TOXICIDAD EN VEGETALES: PROBLEMTICA Y ANLISIS

Casabuono, A. C. y Pomilio, A. B.*

* PROPLAME-CONICET, Departamento de Qumica Orgnica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos
Aires - 3 Piso, Pabelln II, Ciudad Universitaria, CP 1428 - Buenos Aires, Tel/Fax 54 11 4814 3952, e-mail:
proplame@quimor.qo.fcen.uba.ar.

RESUMEN
Dado que en nuestro pas el ganado se alimenta principalmente de pasturas
naturales, muchas de las cuales le son nocivas, resulta importante una revisin y
actualizacin de la informacin existente sobre estas intoxicaciones.
Uno de los proyectos de investigacin del PROPLAME encara el estudio de
especies vegetales txicas en forma integral, comprendiendo la identificacin del
material vegetal, seguimientos toxicolgicos y el estudio estructural de los
metabolitos secundarios.
La metodologa de trabajo comienza con la identificacin de la especie por
botnicos especialistas y contina con la extraccin con solventes de distinta
polaridad. Mediante el uso de diversos mtodos separativos, principalmente
tcnicas cromatogrficas, se aislan los metabolitos presentes. La caracterizacin e
identificacin de los principios activos se realiza por mtodos electroforticos y por
espectroscopia UV, IR, RMN y CGL-EM entre otros.
El seguimiento de toxicidad se efecta inyectando i.p. en ratones y luego se
analizan histopatolgicamente los rganos afectados por las fracciones y/o
sustancias activas.
As, se estudiaron en nuestro laboratorio especies pertenecientes a distintos
gneros e incluso a distintas familias (Compositae, Solanaceae, Gramineae). Si
bien en algunas especies las estructuras de los principios activos estaban
correlacionados con la quimiotaxonoma de la familia en otras, como Poa huec y
Festuca argentina, ambas pertenecientes a la familia Gramineae, tribu Festuceae,
estara ms relacionada con metabolitos que se generaran como respuesta a
interacciones a nivel ecolgico, involucradas en las asociaciones planta-endofito y
animal-planta-endofito.
SUMMARY
In our country cattle grazing based on natural pastures leads sometimes to
loxicoses, which require an up-to-date and continuous revision.
One of the research projects of PROPLAME deals with the full study of toxic plants
of Argentina, including the botanical identification of the plant material, structure
elucidation of the secondary metabolites and toxicological assays. The
methodology begins with the identification of the botanical species by taxonomists,
followed by the extraction of the plant material with solvents of different polarity.

The constituents are isolated by the use of a variety of separative steps, especially
an array of chromatographic techniques.
The identification of the active compounds is performed by chemical and spectral
data, e.g. UV, FT-IR, 1H- and 13C-NMR, GC-MS, EI-MS, FAB-MS.
Toxicity and/or lethality of the chromatographic fractions and constituents are
monitored by ip administration to mice, animis are necropsied and the injured
organs are subjected to a histopathologic analysis.
A number of especies belonging to different genera of families such as
Compositae, Solanaceae, have been studied in our laboratory. Chemical structures
of the active compounds usually are well correlated with chemotaxonomical
viewpoints of the botanical family. However, in the case oPoa and Festuca
especies (family: Gramineae) the lethality could be explained as a response to
ecological interactions involved in plant-endophyte and animal-plant-endophyte
associations.
INTRODUCCIN
Dada la mortalidad observada en vacunos por ingestin de algunas pasturas
naturales, resulta importante estudiar aquellas especies botnicas que perjudican
en grado sumo a nuestra ganadera. Debe tenerse en cuenta que siendo nuestro
pas esencialmente agrcola-ganadero, y que la alimentacin del ganado se
efecta principalmente por pasturas naturales, se estiman anualmente numerosas
prdidas o bien intoxicaciones graves de los animales, por no conocer los
principios activos y por ende no contar con los antdotos adecuados.
Vale la pena destacar, que existe una marcada y constante demanda de
informacin en esta rea, especialmente por profesionales veterinarios que en la
prctica diaria se ven enfrentados a diagnsticos presuntivos de intoxicaciones,
que en la mayora de los casos no pueden aclarar. Las causas ms frecuentes son
el desconocimiento de las especies reconocidas como txicas, el hecho de
confundir especies botnicas y no poseer datos qumicos de sus componentes, as
como de sus principios activos y patogenia, y por ltimo la falta de actualizacin y
desarrollo de este tema en el pas.
En el marco de nuestro laboratorio dentro del PROPLAME (Programa de Plantas
Txicas y Medicinales, y Metabolismo de Sustancias Sintticas y Naturales) se
contina encarando entre otros proyectos de investigacin, el estudio de especies
vegetales txicas de nuestro pas, sobre las que no se conocan estudios qumicos
y toxiclogos sistemticos sobre la relacin toxicidad-identidad de la planta
involucrada. En general, las plantas txicas se registran a nivel agronmico y/o
botnico, y suele ocurrir que los lugareos las denominen con nombres vulgares
que generan confusin ya que pueden comprender a varias especies del mismo y
a veces distinto gnero. Por ello, en base a nuestra experiencia partimos de
material vegetal identificado por taxnomos especialistas y, mediante el uso de

tcnicas extractivas y cromatogrficas, realizamos el seguimiento toxicolgico de

fracciones y subfracciones en animales de experimentacin hasta caracterizar e
identificar el principio activo, por mtodos qumicos y aplicacin de tcnicas
espectroscpicas (1H- y 13C-RMN mono- y bidimensionales, UV, IR, espectrometra
de masa de impacto electrnico IE-EM y por bombardeo de tomos rpidos FABEM, etc.)
As, se han elucidado en este laboratorio los principios activos de especies
pertenecientes a distintos gneros provenientes de diferentes familias. En algunos
casos, la estructura qumica del compuesto letal result concordante con las
caractersticas quimiotaxonmicas del gnero o bien de la tribu. Sin embargo, en
la tribu Festuceae la relacin txico-metabolito secundario no sera tan directa,
sino que podra ser comprensible tan slo teniendo en cuenta aspectos ecolgicos
como las posibles interacciones animal superior-planta, planta-endofito, endofitotxico.
Breve descripcin de algunos de los gneros y especies previamente estudiados
en nuestro laboratorio (1):
WEDELIA (familia Compositae): Este gnero se caracteriz qumicamente por
poseer diterpenos tetracclicos.
Wedelia glauca (Ort.) Hoffmann ex Hicken, de nombre vulgar "sunchillo", "yuyo
sapo" "suncho", palabra quechua que significa arbusto de flores amarillas, es
autctona del centro y zonas irrigadas del noroeste de nuestro pas. Es una
especie invasora para la agricultura y resulta especialmente txica para bovinos
que la comen sin reparos.
Wedelia buphthalmiflora Lorentz, reclasificada como Zexmenia
buphthalmiflora (Lorentz) Ariza Espinar, crece frecuentemente en suelos rocosos
del centro de la Argentina y es considerada venenosa por algunos autores.
SENECIO (familia Compositae) es un gnero que posee alrededor de doscientas
cincuenta especies en Argentina (2). En un gran nmero de ellas se encontraron
alcaloides pirrolizidnicos y furanoeremofilanos. Los alcaloides pirrolizidnicos son
en general hepatotxicos y responsables de "seneciosis" que causan prdidas en
el ganado.
Senecio crassifloms (Poir.) D. C. "boleo" es una hierba perenne de 30-40 em de
altura que posee flores amarillas, endmica de las dunas del sur de Brasil,
Uruguay y noreste de Argentina. Senecio bonariensis H. et A. "margarita de
agua" es frecuente en zonas hmedas de Uruguay, noreste y centro de Argentina.
Senecio vira-vira Hieron, es comn en las regiones secas del centro de Argentina
(2).

DATURA L. (familia Solanaceae) es un gnero cosmopolita que ha sido usado

desde la antigedad con fines alucingenos (3). Varias especies, como D.
stramonium (en ingls: "jimson weed") son ingeridas voluntariamente por humanos
ya que contienen alcaloides del tropano y, a dosis intermedias, producen
alucinaciones, delirio y fiebre mientras que en dosis bajas se registran midriasis y
palpitaciones, y por sobredosis depresin, paro cardaco y respiratorio (4). Se
conocen especies ricas en alcaloides derivados de la escopolamina y otras,
como D. stramonium, en derivados de la hiosciamina. En nuestro pas se han
registrado pocos casos de intoxicacin del ganado por estas pasturas ya que
usualmente los animales no la ingieren por su sabor no agradable. En cambio, la
ingestin de sus semillas causa mortandad en chanchos y aves de corral por
encontrarse accidentalmente mezcladas con semillas comestibles como sorgo y
girasol.
Datura ferox L. o "chamico" es una hierba anual de 50 cm de altura y flores
blancas (5), adventicia en Amrica, y es la ms distribuida en el norte y centro de
Argentina (6).
NIEREMBERGIA (familia Solanaceae)
Nierembergia hippomanica Miers "chuscho" est ampliamente distribuida en
Argentina. En nuestro laboratorio se identificaron alcaloides del tropano (accin
parasimpatoltica) y fenetilaminas (accin simpatomimtica) (7), aunque ninguno
de estos compuestos result responsable de la toxicidad de esta especie en
vacas, ovejas, conejos y caballos.
FESTUCEAE (familia Gramineae; subfamilia Festucoideae) es una tribu que
presenta gneros como Festuca, Poa, Bromus y Lolium vulgarmente conocidos
como pastos. Varias gramneas patagnicas son designadas con el nombre de
"coirn"; los lugareos distinguen diversos coirones segn su aspecto y
propiedades, pero en realidad pertenecen a distintos gneros.
Aos atrs, se supona que los alcaloides presentes en varios miembros txicos
de esta tribu, tales como Festuca arundinacea Schreb. y Lolium perenne L.
estaban implicados en las enfermedades como "pie de festuca" y "tembleques" (en
ingls: "staggers") (8) producidas por estas pasturas. Sin embargo no se reprodujo
el sndrome al administrar perlolina o lolina y sus derivados en animales de
laboratorio. Posteriormente se identific el principio activo de L. perenne como el
indol isoprnico lolitrem B (9). Tambin se ha relacionado la toxicidad de estas
especies con la presencia de endofitos fngicos, aunque no estn presentes en
todos los casos (10).
El gnero Festuca comprende unas cien especies mesotrmicas distribuidas en
todo el mundo; muchas de las cuales son forrajeras. En la Argentina existen unas
veinticinco especies ubicadas en diversos sistemas montaosos, y slo han sido
sindicadas como txicas F. argentina, F. hieronymi y, tal vez, F. dissitiflora (11).

Poa huecu Par. "coirn blanco" es un pasto perenne txico que crece en la zona
patagnica occidental (11). Produce la enfermedad "huec" o "pataleta" que
muestra una forma crnica (12) con desrdenes nerviosos, y otra aguda que
comprende un primer perodo con temblores y contracciones musculares en cuello
y patas y pelo erizado y un segundo perodo con lesiones en la conjuntiva,
parlisis y posteriormente la muerte en ovejas, caballos y vacas. Se consideraba
que esta toxicosis era causada por la infeccin fngica presente en la planta, sin
embargo (13) reprodujeron experimental mente la enfermedad en ovejas usando
aparentemente material vegetal libre de endofito. Por primera vez en nuestro
laboratorio se logr reproducir la toxicosis en animales de laboratorio.
Festuca hieronymi Hackel "aive" es una planta perenne densamente cespitosa,
que habita en estepas graminosas, valles y faldas montaosas del noroeste
argentino, entre los mil quinientos y tres mil quinientos metros sobre el nivel del
mar (11).
A principios de siglo Rivas y Zanolli estudiaron una planta causante de la
"tembladera" y comprobaron que tendra una accin daina en equinos, ovinos,
bovinos y caprinos; segn Parodi podra tratarse de F. hieronymi (11). Adems
mencionaron la existencia de un hongo no identificado certeramente como as
tambin ejemplares que no provocaban toxicidad. Festuca argentina (Speg.)
Parodi, llamada vulgarmente "coirn", "c. negro", "c. grande", "c. falso", "c. del
huec", "c. duro" y "pampa grass". Esta especie haba sido descripta inicialmente
bajo el gnero Poa y luego fue transferida a Festuca. Es una planta perenne que
forma matas espesas de 0,50 m a un metro de altura (11); se encuentra en
estepas secas y en faldas de cerros en la zona preandina patagnica comprendida
entre Catan-Lil (Pcia. de Neuqun) y Lago Argentino (Pcia. de Santa Cruz);
reaparece formando la estepa graminosa que rodea al Golfo San Jorge, llegando
hasta Puerto Deseado (14).
Desde principios de siglo se describe una enfermedad del ganado bajo los
nombres de "pataleta", "chucho" "tembladera", "staggers", "loco" "huec" que
se produce por un coirn; es un desorden no infeccioso que afecta a caballos,
vacunos y ovinos. La enfermedad se caracteriza por un debilitamiento, sbitas
contracciones musculares, movimientos irregulares de la cabeza, rigidez de los
miembros y parlisis motoras transitorias, acompaados por espasmos bajo
excitacin. Existe tambin un desarreglo de la visin y conjuntivitis. Por los
sntomas y el rea geogrfica donde ocurra, se deduce que el coirn sera la F.
argentina.
OBJETIVOS
En este artculo se expondr la metodologa general utilizada en el PROPLAME
para estos estudios qumicos de toxicidad en las especies arriba mencionadas,
que abarca desde la identificacin del material vegetal, hasta la caracterizacin de
los principios activos. En particular, se ejemplificarn con mayor detalle las
tcnicas y procedimientos de seguimiento de toxicidad en Festuca argentina.

Se discutirn los resultados obtenidos en todas las especies nombradas, haciendo

nfasis en la problemtica de la tribu Festuceae, que involucrara aspectos de
Qumica Ecolgica (15) y relaciones fenticas entre F. argentina yF.
hieronymi (16).
MATERIALES Y MTODOS
En general, cuando se debieron subfraccionar los extractos de polaridad baja o
mediana (extracto de ter de petrleo, extracto metanlico) para aislar el principio
txico, se utilizaron principalmente tcnicas cromatogrficas que se describen a
continuacin:
a) Cromatografa en columna: Los rellenos utilizados fueron silicagel "H" (Merck),
sephadex LH-20 (Sigma), almina neutra (Woelm), resina de intercambio
Amberlite IRA-400 (forma HO) (Sigma). Las columnas de silicagel y las de almina
fueron eludas a mediana presin. Para las cromatografas rpidas en "columna
seca" se emplearon embudos con placa filtrante de vidrio sinterizado, haciendo
vaco al agregar el solvente.
Todos los solventes utilizados en las extracciones y en las cromatografas fueron
previamente purificados en nuestro laboratorio.
b) Cromatografa en capa delgada (CCD): Para las cromatografas analticas en
capa delgada se utilizaron placas preparadas de silicagel G (Merck) de 250 m de
espesor, cromatoplacas de silicagel -60 F254 (Merck), de fase reversa RP-18
(Merck), de almina F254 de 100 m de espesor y de celulosa F254 (Merck).
Tambin se usaron cromatoplacas de alta resolucin (en ingls: HPTLC) de
silicagel 60 F254.
Para las CCD preparativas, se prepar cada placa suspendiendo 30 g de silicagel
G en 60 ml de agua destilada y luego se extendi sobre una placa metlica (20 cm
x 20 cm). Se la dej reposar por 24 hs a temperatura ambiente y posteriormente
se la activ en estufa a 110-120C durante una hora.
Como revelador universal se emple una mezcla de cido sulfrico-cido actico
(1:1) o iodo. Tambin se revel con luz ultravioleta (UV) de longitud de onda de
254 nm. Como reveladores especficos se utilizaron: para alcaloides, el reactivo de
Dragendorff segn Thies, Reuther, modificacin de Vgujfalvi (17); para terpenos,
anisaldehdo 1 % en medio cido; para compuestos fenlicos, FeCl, al 2% en
etanol y, para compuestos esteroidales, el reactivo de Liebermann Burchard (18).
En todos los casos, luego de rociar la placa con el revelador correspondiente, se la
calent a 105-110C durante dos a cinco minutos.
c) Cromatografas gas-lquido (CGL): Se utiliz para el anlisis de fracciones
relativamente voltiles con columnas empacadas o capilares y deteccin de
ionizacin de llama (en ingls: FID) y nitrgeno como gas portador.

Para caracterizar compuestos presentes en trazas se efectuaron los CG-EM, es

decir CGL en columna empacada acoplados a espectrometra de masas o CGL
capilar-EM, en un cromatgrafo Hewlett Packard 5890A acoplado a un detector
selectivo de masas 5970B en un VG TRIO-2 VG Mass Lab respectivamente.
d) Cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR; en ingls: HPLC): En general
se us con fase estacionaria de fase reversa RP-18, tanto en columnas analticas
como semipreparativas y se llevaron a cabo en un equipo Waters 6000A o en un
equipo KONIK 500B con deteccin por espectrofotometra UV de longitud de onda
variable Waters 481.
En los casos en que se aisl el metabolito secundario, se identific por
combinacin de informacin tales como puntos de fusin, poderes rotatorios,
espectros de absorcin ultravioleta (UV), espectros de absorcin infrarroja (IR).
Los espectros de masas (EM) se realizaron por introduccin directa o luego de
COL, ionizando por impacto electrnico en general a 70 eV. Tambin se estudiaron
los espectros de resonancia magntica nuclear protnica ( 1H-RMN) y los de
carbono trece (13C-RMN) de alta resolucin a 200,1 MHz y 50,3 MHz
respectivamente, en un espectrmetro Bruker ACE-200.
Material vegetal: Todas las especies estudiadas fueron identificadas por botnicos
especialistas y en cada caso un ejemplar fue depositado en un herbario de
renombre internacional.
Por ejemplo, Festuca argentina (Speg.) Par. fue recolectada por el Ing. A. Soriano
en la Estacin Experimental del INTA de Ro Mayo, Chubut, e identificada en el
Instituto de Botnica Darwinion por la Dra. Elisa Nicora. Ejemplar de herbario N SI
28004 depositado en dicho Instituto.
Extraccin del material vegetal: La planta entera, o bien parte de la misma, fue
secada a 30C en estufa con circulacin de aire y molida posteriormente en un
molino Wiley modelo DE-5 (en los casos de presencia evidente de aceites
esenciales que resultaran de inters, el material fresco fue cortado y sometido a
un arrastre con vapor de agua).
El material molido fue extrado sucesivamente en Soxhlet con solventes de
polaridad creciente. El remanente vegetal de algunas especies se extrajo con
agua en batch y agitacin: posteriormente se filtr y centrifug y la solucin
sobrenadante fue liofilizada. Partiendo de planta entera de F. argentina se obtuvo
luego de extraer con ter de petrleo (fraccin 60-80 C), con metanol y
posteriormente con agua, un extracto de ter de petrleo (1,6 % del peso seco),
un extracto metanlico (6,7 % del peso seco) y un extracto acuoso (1,5 % del peso
del remanente vegetal seco).
Fraccionamiento del extracto metanlico: Se disolvi este extracto en solventes
adecuados, se agreg poliamida para columna previamente lavada sucesivamente
con cloruro de metileno, agua y metanol, y se evaporaron los solventes. La pastilla

resultante se someti a percolaciones sucesivas con cloruro de metileno, agua y

metanol; por evaporacin de los solventes se obtuvieron los percolados de cloruro
de metileno, acuoso y metanlico respectivamente.
Parte del extracto metanlico de F. argentina se trat con poliamida (masa extr:
masa poliamida, 2:3) y siguiendo el procedimiento descripto se obtuvieron los
percolado de cloruro de metileno (1,0 % relativo a planta seca), percolado acuoso
(2,8 % rel. a planta seca), y percolado metanlico (2,3 % rel. a planta seca).
Bsqueda y separacin de alcaloides: Ante la sospecha de presencia de
compuestos nitrogenados, en general se efectu una bsqueda sistemtica de
alcaloides sobre el extracto metanlico o alguno de sus percolados, para luego
ensayar toxicidad en ratones.
As ocurri en el caso del extracto metanlico de F. argentina pues present varias
manchas anaranjadas al revelar con el reactivo de Dragendorff (17) los
cromatogramas (CCD) de almina. Para proceder al aislamiento y fraccionamiento
a los mismos, se ensay la bsqueda analtica de las condiciones adecuadas de
pH para las extracciones. As, se disolvi un gramo del extracto metanlico seco
en cido sulfrico 1 N, filtrando el insoluble en ese medio.
Sobre esta solucin acuosa cida se realizaron extracciones con cloruro de
metileno, descartndose esta fase orgnica. A continuacin la fase acuosa acida
se extrajo con cloruro de metileno, llevndola previamente a distintos pH,
resultando convenientes pH= 8 y 11. con NH4OH y luego con Na2CO, slido.
Ensayos toxicolgicos
Preparacin de las muestras: Se prepararon suspensiones acuosas de los
respectivos extractos y/o fracciones. En los casos de muy difcil dispersin se
agregaron algunas gotas de Tween 80; o bien las muestras fueron colocadas en
un bao ultrasnico durante unos minutos para lograr suspensiones estables
hasta una concentracin mxima de 100 mg/ml. de agua, adecuada segn la
naturaleza del extracto y/o fraccin.
As, se ensayaron los extractos de ter de petrleo, metanlico y acuoso, as
como los percolados de cloruro de metileno, acuoso y metanlico y las fracciones
provenientes de la marcha de alcaloides de F. argentina.
Animales de experimentacin: Se inyectaron intraperitonealmente (i.p.) cepas
puras de ratones de ambos sexos. Se trabaj con lotes de ratones, utilizando
adems en cada caso animales control y blancos.
Histopatlogos especialistas realizaron las necropsias de los ratones inyectados, y
el examen histopatolgico de los rganos afectados.

En una etapa avanzada del aislamiento del principio activo, en algunos casos se
inyectaron animales superiores.
Fraccionamiento del extracto acuoso de Festuca argentina: La suspensin acuosa
proveniente de la extraccin del marco vegetal con agua (batch, agitacin,
temperatura ambiente) se centrifug a 2000 rpm hasta obtener una solucin
lmpida. Se trabaj sobre este sobrenadante, luego de liofilizarlo, buscando los
mtodos de fraccionamiento de este extracto polar que fuesen adecuados desde
el punto de vista toxiclogico.
Resultaron tiles las precipitaciones del extracto acuoso con solventes orgnicos.
Se efectuaron ensayos toxicolgicos en. ratones inoculando suspensiones de los
precipitados obtenidos a distintas concentraciones y de la solucin remanente,
logrando localizar la fraccin activa.
Dado lo til que result este mtodo separativo, por ser reproducible y permitir
trabajar con grandes cantidades, se repiti el procedimiento para el
subfraccionamiento con control toxiclogico. Tcnicas de liofilizacin, dilisis con
membranas de diversos cortes y tcnicas electroforticas nativas y bajo
condiciones desnaturalizantes fueron utilizadas satisfactoriamente. De esta
manera se determin la naturaleza qumica de los componentes de la fraccin letal
de Festuca argentina, evidenciando su naturaleza glicoproteica por el mtodo de
Folin-Lowry, tincin con azul brillante de Coomassie y reactivo de cido peridicoSchiff (PAS).
RESULTADOS Y DISCUSIN
Utilizando esencialmente la metodologa descripta, en nuestro laboratorio (1) se
obtuvieron previamente los siguientes resultados:
En Wedelia glauca result letal la fraccin ms polar del extracto metanlico,
siendo el compuesto responsable un diterpeno tetracclico monoglicosidado,
acilado y sulfatado, causante de paro respiratorio en ratones. Para elucidar su
estructura fue necesario realizar reacciones de degradacin e hidrlisis en medio
cido y bsico, as como un anlisis espectroscpico exhaustivo del compuesto y
de sus productos de degradacin (19).
En contraste, de W. buphthalmiflora reclasificada como Zexmenia buphthalmiflora,
se identificaron saponinas triterpnicas (20), y diterpenos relacionados con los de
W. glauca, pero sin presentar toxicidad en los ensayos en animales de laboratorio.
En Senecio bonariensis y S. vira-vira el extracto de ter de petrleo produjo
mortandad animal debido a derivados de furanoeremofilanos. Adems, en estas
dos especies y en S. crassiflorus result letal el extracto metanlico
identificndose alcaloides pirrolizidnicos como la senecionina, anacrotina (21) y
los correspondientes derivados N-oxidados en el extracto metanlico de S.
crassiflorus as como sesquiterpenos (22). La hepatotoxicidad provendra de

metabolitos generales de naturaleza pirrlica con centros electroflicos reactivos

(23).
El nico estudio previo de Datura ferox de nuestro pas lo realizaron Coussio y
colaboradores (24) con el objetivo de efectuar en esta especie la determinacin
cuantitativa por COL de alcaloides totales, y en particular, escopolamina, teniendo
en cuenta factores de distribucin geogrfica, localizacin en las distintas partes
de la planta, etc. Sin embargo, los otros alcaloides de semillas no fueron
estudiados qumicamente.
Debido a intoxicaciones de origen incierto registradas en animales de corral en la
provincia de Buenos Aires, al analizar este problema encontramos que se deba a
la ingestin de semillas de "chamico" (Datura ferox) mezcladas con las semillas
utilizadas como alimento usual de estos animales. Por esa razn, se estudi en
nuestro laboratorio la fraccin letal que result estar constituida por alcaloides que
fueron analizadas estructuralmente en detalle. Adems de la escopolamina
mayoritaria que ya se haba descripto, se estudiaron por primera vez los restantes
alcaloides presentes en las semillas de esta especie que crece en la Argentina,
siendo identificados alcaloides del tropano como 30C-tigloiloxipropano
(tigloiltropena), apoescopolamina (apohioscina), los nuevos compuestos 7|3hidroxi-6p-propeniloxi-30C-tropoiloxytropano y 3-fenilacetoxi-6|3,7|3-epoxitropano
(3-fenilacetoxiescopina), trazas de 7p-hidroxi-6p-isovaleroiloxi-30Ctigloiloxitropano y el alcaloide pirrolidnico higrina, no se detectaron hiosciamina,
nicotina ni N-xidos del tropano en las muestras estudiadas (25).
Aunque la escopolamina y otras drogas relacionadas son importantes anestsicos
y antiespasmdicos se han revisto sus propiedades al ser dada en forma
transdermal, su toxicidad sobre el sistema nervioso central y su accin alergenica.
El principio letal de Nierembergia hippomanica se aisl en nuestro laboratorio del
percolado acuoso del extracto metanlico, identificndose por IR, 1H y 13C-RMN,
EM e hidrlisis bsica como la pirrol-3-carbamidina (26). La hiperexcitabilidad y las
convulsiones generadas al inocular ese compuesto en ratones sugerira una
accin sobre el sistema nervioso central.
Las tres especies estudiadas pertenecientes a la tribu Festuceae resultaron
txicas en ratones y produjeron un cuadro clnico patolgico similar, aunque
qumicamente presentaron algunas diferencias. As, en Festuca
hieronymiresultaron activos los percolados de cloruro de metileno y acuoso y el
extracto acuoso. Por otro lado, en Poa huecu result letal en ratones slo el
extracto acuoso, del cual se identific una glicoprotena letal rica en glucosa y
manosa, y en aminocidos como prolina, cido glutmico y cido asprtico (27).
Adems, esta glicoprotena reprodujo la sintomatologa de ovejas y vacas en
ratones (27).

Mientras que en Poa huecu no se detectaron compuestos nitrogenados

alcaloidales, excepto colina y acetilcolina, en Festuca argentina se caracterizaron
en nuestro laboratorio alcaloides de la familia de la lolina en baja proporcin.
Luego de una separacin sistemtica de alcaloides a distintos pHs realizada sobre
el extracto metanlico de Festuca argentina y posterior purificacin por
cromatografa en columna, se elucidaron las estructuras de lolina, N-metillolina,
lolinina (N-acetillolina), N-formillolina y el nuevo compuesto A5-N-acetillolina.
Adems, se identific el acetato de colina, previa precipitacin como la
correspondiente sal de Reinecke (28).
Durante muchos aos hubo controversias sobre si los alcaloides de la lolina
podan ser la causa de la toxicidad que presentaban algunas pasturas. Sin
embargo cuando inoculamos en ratones las fracciones alcaloidales de Festuca
argentina conteniendo los derivados de lolina, no reprodujeron la sintomatologa, y
slo resultaron letales al ser inyectados en altas concentraciones en animales de
experimentacin pero no al administrarlo por va oral (29,30), en forma anloga a
lo observado en Festuca arundinacea (31).
Por otro lado, se realizaron estudios sobre pasturas teniendo en cuenta no slo la
identificacin del material vegetal sino tambin detectando la presencia o no de
endofitos y su naturaleza (32). De esta manera se comenzaron a hacer
estadsticas y estudios teniendo presente el tro planta-endofito-toxicidad, lo que
mejor la calidad de las conclusiones. Por ejemplo se observ que aparentemente
se correlacionara la concentracin de estos alcaloides en la planta (CDL:
Concentracin de Derivados de Lolina) con el grado de infestacin (% endofito) en
la planta txica durante una estacin determinada (33,34), pero no se pudo
establecer una simple relacin entre la CDL y la FIE (frecuencia infeccin
endoftica) en condiciones de pastoreo a largo plazo ya que podran estar
involucrados factores asociados con la influencia del animal en pastoreo sobre la
respuesta de la planta, crecimiento del endofito, y metabolismo, as como factores
ambientales.
Ahondando en las funciones que podran tener estos alcaloides norpirrolizidnicos
con puente etreo y teniendo en cuenta los conceptos de qumica ecolgica como
ser las posibles interacciones del vegetal con otros sistemas y su forma de
expresin en cuanto a metabolitos secundarios de la misma, se puso en evidencia
que estos alcaloides de la lolina tendran funciones ms relacionadas con
propiedades de defensa y resistencia a insectos de laFestuca infectada que con la
toxicosis en s (35).
El estudio toxicolgico que realizramos en Festuca argentina condujo a los
percolados y extracto activo, observndose parlisis generalizada al inyectar dosis
letales en ratones, as como midriasis y ataxia del tren posterior. Luego se realiz
el fraccionamiento de estos extractos eligiendo en forma emprica los mtodos
separativos ms adecuados para los fines toxicolgicos, analizando la actividad de
cada subfraccin en ratones. De esta manera y con permanente seguimiento de la
accin letal, necropsia de los animales y estudios histopatolgicos se obtuvieron

los compuestos responsables de la parlisis e incordinacin motora.

Precipitaciones con solventes, dilisis con membranas de diversos cortes,
permeaciones en geles y liofilizaciones fueron usadas como etapas claves en la
purificacin. Resultados anlogos fueron obtenidos con Festucas genticamente
relacionadas.
CONCLUSIONES
En algunas especies estudiadas en nuestro laboratorio como Wedelia
glauca, Senecio bonariensis, Senecio vira-vira y Senecio crassiflorus y Datura
ferox, las sustancias que resultaron ser los principios txicos correspondan a
metabolitos secundarios con estructuras qumicas, si bien nuevas en varios casos,
esperables desde el punto de vista quimiotaxonmico a nivel de tribu y/o gnero.
En cambio, el anlisis de las especies pertenecientes a los
gneros Festuca y Poa de la tribu Festuceae, los resultados que obtuviramos se
interpretan mejor en base a los conceptos introducidos por la Qumica Ecolgica.
Actualmente podramos plantear el anlisis de la toxicidad de esta tribu como un
proceso complejo ya que no involucrara simplemente una interaccin de tipo
planta-animal. La presenciado endofitos en las festucas sudamericanas
reconocidas como txicas y su ausencia en las especies reconocidas como
forrajeras (32), apoyara en parte la hiptesis de que los endofitos fngicos
estaran relacionados de alguna manera con la toxicidad de estas plantas. Dado
que el material vegetal empleado tena endofitos, se generan varias interacciones
y respuestas posibles a las mismas, como las referidas a si el endofito es el
causante inmediato de la toxicidad, es decir, si ste generara metabolitos letales
para el ganado (micotoxinas), o si los mismos provendran de la simbiosis
mutualista.
Asimismo, otra posibilidad sera qe, a travs de la asociacin plantamicroorganismo (gramnea-endofito) (36) se generara una respuesta de la planta
de tipo fitoalexina que resultara txica al ganado, como por ejemplo el glicopptido
identificado en Poa huecu (27). Incluso se ha purificado del tejido de hojas de Poa
ampla Merr. infectadas por endofito, una proteinasa de Acremonium typhinum que
se expresa abundantemente en el pasto husped infectado. Dado que esta
proteinasa posee una expresin regulada en cultivo del hongo mientras que es
abundante en tejido de planta infectada, se sugiere que su expresin podra estar
involucrada con la interaccin simbitica planta-hongo (37).
Es por ello que ha resultado importante encarar las investigaciones en la tribu
Festuceae y en general en gramneas, hacia las interacciones planta-endofitoanimal superior y los metabolitos relacionados desde un aspecto multidisciplinario
bioqumico-micolgico-biolgico y qumico para poder as clarificar las toxicosis
provocadas por varias especies de esta familia.
AGRADECIMIENTOS

Se agradece al Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas

(CONICET) y a la Universidad de Buenos Aires (UBA) por el apoyo financiero,
como as tambin al Ing. A. Soriano, a la Dra E. Nicora y al Dr E. Zallochi por la
recoleccin e identificacin de parte del material vegetal.
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