de muestra puede automatizarse
empleando un formato de 96-pocillos.
Mientras que la ganancia en tiempo de vida de la columna pudiera no
justificar por s sola el coste de este elaborado y caro proceso de limpieza,
el mtodo se beneficiara de la mejora en reproducibilidad lo que
considerado a lo largo de los aos debera tenerse en cuenta.
Sustitucin de la Columna
Poniendo en prctica las recomendaciones detalladas hasta ahora podremos
incrementar apreciablemente la vida de las columnas pero en definitiva
stas deben considerarse como materiales consumibles. La duracin de una
columna viene determinado por un gran nmero de factores interrelacionados, p.ej. Tampones y su pH, limpieza de muestra, etc, pero
habitualmente un rango entre 500-2000 inyecciones puede considerarse
aceptable.
- 95 -
7. Picos con Cola

La aparicin de colas en los picos es una de las deformaciones
cromatogrficas ms frecuentes. Se dice que un pico tiene cola cuando
muestra una asimetra mayor de 1.2, aunque en ocasiones picos con valores
de As tan altos como 1.5 puedan ser aceptables para una gran variedad de
ensayos. El factor de asimetra de pico () se calcula segn la siguiente
ecuacin:
= wb2 / wb1
Donde;
wb2 = Ancho del pico en la lnea de base despus del centro del pico
wb1 = Ancho del pico en la lnea de base antes del centro del pico
La principal causa de aparicin de cola en un pico es la coincidencia de ms

de un mecanismo de retencin. En las separaciones por Fase Reversa, el
principal modo de retencin de los analitos es a travs de interacciones
hidrofbicas no-especficas con la fase estacionaria. Sin embargo, tambin
son frecuentes las interacciones polares con grupos de silanoles residuales
existentes en el soporte de slice. Compuestos que posean en su estructura
grupos amino o cualquier otro grupo bsico, pueden interactuar
fuertemente con los grupos silanoles ionizados, produciendo picos con cola.
Este efecto se muestra en la figura siguiente a un pH >3.0.
- 96 -

Estas interacciones secundarias pueden minimizarse si se realiza la
separacin a un pH ms bajo, asegurando as la protonacin completa de los
citados grupos silanol residuales;
Otra alternativa es la utilizacin de columnas end-capped. End-capping

es el nombre que se da al proceso qumico por el cual los grupos silanoles
residuales de la fase estacionaria se transforman en otros grupos funcionales
sustancialmente menos polares en su superficie. Esta modificacin tiene el
efecto de reducir las interacciones secundarias que puedan producirse
potencialmente con molculas de analitos polares.
Los reactivos qumicos empleados para el proceso de end-capping
incluyen generalmente;
Trimetilclorosilosano (TMCS)
Hexametildisilazano (HMDS)
- 97 -
El proceso de End-capping reduce las colas observadas con analitos

polares, bloqueando de forma eficiente sus interacciones con los grupos
silanol residuales que pudieran ser potencialmente ionizables. A pesar de
ello, el end-capping slo disminuye aproximadamente a un 50% el nmero
de grupos silanol no reaccionados. Debido a factores de impedimento
estrico este tipo de reacciones rara vez son eficientes en trminos
absolutos y en consecuencia una columna completamente end capped no
es nunca tanto como debera!
En el caso de que todos los picos cromatogrficos muestren cola debe
considerarse la posibilidad de que la columna se haya sobrecargado por un
exceso de muestra. Evale aplicando la ecuacin descrita previamente en
la pgina 104. Si fuera necesario utilice una fase estacionaria de mayor
capacidad p.ej. de mayor % carbono o tamao de poro, utilice una columna
de mayor dimetro, o reduzca la cantidad absoluta de muestra o volumen
inyectado.
Examine la columna por si se hubieran formado volmenes muertos o se
hubiera bloqueado parcialmente la frita de entrada. Sustituir la columna
por otra nos confirmar rpidamente el problema.
Si se sospecha que existe algn volumen muerto, quite las conexiones de
cierre y revise la cabeza de columna. Si se observa algn hueco en el relleno
cbralo con fase estacionaria, o si no, limpie o sustituya la frita de entrada
y pruebe la columna de nuevo para ver si el problema estaba originado o no
por una frita parcialmente obstruida. En ocasiones, invertir la columna y
lavarla con un 100% de un disolvente fuerte tambin permite eliminar
bloqueos y contaminacin del filtro de entrada.
- 98 -

Compruebe las instrucciones del fabricante para ver si la columna puede
mantenerse en la orientacin inversa de flujo o no.
Si slo uno, o algunos, de los picos cromatogrficos muestran cola,
considere la posibilidad de que la columna est mostrando efectos de
particin o retencin secundarios.
Reduzca la probabilidad de que cualquier analito potencialmente bsico
interactu con los grupos silanol residuales usando columnas fabricadas con
slice desactivada (Tipo B), que han sido completamente bloqueadas (endcapped). Como parte de cualquier procedimiento de desarrollo de mtodos
reduzca el pH de la fase mvil para suprimir la ionizacin de cualquier grupo
silanol. En general, una fase mvil con pH <3 ser suficiente para este
propsito. Adicionalmente, el empleo de fases mviles a bajo pH asegura la
protonacin de los analitos cidos, aumentando su retencin y minimizando
cualquier tipo de interaccin inica.
La figura de abajo ilustra el efecto producido en las colas de pico al reducir
el pH de separacin. La mezcla de cinco frmacos bsicos consiste en
Fenilpropanolamina, Efedrina, Anfetamina, Metanfetamina y Fenteramina
(Picos 15) respectivamente. El primer cromatograma se adquiri a un pH
de la fase mvil de 7.0, y en estas condiciones de separacin, el Pico 4,
Metanfetamina muestra un factor de cola USP al 5% (USP Tf 5%) de 2.35.
La disminucin del pH de la fase mvil reduce la interaccin de los analitos
bsicos con los grupos silanol residuales eliminado de esta forma la cola
excesiva de los picos. El segundo cromatograma se adquiri con una fase
mvil a pH 3.0 y el USP Tf (5%) de la Metanfetamina en estas condiciones se
redujo a 1.33.
La adicin de Trietilamina (TEA) a la fase mvil en niveles de concentracin

de 510mM, tambin reduce o posiblemente elimina, la cola en compuestos
bsicos. La TEA compite con los analitos polares bsicos por enlazarse con
los grupos silanol residuales, produciendo una funcin de pseudo endcapping. Esta alternativa sin embargo es menos conveniente, ya que la
fase estacionaria se altera irreversiblemente por la adicin de tal
- 99 -

modificador, afectando a la selectividad mostrada por el sistema de
separacin posteriormente.
La cromatografa de pares de iones puede resolver el problema de las colas
para analitos cidos o bsicos. Otra opcin para la separacin de especies
inicas podra ser emplear cromatografa de intercambio inico.
Desde un punto de visto prctico, generalmente slo es posible utilizar el pH
para suprimir la ionizacin cida ya que la ionizacin bsica requiere valor
de pH tpicamente mayores de 8, y a ese pH se puede producir la disolucin
de la slice. Sin embargo, los fabricantes de columnas ofrecen versiones que
permiten trabajar a un pH mayor, protegiendo la slice de su disolucin por
medio de ligandos bi- y tri- dentados. Estos ligandos son en realidad dos o
tres ligandos tradicionales que se han puenteado por medio de procesos
qumicos patentados antes de aplicarlos a la fase estacionaria.
Su
estructura puenteada permite proteger su superficie frente a valores
extremos de pH.
La Figura muestra ligandos bidentados y la proteccin ofrecida a la

superficie de la slice gracias a su estructura de puente.
Un nico pico con cola tambin podra producirse por un pequeo pico
eluyendo inmediatamente despus del pico cromatogrfico de inters. La
posibilidad de que esto ocurra es la razn primordial por la que las colas de
pico nunca deben ignorarse.
Como se describa en el apartado
desdoblamiento de picos y hombros, podemos confirmar la presencia de
un interferente cambiando la longitud de onda de deteccin, o mejorar la
resolucin de la separacin empleando una columna de mayor eficiencia
p.ej. una columna ms larga o empaquetada con partculas de menor
tamao.
Ajuste la selectividad del sistema frente a compuestos co-eluyentes
variando la composicin o el tipo de la fase mvil, la temperatura, o la fase
estacionaria de la columna. Emplee algn procedimiento de clean-up
p.ej. SPE para eliminar cualquier contaminante interferente. Evale si
alguno de los picos coeluyentes pueden provenir de inyecciones anteriores
haciendo una inyeccin en blanco y siguiendo el procedimiento descrito en
Ensanchamiento de Picos de la pg. 105.
- 100 -
8.
Picos con Frente
Si todos los picos cromatogrficos muestran frente debe considerarse la

posibilidad de una sobrecarga de la columna por exceso de muestra
inyectada. Evalelo aplicando la ecuacin descrita previamente en la pg.
104. Si fuera necesario utilice una fase estacionaria de mayor capacidad
p.ej. de mayor % carbono o tamao de poro, utilice una columna de mayor
dimetro, o reduzca la cantidad absoluta de muestra o volumen inyectado.
Si se ha inyectado un volumen de muestra excesivamente grande, y el
solvente de la muestra y la fase mvil no estn adecuadamente
emparejados, pueden producirse dos equilibrios de distribucin, provocando
una particin diferencial en la columna. Refirase a las reglas empricas
descritas en las pginas 54-56 en relacin al adecuado emparejamiento de
entre el volumen de inyeccin con la fuerza eluotrpica del disolvente de la
muestra para eliminar ste fenmeno.
Un nico pico que muestre frente tambin puede deberse a un pequeo pico
que eluya justo antes del pico cromatogrfico de inters. Esta posibilidad es
la principal razn por la que un pico con frente nunca debe ser ignorado.
Como se describa en el apartado desdoblamiento de picos y hombros,
podemos confirmar la presencia de un interferente cambiando la longitud de
onda de deteccin, o mejorar la resolucin de la separacin empleando una
columna de mayor eficiencia p.ej. una columna ms larga o empaquetada
con partculas de menor tamao.
la pg. 89.
- 101 -
Tutorial 2
Pregunta 1
Usando la tabla siguiente enumere cinco partes del Automuestreador de
Loop completo que pueden requerir mantenimiento rutinario.
Indique la principal incidencia que puede presentar cada una de los
componentes enumerados y cul sera la solucin ms adecuada para
remediarla.
Componente
Incidencia
Solucin
- 102 -
Pregunta 2
A continuacin se muestran dos cromatogramas que pueden o no darnos
informacin sintomtica del status operacional del sistema HPLC.
Indique que acciones pueden ser necesarias para mejorar la cromatografa
obtenida. Rellene sus respuestas empleando la tabla incluida.
Condiciones:
Muestra:
Columna:
Flujo:
Fase Mvil:
Vol Inyeccin:
Deteccin:
Cuatro Esteroides Anabolizantes de un suero

concentrado.
Concentracin estimada 10ug/mL.
RP C18 columna 150 x 4.6 mm 5m
Obtenida sin ninguna informacin histrica previa.
1.5mL/min
46% Agua- MeOH:0.01% KHPO4 v/v (pH 5.2)
100L
254nm
Incidencia
Solucin
- 103 -
Detectores
Describir las propiedades del detector ideal.

Definir los trminos y conceptos ms comunes.
Describir el diseo y los principios de operacin de los detectores de
HPLC ms comunes.
Ennumerar y describir las incidencias ms importantes con los
detectores y los procedimientos de mantenimiento.
9.1 El Detector Ideal

El Detector ideal debera mostrar las siguientes caractersticas:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Ser igual de sensible para todos los picos eluidos o registrar nicamente
aquellos picos que sean de inters.
No ser afectado por cambios de temperatura o composicin de la fase
mvil.
Ser capaz de monitorizar trazas de las especies a analizar.
No contribuir de forma apreciable al ensanchamiento de los picos.
Proporcionar una respuesta rpida que le permita detectar picos
cromatogrficos estrechos provenientes de la columna.
Ser robusto y fcil de mantener.
Terminologa y Conceptos Generales

Selectividad
Un Detector no selectivo reacciona frente a una propiedad general del
eluyente que pasa a travs de l. Cuando un analito eluye de la columna, las
caractersticas de esa propiedad cambian, y ese cambio bruto se mide y se
registra. Esta deteccin no-selectiva es caracterstica del detector de ndice
de refraccin.
En contraste, los detectores selectivos no reaccionan simplemente a los
cambios en las propiedades generales en el eluyente sino que miden una
respuesta definida que se produce por cambios en una propiedad especfica
o caracterstica del analito. Dicha deteccin selectiva es caracterstica de
los detectores de Absorbancia UV, Fluorescencia y Espectrometra de Masas.
Sensibilidad
La seal ms baja detectable no debe ser nunca menor de tres veces la
altura del ruido promedio en la lnea de base; Es decir, una relacin seal a
ruido (S/N) de 3:1 para un analito determinado determina su "Limite de
Deteccion".
- 104 -

Si la cantidad de analito inyectado cae por debajo de su lmite de
deteccin, entonces la seal no podr diferenciarse del ruido. Para los
anlisis cuantitativos se recomienda una relacin seal/ruido de 10:1 y
define el Lmite de Cuantificacin.
Figura mostrando una S/N de 10:1 El Lmite de Cuantificacin (LoQ).

A continuacin se incluye un cuadro comparativo de la selectividad y
sensibilidad ofrecida por diferentes detectores:
Tipo de Detector
Selectividad
Sensibilidad
(Min. Masa Detectada)
Indice de Refraccin
Baja
15g
Conductividad
Baja
1050ng
Light Scattering Evaporativo
Baja
0.11.0ng
Media
0.51.0ng
Electroqumico
Alta
50500pg
Fluorescencia
Alta
10100pg
Espectrmetro de Masas
Alta
125pg
UV/Visible
- 105 -
Rango Lineal
El Detector ideal debera proporcionar una seal de respuesta cuya rea
fuera proporcional a la cantidad de muestra inyectada, independientemente
de si est cantidad es grande o pequea. Esta linealidad no es infinita, pero
debe extenderse en el rango ms amplio posible. La pendiente de la recta
en el diagrama de abajo se denomina respuesta y representa en que
magnitud el detector responde a un cambio especfico en la concentracin
de la muestra:
Figura mostrando la respuesta de un detector lineal y uno no lineal
Area o Altura de Pico?

Es una prctica comn emplear el rea de pico cromatogrfico para
propsitos cuantitativos ya que proporciona una medida ms robusta. Sin
embargo, en ocasiones la altura de pico puede proporcionarnos resultados
ms exactos y reproducible, como es el caso de una pareja de picos crtica
que o est bien resuelta:
- 106 -
9.2 El Detector UV/Visible

Principio Operacional Detector UV/Visible Sintonizable
Con el Detector UV/Vis Sintonizable, o de longitud de onda variable, la
longitud de onda requerida se pre-selecciona por el analista por medio de
software. Esta seleccin produce el movimiento fsico de una red de
difraccin (monocromador) alojado en el interior del detector, permitiendo
que un haz con la longitud de onda de la luz seleccionada ilumine el camino
ptico de la celda de flujo y llegue al fotodiodo. El fotodiodo mide el
cambio de absorbancia de los componentes de la muestra que pasan a travs
de la celda de flujo enviando una seal de respuesta al sistema de registro.
Beam Splitter
Detector UV/Visible de Longitud de Onda Variable (Sintonizable)
Principio Operacional Detector UV/Visible Diodo-Array

A diferencia del detector sintonizable, el detector UV/Visible Diodo-Array
(DAD) permite que pasen a travs de la celda el rango completo de luz
proveniente de la fuente. Esta luz se divide posteriormente en su espectro
por medio de la red de difraccin alcanzando la serie de fotodiodos, cada
uno de ellos capaz de medir con precisin una porcin extremadamente
definida del espectro electromagntico de la luz incidente. Esta distribucin
ptica permite obtener mayor informacin que la obtenida simplemente con
un anlisis cromatogrfico a una nica longitud de onda.
- 107 -
Detector UV/Visible Diodo-Array (DAD)
- 108 -
9.3 Incidencias y Mantenimiento del Detector

UV/Visible
Lmparas de Deuterio y Tungsteno
Una lmpara de Deuterio produce radiacin intensa en el rango de
longitudes de onda de 190400nm gracias a una descarga de plasma
realizada en una atmsfera de Deuterio (D2 Hidrgeno Pesado). Las
Lmparas de Tungsteno se usan a menudo junto a lmparas de Deuterio, y
emiten luz en el UV cercano y en la regin visible del espectro
electromagntico, tpicamente en el rango de longitudes de onda de 340850 nm.
La vida til de cualquier lmpara de detector es necesariamente funcin del
nmero total de horas en que una lmpara en particular puede realizar su
trabajo de forma til. En concreto, la vida til de una lmpara ser
proporcionalmente ms corta si la aplicacin a que se dedica es a un anlisis
de trazas muy exigente ms que a un mtodo de ensayo, ya que una vez que
el ruido de la lnea de base o la deriva excedan los lmites establecidos por
el mtodo, la lmpara deber ser sustituida.
Lineas de base con Ruido o Deriva indicativas de una lmpara gastada
- 109 -

La emisin de una lmpara de Deuterio decrece de forma exponencial. En
concreto, sta emisin decrece lentamente hasta el final de la vida de la
lmpara, momento en que comienza a decrecer rpidamente producindose
finalmente un fallo en su encendido. Este rpido deterioro en la emisin
puede proporcionar al usuario un aviso sobre el inminente fallo de la
lmpara. A medida que la emisin de la lmpara se reduce se producir una
disminucin en la relacin S/N y en consecuencia no se obtendr la
sensibilidad a los analitos requerida por el mtodo.
Una lmpara de deuterio puede considerarse inutilizable cuando su emisin
cae por debajo de del 50% de su valor original a una longitud de onda
especfica, o cuando el test de idoneidad del sistema (system suitability) no
cumple el valor de S/N especificado. Existen tres razones fundamentales del
decrecimiento de la emisin con el tiempo:
Evaporacin del Tungsteno, Molibdeno o recubrimiento del filamento,

que produce una emisin reducida o problemas en el encendido.
Reaccin del material de recubrimiento con la envoltura de cuarzo.
Solarizacin de la envoltura de cuarzo a 200250nm, provocando el
desarrollo de absorcin entre stas longitudes de onda.
La vida til de una lmpara de deuterio es inversamente proporcional al

nmero de encendidos que experimenta. Mantener la lmpara
continuamente encendida aumentar su vida til unas tres veces, en un
promedio de 8 horas diarias de funcionamiento. Encender y apagar la
lmpara en los descansos entre anlisis o durante la noche reducir
apreciablemente su vida til, siendo al final un procedimiento improductivo
ya que la lmpara requerir un tiempo de calentamiento de
aproximadamente 30 minutos para estabilizar la lnea de base.
Cul es la vida media esperada de una lmpara de deuterio? Tpicamente
entre 800 y 1000 horas, 1800-2000 horas en las lmparas de deuterio de
larga duracin. La fuente de Tungsteno de la porcin visible de muchos
detectores UV/Visible tiene una vida extraordinariamente larga y en general
falla porque se funde.
Es importante resaltar que las lmparas de deuterio tienen caducidad en su
almacenamiento. La lmpara puede envejecer considerablemente durante
su almacenamiento, de forma que pueda ser inutilizable para su uso en un
detector despus de slo 6 meses. Se recomienda por lo tanto pedir una
lmpara de repuesto cuando estemos cerca del fin de su vida til ms que
disponer permanentemente de una lmpara de repuesto a mano.
Muchos softwares actuales disponen de una funcin de diagnstico
incorporada que nos permite medir la intensidad y el envejecimiento de la
lmpara.
- 110 -
La Celda de Flujo
La contaminacin de la propia celda o de sus ventanas puede ser el
resultado de una limpieza inadecuada del sistema o del tipo de muestra en
s misma. Unas ventanas de la celda que estn sucias producirn una
prdida progresiva tanto en la intensidad de la luz incidente como en la
saliente, afectando as a la absorbancia de los analitos y a su respuesta en
funcin del tiempo.
Prdida de sensibilidad causada por unas ventanas de la celda sucias

Cualquier contribucin a la absorbancia generada por la propia celda puede
comprobarse y medirse por medio de un test especfico de intensidad:
tpicamente esto implica el llenado de la celda con H2O o un solvente de
referencia.
Los siguientes procedimientos genricos de limpieza de la celda de flujo se
incluyen como suplemento a las recomendaciones especficas del fabricante
para cada detector en particular; por favor, consulte los manuales de
operacin antes de emplear cualquiera de estos procedimientos.
Los procedimientos generales de limpieza son aplicables a todos los
detectores pticos y pueden tener la forma de alguno de los siguientes:
Backflushing (limpieza en contracorriente)

Limpieza con disolvente
Lmpieza con cido
La limpieza de la celda de flujo en contracorriente (Backflushing) elimina

con frecuencia material particulado que pudiera haber bloqueado el tubo de
entrada. Se conecta la bomba a la salida del detector y se invierte el flujo
de eluyente a travs de la celda, enviando el flujo directamente al
contenedor de desechos. Si se observaban sntomas de una contrapresin
alta, al invertir el flujo, la presin caer y se eliminar el bloqueo.
Este procedimiento debe aplicarse con precaucin puesto que una presin
excesiva sobre la celda de flujo podra provocar fugas alrededor de las
- 111 -

ventanas o incluso la rotura de la propia celda de cuarzo. Para evitar la
sobrepresin en la celda hemos de seleccionar la presin mxima de la
bomba por debajo de la mxima presin que admita la celda e ir
incrementando gradualmente el flujo en pasos de 0.1mL/min para evitar
choques de presin. Una celda estndar de 1.0 cm de paso ptico suele
tener una presin mxima de alrededor de 120 Bar.
La limpieza con disolventes es til cuando nos encontramos en presencia de
un contaminante orgnico soluble o se sospecha que hay gotas de un
solvente inmiscible en la celda de flujo. Pasando a travs de la celda una
serie de solventes con propiedades fsicas y qumicas diferentes p.ej.
viscosidad, polaridad, etc, puede eliminarse de forma eficiente cualquier
contaminante en un amplio rango de solubilidades. Dichas series de
disolventes pueden consistir en Metanol, seguido de Tetrahidrofurano (THF),
Cloruro de Metileno antes de volver de nuevo al Metanol.
La limpieza cida es el ms agresivo de los tres procedimientos de limpieza
descritos. Este procedimiento implica el paso de un cido por la celda del
detector para eliminar contaminantes y posterior paso de H2O para eliminar
todos los restos de cido. Para asegurar la eliminacin de cualquier traza de
residuo de cido, y cualquier residuo potencialmente absorbente en el UV a
bajas longitudes de onda, es necesario bombear H2O a travs de la celda de
flujo.
Se utiliza preferentemente Acido Ntrico ya que los cidos
halogenados p.ej. HCl atacan agresivamente los componentes de acero
inoxidable de la celda.
Si ninguno de los mtodos de limpieza anteriores eliminan la contaminacin
o los problemas de bloqueo, la celda tiene que desmontarse o reemplazarse.
Existen Kits de Reconstruccin que son normalmente ms econmicos que
adquirir una celda completamente nueva. Consulte el manual de operacin
para las recomendaciones y advertencias especficas.
El paso de burbujas de aire a travs de la celda causar picos de ruido
(spikes) en el cromatograma. La desgasificacin incorrecta del eluyente es
por lo general la causa de los problemas con burbujas, especialmente si se
ha utilizado mezcla a baja presin. La reduccin de presin resultante de la
mezcla de disolventes requiere una desgasificacin adicional puesto que el
aire es menos soluble en la mezcla de solventes que en el solvente puro
original.
Una celda de flujo sucia puede atrapar microburbujas cuando pasan a travs
de ella. Estas microburbujas pasan normalmente a travs de la celda sin ser
notadas pero cuando se atrapan pueden asociarse para generar burbujas
mayores afectando al ruido y la deriva de lnea de base. Cualquier burbuja
atrapada debe purgarse de la celda requiriendo en ocasiones el uso de
isopropanol, cuya mayor viscosidad comparada con el acetonitrilo o
metanol, ayuda a arrastrar la burbuja envindola a desechos.
- 112 -
Una lectura de absorbancia que se va fuera de escala de forma inmediata y

evidente puede ser el resultado de una ventana de celda rota. El Solvente
que pasa a travs de la celda de flujo puede fugar hacia la superficie
externa de la ventana provocando dichos cambios de absorcin.
La Red de Difraccin (Monocromador)

En la mayora de los detectores UV/Visible de longitud de onda variable el
monocromador viene pre-alineado de fbrica, y est encerrado en una
unidad ptica sellada junto a algunos espejos que conforman el camino
ptico. Un fallo en el monocromador se evidencia porque es incapaz de fijar
la longitud de onda requerida para el anlisis y requerir de la intervencin
de un ingeniero de servicio tcnico.
Debe comprobarse la exactitud de longitud de onda bien empleando una
solucin de calibracin conocida con un mximo de absorcin definido, o
bien, empleando una banda caracterstica de emisin de la lmpara de
deuterio.
- 113 -
9.4 Picos Negativos

La aparicin de picos negativos se produce debido a factores no relacionados
con las interacciones entre los analitos y la columna. Se observan picos
Negativos cuando los cables de seal del detector estn invertidos, o cuando
el interruptor de polaridad se encuentra en la posicin incorrecta. Los picos
Negativos son normales cuando se utiliza el Detector de Indice de Refraccin
Los picos Negativos aparecern en el cromatograma si la absorbancia de la

muestra es menor que la de la fase mvil a la longitud de onda de
deteccin. Hay que emplear por lo tanto fases mviles que muestren una
absorbancia UV/Vis baja, o cambiar la longitud de onda de deteccin del
analito.
Si a lo largo del tiempo se concentran en la fase mvil compuestos
fuertemente absorbentes puede aparecer una situacin similar si el
disolvente se recicla. Si est empleando reciclado de fase mvil y comienzan
a aparecer picos negativos tras un uso prolongado de la fase mvil, lave
abundantemente la columna con un disolvente fuerte y re-equilbrela, con
fase mvil recientemente preparada. Si desaparece el problema de picos
negativos, es un indicio de que la fase mvil estaba contaminada.
Cuado se emplea el detector de Diodo Array (DAD) es recomendable
emplear una longitud de onda de referencia para posibilitar la sustraccin
de lnea de base. Esto tiene la ventaja de corregir una lnea de base con
deriva mejorando as los lmites de deteccin y de cuantificacin.
Es
importante asegurarse de que la longitud de onda de referencia y el ancho
de banda (bandwith) se han elegido correctamente para prevenir la
posibilidad de que se produzca una absorbancia mayor que la de los analitos
a detectar y se generen picos negativos en el cromatograma.
El procedimiento correcto para la seleccin de las longitudes de onda de
deteccin y de referencia se describe en relacin con el espectro UV del
cido ansico. Para optimizar la deteccin de la menor cantidad posible de
cido ansico seleccione la longitud de onda de medida al pico ms intenso
- 114 -

del espectro, es decir, 252nm. Tratando el espectro como si fuera un pico
pseudo-cromatogrfico, compruebe su anchura a media altura (PWHH). Este
ser en ancho de banda de la longitud de onda de medida (Bandwith) p.ej.
30nm.
Es posible reducir los efectos de fondo gracias a una adecuada eleccin de
las longitudes de onda de medida y de referencia. La longitud de onda de
referencia puede emplearse para eliminar los siguientes efectos, que
provocarn todos ellos derivas de lnea de base durante el anlisis
cromatogrfico o bien mostrarn ondulaciones o ruido en la misma;
1.
2.
Reduccin del ruido generado por:

Particulas en suspensin
Cambios en el ndice de refraccin del eluyente cuando se emplean
gradientes de elucin.
Turbulencias en la celda de flujo
Reduccin en la deriva del instrumento causada por:
Envejecimiento / deformacion de la lmpara
Identifique en el cromatograma el pico que absorbe a la longitud de onda

mayor, en el ejemplo es el cido ansico. Determine la longitud de onda a
la que el pico del cido ansico deja de absorber, se considera generalmente
cuando la absorbancia cae por debajo de 1.0mAU, y en el ejemplo del cido
ansico ser 300nm. Para evitar la posibilidad de una contribucin a la
absorbancia de la longitud de onda de referencia elegida, aada 10nm a
este valor Esta longitud de onda ser el lmite inferior de la longitud de
onda de referencia, i.e. 310nm.
Para eliminar los efectos de fondo descritos hay que elegir un ancho de
banda grande, tpicamente de 100nm, y situar la longitud de onda de
referencia en el punto medio de esta ventana i.e. 360nm.
- 115 -
9.5 El Detector de Light Scattering Evaporativo

Principio de Operacin Detector Light Scattering Evaporativo
El Detector de Light Scattering Evaporativo (ELSD) mide la cantidad absoluta
de luz dispersada por las partculas de analito que se secan mediante
evaporacin. Siempre que la muestra est presente en la cantidad
suficiente, no se evapore por s misma, o se descomponga durante la etapa
de secado, el detector proporcionar una respuesta medible.
El mecanismo de deteccin de Light Scattering Evaporativo implica tres
etapas:
1.
2.
3.
Nebulizacin, utilizando N2 u otro gas inerte, para formar un aerosol o

pluma de gotitas uniformes.
Evaporacin del eluyente en un tubo de evaporacin con temperatura
controlada e independiente, generando una pluma de partculas de
analito no-voltiles.
Deteccin ptica de la luz dispersada por las partculas de analito de
un haz de luz incidente. La respuesta es proporcional a la masa de
analito que pasa a travs del haz de luz, y es independiente de
cualquier propiedad espectral del analito.
El Detector de Light Scattering Evaporativo

El ELSD puede considerarse universal, y representa tcnica de deteccin
ideal para todos los compuestos no voltiles, un amplio rango de
compuestos voltiles con la adecuada seleccin del eluyente, y aquellos
compuestos que no poseen cromforos UV/visible o varan mucho en sus
coeficientes de extincin. Su sensibilidad es superior a la ofrecida por los
detectores de ndice de refraccin, y se obtiene sin los problemas de deriva
- 116 -

de lnea de base, gracias a la independencia de la deteccin de las
caractersticas espectrales de absorcin del eluyente.
La medida cuantitativa de la luz dispersada por una solucin se realiza
habitualmente con iluminacin lser. La luz dispersada se mide como
funcin del ngulo entre el detector y la direccin del haz incidente. En
consecuencia, las medidas realizadas simultneamente en un amplio rango
de ngulos de dispersin permiten la determinacin directa de la masa
molar y el tamao de las molculas en solucin, sin necesidad de generar
una curva de calibracin basada en referencia o suposiciones fsicas sobre la
muestra.
Si es necesario, el analista puede crear una curva de calibracin universal
para un nico analito, con la que puede interpolarse la concentracin de
todos los analitos de la misma clase.
Incidencias y Mantenimiento del Detector de Light-Scattering

Evaporativo
La Celda de Deteccin
Eventualmente la celda de deteccin de cada instrumento de light
scattering se ensuciar: esto es especialmente cierto para la cromatografa
acuosa. Detenga el flujo de fase mvil, y aumente el flujo de gas de
nebulizacin para arrastrar cualquier partcula no voltil del interior de la
celda. Por favor, consulte el manual de operacin antes de realizar
cualquier procedimiento de limpieza.
Cualquier fase mvil que se utilice sin filtrar o tampones que empleen sales
o modificadores no voltiles contribuirn a un ruido excesivo de lnea de
base o a picos continuos (spikes). En el peor de los escenarios dichos
aditivos pueden contaminar el tubo de deriva del detector y la celda de
deteccin. Modificadores voltiles que son aceptables incluyen: cido
Trifluoroactico, cido Actico, Formiato Amnico, Acetato Amnico e
Hidrxido Amnico.
Si la seal del detector de light-scattering evaporativo est fuera de escala
mientras la de la traza UV correspondiente es normal, esa respuesta
aumentada es debida a compuestos que no absorben en el UV pero que
eluyen de la columna. Recuerde que el ELSD responder a todos los analitos
semi-voltiles y no-voltiles.
Ruido de Lnea de Base

Debido a una temperatura en el tubo de evaporacin insuficiente, el ruido
en la lnea de base cromatogrfica puede aumentar como resultado de una
evaporacin de fase mvil ineficaz. Aumente la temperatura de evaporacin
en pasos de 5C tanto como se necesite para localizar la temperatura ms
baja a la que se evaporar la fase mvil de forma eficiente, pero que
minimice la prdida de cualquier componente semi-voltil de la muestra.
- 117 -

Cuando se realizan gradientes de elucin optimice la temperatura de
evaporacin para la condicin de solvente
que representa la mayor
carga de evaporacin. En anlisis con Gradiente por Fase Reversa significar
que la alta proporcin de H2O al inicio del gradiente requerir una
temperatura de evaporacin mayor que la correspondiente a una alta
proporcin de solvente orgnico. Este proceso se invertir cuando se
realicen anlisis con gradiente en Fase Normal.
Un nebulizador parcialmente bloqueado o daado, y la degradacin de la
columna por exposicin a disolventes incompatibles o condiciones extremas
de pH pueden contribuir a elevados niveles de ruido.
9.6 El Detector Espectromtrico de Masas

Los Espectrmetros de Masas trabajan ionizando las molculas y analizando
e identificando posteriormente estos iones segn sus respectivos ratios
masa/carga (m/z). Los dos componentes en este proceso son:
1.
2.
La Fuente de Iones, donde se generan los iones.

El analizador de Masa, que ordena los iones segn su ratio m/z.
Existen diferentes tipos de Fuentes de iones utilizadas comnmente en

Cromatografa Lquida/Espectrometra de Masas (LC/MS), siendo cada una
de ellas adecuada para diferentes grupos de compuestos. Muchos de los
recientes avances en LC/MS se han producido en el diseo de las Fuentes de
iones y en las tcnicas para ionizar las molculas de analito que separan los
iones resultantes de la fase mvil.
La introduccin de las tcnicas de Ionizacion a Presin Atmosfrica (API) ha
permitido expandir el nmero y el tipo de los compuestos analizables que
pueden ionizarse de forma efectiva. Durante el proceso API, las molculas
de analitos se ionizan en primer lugar, antes de ser mecnica y
electrostticamente filtradas de las especies neutras. Las tcnicas
comunes API son:
1.
2.
3.
Ionizacin por Electrospray (ESI).

Ionizacin Qumica a Presin Atmosfrica (APcI).
Fotoionizacin a Presin Atmosfrica (APPI).
- 118 -
Aplicabilidad relativa de los analitos a las tcnicas API.
Principio Operacional Ionizacin por Electrospray (ESI)

ESI utiliza la qumica en solucin para pre-formar y mantener los iones de
analito antes de que alcancen al espectrmetro de masas. El flujo de
eluyente se convierte inicialmente en un aerosol (nebulizacin) en la fuente
a presin atmosfrica. Mientras el aerosol se encuentra en la fuente est
sometido a un fuerte campo electrosttico y a una corriente caliente de gas
de secado inerte.
El campo electrosttico de alto potencial induce una posterior disociacin
de las molculas de analito, mientras que el gas de secado reduce
progresivamente las gotas de aerosol por evaporacin del eluyente. Al
reducirse el tamao de las gotas, la concentracin de la carga aumenta y
llegado un cierto tamao se alcanza el lmite Rayleigh de inestabilidad
generndose a su vez grupos de gotas cada vez ms pequeas.
Eventualmente, el tamao de gota se reduce tanto que las fuerzas de
repulsin entre los iones de la misma carga exceden la tensin superficial de
la gota, y son desorbidos directamente en fase gaseosa a travs de una serie
de explosiones de Coulomb.
Estos iones son atrados y conducidos a travs de un capilar, unos conos de
muestreo, y lentes skimmer hacia el analizador de masas para su posterior
deteccin. Desde que los iones son desorbidos de las gotas hasta que
alcanzan al analizador de masas, pueden aparecer una gran variedad de
reacciones en fase gaseosa, tpicamente transferencia de protones e
intercambio de cargas.
- 119 -
Figura ilustrando el proceso de ionizacin por Electrospray

Cualquier compuesto capaz de formar iones en solucin, bien sea a travs
de un efecto de induccin de carga o bien debido a la existencia de algn
grupo ionizable en su estructura, es susceptible de ser analizado por ESI.
ESI es especialmente til para el anlisis de grandes biomolculas, como las
protenas, oligonucletidos y carbohidratos. Estas grandes molculas
adquieren mltiples cargas y, a travs de un proceso denominado
Deconvolucin, esa serie de seales de mltiple carga puede convertirse y
asignarse a una nica carga en una escala de masa real. ESI puede tambin
emplearse para analizar pequeas molculas farmaceticas como
benzodiacepinas u otras molculas de inters biolgico.
- 120 -
Principio de Operacin Ionizacin Qumica a Presin

Atmosfrica
En APcI el eluyente se vaporiza en un nebulizador calentado, tpicamente a
350-500C. El calor causa la vaporizacin del eluyente a la fase gaseosa
ionizndose sus molculas posteriormente gracias a electrones que
provienen de la descarga continua de una aguja de corona. Los iones de
solvente formados transfieren entonces su carga a las molculas de analito
que son consecuentemente atradas hacia el capilar de entrada y conducidas
a travs del mismo, de los conos de muestreo y de las lentes de skimmer
hacia el analizador de masas para su posterior deteccin.
Figura ilustrando el proceso de Ionizacin Qumica a Presin Atmosfrica

APcI se aplica a una gran variedad de analitos polares y no polares. Sin
embargo, rara vez se producen los fenmenos de carga mltiple que son tan
caractersticos de ESI, y en consecuencia su aplicabilidad est tpicamente
dirigida a molculas de menos de 1500 Da de peso molecular que no sean
trmicamente lbiles.
En comparacin con ESI, la mxima sensibilidad en APcI se consigue
generalmente cuando se emplea cromatografa en fase normal, ya que su
mecanismo de ionizacin favorece a las molculas neutras en solucin, y los
disolventes empleados en este modo cromatogrfico no mantienen
fcilmente iones en solucin.
- 121 -
Principio de Operacin Fotoionizacin a Presin Atmosfrica

APPI opera de forma similar a APcI. El eluyente LC se nebuliza en primer
lugar con un vaporizador calentado pasando a la fase gaseosa. Los fotones
emitidos en la fuente por una lmpara de descarga se controlan
cuidadosamente con respecto a sus energas de ionizacin, permitiendo la
ionizacin de tantas molculas de analito como sea posible mientras se
minimiza la ionizacin de las molculas del eluyente. Los iones de analito
formados son atrados hacia el capilar de entrada, y conducidos a travs del
mismo, de los conos de muestreo y de las lentes de skimmer hacia el
analizador de masas para su posterior deteccin.
APPI se aplica a la mayora de analitos analizables por APcI, pero muestra
una sensibilidad mejorada para los compuestos altamente no-polares cuando
se realiza la cromatografa a bajos flujos (<100L/min).
Incidencias y Mantenimiento del Espectrmetro de Masas

Iones Contaminantes
La contaminacin de iones en el espectro de masas produce una prdida de
sensibilidad en los analitos y aumenta la complejidad en la asignacin de las
masas. Estos iones contaminantes pueden provenir de diferentes orgenes,
incluyendo:
1.
2.
3.
La Fase Mvil
La mayora de los solventes de grado HPLC contendrn impurezas que
no absorban en el UV, o estn presentes a niveles de concentracin por
debajo de los lmites de deteccin de la mayora de otros detectores
LC, pero pueden ser la mayor fuente de contaminacin de iones
observada en el espectro de masas.
Las botellas de vidrio de H2O grado HPLC son extraordinariamente
proclives a contener iones sodio y potasio que generan iones aducto de
una intensidad significativa.
Modificadores de la Fase Mvil.
Muchos de los modificadores tpicos de las fases mviles pueden
generar por s mismos iones fuertes, o introducir iones contaminantes
en la fase mvil.
Siempre que sea posible deben utilizarse reactivos de la mayor pureza
posible, y minimizar la concentracin empleada.
Tubos de Conexin.
Evite los tubos de plstico para minimizar la introduccin de iones
Ftalato. El in de Ftalato 609Da es a menudo el pico base de cualquier
espectro de masas, y puede ser introducido inadvertidamente desde los
tapones con septum.
Minimice la contribucin de los Ftalatos purgando la fuente con N2 gas
a temperaturas ms altas de las utilizadas por trmino medio para
eliminar la contaminacin.
Utilice tubo PEEK incoloro para reducir el ruido de fondo.
- 122 -
4.
5.
Los tubos de acero inoxidable a menudo producen adsorcin de los

analitos y contaminacin con lcali.
El Gas de Secado
La contaminacin por el gas de secado es especialmente importante en
APcI, pues es extremadamente sensible a los mecanismos de ionizacin
en fase gaseosa.
La principal impureza en el N2 proveniente de cilindros o de Tanques
Dewar es la existencia de hidrocarburos. La principal impureza en los
generadores de N2 es el O2 con trazas de Ar, puesto que los prefiltros
de los generadores atrapan los hidrocarburos.
Lnea de Exhaust (Escape)
En algunas ocasiones es posible que algunos contaminantes fluyan en
hacia la fuente provenientes de la lnea de exhaust. Cuando la salida
de exhaust de la fuente y la de la bomba de vaco externa estn
combinadas en una, es posible que algo del aceite de la bomba migre
hacia la cmara de spray recubriendo los componentes de la fuente y
generando contaminacin del analizador de masas. Para evitarlo se
puede incorporar una trampa intermedia entre la salida de la bomba y
la fuente, manteniendo una presin positiva en la cmara de spray en
todo momento.
Es recomendable disponer de unos espectros de masas de fondo y de blanco

obtenidos bajo condiciones estndar como referencia. Esto ayudar en la
potencial identificacin de fuentes de contaminacin en situaciones futuras.
Mantenimiento de la Bomba Rotatoria

Las Bombas Rotatorias son responsables de proporcionar el vaco inicial, y se
emplean para ayudar a la bomba turbomolecular de alto vaco unida
directamente al espectrmetro de masas. El vaco inicial est tpicamente
en el rango de 1.5 2.5 Torr. Adicionalmente, la bomba rotatoria captura y
atrapa solvente residual, contaminantes y analitos introducidos en el
espectrmetro de masas.
El nivel de fluido de la bomba rotatoria debe comprobarse una vez a la
semana. Esto se hace normalmente por inspeccin visual del nivel de fluido
en la ventana situada en el frontal de la bomba. El nivel de fluido debe
estar entre las lneas marcadas de nivel mximo y mnimo. Si est cercano a
la lnea de mnimo, hay que aadir fluido o alternativamente sustituirlo todo
si nos encontramos prximos la fecha de mantenimiento.
Cuando est limpio, el fluido de la bomba tiene un color Amarillo plido,
que a travs del tiempo y uso se va oscureciendo gradualmente. Cada seis
meses, o incluso antes dependiendo del uso, es necesario cambiar el fluido
de la bomba. Para ste cambio es necesario apagar y ventear el
espectrmetro de masas segn las instrucciones del fabricante.
Eleve la bomba del suelo y coloque un contenedor para recoger el fluido
viejo que saldr al retirar el tapn de drenaje. Desenrosque y quite el tapn
de la parte superior de la bomba y posteriormente el tapn de drenaje de
- 123 -

la parte inferior del cuerpo de la bomba permitiendo que el aceite drene.
El fluido drenar ms rpido y ms completamente si la bomba est an
caliente. Desechar el fluido antiguo para su tratamiento como residuo
txico. Reinstale el tapn de drenaje y llene la bomba con fluido nuevo
hasta que su nivel est cerca pero no por encima de la lnea superior
marcada en la ventana de visualizacin.
Aproximadamente una vez a la semana ser necesario hacer un ballast de
la bomba. El ballasting se realiza abriendo la vlvula de ballast de la
bomba rotatoria, lo que permite a la atmsfera entrar a travs del fluido de
la bomba y eliminar contaminantes atrapados restaurando su
compresibilidad. Adicionalmente, este proceso permite que cualquier aceite
atrapado en el filtro drene de nuevo al reservorio principal. El Ballasting
debe realizarse nicamente cuando el instrumento no est en uso, ya que el
vaco en el analizador estar necesariamente comprometido durante el
proceso. No deje la bomba con la vlvula de Ballast abierta durante largos
periodos de tiempo ya que esto puede potencialmente provocar daos; 30 a
60 min deben ser suficientes dependiendo del uso del instrumento, flujos y
tipo de tampones empleados.
Figura ilustrando la posicin de la vlvula de gas ballast
- 124 -
Tutorial 3
Pregunta 1
Evaluar los problemas mostrados en el siguiente cromatograma y sugerir las
posibles causas de stos y cmo pueden corregirse:
Observaciones:
Posibles Causa(s) y Solucin(es):
- 125 -
Pregunta 2
Usando los conocimientos adquiridos durante el curso complete un programa de
mantenimiento para su sistema de HPLC empleando la tabla de abajo como gua.
Componente
Frecuencia de Mantenimiento.
Cada..
Procedimiento de
Mantenimiento
48 Horas
Semana
Mes
+ Mes
La Fase Mvil
Solvente
Tamponado
Filtros de
Solvente
La Bomba
Check
Valves
Pistones y
Sellos
Frita Vlvula
de Purga
Cebado
El Autoinyector
Sello del
Rotor
Aguja y
Asiento de
la Aguja
La columna
Guarda
Columna
Columna
El Detector
Lmpara
Celda Flujo
- 126 -

10. Guia para incidencias
La interpretacin del cromatograma HPLC es esencial para el diagnstico
correcto y la correccin de los problemas en LC. Los problemas se pueden
identificar a partir del cromatograma y pueden englobarse en una de las
tres categoras siguientes:
Lneas de Base
La apariencia o el perfil de la lnea de base pueden ayudar en la
identificacin de muchos de los problemas asociados con los
componentes del sistema.
Forma de los Picos
La forma del pico cromatogrfico proporciona una valiosa informacin
al caracterizar las prestaciones proporcionadas tanto por los
componentes del sistema como por la columna.
Tiempos de Retencin
Cualquier variacin observada en los tiempos de retencin de los
analitos es crtica en el diagnstico para eliminar problemas del
sistema LC.
- 127 -
10.1 Lneas de Base

La pariencia de la lnea de base cromatogrfica puede describirse de
mltiples formas distintas. Estas se describen a continuacin, haciendo
referencia a las posibles causas y sus acciones correctoras.
10.1.1 Lneas de Base Errticas

Mostradas en el cromatograma como variaciones aleatorias a corto plazo
(positivas y negativas), no muestran un patrn lgico cuando las estudiamos
en un intervalo mayor de tiempo.
La siguiente tabla enumera una serie de razones por las cuales la lnea de
bsica puede ser errtica, junto a la solucin apropiada sugerida.
- 128 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Lneas de Base Errticas

Componente
Causa Potencial
Desgasificacin mezcla incorrecta de la Fase Mvil
Solucin
Asegurese de desgasificar convenientemente.
Asegrese que la Fase Mvil se ha preparado correctamente de acuerdo al
PNT, incluyendo la(s) necesaria(s) etapa(s) de filtracin.
Bomba HPLC
Fallos en la Vlvula Proporcional de Gradiente (mezclado)
Llene las 4 botellas de disolvente con el mismo volumen del mismo y

realice una mezcla 1:1:1:1 durante un tiempo suficiente. El consumo en
cada botella de disolvente debe ser el mismo si las vlvulas individuales de
cada canal operan correctamente.
Vlvulas antirretorno de entrada y/o salida pegadas o parcialmente

bloqueadas.
Sustituya y compruebe
Realice los tests de mantenimiento especfico indicados por el fabricante
para evaluar la integridad de los componentes individuales del cabezal de
la bomba.
Limpie o sustituya los que sean necesarios siguiendo el protocolo descrito
(ver pg. 46 ss), o las instrucciones del fabricante.
Fugas en los sellos de los pistones
Sustituya y compruebe.
Automuestreador
Adsorcin de muestra en los componentes de la vlvula de inyeccin.
Columna
Ligero sangrado de muestra fuertemente retenida o matriz
Use un disolvente para la muestra lo ms fuerte posible sin que

comprometa la forma de pico (ver pgs. 65 ss).
Implemente un rgimen de lavados de la vlvula tras cada inyeccin.
Use una guarda columna.
Asegurese de que la columna se lava con un disolvente fuerte despus de
cada muestra o lote de muestras (ver pgs. 86 ss).
Detector
Tiempo de Reequilibracin insuficiente
Mnimo 10 volmenes de columna. En

volmenes de columna.
Polvo o suciedad en los tarjetas electrnicas
Sustituya el detector y compruebe. Si es necesario solicite una visita al

servicio tcnico.
Lmpara cerca del fin de su vida til.
Mantenga un diario del uso de la lmpara.
Celda de Flujo contaminada con muestra y/o matriz

Captura de Datos
Conversor Analgico-Digital o tarjetas electrnicas defectuosas
mtodos con Par Inico 2050
Establezca un tiempo obligatorio de sustitucin de la lmpara p.ej. 80%

del total de su vida til esperada.
Desmonte y limpie o sustituya la celda de flujo segn las directrices del
fabricante.
Sustituya el sistema de captura de datos y compruebe. Si es necesario
solicite una visita al servicio tcnico.
Conexiones con mala toma de tierra.
Compruebe y ajuste todos los cables de conexin visibles.
Perdda de contacto en los cables
- 129 -
10.1.2 Lnea de Base Cclica (Corta Frecuencia)

Se observa como una oscilacin cclica positiva o negativa y a corto plazo
en la traza cromatogrfica.
Lnea de base cclica a corta frecuencia y lnea de base normal

No confunda una burbuja de aire en la celda del detector con un problema
con la lmpara. Las burbujas de aire pueden fluir hacia el detector y causar
un pico muy estrecho, o una perturbacin que se parece a un pico
cromatogrfico, aunque de una ancho de pico apreciablemente menor. En
otros casos la burbuja de aire puede pararse en la celda de flujo y causar un
desplazamiento dramtico de la lnea de base; generalmente fuera de
escala.
La desgasificacin inapropiada de los disolventes es por lo general la causa
ms frecuente de problemas con burbujas, y en especial si se est
empleando un sistema de mezcla a baja presin. En estos casos la reduccin
de presin producida en la mezcla de los disolventes permite la
desgasificacin de los mismos al ser menos solubles en la mezcla que en los
disolventes por separado.
- 130 -

Si no lo tiene instalado, considere usar un regulador de contrapresin
despus del detector para evitar la desgasificacin asociada a la reduccin
de presin. Elija un regulador de contrapresin que tenga una especificacin
de presin MENOR que la presin mxima que permite la celda de flujo del
detector. Como alternativa puede usar un tubo PEEK de 50 cm de longitud y
0.17mm de d.i. a la salida del detector y al que se le conecta la lnea de
desechos.
Es posible identificar problemas de burbujas de aire parando el flujo de la
fase mvil, si el problema es una burbuja, la lnea de base permanecer
estable, bien dentro fuera de escala. En cambio, un problema electrnico
en la lmpara permanecer cuando se pare el flujo de fase mvil.
La tabla siguiente enumera diferentes razones por las que la lnea de base
del cromatograma puede mostrar oscilaciones de corta frecuencia junto con
su solucin adecuada.
- 131 -
Lnea de Base Cclica (Corta Frecuencia)

Componente
Causa Potencial
Desgasificacin o mezcla inapropiada de la fase mvil
Solucin
Asegurese de desgasificar convenientemente.
Asegrese que la Fase Mvil se ha preparado correctamente de acuerdo al
PNT, incluyendo la(s) necesaria(s) etapa(s) de filtracin.
Bomba HPLC
Aire atrapado en el cabezal(es) de la bomba
Rellene las botellas de disolvente y cebe las lneas lo que se requiera.

Abra la vlvula de purga, aumente el flujo (5mL/min) para desplazar el
aire atrapado.
Vlvulas antirretorno de entrada y/o salida pegadas o parcialmente

bloqueadas.
Afloje la rosca de la vlvula de salida para desplazar el aire atrapado.

Sustituya y compruebe.
Limpie o sustituya si es necesario utilizando el protocolo genrico descrito
(ver pgina 46 ss), o siguiendo las instruccines del fabricante.
Automuestreador
Sustituya o repare el amortiguador de pulsos (damper)
Solicite una visita del servicio tcnico si se requiere.
Fuga potencial en el cuerpo de la vlvula de inyeccin que introduce aire.
Realice el test de mantenimiento especificado por el fabricante para

evaluar la integridad de los componentes del automuestreador.
Loop o conexin de la aguja potencialmente defectuosos.
Revise la vlvula conmutable para buscar conexiones flojas.

Desmonte y re-asiente la vlvula conmutable o sustituya sus comentes si
es necesario.
Detector
Burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo.
Purge el aire. NO exceda el lmite mximo de operacin-tpicamente 120

bar para una celda de flujo de 1 cm y 13L de volumen.
Revise la documentacin del fabricante para confirmar.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presin para evitar la desgasificacin. Tpicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. ser suficiente.
Fluctuaciones de la corriente elctrica de alimentacin
Compruebe otros instrumentos

fluctuaciones si es necesario.
instale
proteccin
- 132 -
contra
las
10.1.3 Lnea de Base Cclica (Larga Frecuencia)

Observada como una oscilacin positiva o negativa de la traza
cromatogrfica de larga frecuencia.
La tabla siguiente enumera diferentes razones por las que la lnea de base
del cromatograma puede mostrar oscilaciones de larga frecuencia junto con
su solucin adecuada.
- 133 -
Lnea de Base Cclica (Larga Frecuencia)

Componente
Causa Potencial
Solucin
Fluctuaciones de Temperatura que cambian la composicin del disolvente

o su viscosidad
Compruebe que la botella de disolvente est cerrada.
Bomba de HPLC
Aire atrapado en el cabezal(es) de la Bomba
Abra la vlvula de purga, aumente el flujo (5mL/min) para desplazar el

aire atrapado.
Columna
Fluctuaciones en la temperatura del termostado de columnas
Compruebe la calibracin de temperatura del horno de columnas.
Ligero Sangrado de una muestra o de matriz fuertemente retenida
Asegrese de que la columna se lava con un disolvente fuerte al final de

cada muestra o lote de muestras analizadas.
Burbuja(s) de aire atrapada(s) en la celda del detector
Purge el aire. NO exceda el lmite mximo de operacin-tpicamente 120

bar para una celda de flujo de 1 cm y 13L de volumen.
Mantenga constante la temperatura de la fase mvil.
Afloje la rosca de la vlvula de salida para desplazar el aire atrapado.
Detector
Revise la documentacin del fabricante para confirmar.

Crawford Scientific
- 134 -

La figura de abajo muestra como la termostatizacin de la fase mvil no
solo asegura una lnea de base aceptable sino que adems mantiene una
forma de adecuada del pico cromatogrfico.
El cromatograma (b) se obtuvo con una temperatura de columna de 380C,
pero con la fase mvil entrando a temperatura ambiente (220C). Puede
observarse una apreciable distorsin y ensanchamiento de los picos.
El cromatograma (a) se obtuvo empleando un pre-calentador del eluyente,
que consiste en un tubo de acero inoxidable de 0.25mm d.i. enrollado como
una bobina plana y fijado al bloque de calentamiento del horno de
columnas, situado entre el automuestreador y la columna. Algunos hornos
comerciales incluyen ya un pre-calentador de fase mvil.
- 135 -
10.1.4 Lineas de Bases con Deriva

Se define como Deriva a la variacin de la seal cromatogrfica con el
tiempo siempre en la misma direccin (tendencia), sea sta positiva o
negativa.
La tabla siguiente indica diferentes razones por las que la lnea de base del
cromatograma puede mostrar deriva junto con su solucin adecuada.
- 136 -
Lneas de Base con Deriva

Componente
Causa Potencial
Fuerte absorbacia mostrada por un(os) componete(s) de la fase mvil.
Contaminacin y/o Evaporacin de la Fase Mvil.
Solucin
Si se usa un Detector Diodo-Array (DAD) seleccione una longitud de onda
de referencia y un ancho de banda adecuados para eliminar el efecto de
absorbancia del (los) componente(s).
Registre los n de lote de los disolventes y aditivos para identificar fuentes
potenciales de contaminantes que absorban.
Prepare fase mvil fresca y compruebe de nuevo.
Compruebe los puntos de ebullicin de los componentes de la fase mvil.
Tape las botellas de disolvente para evitar prdidas por evaporacin.
Bomba HPLC
Automuestreador
Inmiscibilidad de los disolventes empleados en la Fase Mvil.
Lave el sistema con un disolvente intermedio compatible antes de

introducir nueva fase mvil. Evale la posible inmiscibilidad refirindose a
la tabla de miscibilidad (Ver pg. 15).
Columna no acondicionada con la nueva fase mvil.
Cebe las lneas y lave el sistema de HPLC hasta que se obtenga una lnea
de base estable.
Re-equilbrado insuficiente de la columna o del gradiente de elucin.
Si empleamos un gradiente completo (i.e. 5 100% solvente B), debemos

asegurar un cambio de 10 volmenes de columna antes de realizar una
nueva inyeccin de muestra.
Adsorcin de muestra en los componentes de la vlvula de inyeccin.
Mantenga la posicin de inyeccin de la vlvula del inyector al menos unos

minutos despus de la introduccin de la muestra para asegurar un lavado
intenso.
Use un disolvente de la muestra tan fuerte como sea posible sin que se
comprometa la forma de pico
Implemente un rgimen de lavado de la vlvula despus de cada
inyeccin.
Columna
Detector
Ligero sangrado de muestra o matriz fuertemente retenida.
Asegrese de que la columna se lava con un disolvente fuerte despus de

cada muestra o lote de muestras.
Mtodo de Fase Reversa con formacin de Pares Inicos.
Aumente el tiempo de re-equilibrado a 20-25 volmenes.
Exposicin del Sistema gradientes de temperatura.
Termostatice la columna y las lneas de entrada y salida de la misma.
Direccin Negativa Componente fuertemente absorbente en un eluyente

dbil.
Seleccione en el DAD la longitud de onda de referencia y un ancho de

banda adecuados para eliminar el efecto de absorbancia del (los)
componente(s)
Direccin Positiva Componente fuertemente absorbente en un eluyente

fuerte.
Compruebe que est usando el disolvente correcto.

Asegrese de que la polaridad de la seal del detector est correctamente
seleccionada.
- 137 -
10.1.5 Lneas de Base con Ruido

Las perturbaciones momentneas positivas o negativas o los saltos de la
seal cromatogrfica causando picos transitorios se denominan spikes.
La forma ms simple de comprobar si hay un excesivo ruido en la lnea de

base es realizar un cromatograma sin inyectar muestra. Ample el
cromatograma blanco resultante de forma que pueda medir fcilmente la
amplitud de la lnea de base. Seleccione una regin de sta, p.ej.
aproximadamente de un minuto, expandindola lo suficiente para mostrar el
ruido, y trace lneas que describan a grosso modo los lmites de ste. La
distancia fsica entre ambas lneas puede convertirse a unidades de
Absorbancia (AU).
La mayora de los detectores tienen especificaciones de ruido de 0.5 1.0 x

10-5 AU, de forma que un detector que muestre excesivo ruido puede
identificarse con facilidad. Un ruido excesivo en la lnea de base puede
reducirse de forma aceptable gracias a la instalacin de un filtro de
resitencia capacitancia.
Las especificaciones del detector se suelen dar sobre una celda seca y vaca
a 255nm.
No es muy prctico tener que crear una celda seca,
especialmente si se desea medir el ruido bajo condiciones similares a las del
anlisis cromatogrfico. Es aceptable sustituir la tcnica de la celda de flujo
seca por una fase mvil isocrtica y estacionaria. Si el ruido observado en
estas condiciones est aproximadamente a 2x de la especificacin, el
detector est funcionado correctamente. El ruido a s ms bajas, como
215nm, ser mayor aquel mostrado a 255nm con la fase mvil fluyendo a
travs de la celda.
Los transitorios (Spikes) se caracterizan por tener un ancho de pico a
mitad de altura considerablemente menor que un pico cromatogrfico real.
Aparecern de forma aleatoria durante el anlisis cromatogrfico, estando
por encima del ruido de lnea de base determinado de la forma
anteriormente indicada. Una lmpara de detector cerca del lmite de su
vida o un ruido electrnico excesivo generalmente causan este tipo de
perturbaciones. La tabla siguiente sugiere diferentes causas para que una
lnea de base muestre ruido junto con su solucin propuesta.
- 138 -
Lneas de Base Ruidosas

Componente
Causa Potencial
Solucin
Burbujas de aire en la Fase mvil
Asgurese de desgasificar adecuadamente
Bomba HPLC
Compruebe todas la conexiones buscando fugas que pudieran provocar la

entrada de aire
Elimine est posibilidad parando el flujo de fase mvil: si an se muestra

el ruido entonces el conjunto de suministro de disolvente no es la causa.
Compruebe las reas alrededor del cabezal de la bomba por si hubiera

depsitos de sales de los tmpones.
Apriete las conexiones si es necesario.
Automuestreador
Introduccin de aire durante la inyeccin.
Realice los test de mantenimiento especificados por el fabricante para

evaluar la integridad de los componentes individuales del
Automuestreador.
Disolvente de la muestra o Fase mvil incorrectas
Columna
Sustituya los componentes dudosos si es necesario.
Si la viscosidad del disolvente de la muestra es alta, o posee un bajo punto

de ebullicin, es conveniente reducir la velocidad de succin de muestra y
la de inyeccin para evitar cavitacin.
Temperatura de la Columna mayor que el punto de ebullicin de alguno de

los componentes de la fase mvil.
Prdida de los ligandos de la fase estacionaria.
Disminuya la temperatura de separacin para evitar la ebullicin del

disolvente.
Crawford
Scientific
Revalide el mtodo si hay una prdida deresolucin
o cambia
la
selectividad de la columna.
Compruebe que el mtodo est operando en el rango correcto de pH para
esa columna.
Compruebe que el mtodo funciona dentro de los lmites de
especificados para esa columna.
Disolucin de la slice de la fase estacionaria.

Detector
Pertubaciones
electrnicos.
elctricas
spikes
provenientes
de
los
circuitos
pH
Sustituya el detector y compruebe.

Solicite una visita del servicio tcnico si se requiere.
Burbujas de aire atrapadas en la celda del detector.
Purge el aire. NO EXCEDA el lmite superior de presin establecido para la

celda del detector, tpicamente de 120 bares para una celda estndar de
1cm de paso ptico y 13L de volmen.
Revise la literatura del fabricante para confirmarlo.
Mantenga un registro de las horas de uso de la lmpara.
Captura de Datos
Lmpara cerca del lmite de su vida til.
Establezca un periodo de sustitucin obligatorio de la lmpara. P.ej. al

80% de su tiempo de vida til esperada.
Mala toma de tierra / Conexin floja
Sustituya el sistema de adquisicin de datos y compruebe.

Revise y reconecte todos los cables de conexin visibles.
- 139 -
2007
10.2
Formas de Pico
10.2.1 Ensanchamiento de los Picos

La correccin de picos ensanchados requiere determinar si dicho
ensanchamiento es producto de cambios en el sistema HPLC, deterioro de la
columna o se trata de un eluido tardo proveniente de una inyeccin
anterior.
Si todos los picos separados se han ensanchado, siendo los primeros los que
muestren ms ensanchamiento, el problema vendr causado simplemente
por la introduccin de un gran volumen extra-columna en el sistema;
Adicin de una longitud de tubo desproporcionada.

Una conexin de capilar o de columna deficiente.
Conexiones de PEEK (ajustables a mano) desgastadas.
Si no es as, o el ensanchamiento de pico se viene observando durante un

periodo de tiempo largo, es un indicativo del deterioro general de la propia
columna.
La Eficiencia de la Columna, o nmero de platos (N), se usa como medida
matemtica del deterioro de una columna en funcin del tiempo y del
nmero de inyecciones. Midiendo el nmero de platos para un determinado
compuesto de la muestra, o evaluando el pico cromatogrfico con un
conjunto de estndares de calidad recomendado por el fabricante de la
columna, y comparando el resultado con el registro histrico nos indicar la
magnitud del deterioro. Siempre que la fase mvil y el resto de parmetros
del sistema no se hayan cambiado, la retencin de los analitos no debera
variar significativamente cuando la eficiencia caiga.
- 140 -

La Eficiencia de la columna se puede calcular aplicando la ecuacin
siguiente:
N = 5.54 x (tR / w0.5)2
Dnde;
N=
Nmero de Platos de la Columna
tR = Tiempo de Retencin del Analito
w0.5 = Ancho de pico a mitad de altura (FWHH)
Si N aumenta cuando aumenta el tiempo de retencin del analito, es

que la columna genera la mayor contribucin al volumen muerto del
sistema, y el HPLC funciona correctamente.
Si N decrece o llega a ser aleatorio cuando aumenta el tiempo de
retencin del analito, es el HPLC quien genera la mayor contribucin
al volumen muerto del sistema y no funciona adecuadamente.
Hay que evaluar si otros componentes del sistema pueden tambin

contribuir al ensanchamiento de los picos. stos incluyen guarda columnas
deterioradas, o la introduccin inadvertida de gran volumen extra-columna.
Los compuestos de alto peso molecular, en especial las protenas, pueden
ensanchar sus picos en columnas de tamaos de poro < 80A; asegurese que
usa un tamao de poro > 300A cuando analice dichas especies qumicas.
Puede sospecharse de que un pico que eluye tarde provenga de una
inyeccin previa cuando aparece como un nico pico ancho en un
cromatograma con el resto de los picos estrechos. Es importante destacar
que este pico puede no aparecer en todas las inyecciones, y por lo tanto
puede no ser observado inicialmente, especialmente en separaciones multicomponente complejas. Puesto que este eludo tardo en cuestin sufre
simplemente de un aumento en su factor de capacidad (k), una
aproximacin simple para identificar su origen es permitir que el
cromatograma tenga una duracin de muchas veces el tiempo de anlisis
normal.
Una forma ms eficiente para localizar a un pico de elucin tarda es
calcular primero su tiempo de retencin real. Esta aproximacin tiene la
ventaja de que permite saber con que inyeccin en particular est
realmente asociado el pico.
En primer lugar determine el n de platos de un pico determinado del
cromatograma. Como ejemplo tomaremos un pico con tiempo de retencin
de 12min, y un ancho de pico a mitad de altura (PWHH) de 0.15min. A
partir de la ecuacin descrita anteriormente obtendramos:
N = 5.54 x (12 / 0.15)2 y
N = 35,456
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 141 -
Resolviendo la ecuacin para tR tendramos;

tR = 0.425 x (w0.5) x N y
tR = 12.0
Midiendo el ancho de pico a mitad de altura del ltimo pico es posible
predecir su tR.
En este ejemplo supondremos que el ancho de pico problema es de 0.5min.
Utilizando este ancho de pico, y el nmero de platos previamente
determinado a partir del pico cromatogrfico de 35.456, el tiempo de
retencin calculado es de 40min. Esto significa que el ltimo pico que eluye
est relacionado con una inyeccin realizada 40 min antes. Re-inyectando la
muestra sospechosa y alterando el tiempo de anlisis en consecuencia
podemos confirmar este tiempo de retencin.
A menudo no es posible eliminar estos picos de elucin tarda. Por lo tanto,
en lugar de modificar las condiciones de separacin, o esperar hasta que el
pico eluya antes de hacer la siguiente inyeccin, es generalmente ms
conveniente modificar el tiempo de anlisis de forma que el pico de elucin
tardo caiga en una zona irrelevante del cromatograma posterior.
- 142 -
10.2.2 Desdoblamiento de Picos y Hombros

Si todos los picos del cromatograma son dobletes probablemente la
columna ha desarrollado un vaco o canalizaciones en su inicio. La
sustitucin de la columna confirmar rpidamente el problema.
Si se sospecha de la existencia de un vaco hay que desmontar la conexin

de cabeza de columna y comprobar visualmente la misma. Si existe un vaco
hay que rellenarlo con fase estacionaria, y si no, limpiar o sustituir la frita y
probar la columna de nuevo para establecer si el problema fue
originalmente
causado
por
una
frita
parcialmente
obstruida.
Adicionalmente, invertir la columna y lavarla con un 100% de disolvente
fuerte puede eliminar cualquier contaminacin que bloquee la entrada de la
columna envindola directamente a desechos. Compruebe las instrucciones
del fabricante para saber si la columna puede mantenerse en orientacin de
flujo inversa.
Puesto que el bloqueo parcial de la frita de entrada de la columna est
generado por depsitos de partculas existentes en la fase mvil, disolvente
de la muestra o rotor seal, asegurese de filtrar adecuadamente e insertar un
filtro de lnea entre el inyector y la cabeza de columna.
Si solamente uno de los picos del cromatograma se muestra como un
doblete, podemos sospechar de la existencia de otro pico o interferencia
que coeluye. Confirme la presencia de esta interferencia cambiando la
longitud de onda del detector, o mejorando la resolucin de la separacin
usando una columna que proporcione una mayor eficiencia, p.ej. una
columna ms larga o empacada con partculas de menor tamao.
Ajuste la selectividad mostrada por el sistema de separacin frente a los
compuestos que coeluyen alterando la composicin o el tipo de la fase
mvil, la temperatura de separacin o la fase estacionaria de la columna.
Use algn procedimiento previo de limpieza de la muestra p.ej. SPE para
eliminar cualquier interferencia contaminante. Evale si un determinado
pico que coleuye proviene de una inyeccin previa o no, inyectando un
blanco y evaluando segn el procedimiento descrito en la pg 141.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 143 -

Lave de forma rutinaria la columna con un disolvente fuerte de alto poder
de elucin cuando realice separaciones isocrticas. Este efecto se muestra
en la figura de abajo, donde la forma de pico de un grupo de drogas bsicas
son separadas isocrticamente en una fase mvil de 25mM Na2HPO4
(pH3.0):MeOH (60:40) y su forma se mejora significativamente tras un
lavado de columna con 100% de acetonitrilo.
Si se ha inyectado un volumen de muestra demasiado grande, y el solvente

de la muestra y la fase mvil no han sido adecuadamente emparejados, se
producirn dos equilibrios de distribucin, generando un particionamiento
diferencial de la muestra en la columna. La consecuencia de esto ser la
formacin de dobletes o picos con hombros. Refererirnos a las reglas
empricas descritas en las pgs. 79 ss en relacin con el emparejado del
volumen de inyeccin y la fuerza del disolvente de la muestra ayudar a
eliminar este fenmeno.
La siguiente figura ilustra el deterioro en la forma de pico debido a un
inadecuado emparejamiento entre el disolvente de la muestra y la fase
mvil, mostrando la inyeccin de una mezcla de cuatro componentes
disuelta en diferentes disolventes y separada en una columna de fase
reversa C18 bajo condiciones isocrticas de MeOH:H2O 60:40 (v/v).
La mezcla test se separ en cada cromatograma disuelta en;

(a) Fase Mvil
(b) Tetrahidrofurano
(c) Etanol
(d) Butanol
- 144 -

El aumento de la fuerza de elucin del disolvente produce una degradacin
apreciable de la forma de pico cromatogrfico.
Evale si la columna ha sido saturada en masa. Es posible determinar
empricamente la masa mxima que puede inyectarse en un determinado
anlisis empleando la ecuacin siguiente:
max 50 x (1 k' / k')2 x dc2
Dnde;
max =
k' =
dc =
Masa de muestra en g
Factor de Capacidad
Dimetro interno de la Columna en cm
Esta ecuacin no funciona bien para tamaos de partcula < 5m, o si

compuestos bsicos muestran adsorcin diferencial con la fase estacionaria.
max se refiere a cada compuesto independiente en la muestra y no a la
masa total de muestra. Por lo tanto, si no hay componentes de la muestra
por encima del 10% de la masa total de muestra max ser 10x el valor
efectivo calculado.
Si se requiere use una fase estacionaria de mayor capacidad, es decir, con
un mayor % de carbono u mayor tamao de poro, una columna con mayor
dimetro o reduzca la cantidad total de muestra inyectada.
Desmonte la vlvula de inyeccin y revise el rotor seal en bsqueda de un
posible desgaste, incluyendo roturas entrecuzadas, que pueden generar la
presencia de una ruta de flujo inesperada en el inyector. Sustituya el rotor
seal si es necesario, fijando un nmero mximo de inyecciones antes de
sustituir peridicamente el mismo. Para ms informacin refirase a la
seccin 5.3 Incidencias del Automuestreador "Efecto Memoria".
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 145 -
10.2.3 Picos con Cola

La aparicin de colas en los picos es una de las deformaciones
cromatogrficas ms frecuentes. Se dice que un pico tiene cola cuando
muestra una asimetra mayor de 1.2, aunque en ocasiones picos con valores
de As tan altos como 1.5 puedan ser aceptables para una gran variedad de
ensayos. El factor de asimetra de pico () se calcula segn la siguiente
ecuacin:
= wb2 / wb1
Donde;
wb2 = Ancho del pico en la lnea de base despus del centro del pico
wb1 = Ancho del pico en la lnea de base antes del centro del pico
La principal causa de aparicin de cola en un pico es la coincidencia de ms

de un mecanismo de retencin. En las separaciones por Fase Reversa, el
principal modo de retencin de los analitos es a travs de interacciones
hidrofbicas no-especficas con la fase estacionaria. Sin embargo, tambin
son frecuentes las interacciones polares con grupos de silanoles residuales
existentes en el soporte de slice. Compuestos que posean en su estructura
grupos amino o cualquier otro grupo bsico, pueden interactuar
fuertemente con los grupos silanoles ionizados, produciendo picos con cola.
Este efecto se muestra en la figura siguiente a un pH >3.0.
- 146 -

Estas interacciones secundarias pueden minimizarse si se realiza la
separacin a un pH ms bajo, asegurando as la protonacin completa de los
citados grupos silanol residuales;
Otra alternativa es la utilizacin de columnas end-capped. End-capping

es el nombre que se da al proceso qumico por el cual los grupos silanoles
residuales de la fase estacionaria se transforman en otros grupos funcionales
sustancialmente menos polares en su superficie. Esta modificacin tiene el
efecto de reducir las interacciones secundarias que puedan producirse
potencialmente con molculas de analitos polares.
Los reactivos qumicos empleados para el proceso de end-capping
incluyen generalmente;
Trimetilclorosilosano (TMCS)
Hexametildisilazano (HMDS)
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 147 -
El proceso de End-capping reduce las colas observadas con analitos

polares, bloqueando de forma eficiente sus interacciones con los grupos
silanol residuales que pudieran ser potencialmente ionizables. A pesar de
ello, el end-capping slo disminuye aproximadamente a un 50% el nmero
de grupos silanol no reaccionados. Debido a factores de impedimento
estrico este tipo de reacciones rara vez son eficientes en trminos
absolutos y en consecuencia una columna completamente end capped no
es nunca tanto como debera!
En el caso de que todos los picos cromatogrficos muestren cola debe
considerarse la posibilidad de que la columna se haya sobrecargado por un
exceso de muestra. Evale aplicando la ecuacin descrita previamente en
la pgina 104. Si fuera necesario utilice una fase estacionaria de mayor
capacidad p.ej. de mayor % carbono o tamao de poro, utilice una columna
de mayor dimetro, o reduzca la cantidad absoluta de muestra o volumen
inyectado.
Examine la columna por si se hubieran formado volmenes muertos o se
hubiera bloqueado parcialmente la frita de entrada. Sustituir la columna
por otra nos confirmar rpidamente el problema.
Si se sospecha que existe algn volumen muerto, quite las conexiones de
cierre y revise la cabeza de columna. Si se observa algn hueco en el relleno
cbralo con fase estacionaria, o si no, limpie o sustituya la frita de entrada
y pruebe la columna de nuevo para ver si el problema estaba originado o no
por una frita parcialmente obstruida. En ocasiones, invertir la columna y
- 148 -

lavarla con un 100% de un disolvente fuerte tambin permite eliminar
bloqueos y contaminacin del filtro de entrada.
Compruebe las instrucciones del fabricante para ver si la columna puede
mantenerse en la orientacin inversa de flujo o no.
Si slo uno, o algunos, de los picos cromatogrficos muestran cola,
considere la posibilidad de que la columna est mostrando efectos de
particin o retencin secundarios.
Reduzca la probabilidad de que cualquier analito potencialmente bsico
interactu con los grupos silanol residuales usando columnas fabricadas con
slice desactivada (Tipo B), que han sido completamente bloqueadas (endcapped). Como parte de cualquier procedimiento de desarrollo de mtodos
reduzca el pH de la fase mvil para suprimir la ionizacin de cualquier grupo
silanol. En general, una fase mvil con pH <3 ser suficiente para este
propsito. Adicionalmente, el empleo de fases mviles a bajo pH asegura la
protonacin de los analitos cidos, aumentando su retencin y minimizando
cualquier tipo de interaccin inica.
La figura de abajo ilustra el efecto producido en las colas de pico al reducir
el pH de separacin. La mezcla de cinco frmacos bsicos consiste en
Fenilpropanolamina, Efedrina, Anfetamina, Metanfetamina y Fenteramina
(Picos 15) respectivamente. El primer cromatograma se adquiri a un pH
de la fase mvil de 7.0, y en estas condiciones de separacin, el Pico 4,
Metanfetamina muestra un factor de cola USP al 5% (USP Tf 5%) de 2.35.
La disminucin del pH de la fase mvil reduce la interaccin de los analitos
bsicos con los grupos silanol residuales eliminado de esta forma la cola
excesiva de los picos. El segundo cromatograma se adquiri con una fase
mvil a pH 3.0 y el USP Tf (5%) de la Metanfetamina en estas condiciones se
redujo a 1.33.
La adicin de Trietilamina (TEA) a la fase mvil en niveles de concentracin

de 510mM, tambin reduce o posiblemente elimina, la cola en compuestos
bsicos. La TEA compite con los analitos polares bsicos por enlazarse con
los grupos silanol residuales, produciendo una funcin de pseudo endTraduccin Grupo Biomaster 2009
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 149 -

capping. Esta alternativa sin embargo es menos conveniente, ya que la
fase estacionaria se altera irreversiblemente por la adicin de tal
modificador, afectando a la selectividad mostrada por el sistema de
separacin posteriormente.
La cromatografa de pares de iones puede resolver el problema de las colas
para analitos cidos o bsicos. Otra opcin para la separacin de especies
inicas podra ser emplear cromatografa de intercambio inico.
Desde un punto de visto prctico, generalmente slo es posible utilizar el pH
para suprimir la ionizacin cida ya que la ionizacin bsica requiere valor
de pH tpicamente mayores de 8, y a ese pH se puede producir la disolucin
de la slice. Sin embargo, los fabricantes de columnas ofrecen versiones que
permiten trabajar a un pH mayor, protegiendo la slice de su disolucin por
medio de ligandos bi- y tri- dentados. Estos ligandos son en realidad dos o
tres ligandos tradicionales que se han puenteado por medio de procesos
qumicos patentados antes de aplicarlos a la fase estacionaria.
Su
estructura puenteada permite proteger su superficie frente a valores
extremos de pH.
La Figura muestra ligandos bidentados y la proteccin ofrecida a la

superficie de la slice gracias a su estructura de puente.
Un nico pico con cola tambin podra producirse por un pequeo pico
eluyendo inmediatamente despus del pico cromatogrfico de inters. La
posibilidad de que esto ocurra es la razn primordial por la que las colas de
pico nunca deben ignorarse.
Como se describa en el apartado
desdoblamiento de picos y hombros, podemos confirmar la presencia de
un interferente cambiando la longitud de onda de deteccin, o mejorar la
resolucin de la separacin empleando una columna de mayor eficiencia
p.ej. una columna ms larga o empaquetada con partculas de menor
tamao.
Ensanchamiento de Picos de la pg. 105.
- 150 -
10.2.4 Picos con Frente
Si todos los picos cromatogrficos muestran frente debe considerarse la

posibilidad de una sobrecarga de la columna por exceso de muestra
inyectada. Evalelo aplicando la ecuacin descrita previamente en la pg.
104. Si fuera necesario utilice una fase estacionaria de mayor capacidad
p.ej. de mayor % carbono o tamao de poro, utilice una columna de mayor
dimetro, o reduzca la cantidad absoluta de muestra o volumen inyectado.
Si se ha inyectado un volumen de muestra excesivamente grande, y el
solvente de la muestra y la fase mvil no estn adecuadamente
emparejados, pueden producirse dos equilibrios de distribucin, provocando
una particin diferencial en la columna. Refirase a las reglas empricas
descritas en las pginas 54-56 en relacin al adecuado emparejamiento de
entre el volumen de inyeccin con la fuerza eluotrpica del disolvente de la
muestra para eliminar ste fenmeno.
Un nico pico que muestre frente tambin puede deberse a un pequeo pico
que eluya justo antes del pico cromatogrfico de inters. Esta posibilidad es
la principal razn por la que un pico con frente nunca debe ser ignorado.
Como se describa en el apartado desdoblamiento de picos y hombros,
podemos confirmar la presencia de un interferente cambiando la longitud de
onda de deteccin, o mejorar la resolucin de la separacin empleando una
columna de mayor eficiencia p.ej. una columna ms larga o empaquetada
con partculas de menor tamao.
la pg. 89.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 151 -
10.2.5 Efecto Memoria y Picos Fantasma
Los picos fantasmas son picos que aparecen en el cromatograma, incluso

cuando no se ha realizado ninguna inyeccin. Hay dos causas frecuentes
para la aparicin de picos fantasma:
1.
Puede ser un pico de elucin tardo proveniente de una inyeccin

anterior. Debido a que tal pico habr estado en la columna durante un
tiempo apreciable, se mostrar como mucho ms ancho que el resto de
picos cromatogrficos de su alrededor.
La fuente potencial puede trazarse empleando el mtodo de clculo de
tiempos de retencin descrito anteriormente en la pg 141. Modifique
el mtodo segn se necesite, incluyendo el lavado de la columna con
un disolvente fuerte para eliminar cualquier contaminante potencial
que estuviera fuertemente adsorbido.
2.
Los picos fantasmas pueden derivarse de una fase mvil contaminada.

Bajo condiciones isocrticas los picos pueden ser distintos, o se puede
observar un desplazamiento de la lnea de base slo despus de que el
HPLC est funcionando durante algn tiempo. En condiciones de
gradiente los picos normalmente aparecen al mismo tiempo de
retencin, tanto en la inyeccin de un blanco como en la de una de
muestra.
En cualquier caso, dichos picos fantasma pueden trazarse como
originados por una fase mvil contaminada. Para aislar la fuente
contaminacin use fase mvil recin preparada, slo disolventes de
grado HPLC, Agua de grado HPLC y aditivos y tampones de alta pureza.
Si el problema persiste elimine uno a uno los componentes de la fase
mvil hasta aislar el problema.
- 152 -
El Reciclaje de fase mvil se encuentra limitado a las separaciones

isocrticas exclusivamente, y es ms til para aquellos mtodos
empleados para anlisis rutinarios con concentraciones de muestra
moderadas como ocurre con frecuencia en los laboratorios de Control
de Calidad. Los componentes de la muestra se diluyen en el tanque de
recogida de fase mvil de forma que pasa un tiempo considerable
hasta que el fondo (background) del cromatograma cambia de forma
preciable. Esto se evidencia por lo general en una lnea de base
ascendente o un mayor nivel de ruido, producindose una prdida en la
sensibilidad de los analitos. En ese momento tambin pueden
observarse picos fantasma de cuando en cuando.
A menudo se aade cido trifluoroacetico (TFA) a las fases mviles de fase
reversa como agente formador de par-inico para estrechar los picos
cromatogrficos. Potencialmente puede aparecer contaminacin del TFA si
se utiliza una nica botella como origen, ya que la exposicin del TFA al aire
lo oxida rpidamente. Considere por lo tanto el uso de ampollas de TFA
selladas individualmente ms que alicuotar desde una botella ya abierta.
Este puede ser especialmente aplicable para el anlisis de estabilidad de
muestra forzadas a degradarse. El Tetrahidrofurano sufre tambin de los
mismos problemas de degradacin oxidativa.
La posibilidad de que el sistema de inyeccin pueda ser la fuente de picos
fantasma tambin existe. Material proveniente de las muestras de
inyecciones anteriores puede haber quedado adsorbido en diferentes
componentes del sistema de inyeccin, especialmente en el rotor seal, y
producirse unn sangrado en una escala grande tiempo. Evale lavando el
sistema de inyeccin con un disolvente fuerte para inyectra posteriormente
un blanco. Si no se observan picos en el blanco, optimice e incorpore ese
rgimen de lavado al mtodo, o investigue el mecanismo potencial de la
adsorcin del componente y corrjalo en consonancia.
Puesto que diferentes materiales de rotor pueden adsorber materiales
diferentes de la muestra, merecera la pena investigar si el efecto se
disminuye o incluso se elimina, cambiando entre rotores de Vespel,
Tefzel y PEEK que estn comercialmente disponibles.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 153 -
10.2.6 Picos Negativos

La aparicin de picos negativos se produce debido a factores no relacionados
con las interacciones entre los analitos y la columna. Se observan picos
Negativos cuando los cables de seal del detector estn invertidos, o cuando
el interruptor de polaridad se encuentra en la posicin incorrecta. Los picos
Negativos son normales cuando se utiliza el Detector de Indice de
Refraccin.
Los picos Negativos aparecern en el cromatograma si la absorbancia de la

muestra es menor que la de la fase mvil a la longitud de onda de
deteccin. Hay que emplear por lo tanto fases mviles que muestren una
absorbancia UV/Vis baja, o cambiar la longitud de onda de deteccin del
analito.
Si a lo largo del tiempo se concentran en la fase mvil compuestos
fuertemente absorbentes puede aparecer una situacin similar si el
disolvente se recicla. Si est empleando reciclado de fase mvil y comienzan
a aparecer picos negativos tras un uso prolongado de la fase mvil, lave
abundantemente la columna con un disolvente fuerte y re-equilbrela, con
fase mvil recientemente preparada. Si desaparece el problema de picos
negativos, es un indicio de que la fase mvil estaba contaminada.
Cuado se emplea el detector de Diodo Array (DAD) es recomendable
emplear una longitud de onda de referencia para posibilitar la sustraccin
de lnea de base. Esto tiene la ventaja de corregir una lnea de base con
deriva mejorando as los lmites de deteccin y de cuantificacin.
Es
importante asegurarse de que la longitud de onda de referencia y el ancho
de banda (bandwith) se han elegido correctamente para prevenir la
posibilidad de que se produzca una absorbancia mayor que la de los analitos
a detectar y se generen picos negativos en el cromatograma.
El procedimiento correcto para la seleccin de las longitudes de onda de
deteccin y de referencia se describe en relacin con el espectro UV del
cido ansico. Para optimizar la deteccin de la menor cantidad posible de
- 154 -

cido ansico seleccione la longitud de onda de medida al pico ms intenso
del espectro, es decir, 252nm. Tratando el espectro como si fuera un pico
pseudo-cromatogrfico, compruebe su anchura a media altura (PWHH). Este
ser en ancho de banda de la longitud de onda de medida (Bandwith) p.ej.
30nm.
Es posible reducir los efectos de fondo gracias a una adecuada eleccin de
las longitudes de onda de medida y de referencia. La longitud de onda de
referencia puede emplearse para eliminar los siguientes efectos, que
provocarn todos ellos derivas de lnea de base durante el anlisis
cromatogrfico o bien mostrarn ondulaciones o ruido en la misma;
1.
2.
Reduccin del ruido generado por:

Particulas en suspensin
Cambios en el ndice de refraccin del eluyente cuando se emplean
gradientes de elucin.
Turbulencias en la celda de flujo
Reduccin en la deriva del instrumento causada por:
Envejecimiento / deformacion de la lmpara
Identifique en el cromatograma el pico que absorbe a la longitud de onda

mayor, en el ejemplo es el cido ansico. Determine la longitud de onda a
la que el pico del cido ansico deja de absorber, se considera generalmente
cuando la absorbancia cae por debajo de 1.0mAU, y en el ejemplo del cido
ansico ser 300nm. Para evitar la posibilidad de una contribucin a la
absorbancia de la longitud de onda de referencia elegida, aada 10nm a
este valor Esta longitud de onda ser el lmite inferior de la longitud de
onda de referencia, i.e. 310nm.
Para eliminar los efectos de fondo descritos hay que elegir un ancho de
banda grande, tpicamente de 100nm, y situar la longitud de onda de
referencia en el punto medio de esta ventana i.e. 360nm.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 155 -
10.3
Tiempo de Retencin
El tiempo de retencin de los analitos puede fluctuar, aumentar o disminuir,

y es crtico para diagnosticar y eliminar problemas en el sistema de HPLC.
El diagnstico de las variaciones observadas en el tiempo de retencin
equiere determinar si el problema est generado por el sistema HPLC o por
la columna. A partir de los principios fundamentales;
Si el tiempo muerto (t0) y el tiempo de retencin del analito (tR)

varan juntos podemos sospechar de un cambio en el flujo de
eluyente. En este escenario el factor de capacidad (k') se mantendr
constante.
Si es slo el tiempo de retencin del analito tR el que vara, entonces
k' cambiar tambin. En este escenario las sospechas van dirigidas a
un en cambio en la selectividad del sistema de separacin, es decir,
en la composicin de la fase mvil, la temperatura, la fase
estacionaria de la columna, etc.
10.3.1 Tiempos de Retencin Fluctuantes

La variacin en el tiempo de retencin de los analitos se debe generalmente
a cambios producidos en la composicin de la fase mvil, y es tpicamente el
resultado de una mezcla de solventes inconsistente. Una reduccin del
510% en el tiempo de retencin del analito por fase reversa puede
producirse por cada 1% de incremento en la proporcin del componente
orgnico de la fase mvil. Esta variacin es bien conocida, y a menudo se
utiliza para producir grandes cambios en la selectividad particular de un
sistema de separacin para un rango de analitos cuando es necesario.
La figura a continuacin muestra la variacin de tiempo de retencin en una
serie de inyecciones consecutivas de una mezcla estndar de cuatro
componentes, empleando un sistema de mezcla a baja presin. La parte
inicial del mtodo de separacin emplea una seccin isocrtica de 12 mn a
62% B.
- 156 -

Suponiendo que el contenido de las botellas de disolvente se ha preparado
correctamente, la incorrecta composicin de la fase mvil puede provenir
de unos de los dos problemas siguientes;
1.
Si existe una restriccin en uno o ms de los canales de disolvente que

vienen desde las botellas hacia la vlvula de proporcin, la proporcin
obtenida de la mezcla de solventes ser incorrecta. Para eliminar la
posibilidad de que el suministro de una o ms fases mviles est
restringido, hay que desconectar la lnea de entrada de disolvente de
la vlvula proporcional. Una vez desconectada, el lquido debe sifonar
libremente si no existe ninguna restriccin.
Afloje el tapn de la botella de disolvente si est cerrado, para liberar
cualquier vaco parcial de la botella. Si la presurizacin insuficiente
fuese la causa del problema el solventes sifonar entonces
perfectamente. Si el flujo queda an restringido, quitar el filtro de
entrada de disolvente y comprobar si sifona de nuevo. Si la lnea sifona
libremente el filtro est bloqueado. Si el filtro es del tipo de vidrio
sinterizado lmpielo sumergindolo en cido ntrico 6M, para despus
lavarlo abundamentemente con H2O, despus con MeOH, y de nuevo
con agua antes de reinstalarlo. No lo sonique, puesto que podra
provocarse la fractura del vidrio debido a la frecuencia de ultrasonidos
aplicada.
Si una lnea de disolvente se encuentra restringida se introducir menos
disolvente, generando un ligero vaco en la vlvula proporcional de
gradiente. En consecuencia, cuando la segunda vlvula se abra habr
un torrente del nuevo disolvente para compensar ese vaco parcial, con
el resultado de que la proporcin de disolvente introducido variar. Un
exceso de disolvente B en la fase mvil har que los analitos eluyan
antes, como en el ejemplo observado en el cromatograma del
ejemplo.
2.
Si el suministro de disolvente no se encuentra restringido, el problema

puede encontrarse en el software de control o sospecharse de un
problema mecnico en la vlvula proporcional. Los sistemas de mezcla
a baja presin trabajan abriendo cada vlvula proporcional durante un
tiempo determinado, cerrndola, y abriendo despus la segunda
vlvula, etc. En el ejemplo anterior, si el ciclo total de la vlvula
fuese de 100ms, y se necesitara una fase mvil isocrtica de 38% A:62%
B la vlvula A permanecer abierta durante 38ms y la vlvula B durante
62ms.
Para comprobar si hay fallos en la vlvula proporcional, cebe todas las
lneas con el mismo disolvente y partiendo de volmenes iguales en las
botellas realice una mezcla cuaternaria de proporcin fija 1:1:1:1 (v/v)
durante un tiempo fijo a un flujo fijo. La reduccin del volumen en
cada botella de disolvente debe ser la misma si la vlvula funciona
correctamente.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 157 -
Adicionalmente, cuando se dejan preparadas fase mviles durante un

tiempo los solventes ms voltiles de la mezcla pueden evaporarse,
produciendo un cambio en las caractersticas generales de retencin.
Sin embargo la evaporacin no tiene mucha influencia en los mtodos
en fase reversa, a menos que la botella de disolvente se caliente
durante el uso. Pueden producirse problemas con la fase mvil cuando
se usa un disolvente reciclado incorrectamente. Asegrese de que la
botella de disolvente contiene un minmimo de unos tres litros de fase
mvil, y que est siendo agitada constantemente. De esta forma los
contaminantes o cualquier otro pequeo cambio en el eluyente
proveniente de la columna sern diluidos eficientemente antes de
pasar a travs del sistema la prxima vez.
Las variaciones de tiempo de retencin tambin pueden ser causadas por
fluctuaciones de la temperatura. Por cada cambio de 1C en la temperatura
de la columna puede producirse un cambio del 12% en el tiempo de
retencin. La forma ms sencilla de eliminar este problema potencial es
asegurarse de que tanto la columna como la fase mvil estn
termostticamente controladas. Compruebe problemas potenciales de
temperatura usando un termmetro calibrado, y determine si cualquier
fluctuacin de temperatura observada se correlaciona con cambios en el
tiempo de retencin de los analitos.
El envejecimiento de la columna puede tambin contribuir a variaciones en
el tiempo de retencin. El empleo de guarda columna puede extender en la
prctica la vida efectiva de una columna. Ms an, se recomienda el uso de
guarda columna por una razn especfica; servir de filtro para eliminar
materiales fuertemente retenidos que podran contaminar potencialmente
la columna analtica.
Analizar estndares de comprobacin con ms frecuencia puede permitir un
sistema de captura de datos que actualice convenientemente la deriva
observada en el tiempo de retencin. Asigne un pico cromatogrfico de la
muestra como pico de referencia. El uso de un estndar interno puede
ayudar tambin, en especial si se utilizan tiempos de retencin relativos en
lugar de absolutos.
La tabla siguiente muestra el efecto observado de cambiar las condiciones
de separacin en el tiempo de retencin tR de los analitos.
Efecto del cambio de las Condiciones de Separacin en la
retencin de los analitos
Variable
Mtodo
Cambio Variable
Cambio Prom. tR
Flujo
Todos
+1%
-1%
Temperatura
Todos salvo SEC
+10C
-(12%)
- 158 -
Composicin de la Fase Mvil:

Solvente Orgnico
RP-HPLC*
+1% (v/v)
-(510%)
pH
RP-HPLC
+0.01 unit
(01%)
Solvente Fuerte
Fase Normal
+1%
-(12%)
Tampn:
SEC
+1%
0%
Solvente Orgnico
* Incluyendo Cromatografa de Pares de Iones RP-HPLC
Mejora la fiabilidad de cualquier anlisis LC con respecto a las variaciones

en tiempo de retencin y a la forma de los picos asegurndose de que la
capacidad tamponadora de la fase mvil es suficiente para compensar
cualquier cambio de pH.
Generalmente un tampn funcionar con la mayor eficiencia cuando se
encuentre en 1 unidades de pH del pka del analito. Es muy importante
saber que los tampones fosfato no proporcionan la capacidad tamponadora
deseada en el rango de pH de 36. Este rango de pH puede llenarse bien
usando un tampn acetato (pka 4.8), o citrato, ya que este tampn muestra
tres pkas en el rango de pH tpico de las separaciones en fase reversa. Sin
embargo, el citrato tiene el inconveniente de ser altamente corrosivo para
las superficies de acero inoxidable.
La tabla siguiente muestra el rango efectivo de la capacidad tamponadora
de diferentes tampones cidos comunes:
Valores pka para Tampones cidos comunes
Tampn
Pka
Rango pH efectivo*
Fosfato
2.1
1.1 3.1
7.2
6.2 8.2
12.3
11.3 13.3
Acetato
4.8
3.8 5.8
Citrato
3.1
2.1 4.1
4.7
3.7 5.7
5.4
4.4 6.4
* Rango pH efectivo 1 pH unidades del pka
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 159 -

Para mantener una adecuada capacidad tamponadora de las muestras de
analitos, comience con una concentracin de tampn entre 2550mM. No
emplee menos de 20mM, a no ser que utilice un detector espectromtrico
de masas.
Considere cambiar a un sistema tampn de naturaleza voltil p.ej. acetato
amnico o formiato amnico. Los tampones voltiles previenen contra la
contaminacin y el ensuciamiento de la fuente del espectrmetro de masas,
mejorando la sensibilidad y la eficiencia en la deteccin.
La figura de abajo muestra el efecto negativo producido por variacin del
pH en el tiempo de retencin del analito y en su forma de pico. Los dos
compuestos cromatografiados son cido benzoico y srbico respectivamente.
A un pH tamponado de 3.5 stos cidos dbiles se encuentran
completamente protonados, y por lo tanto muestran tiempos de retencin
largos en una caolumna de fase reversa. (Cromatograma A). A un pH
tamponado a pH 7.0 los cidos se encuentran completamente
desprotonados. Poseen ahora un grado de polaridad mucho mayor que a pH
3.5, y en consecuencia su tiempo de retencin decrece dramticamente
(Cromatograma B). Sin embargo, se utiliza un pH no tamponado de 7.0 el
estado de ionizacin de estos analitos no est controlado de forma
eficiente, y el equilibrio dinmico est constantemente cambiando entre la
forma ionizada e ion- suprimida y tanto el tiempo de retencin como la
forma de pico varan dramticamente (Cromatograma C).
10.3.2 Decrecimiento del Tiempo de Retencin

Si el tiempo muerto(t0) y el tiempo de retencin (tR) decrecen
simultneamente, el factor de capacidad del analito (k') permanecer
constante. En este escenario puede sospecharse de un progresivo aumento
en el flujo. Compruebe los parmetros de operacin del mtodo y la
calibracin del flujo del sistema.
Chequee el pH de cualquier fase mvil tampn utilizada. A menos que se
establezca especficamente por parte del fabricante de la columna, el pH de
operacin debe mantenerse en el rango de pH de 2 a 8. Por debajo de pH 2
el enlace siloxano que une el ligando de la fase estacionaria al soporte de
slice se romper, producindose la prdida de fase estacionaria. Por
encima de aproximadamente pH 8 se produce la disolucin del soporte de
slice. En ambos casos disminuir el tiempo de retencin de los analitos.
- 160 -

Considere cambiar el tipo de columna a una variedad polimrica no basada
en slice para permitir separaciones cromatogrficas a pH extremo.
Asegrese de que la columna no esta sobrecargada. Aplique la ecuacin
descrita en la pg 145, y si fuera necesario aumente la carga de carbono de
la columna utilizada, o disminuya la cantidad absoluta de la masa de analito
aplicado bien diluyendo la muestrta o reduciendo el volumen de inyeccin.
Elimine cualquier interaccin secundaria de la columna usando un
modificador de fase mvil o tamponando sta adecuadamente. La
Trietilamina puede aadirse como base competitiva para eliminar las
interacciones polares con los grupos silanol residuales, y para aumentar la
carga de carbono efectiva de la columna.
Si realiza gradientes de elucin asegrese de que todos componentes del
disolvente se mezclan en la proporcin y calidad de mezcla adecuadas.
Afloje los tapones de las botellas de disolvente para liberar cualquier
formacin de vaco parcial, asegurando la completa presurizacin y el
llenado completo de las lneas de alimentacin de disolvente.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 161 -
10.3.3 Aumento del Tiempo de Retencin

Si el tiempo muerto(t0) y el tiempo de retencin (tR) aumentan
simultneamente, el factor de capacidad del analito (k') permanecer
constante.
En este escenario puede sospecharse de una progresiva
disminucin en el flujo. Compruebe los parmetros de operacin del mtodo
y la calibracin del flujo del sistema.
Compruebe el cabezal de la bomba buscando fugas. Si realiza gradiente de
elucin compruebe que el gradiente est siendo mezclado y proporcionado
correctamente.
Afloje los tapones de las botellas de disolvente para
liberar cualquier formacin de vaco parcial, asegurando la completa
presurizacin y el llenado completo de las lneas de alimentacin de
disolvente.
10.4
Incidencias con la Presin
Durante el funcionamiento puede esperarse algn aumento en la

contrapresin del sistema. Un aumento en la viscosidad de la fase mvil
producir un incremento en la presin del sistema, y puede producirse
simplemente por una reduccin de la temperatura de operacin de la
columna. De forma similar cualquier cambio en la composicin de la fase
mvil puede alterar la viscosidad. El Isopropanol es cuatro veces ms
viscoso que el metanol a temperatura ambiente, mientras que una mezcla
de H2O:MeOH 40:60 (v/v) generar aproximadamente el doble de la presin
que el MeOH puro.
Otros factores que contribuirn a un incremento en la presin del sistema
son el aumento del flujo, el aumento de la longitud de la columna, la
reduccin del tamao de las partculas de slice o cualquier bloqueo o
restriccin en la ruta seguida por la fase mvil. Elimine la columna como
causa del aumento de presin retirndola del sistema y sustituyndola por
una unin de volumen cero.
Para localizar un bloqueo parcial reduzca el flujo de fase mvil de forma
que se obtenga una presin inferior a 500psi. Con las gafas de proteccin
puestas, vaya aflojando sistemticamente las conexiones LC, yendo desde el
detector hacia la bomba. Cuando se afloje la conexin justo antes del
componente bloqueado la presin caer de forma significativa. La pieza
sospechosa puede limpiarse o sustituirse si es necesario. Si despus de
eliminar el bloqueo ste vuelve a aparecer al poco tiempo, debemos
examinar con mayor detalle la fuente potencial del problema.
- 162 -
10.4.1 Aumento Continuo de la Presin sin

Inyecciones de Muestra
Cuando se observa un aumento constante en la presin del sistema sin que
se hayan realizado inyecciones las causas pueden ser las siguientes:
1.
Partculas en la Fase Mvil

Deben filtrarse todos los disolventes y tampones que no sean de gradoHPLC a travs de un filtro de 0.22m para eliminar cualquier material
particulado; ver pgs 40 ss para ms informacin. Las partculas en la
fase mvil pueden daar los sellos de los pistones del cabezal de la
bomba. El desgaste de los sellos de los pistones puede provocar que las
vlvulas antirretorno se peguen produciendo incrementos de presin,
adems de las variaciones en el tiempo de retencin de los analitos
debido al inadecuado suministro de fase mvil. Cuando se sustituyan
los sellos es necesario evaluar tambin el desgaste de los pistones. Con
una lupa y luz intensa compruebe que no se han formado estras o
canales en el mbolo del pistn. Cualquier dao del pistn producir
inmediatamente un dao en el sello reproduciendo el problema.
2.
Los componentes de la Fase Mvil son inmiscibles o insolubles.

Compruebe la compatibilidad de los disolventes de la fase mvil usando
la tabla de compatibilidad de la pg 15. Emplee un disolvente
intermedio de lavado cuando tenga que cambiar entre fases mviles
potencialmente inmiscibles. Elimine cualquier traza de tampn con
agua antes de la siguiente aplicacin, para evitar la posible
precipitacin y la introduccin inadvertida de material particulado en
el sistema cuando se cambia de un mtodo a otro.
3.
Fase Mvil Inestable (polimerizacin).
4.
Formacin de volmenes vacos en la columna

Las prestaciones de la columna se irn deteriorando con el tiempo. La
exposicin continua a alta presin producir la compresin de la fase
estacionaria, y el desarrollo de un volumen vaco en cabeza de
columna. Adems del aumento en la contrapresin, la forma del pico
cromatogrfico
comenzar
a
deteriorarse;
se
producir
ensanchamiento de los picos debido a la cada de la Eficiencia y
aparecern desdoblamientos de los picos y hombros.
La disolucin de la slice se produce a pH alto. A menos que lo
establezca especficamente el fabricante, no use tampones con pH por
encima de pH 8. Al trabajar con una fase mvil a pH alto debe
emplearse una columna saturadora que puede ayudar a prolongar la
vida de la columna analtica. Una columna saturadora puede ser una
columna vieja del mismo tipo que la columna analtica situada entre el
cabezal de la bomba y el automuestreador. Para minimizar la
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 163 -

contrapresin adicional producida la columna saturadora suele ser de
150 mm o ms corta.
El fundamento tcnico es que la fase mvil iniciar el ataque a la
columna saturadora en primer lugar, pre-tratando de forma efectiva la
fase mvil de forma que ser menos agresiva con la columna analtica.
A medida que el relleno de la columna saturadora se va disolviendo se
generan micropartculas de slice que van acumulndose y bloqueando
la frita de salida de la columna saturadora. Estas partculas se van
haciendo cada vez ms pequeas, y eventualmente pueden pasar a
travs del filtro de salida de la columna saturadora. Es muy
conveniente por lo tanto instalar un filtro de lnea de 0.5m o menor
entre la salida de la columna saturadora y la entrada del
automuestreador para atrapar estas partculas.
Con la disponibilidad comercial de rellenos de slice estables a alto pH,
y de fases sin slice resistentes al ataque pH, actualmente hay menos
justificacin en el uso de columnas saturadoras.
- 164 -
10.4.2 Aumento Continuo de la Presin con

Inyecciones de Muestra
1.
Particulas en la muestra
Las partculas existentes en la muestra producen contaminacin en la
frita de entrada de la columna, generando un incremento de la presin
y anormalidades en la forma de los picos p.ej. colas, desdoblamientos,
etc. Revise visualmente la calidad de la muestra disuelta antes de
inyectarla para decidir si necesita o no ser filtrada. Si el aspecto es
turbio o hay visible material particulado, filtre a travs de un filtro de
0.5 o 0.22m.
Instale un filtro de lnea entre el inyector y la columna, y si se
sospecha de contaminacin proveniente de la muestre instale una
guarda columna para servir de filtro qumico y de partculas.
2.
Compuestos de la Muestra insolubles en la Fase Mvil.

Bajo condiciones de inyeccin ideales el disolvente de la muestra debe
ser el mismo que la fase mvil, o ms dbil. De esta forma se evitarn
anormalidades en la forma de los picos ya que el disolvente de la
muestra no requiere dilucin a la concentracin de la fase mvil y se
evitan mecanismos de particin secundarios. Refirase a las pgs 7982
para ms informacin sobre las condiciones a aplicar cuando se
inyecten muestras en solventes de mayor fuerza eluotrpica que la fase
mvil para asegurar la solubilidad.
3.
Componentes de la muestra irreversiblemente enlazados a la fase

estacionaria de la columna.
Asegrese de que todos los componentes de la muestra son eluidos de
la columna despus de su uso. Elimine los analitos fuertemente
adsorbidos lavando la columna con un disolvente de gran poder de
elucin. Asegrese de que el poro de la fase estacionaria es suficiente
para analizar los analitos en cuestin; use columnas con tamao de
poro de 300 para compuestos de peso molecular mayor de 5kDa.
Invierta el flujo de fase mvil a travs de la columna para acelerar la
eliminacin de cualquier analito fuertemente retenido o liberar el
bloqueo parcial del filtro de entrada de la columna. Las columnas con
base de slice pueden invertirse generalmente sin consecuencias. Sin
embargo, algunas columnas especiales como las de Filtracin en Gel o
las de resinas de intercambio inico pueden no ser tan robustas.
Consulte la literatura proporcionada por el fabricante de la columna
para aclarlo.
Desconecte la columna, invirtala y conecte la antigua salida al tubo
que viene del automuestreador. Lave aproximadamente con 20
volmenes de columna de fase mvil ~ 50mL para una columna de 4.6
x 250mm para eliminar cualquier partcula de la frita, antes de
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 165 -

conectar su salida (la antigua entrada) al detector. Deje la columna en
esta configuracin de flujo inverso y contine la operacin
normalmente.
10.5
Sensibilidad
Una baja sensibilidad puede producirse por alguna de las razones siguientes:
1.
2.
3.
4.
Hay suficiente muestra?

Compruebe prdidas durante la preparacin de la muestra realizando
anlisis de muestras dopadas con una concentracin conocida de
analito.
Considere el uso de estndar interno para ajustar las prdidas
durante la el proceso de preparacin de muestra optimizando el
mtodo de forma apropiada.
Problemas en el Inyector?
Compruebe la calibracin del automuestreador.
Aplique la tcnica de inyeccin adecuada para el volumen disponible
de muestra. Consulte las pgs 79-82 para ms informacin sobre el
llenado completo o parcial del loop.
La aguja del Inyector est parcialmente obstruida.
Rotor Seal desgastado, con una ruta no barrida por la fase mvil.
Problemas en el Detector?
Compruebe el flujo de fase mvil a travs del detector, despejando
cualquier posible bloqueo.
La atenuacin del Detector es demasiado alta.
Es importante verificar los datos cromatogrficos proporcionados por
el sistema de tratamiento de datos peridicamente, evaluando el
aspecto de la lnea de base, picos y separacin en general. Con el fin
de evaluar adecuadamente la sensibilidad del sistema es necesario
disponer se una vista estndar o atenuacin del instrumento. Aunque
la atenuacin puede fijarse en el propio instrumento, es ms
frecuente que la realice el sistema de tratamiento de datos. Un
usuario puede pensar que tiene mala sensibilidad frente a un analito
si la atenuacin se ha seleccionado muy alta.
Concentracin de la Muestra fuera del rango lineal del detector.
Diluya o pre-concentre la muestra para llevar a los analitos dentro del
rango lineal del detector.
Cambio en el Flujo?
Flujo Reducido
Un flujo reducido generar picos cromatogrficos anchos.Las reas de
pico se mantendrn constantes, aunque la altura de pico se reducir,
reduciendo la sensibilidad efectiva y los lmites de deteccin y
cuantificacin. Compruebe los ajustes del mtodo.
Evale el sistema de suministro de disolvente para comprobar si los
sellos de los pistones se han desgastado o las vlvulas antirretorno se
han pegado o bloqueado parcialmente afectando al fujo de fase
mvil.
- 166 -
La reduccin de la temperatura de separacin, la viscosidad de la

fase mvil, cambian el flujo efectivo y los efectos de transferencia de
masa.
10.6 Recuperacin
Una mala recuperacin de la muestra puede producirse por mltiples
razones, pero se debe tpicamente a la adsorcin irreversible de los
ananlitos en la fase estacionaria o en los componentes extra-columna.
Aumente la fuerza eluotrpica de la fase mvil para minimizar la adsorcin.
Para la separacin de analitos bsicos emplee slice desactivada, columnas
con en-capping, o aada una base competitiva como la trietilamina para
minimizar las interacciones retentivas secundarias. Considere usar una
columna de fase estacionaria pomrica si la adsorcin en demasiado fuerte.
Emplee componentes inertes en las conexiones y tubos.
Crawford
Scientific
2007
Crawford
Scientific
2007
- 167 -

Incidencias y Mantenimiento en HPLC PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Incidencias y Mantenimiento en HPLC PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Incidencias y Mantenimiento en HPLC

Traduccin Grupo Biomaster 2009

Crawford Scientific 2007