Sunteți pe pagina 1din 14

Universitatea de Stiinte Agronomice si

Medicina Veterinara Bucuresti


Facultatea de Biotehnologii

TRIPSINA
-REFERATCoordonator Stiintific:
Asistent Universitar Dr.
Simion Vasilica
Student:
Draghici Maria-Veronica

Bucuresti
-2016-

CUPRINS:
INTRODUCERE..pag.3
Cap 1. NOTIUNI GENERALE...............................................pag.6
Cap 2. METODE DE DETERMINARE A TRIPSINEI...pag.8
2.1 Dozarea activitatii tripsinei utilizand ca substrat
hemoglobina denaturata....pag.8
2.1.1 Principiul metodeipag.8
2.1.2 Reactivi si solutii..pag.9
2.1.3 Mod de lucru....pag.9
2.1.4 Calculul rezultatelorpag.9
2.2 Dozarea activitii enzimatice a tripsinei prin metoda GrossMichaelispag.10
2.2.1Principiul metodei..pag.10
2.2.2 Reactivi si solutiipag.10
2.2.3 Mod de lucru..pag.10
2.2.3 Calculul rezultatelor..pag.11
Cap 3. IMPORTANTA SI APLICATIILE TRIPSINEIpag.12
CONCLUZII...pag.13
Bibliografie..pag.14
3

INTRODUCERE
In organismele vii, mii de reactii chimice se desfasoara foarte rapid in conditiile de
presiune si temperatura ale acestuia. Toate aceste transformari sunt mediate de enzime(denumite
initial fermenti sau diastaze), proteine specializate sa catalizeze reactiile metabolice.
Substantele transformate in aceste reactii se caracterizeaza printr-o tendinta limitata de
reactie "in vitro" in aceleasi conditii cu cele din organism.
Astfel de procese, favorabile termodinamic, pot decurge cu viteze crescute datorita actiunii
catalitice a enzimelor.
Caracteristicile enzimelor
Enzimele pot fi definite biocatalizatori care prezinta urmatoarele trasaturi caracteristice:
1.

2.
3.

Enzimele au o putere catalitica enorma accelerand viteza reactiilor cu pana la


1016 fata de viteza reactiei necatalizate. Aceasta capacitate depaseste puterea
oricarui catalizator folosit in sinteza organica. Enzimele au aceasta imensa putere
catalitica in solutii diluate, in conditii moderate de pH si temperatura;
Enzimele nu se consuma si nu se transforma in reactiile catalizate;
Enzimele se caracterizeaza printr-o mare specificitate. Orice enzima este foarte
selectiva atat in ceea ce priveste substanta pe care o transforma (substrat) cat si
din punctul de vedere al reactiei catalizate.

E (enzima)+ S (substrat)

ES (Complex enzima-substrat)

E+ P(produsi)

Se desfasoara fara reactii secundare, astfel ca rezulta numai compusii doriti. Prin aceasta
actiune enzimele se deosebesc de catalizatorii din chimia organica, reactiile desfasurate in
absenta enzimelor avand randamente mai scazute si fiind insotite de reactii secundare.
4.
5.

6.
7.

Enzimele scad energia de activare a moleculelor de substrat pe care le transforma


accelerand astfel viteza reactiei biochimice.
Capacitate de reglare. Reglarea activitatii enzimatice se realizeaza in moduri
diferite ce variaza de la controlul cantitatii de enzima sintetizate de celula pana la
modularea activitatii sale prin interactiuni reversibile cu activatori si inhibitori
metabolici. Activitatea variata a enzimelor poate fi pusa pe seama capacitatii de
adaptare structurala si functionala a proteinelor. Enzimele contribuie astfel la
coordonarea si reglarea proceselor metabolice.
Enzimele se gasesc in celule si actioneaza in cantitate foarte mica dar cu efect
semnificativ.
Enzimele pot cataliza reactiile in conditiile organismului, la temperatura de
aproximativ 37oCsi la presiune atmosferica.

Nomenclatura si clasificarea enzimelor


La inceputurile enzimologiei au fost caracterizate in special enzime ce catalizau reactii de
hidroliza a legaturilor covalente din molecula diverselor substraturi si, de aceea, erau denumite
prin adaugarea sufixului aza la numele substratului asupra caruia actionau.
De exemplu: ureaza (enzima care hidrolizeaza ureea), lipaza (hidrolizeaza lipidele),
fosfataza (hidrolizeaza legaturile fosfat din compusii organici fosforilati), amilaza (care
hidrolizeaza amidonul), proteaze (enzime care scindeaza proteinele), etc. Altele erau denumite cu
numele uzuale mai vechi: pepsina, tripsina, etc.
Aceasta nomenclatura a condus insa la o serie de confuzii si, din acest motiv, Comisia pentru
Enzime a Uniunii Internationale de Biochimie a introdus in 1956 o baza sistematica pentru
denumirea enzimelor.
In prezent fiecarei enzime ii este atribuit un numar de cod si un nume sistematic.
Numarul de cod este format din 4 cifre precedate de prescurtarea EC (Enzyme Comission),
acestea indicand:

prima cifra - clasa de enzime (in functie de reactia catalizata);

a doua cifra - subclasa (da indicatii asupra donorului din reactie);

a treia cifra - subsubclasa (face referire la natura acceptorului din reactie);

a patra cifra indica enzima individuala.


In functie de reactia pe care o catalizeaza, miile de enzime sunt repartizate in 6 clase:
1. Oxidoreductaze;
2. Transferaze;
3. Hidrolaze;
4. Liaze;
5. Izomeraze;
6. Ligaze.

1. Oxidoreductazele catalizeaza reactii de oxidoreducere, prin care se transfera hidrogen


sau electroni intre doua substraturi.
2. Transferazele sunt enzime care catalizeaza transferul unor grupe variate intre doua
substraturi. Numele acestora este in functie de natura grupei transferate: metiltransferaze,
aminotransferaze, formiltransferaze, fosfotransferaze.
3. Hidrolazele sunt enzime care participa la hidroliza unor legaturi diverse, fiind
subclasificate (a doua cifra) in functie de natura acestora.
4. Liazele sunt enzime care participa la formarea unor legaturi duble C-C, C-N, C-O, prin
indepartarea nehidrolitica a unor grupe din substrat.
5. Izomerazele sunt enzime care permit desfasurarea reactiilor de izomerizare fiind
subclasificate in functie de tipul reactiei catalizate.
6. Ligazele sunt enzime care intervin in formarea unor noi legaturi C-C, C-O, C-N, C-S
folosind ATP-ul ca sursa de energie..

Cap 1. NOTIUNI GENERALE


Din clasa hidrolaze fac parte urmatoarele subclase:
3.1- legatura esterica (esteraze);
3.2- legatura glicozidica (glicozidaze);
3.3- legatura fosfat (fosfataze);
3.4- legatura peptidica (peptidaze);
3.5- legaturi intre carbon si azot.
Peptidazele catalizeaza scindarea hidrolitica a legaturilor peptidice specifica structurii
protidelor.
R1
------- CH

R2
CO - NH

R1
------ CH

CH --------R2

COOH

H2N

CH ------

Acestea se subdivid in endopeptidaze si exopeptidaze. Majoritatea peptidazelor actioneaza


la nivelul tubului digestiv avand ca substrat protidele de origine exogena, motiv pentru care li se
atribuie denumirea de enzine proteolitice.
Endopeptidazele (proteinazele) cliveaza legaturile peptidice in anumite pozitii din interiorul
catenei polipetidice, au ca substrat proteinele si polipeptidele cu masa moleculara mare iar ca
produsi de hidroliza catene polipeptidice mai scurte,respectiv cu masa moleculara mai mica;
prezinta o specificitate larga de actiune, sunt sintetizate in sistemul ribozomal din celule sub
forma de proenzime ( precursori inactivi ) si ulterior secretate din celule in tractul digestiv unde
sunt rapid convertite in formele lor active. Formele enzimatic active rezulta dupa eliberarea din
molecula proenzimelor a unor fragmente peptidice care actioneaza ca inhibitori. Existenta lor sub
forma inactiva are un efect protector prevenind digerareamucoaselor tractului digestiv; sunt
serin-proteaze, situsul lor catalitic continand un radical de serina reactiv; unele reactioneaza la
pH bazic iar altele la pH acid. Din endopeptidaze fac parte: pepsina din sucul gastric, tripsina
din sucul intestinal, chimotripsina din intestinul subtire, etc.
Tripsina este o enzim proteolitic ce este secretat sub form inactiv pentru a preveni
autodigestia pancreasului. Enzimele proteolitice atac proteinele ,,fr discriminare ; ele nu fac
distincie ntre proteinele organismului i cele provenite din alimentaie. Pe lng acest mecanism
de protejare, pancreasul secret o substan anti-tripsina. Aceasta este o anti-enzim ce are
proprietatea de neutraliza i distruge tripsina, dar previne i activarea altor enzime proteolitice. In
cazul in care canalele de eliminare a sucului pancreatic sunt blocate se adun cantiti mari de
6

suc pancreatic, iar inhibitorul tripsinei nu mai poate face fa. n acel moment enzimele
proteolitice sunt activate i n cteva ore pancreasul este auto-digerat se produce pancreatit
acut, adesea fatal. La un pH de 7 8 tripsina devine activ. n intestin tripsina este activat de
enterokinaz, o protein secretat de mucoasa duodenului. Tripsinogenul, forma inactiv, devine
tripsin, forma activ, prin pierderea a 6 aminoacizi din structur moleculei sale.
Tripsina are codul (EC 3.4.21.4) . Subclasa 3.4 inglobeaza enzimele care actioneza asupra
legaturilor peptidice si care poarta denumirea generic de peptid-hidrolaze.
Nomenclatura si clasificarea acestor enzime este dificil de stabilit deoarece in estenta ele
catalizeaza acelasi tip de reactie. De mentionat faptul ca denumirile acceptate in present difera de
cele recomandate in 1964 de comisia de Enzimologie avand la baza criterii diferite. Sub-subclasa
3.4.21 reuneste proteinazele care prezinta in centrul catalitic activ un rest de serina si/sau
histidina.

Cap 2. METODE DE DETERMINARE A


TRIPSINEI
Tripsina catalizeaza hidroliza legaturilor peptidice din proteina partial hidrolizate, spre
deosebire de pepsina care realizeaza primul atac asupra proteinelor alimentare in cursul
procesului de digestie. Proteinele vor fi atacate de tripsina numai dupa o denaturare prealabila cu
uree sau prin tratament termic. Produsii reactiei enzimatice catalizate de tripsina sunt:
polipeptide, oligopeptide si aminoacizi. Aceasta enzima catalizeaza hidroliza legaturilor
peptidice in care sunt implicate gruparile carboxil a restului lizil sau arginil. Amidele si esterii
acestor aminoacizi sunt de asemenea hidrolizati, reactivitatea crescand in ordinea:
- peptide < amide < esteri
Activitatea tripsinei poate fi detectata pe substrate sintetice ca: benzoil-L-argininamida, hipurilL-argininamida, benzoil/hipuril-lizinamida, esterul etilic al benzoil argininei.
Tripsina are un pH optim 7,5 in mediul ei de reactie trebuie sa existe CaCl2 pentru a
preveni formarea unor proteine inerte catalitic cand zimogenul este transformat in enzima activa.
Aceasta endopeptidaza se formeaza dintr-un precursor inactiv ( masa moleculara a
tripsinogenului din pancreasul bovin 24433), in celulele exocrine ale pancreasului si este
secretat in lumenul intestinului. Proenzima este transformata in enzima activa sub actiunea
enterokinazei si autocatalitic. pH optim al procesului de activare este cuprins intre pH 7si 9 in
cazul tripsinogenului bovin. In timpul procesului de activare (care consta din scindarea unei
hexapeptide din structura tripsinogenului) este formata si o proteina inerta care la
ultracentrifugare sedimenteaza mai lent decat tripsina-considerata a fi un polimer al enzimei
monomere. Formarea proteinei inerte catalitic este inhibata de ionii de Ca+ care previn
agregarea molecule de tripsina. Tripsina nu poate fi detectata in ser datorita prezentei
inhibitorilor naturali ai acestei enzime.

2.1 Dozarea activitatii tripsinei utilizand ca substrat hemoglobina denaturata


2.1.1 Principiul metodei

Hemoglobina denaturata chimic cu o solutie alcalina de uree. Tripsina hidrolizeaza


compusii din hemoglobina denaturata formand compusi de reactie , solubili in acid tricloracetic
al caror continut de tirozina si triptofan poate fi determinat cu reactivul Folin Ciocalteu la pH
11 sau spectrofotometric la 280 nm.

Biochimie practica-Editia a doua reviziuta si completa- Lector dr. Dana Iordachescu ,


Prof. dr. doc. st. I.F Dumitru , Universitatea din Bucuresti, Bucuresti 1988
1

2.1.2 Reactivi si solutii


1. Solutia substrat. Se dizolva 2 g hemoglobina, 36 g uree si 8 ml NaOH in 80 ml apa
distilata. Dupa 60 de minute de stationare la temperatura camerei ( pentru
desavarsirea procesului de denaturare a hemoglobinei) se adauga 10 ml solutie de
acid boric 1M (se dizolva 6.184 g acid boric, 0.292 g NaCl2 in100 ml apa distilata )
si 4.4 ml CaCl2 Solutie 5%. pH ul solutiei se ajusteaza la valoarea 7.5 cu HCl 1N
si se aduce la 100 ml.
2. Solutia NaOH 0.5N
3. Solutie acid tricloracetic 5%
4. Reactiv Folin Ciocalteu diluat
5. Solutie tripsina obtinuta prin dizolvarea a 50 mg in 100 ml HCl 0.01N sau EPT
obtinut din pancreas bovin, raportat de extractie 1/30 (M/V)
2.1.3 Mod de lucru
Amestecul de reactie consta din:
-

1 ml solutie substrat 1;
0.2 ml solutie tripsina 5 .

Se incubeaza 10 min la 35.5 C. Reactia enzimatica este stopata cu 2 ml solutie acid


tricloracetic 3. Probele se filtreaza dupa care se realizeaza reactia de colorare: 1 ml filtrat, 2 ml
solutie NaOH 0.5 N; 0.6 ml reactiv Folin Ciocalteu diluat de 3 ori. Dupa 10 min se determina
densitatea optica la 660 nm fata de apa distilata. Pentru fiecare proba se prepara un maror in care
acidul tricloacetic este adaugat in mediu inaintea solutiei de enzima.
2.1.4 Calculul rezultatelor
Se realizeaza o curba etalon. Valorile densitatilor optice determinate pentru probe si martori
sunt transformate in nmoli tirozina cu ajutorul acestei curbe etalon. Activitatea enzimatica se
calculeaza dupa formula :
(nmoli proba- nmoli martor ) / 10 * 5 * (1/3.2) fiind exprimata in nmoli tirozina eliberati / 1
ml enzima / min / 35.5 C.
Dupa Anson, o unitate de tripsina este definita ca acea cantitate de enzima care, in conditii
standard hidrolizeaza hemoglobina cu o viteza initiala incat cantitatea produsilor de hidroliza
formati intr-un minut are aceeasi densitate optica ca un nmol de tirozina.

Biochimie practica-Editia a doua reviziuta si completa- Lector dr. Dana Iordachescu ,


Prof. dr. doc. st. I.F Dumitru , Universitatea din Bucuresti, Bucuresti 1988
2

2.2 Dozarea activitii enzimatice a tripsinei prin metoda Gross-Michaelis

2.2.1 Principiul metodei:


Cazeina (substrat proteic) este hidrolizat pn la aminoacizi, sub influena tripsinei, la
temperatur de 37C. Cazeina nehidrolizat va cpta un aspect tulbure, prin adugare de soluie
alcool - acid.

2.2.2 Reactivi si solutii


1. soluie NaCl 9
2. produs biologic: suc pancreatic
3. soluie de cazein 1
4. soluie alcool - acid (acid acetic glacial i alcool)
5. soluie tampon

2.2.3 Mod de lucru


n 10 eprubete se fac diluii crescnde din lichidul de cercetat (suc pancreatic). Se
procedeaz astfel: n prima eprubet se pun 2 cm3 de suc pancreatic, n celelalte cte 1 cm3 de
soluie de NaCl 9. Din prima eprubet se ia 1 cm3 i se trece n eprubeta a 2-a, se amestec, se
ia 1 cm3 , care se pune n eprubeta a 3-a i aa mai departe. Astfel, se obin diluii de suc
pancreatic, n raport de: 1/1; 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64; 1/128; 1/256; 1/512. n fiecare
eprubet se adaug 2 cm3 de soluie de cazein 1 (cte 2 mg de cazein) i cte 1 cm3 de
soluie tampon (pH = 7,8 - 8). Eprubetele se in o or la 37C, pentru a crea enzimei condiii
optime de lucru. Dup ce se scot eprubetele de la termostat, se adaug n fiecare cte 2-3 picturi
de alcool - acid. Se urmrete aspectul coninutului eprubetelor, ncepnd de la prima eprubet.
Se noteaz ultima eprubet, al crei coninut rmne nc limpede (n care cantitatea de tripsin a
fost suficient pentru a hidroliza toat cazeina din eprubet, respectiv cele 2 mg de cazein).

3 UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE DIN CRAIOVA FIZIOLOGIA


APARATULUI DIGESTIV LUCRRI PRACTICE EDITAT DE COLECTIVUL DISCIPLINEI
SUB REDACIA PROF.UNIV.DR. MARIA IANCU 2009

10

2.2.3 Calculul rezultatelor

Rezultatul se exprim n uniti triptice. Unitatea triptic este cantitatea de enzim capabil
s hidrolizeze 1 mg de cazein, ntr-o or, la 37 oC. Exemplu: n eprubeta nr. 4, cantitatea iniial
de 1 cm3 suc pancreatic sau duodenal, a fost diluat la 1/8, hidroliznd 2 mg de cazein. Tripsina
coninut ntr-un cm3 de suc pancreatic nediluat va fi 8 x 2 = 16 uniti triptice.

4 UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE DIN CRAIOVA FIZIOLOGIA


APARATULUI DIGESTIV LUCRRI PRACTICE EDITAT DE COLECTIVUL DISCIPLINEI
SUB REDACIA PROF.UNIV.DR. MARIA IANCU 2009

11

Cap 3. IMPORTANTA SI APLICATIILE


TRIPSINEI
Cauzele carenei de enzime digestive sau ale activitatii sczute a acestora pot fi urmtoarele:
cantitatea redus de suc gastric, stresul, afeciuni gastrice, afeciuni ale pancreasului sau ale
colecistului, alimentaie necorespunztoare, vrsta naintat etc.
Cteva semne ale carenei enzimatice sunt: balonarea, senzaia de piatra n stomac,
scaun unsuros, scaun plutitor, senzaia de plin dup doar cteva nghiituri etc.
Efectele carenei pot fi urmtoarele: glicemie scazut, afeciuni renale, infecii bacteriene
sau virale, gingivit, constipare, diaree, insomnie, artrit, afeciuni cardiovasculare, colesterol
mrit, alergii, depresii, oboseal cronic, balonare, astm, bronit etc.
Nu este de ajuns o alimentaie corect pentru a preveni aceste efecte.
Enzimele digestive se folosesc ca terapie de substitutie pentru a realiza digestia
proteinelor (pepsina, chimotripsina, tripsina, carboxipeptidaza), glucidelor (amilaza) si
lipidelor (lipaza).
Enzimele folosite ca antiinflamatoare si cicatrizante. Sunt diferite endopeptidaze si
enzime ce actioneaza asupra proteoglicanilor care degradeaza tesuturile alterate de la suprafata
unor leziuni facilitand penetrarea medicamentelor, vindecarea ranilor, reducerea edemelor (se
asociaza in medicatia dermatologica, ORL, oftalmica: tripsina, chimotripsina, papaina, lizozim.
Exista medicamente care contin un ansamblu de enzime, cum ar fi: pancreatina, tripsina,
chimotripsina, amilaza, lipaza, dar si enzime care de obicei se gasesc in fructe, dar au actiuni
similare cu unele enzime din organism (papaina, bromelina). In general, aceste enzime sunt inalt
specializate, fiecare enzima punand in miscare o anumita reactie. Ele asigura buna desfasurare a
proceselor metabolice si sprijina sistemul imun in ofensiva contra agentilor patogeni. Fiziologia
enzimelor (descrierea singulara a enzimelor folosite in compozitia anumitor medicamente)
Tripsina este disponibil n cantiti mari n pancresul i pot fi purificate cu destul
uurin. Prin urmare, a fost utilizat pe scar larg n diferite procese biotehnologice.
Tripsina poate fi folosita pentru a descompune cazeina din lapte. Dac se adaug tripsina
la o soluie de lapte praf, ruperea cazeinei va face ca laptele s devin translucid.
Este de asemene folosita pentru a mbunti prelucrabilitatea aluatului ,n extracia de
condimente i arome din proteine vegetale sau animale i la fabricarea sosurilor, pentru a
controla formarea aromei n brnzeturi i produse lactate,pentru a mbunti textura produselor
din pete , n producia de alimente hipoalergenice.

12

CONCLUZII
Enzimele sunt catalizatori biochimici, specifici vietii, care asigura desfasurarea
proceselor metabolice (catabolism si anabolism). Sunt solubile, macromoleculare, de natura
organica, termolabile, produse de organismul viu, iar activitatea lor specifica fata de o anumita
substanta sau un anumit tip de substante sau substrat, si sunt dependente de anumite conditii de
mediu: pH, temperatura, prezenta unor activatori etc. Enzimele pot fi activatoare sau inhibitoare
pentru un anumit proces metabolic, dupa cum pot fi si degradatoare ale unor substante
(enzime amilolitice, glicolitice, proteolitice etc.), fie in mediul extracelular (exoenzime) cum
sunt cele utilizate in industria fermentativa (pepsina, tripsina etc.).
Tripsina: este secretata de catre pancreas ca proenzima inactiva (tripsinogen), este
activata in lumenul intestinal sub actiunea enterokinazei (o enzima secretata de mucoasa
duodenala). Tripsina activeaza chimotripsina enzima care, de asemenea, se secreta sub forma
inactiva (chimotripsinogen).
Tripsina si chimotripsina actioneaza asupra proteinelor neatacate de pepsina gastrica si
asupra produsilor de scindare ai pepsinei pe care ii degradeaza pana la stadiul de pepetide (di-tritetra-peptide) .
Este , asadar , o enzima cu numeroase implicatii biotehnologice , aplicatiile ei fiind in
mai multe domenii(alimentara, farmaceutica, medicala).

Bibliografie:
13

Introducere in enzimologie I.F. Dumitru , Dana Iordachescu, Editura


Medicala, Bucuresti 1981
Biochimie vegetala Conf. dr. Gheorghe Cimpeanu ,Prof. dr. Gabriel Neamtu,
Sef lucrari dr. Carmen Socaciu, Editura Didactica si Pedagogica Bucuresti
UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE DIN CRAIOVA
FIZIOLOGIA APARATULUI DIGESTIV LUCRRI PRACTICE EDITAT DE
COLECTIVUL DISCIPLINEI SUB REDACIA PROF.UNIV.DR. MARIA
IANCU 2009
Biochimie practica-Editia a doua reviziuta si completa- Lector dr. Dana
Iordachescu , Prof. dr. doc. st. I.F Dumitru , Universitatea din Bucuresti,
Bucuresti 1988
Enzimologie Generala, D.C. Cojocaru , Elena Ciornea, Sabina-Ioana Cojocaru,
Zenovia Olteanu, Lacramioara Oprica , Editura Tehnopres, Iasi 2007
http://www.scritub.com/biologie/ENZIME21326.php
http://cesamancam.ro/enzime-digestive.html
http://biology.kenyon.edu/BMB/Chime2/2002/Trypsin/FRAMES/
http://www.worthington-biochem.com/try/
https://books.google.ro/books?
hl=ro&lr=&id=GDd2zYuLpRwC&oi=fnd&pg=PP1&dq=trypsin+enzymatic+ac
tivity+METHOD&ots=z2TElwy3kl&sig=dm41fYRlJ3eftWwWU8sanibHN_I&
redir_esc=y#v=onepage&q=trypsin%20enzymatic%20activity
%20METHOD&f=false
http://www.medtorrents.com/blog/enzimele_fara_ele_nu_decurge_nimic_in_org
anismul_uman/2013-10-14-47
https://www.revistagalenus.ro/revista-e-galenus-2007/310.html
https://en.wikipedia.org/wiki/Trypsin

14