Rvcta V5-N1

RVCTA
Revista Venezolana de Ciencia y Tecnologa de Alimentos. 5 (1): 001-017. Enero-Junio, 2014

http://www.rvcta.org
ISSN: 2218-4384 (versin en lnea)
Asociacin RVCTA, 2014. RIF: J-29910863-4. Depsito Legal: ppi201002CA3536.
Artculo
Cuantificacin de plaguicidas residuales en granos de maz

(Zea mays L.) aplicando tcnicas de evaluacin residual
Determination of residual pesticides in corn (Zea mays L.) kernels using residual
evaluation techniques
Dante Rojas1 *, Valeria Messina2,3, Ana Mara Sancho1, Natalia Pesquera1, Diego Cristos1,
Mariana Galicio4, Alejandra Ricca1
Instituto de Tecnologa de Alimentos, Centro de Investigacin de Agroindustria, Instituto Nacional de

Tecnologa Agropecuaria (INTA). B1708WAB, Morn, Buenos Aires, Argentina.
2
Centro de Investigaciones en Slidos (CINSO), Instituto de Investigaciones Cientficas y Tcnicas

para la Defensa (CITEDEF) / Unidad de Investigacin y Desarrollo Estratgicos para la Defensa
(UNIDEF), Ministerio de Defensa (MINDEF) - Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y

Tcnicas (CONICET). Juan Bautista de la Salle 4970 (B1603ALO), Buenos Aires, Argentina.
3
Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET). Avenida Rivadavia 1917

(C1033AAJ), Buenos Aires, Argentina.
4
Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires (UBA). Avenida Chorroarn 280
(C1427CWO), Buenos Aires, Argentina.
*Autor para correspondencia: drojas@cnia.inta.gov.ar
Aceptado 18-Abril-2014
Resumen
El empleo de plaguicidas en la produccin agrcola ha tomado marcada importancia para

muchos sectores de la sociedad. Los productores agropecuarios necesitan realizar un tratamiento
fitoterapetico efectivo y la utilizacin de estos agroqumicos es una alternativa rentable. Sin embargo,
la toxicidad de estas sustancias presenta un riesgo para la salud humana durante su fabricacin y
002
Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(1):001-017.
empleo. El objetivo del presente trabajo fue obtener informacin de los niveles y frecuencia de los
principales residuos de pesticidas presentes en granos de maz aplicando tcnicas de evaluacin
multiresidual. El muestreo (basado en la Norma ISO 950:1979) fue realizado en cintas de embarque y
terminales portuarias del Ro Paran y del sur de la Provincia de Buenos Aires (Argentina), dado que
manejan ms del 80 % de las exportaciones del pas (Ingeniero White, Rosario/General San Martn/San
Lorenzo, Villa Constitucin y Quequn). Sobre un total de 192 muestras, 94 presentaron residuos de
plaguicidas, siendo el orden de frecuencia de aparicin de los mismos: fenitrotin (n = 40) >
cipermetrina (n = 31) > pirimifs metil (n = 27) > deltametrina (n = 24) > clorpirifs metil (n = 23) >
diclorvs (n = 18) > permetrina (n = 15) > clorpirifs etil (n = 12) > fenvalerato (n = 3) > malatin (n =
2) > endosulfn (n = 0; suma de alfa endosulfn, beta endosulfn y endosulfn sulfato). No se hallaron
organoclorados. Considerando la legislacin Argentina, solo 4 muestras presentaron niveles superiores
a los Lmites Mximos de Residuos (LMR), siendo cipermetrina el plaguicida involucrado. Sin
embargo, segn los LMR del Codex Alimentarius, todas las muestras presentaron niveles permitidos.
Palabras claves: granos de maz, evaluacin multiresidual, lmites residuales, plaguicidas, tcnicas
residuales.
Abstract
The use of pesticides in agricultural production, has taken strong importance to many sectors of
society. Agricultural producers need to make effective phytotherapeutic treatment and the use of these
agrochemicals is an economical alternative. However, the toxicity of these substances presents a risk to
human health during manufacture and use. The aim of this study was to obtain information on the level
and frequency of major pesticide residues present in Argentina in corn kernels applying multiresidual
evaluation techniques. Sampling (based on ISO 950:1979 standard) was performed on tape loading and
port terminals of the Parana river and south of the Province of Buenos Aires, due that these locations
manage over 80 % of the countrys exports (Ingeniero White, Rosario/General San Martn/San
Lorenzo, Villa Constitucin and Quequn). Of a total of 192 samples, 94 samples contained at least one
pesticide residue. The frequency of appearance of pesticide were: fenitrothion (n = 40) > cypermethrin
(n = 31) > pirimiphos methyl (n = 27) > deltamethrin (n = 24) > chlorpyrifos methyl (n = 23) >
dichlorvos (n = 18) > permethrin (n = 15) > chlorpyrifos ethyl (n = 12) > fenvalerate (n = 3) >
malathion (n = 2) > endosulfan (n = 0; sum of alpha endosulfan, beta endosulfan and endosulfan
sulphate). Organochlorines were not detected. According to Argentine legislation, only 4 samples had
levels above Maximum Residue Levels (MRLs). Cypermethrin presented levels above MRL. Besides,
according to Codex Alimentarius, all samples were below the levels allowed.
Keywords: corn kernels, multiresidual evaluation, pesticides, residual limits, residual techniques.
INTRODUCCIN
La produccin Argentina de maz (Zea
mays L.) mostr una tendencia al crecimiento
desde las primeras campaas de la dcada del
90. La produccin anual de maz fue alrededor

de 20 millones de toneladas para el 2005 (Fig.
1), para consumo interno solo se destinaron 5
millones de toneladas, el resto fue el saldo
exportable (Pouiller, 2005; Ricca, 2006;
Rojas, Dante et al.
003
Figura 1.- Produccin de maz en Argentina. Perodo 1990-2012.

FAOSTAT, 2013). La produccin de maz de
Argentina para 2013/2014 se estima en 25
millones de toneladas (USDA/FAS, 2014).
En el mundo el 14,2 % de los pesticidas
son utilizados para la produccin de maz
(Racke, 2003). Histricamente, en Estados
Unidos el 41 % del rea cultivada de maz ha
sido tratada con insecticidas y raramente con
fungicidas y las prdidas de rendimiento
ocasionadas por malezas, insectos y patgenos
han sido estimadas en 10 %, 12 % y 10 %,
respectivamente (Clark et al., 1998).
Los productores agropecuarios necesitan
realizar un tratamiento fitoteraputico efectivo
y una alternativa rentable es la utilizacin de
estos agroqumicos. Sin embargo, la toxicidad y
el uso incorrecto de estas sustancias presentan
un riesgo para la salud humana durante su
fabricacin y empleo (Coscoll, 1993; SouzaCasadinho y Bocero, 2008; FAO/WHO, 2014).
Los residuos de plaguicidas tambin
pueden afectar a la poblacin en forma indirecta
consumiendo alimentos y directamente por la
contaminacin ambiental. Sin embargo, la
capacidad de los individuos para evitar su
exposicin es limitada. Como consecuencia, las
autoridades nacionales redactan legislaciones
con el fin de generar conductas que disminuyan
el riesgo para la salud y favorezcan la
produccin cuidando el medio ambiente (FAO,
2006).
Modelos matemticos han proyectado
incrementos en el nmero de casos de
envenenamiento a causa de plaguicidas en el
mundo, de 500 mil casos por ao en 1972 a 25
millones de casos por ao estimados en 1990
(Levine y Doull, 1992; Teixeira et al., 2004).
Segn datos oficiales publicados por el
Ministerio de Salud de la Nacin, en los
Centros de Informacin, Asesoramiento y
Asistencia
Toxicolgica
(CIAATs)
en
Argentina, en el ao 2000 correspondiente al
Informe I se registraron 12976 consultas para
plaguicidas de uso domstico y 2185 consultas
para plaguicidas de uso agrcola, a su vez, dicho
centro inform que las consultas relacionadas a
plaguicidas de uso domstico correspondieron
al 12 % (MSAL, 2000). En el ao 2002 en el
Informe III se registraron 9781 casos probables
y confirmados para plaguicidas. A su vez, como
plaguicidas de uso veterinario se registraron
algunos
productos
veterinarios,
donde
aparecieron 589 casos en el Informe II y 765
casos en el Informe III, pero en esos informes
no especificaron cuantos productos veterinarios
correspondieron a plaguicidas (MSAL, 2001;
MSAL, 2002).
Algunos plaguicidas estn totalmente
prohibidos o restringidos debido a su elevada
toxicidad, y otros estn autorizados para el
004
empleo en la produccin agropecuaria. No
obstante, la presencia de residuos de este ltimo
grupo de pesticidas en cultivos y alimentos,
tiene fijado un Lmite Mximo de Residuo
(LMR) (Coscoll, 1993; Krieger et al., 2010;
PNUMA, 2010).
El uso extensivo de productos
fitosanitarios y su toxicidad, condiciona a los
gobiernos a regular su empleo, poniendo en
prctica programas de control de residuos con
diferentes objetivos como la evaluacin
toxicolgica, la eficacia, la naturaleza y
cantidad de residuos derivados de la aplicacin
de las distintas formulaciones comerciales.
El anlisis qumico de productos
fitosanitarios en matrices alimenticias y
medioambientales tiene una posicin destacada
para llevar a cabo estos controles (Lehotay y
Hajlov, 2002; Racke, 2003).
La validez de los resultados analticos y
las exigencias de los pases compradores son
consideraciones importantes a tener en cuenta
en un laboratorio que realiza anlisis de
residuos
de
pesticidas
en
productos
agroalimentarios. Adems, una forma de
ahorrar tiempo, trabajo y dinero en el
laboratorio es utilizar el menor nmero de
mtodos para la mayor cantidad de analitos.
El objetivo del presente trabajo fue
obtener informacin de los niveles y frecuencia
de los principales residuos de pesticidas
presentes en granos de maz aplicando tcnicas
de evaluacin multiresidual de plaguicidas.
MATERIALES Y MTODOS
Muestras
El muestreo, basado en la Norma ISO
950 (ISO, 1979), fue realizado durante 2
periodos de cosecha (2012 y 2013). Se
obtuvieron un total de 192 muestras de granos
de maz, 165 muestras fueron obtenidas de las
cintas de embarque y 27 de terminales
portuarias del Ro Paran y del sur de la
Provincia de Buenos Aires (Ingeniero White,
Rosario/General San Martn/San Lorenzo, Villa

Constitucin y Quequn), dado que manejan
ms del 80 % de las exportaciones del pas.
Previo a su anlisis, se realiz en los
laboratorios portuarios la molienda de los
granos bajo la supervisin de personal
proveniente del Servicio Nacional de Sanidad y
Calidad
Agroalimentaria
(SENASA),
organismo responsable de garantizar y certificar
la sanidad y calidad de la produccin
agropecuaria, pesquera y forestal. Las muestras
fueron empaquetadas, selladas, rotuladas y
remitidas al laboratorio INTA (Instituto
Nacional
de
Tecnologa
Agropecuaria,
Laboratorio de Plaguicidas) donde fueron
almacenadas en refrigeracin a -18 1 C hasta
su anlisis.
Tratamiento de las muestras para su
anlisis
El mtodo empleado se bas en el
procedimiento QuEChERS (quick, easy,
cheap, effective, rugged, and safe) (Lehotay et
al., 2007).
Se colocaron 5 g de granos molidos en
un tubo de polipropileno con tapa a rosca de 50
mL. Se agreg 1 mL de hexaclorobenceno
(Sigma-Aldrich), agua desionizada y se agit.
Se agreg cido actico glacial (Sintorgan) (1
% en acetonitrilo), acetato de sodio anhidro
(Sigma-Aldrich) y sulfato de magnesio
anhidro (Sigma-Aldrich). Inmediatamente se
agit manualmente durante 1 minuto y se
centrifug a 5000 rpm (Gelec, modelo G130D) durante 3 minutos para separar el
extracto lmpido. Se transfiri el extracto a un
tubo de polipropileno con tapa de 2,5 mL con
amina primaria-secundaria (PSA) (SigmaAldrich), C18 y sulfato de magnesio anhidro.
Inmediatamente se agit manualmente durante
5 minutos y se centrifug a 5000 rpm para
obtener un sobrenadante. Luego se coloc 500
L del sobrenadante en viales de vidrio y se
aadi solucin de trifenilfosfato (SigmaAldrich).
Rojas, Dante et al.
005
La optimizacin de la tcnica analtica

se realiz con muestras blanco. Las mismas no
presentaron tratamiento con los plaguicidas
investigados.
contaminacin.
Para su anlisis se aplic Anlisis de
Regresin y se calcul el coeficiente de
correlacin de Pearson (r) (Ec. 1).
Preparacin de patrones para evaluar

pesticidas en las muestras
Ecuacin (1)
Disoluciones y diluciones se realizaron

corrigiendo los volmenes de forma
gravimtrica, a fin de disminuir la
incertidumbre del mtodo (vila et al., 2004;
tpn et al., 2004; Herrera de Pablo et al.,
2007; Pihlstrm et al., 2009). Se utiliz
material volumtrico de vidrio calibrado con
certificado de trazabilidad al Sistema
Internacional de Unidades.
Se prepararon soluciones patrones (10
mg/mL tolueno) de clorpirifs metil, clorpirifs
etil, pirimifs metil, fenitrotin, malatin, alfa
endosulfn, beta endosulfn, endosulfn
sulfato, permetrina, cipermetrina, fenvalerato,
esfenvalerato, deltametrina (Sigma-Aldrich),
diclorvs (AccuStandard) y soluciones
patrones
(2
mg/mL
tolueno)
para
hexaclorobenceno (HCB) y trifenilfosfato
(TPP) (Sigma-Aldrich). A su vez se utilizaron
soluciones mezclas de pesticidas de diferentes
concentraciones para determinar los parmetros
analticos del mtodo (exactitud, precisin,
sensibilidad, entre otros). Se utilizaron HCB y
TPP como estndares internos (Lehotay, 2006).
Curva de calibracin
La respuesta de los analitos se
comprob trabajando con extractos de muestras
blanco contaminadas a distintos niveles de
concentracin: 0,005 mg/kg; 0,01 mg/kg; 0,02
mg/kg; 0,03 mg/kg; 0,05 mg/kg; 0,1 mg/kg; 0,2
mg/kg; 0,3 mg/kg; 0,6 mg/kg y una muestra
blanco. Se realiz el ensayo por triplicado, con
al menos 2 inyecciones para cada nivel. La
muestra blanco fue incluida para investigar la
aparicin de sustancias co-extradas del maz
que produzcan interferencias o acten como
c c s s
c c s s
2
Donde:
c : es la concentracin
s : es la seal correspondiente a c
c : es el promedio de c
s : es el promedio de s (Di Rienzo et al., 2008)

El criterio de aceptacin utilizado fue R
0,98 (Herrmann y Poulsen, 2007; 2008;
2009).
Ensayos de recuperacin
Se contaminaron muestras blanco
artificialmente a distintos niveles: 0,01 mg/kg;
0,02 mg/kg; 0,03 mg/kg; 0,04 mg/kg; 0,07
mg/kg; 0,15 mg/kg; 0,35 mg/kg y 0,60 mg/kg.
Una muestra blanco sin contaminacin fue
incluida como cero. Se realiz el ensayo por
triplicado, con al menos 2 inyecciones para
cada nivel.
Exactitud: fue evaluada a travs del
clculo de Recuperacin porcentual (R %). La
R % se calcul segn Ec. 2.
Ecuacin (2)
R%
(CF CU)
x 100
CN
Donde:
CF : es la concentracin de analito medido en la
muestra fortificada
CU : es la concentracin de analito medido en
la muestra sin fortificar
CN : es la concentracin de analito agregado
(valor nominal o terico) en la muestra
fortificada
006
El criterio de aceptacin fue 70 R %
120 % para cada analito en todos los niveles
(Pihlstrm et al., 2009).
fue
evaluada
como
Precisin:
reproducibilidad. Se determin para todos los
analitos en cada uno de los niveles y fue
expresada como Desviacin Estndar Relativa
porcentual (Relative Standard Deviation, RSD
%) del ensayo de recuperacin. La
reproducibilidad
para
cada
nivel
de
concentracin, se calcul en base a todos los
valores de concentracin obtenidos (Ec. 3).
Ecuacin (3)
RSD %
SD
x 100
X
Donde:
SD : es la desviacin estndar de las
determinaciones
X : es el promedio de la concentracin
calculada de cada nivel.
El criterio de aceptacin utilizado fue el
valor de RSD % observado para cada nivel
investigado RSD % calculado segn la
ecuacin de Horwitz (Horwitz, 1982; Herrmann
y Poulsen, 2007; 2008; 2009) (Ec. 4).
Ecuacin (4)
RSD % 2(1-0,5 logC)
Donde:
C : es la concentracin expresada como una
fraccin de masa
Sensibilidad: Lmite de Deteccin (LD):
fue expresado como 3 veces la Desviacin
Estndar (Standard Deviation, SD) de la
recuperacin del menor nivel que cumple con
los criterios de aceptacin de precisin y
exactitud. Lmite de Cuantificacin (LC): fue
expresado como 6 veces el SD de la
recuperacin del menor nivel que cumple con
los criterios de aceptacin de precisin y
exactitud.
La
Incertidumbre
del
mtodo:
estimacin de la Incertidumbre del mtodo se
realiz con los datos obtenidos del ensayo de
recuperacin, segn:
SDR %
R % media
Ecuacin (5)
RSD
Ecuacin (6)
U RSD k C
Donde:
RSD : es la desviacin estndar relativa
SDR % : es la desviacin estndar de
recuperacin
R %media : es la recuperacin promedio
C : es la concentracin
k : es un factor de cobertura
U : es la incertidumbre expandida del mtodo.
El valor de k es 2 para un nivel de
confianza de 95 %.
Deteccin
pesticidas
cuantificacin
de
Se utiliz un cromatgrafo de gases

marca PerkinElmer, modelo Clarus 600
(PerkinElmer, Inc., Shelton, Connecticut, USA)
con muestreador automtico, puerto de
inyeccin con vaporizador de temperatura
programable (PTV, programmed temperature
vaporization), control programable del sistema
neumtico, usados para inyeccin de grandes
volmenes (LVI, large volume injection).
Guarda columna de slice fundida de 5 m x 0,25
mm (Supelco), columna capilar marca Varian,
modelo Factor Four VF-5ms, de 30 m x 0,25
mm (0,25 m) de fase estacionaria 95 %
dimetil-5 % difenil polisiloxano de bajo
sangrado. El gas portador (carrier) fue helio
con grado de pureza 99,999 %. Acoplado a un
espectrmetro de masas PerkinElmer, modelo
Clarus 600 (PerkinElmer, Inc.). Se utiliz una
fuente de ionizacin por impacto electrnico a
290 C. El mismo const de un analizador
Rojas, Dante et al.

cuadrupolar, con un prefiltro tambin
cuadrupolar con detector dnodo de conversin,
una placa de fsforo y un tubo
fotomultiplicador.
Se inyectaron 10 L de muestras y el
programa de temperatura del horno fue: 70 C
(6 min); a 25 C/min hasta 170 C; a 5 C/min
hasta 230 C; a 20 C/min hasta 290 C (10
min).
Los datos cromatogrficos se obtuvieron
monitoreando iones especficos (SIM, selected
ion monitoring) usando un in de
cuantificacin y al menos 2 iones calificadores,
para cada analito. Para la seleccin de los iones
se escogieron candidatos consultando la Base
de Datos de Laboratorios de Referencia de la
Unin Europea para Residuos de Plaguicidas
(DataPool of the EU Reference Laboratories
for Residues of Pesticides). Los parmetros
finales fueron determinados por inyeccin de
soluciones patrones de los analitos en las
mismas condiciones en que se analizaron las
muestras (Albero et al., 2005).
Los residuos de plaguicidas se
identificaron de acuerdo a 2 parmetros: tiempo
de retencin relativo al HCB y relacin de
abundancias relativas de iones.
Se analizaron los siguientes plaguicidas:
diclorvs, clorpirifs metil, clorpirifs etil,
pirimifs metil, fenitrotin, malatin, alfa
endosulfn, beta endosulfn, endosulfn
sulfato, permetrina, cipermetrina, fenvalerato,
esfenvalerato y deltametrina.
Criterio de calidad de las muestras
Las muestras se analizaron por
duplicado y el desempeo analtico (GC-MS) se
trabaj con doble estndar interno TPP y HCB
en cada muestra. El criterio de aceptacin fue
que la relacin TPP/HCB (rea de picos) se
mantuviera en todas las muestras (RSD < 10 %)
(Lehotay, 2006).
En cada tanda de 10 anlisis se incluy
un control de calidad (muestra blanco
contaminada) y un blanco de reactivos. Los
007
criterios utilizados fueron: a) Recuperacin

porcentual (70 R % 120) para todos los
plaguicidas investigados; b) ausencia de
interferentes y contaminaciones en el blanco de
reactivos (Hill et al., 1999; Lehotay, 2006;
Pihlstrm et al., 2009).
Identificacin de analitos
Para cada analito se determin el tiempo
de retencin relativo al HCB y la relacin de
abundancias relativas entre el in cuantificador
y al menos 2 iones calificadores. Siendo los
tiempos de retencin relativos al HCB con una
tolerancia de 0,5 % (Pihlstrm et al., 2009).
Las curvas de calibracin fueron construidas
teniendo en cuenta el efecto matriz. El
endosulfn se expres como la suma de alfa
endosulfn, beta endosulfn y endosulfn
sulfato. Permetrina, cipermetrina, fenvalerato y
deltametrina representa cada uno la suma de sus
ismeros (SAGPyA, 2008; Pihlstrm et al.,
2009).
RESULTADOS Y DISCUSIN
Curvas de calibracin
Los
coeficientes
de
correlacin
estudiados presentaron valores R 0,992.
Herrmann y Poulsen (2007; 2008; 2009)
presentaron coeficientes para validacin (GCITD y GC-MS/MS) con valores de R 0,98
para sus curvas de calibracin trabajando con la
metodologa QuEChERS en harinas de cereales
(avena, arroz, centeno y trigo).
Ensayos de recuperacin del mtodo
El ensayo de recuperacin fue utilizado
para evaluar la precisin, exactitud, estimar la
incertidumbre y calcular el lmite de
cuantificacin del mtodo.
Exactitud: la exactitud del mtodo fue
evaluada para cada analito en los diferentes
niveles de concentracin calculando la
008
Recuperacin porcentual (R %) obtenida
durante el ensayo.
La Fig. 2 muestra la frecuencia relativa
porcentual (f %) para distintos rangos de R %.
Se observ que el 65 % de las recuperaciones
se hallaron entre 90 - 109 %, 21 % para R %
< 90 % y solo 14 % para R % > 110.

En la Fig. 3 se pueden observar los R %
promedio de cada analito, donde esfenvalerato
present la menor R % media (91,5 %) y
malatin la mayor R % media (103,9 %).
En el Documento No. SANCO
Figura 2.- Recuperacin porcentual (R %) en funcin de la frecuencia

relativa porcentual (f %).
Figura 3.- Recuperacin porcentual (R %) promedio agrupadas por analito.
Rojas, Dante et al.

10684/2009 se recomienda un intervalo de
aceptacin de 70 - 120 %. Aunque, sugiere
considerar recuperaciones menores, en forma
excepcional, cuando se demuestre una buena
precisin y se conozca la causa de la baja
recuperacin.
Lehotay et al. (2007) han sealado que
en residuos de plaguicidas, cuando se aplica el
mtodo QuEChERS, el criterio de aceptacin
para la recuperacin porcentual debera estar
entre 70 - 120 %. La recuperacin porcentual
en cada nivel de fortificacin para el presente
ensayo fue de 70 - 120 %. La exactitud
aceptable se logr optimizando el tiempo de
retencin, la relacin masa/carga de los iones y
la abundancia de los mismos (SENASA, 2002;
FAO/OMS, 2005; Pihlstrm et al., 2009).
La
precisin de la
Precisin:
metodologa
fue
evaluada
como
reproducibilidad para cada analito en los
diferentes niveles de concentracin estudiados
durante el ensayo de recuperacin. La
reproducibilidad se calcul como RSD % (Fig.
4). Los mayores valores de RSD % promedio
correspondieron a deltametrina (23,4 %),
009
endosulfn sulfato (20,3 %), cipermetrina (17,6

%), diclorvs (16,7 %).
En la Fig. 5 se puede observar la RSD %
en funcin de los niveles de concentracin
estudiados. Las variaciones de RSD % en
funcin de los niveles de concentracin
estudiados mostraron que los niveles de
concentracin ms bajos (0,01 - 0,02 mg/kg)
presentaron valores de RSD % promedio ms
altos (24 % y 19 %, respectivamente) y el nivel
ms alto (0,60 mg/kg) mostr el menor RSD %
promedio (11 %), lo cual es esperable al
analizar la ecuacin de Horwitz (Alder et al.,
2001).
El Documento SANCO No. 10684/2009
recomienda un RSD % de reproducibilidad 20
%. Sin embargo, laboratorios oficiales de la
Unin Europea publican resultados de
validacin de metodologa QuEChERS,
aceptando valores de RSD % menores o iguales
a los obtenidos de la Ec. Horwitz (Herrmann et
al., 2007; 2008; 2009). El criterio de aceptacin
establecido en el presente trabajo fue el valor de
RSD % observado para cada nivel investigado
RSD % calculado segn la ecuacin de
Horwitz.
Figura 4.- Desviacin estndar relativa porcentual (RSD %) promedio para cada analito estudiado.
010
Figura 5.- Reproducibilidad (RSD %) promedio en funcin de las distintos niveles de concentracin.
Como conclusin se pudo comprobar
que con la metodologa propuesta se logr
precisin aceptable para diclorvs, clorpirifs
metil, pirimifs metil, fenitrotin, malatin,
clorpirifs etil, cipermetrina, fenvalerato y
esfenvalerato en el intervalo de 0,01 a 0,60
mg/kg; para permetrina y deltametrina entre
0,02 a 0,60 mg/kg, para alfa endosulfn entre
0,03 a 0,60 mg/kg, beta endosulfn entre 0,04 a
0,60 mg/kg y para endosulfn sulfato entre 0,07
a 0,60 mg/kg.
Para
evaluar
la
Sensibilidad:
sensibilidad del mtodo se calcularon los
Lmites de Deteccin (LD) y Lmites de
Cuantificacin (LC) del mtodo para cada
residuo investigado. Con el fin de determinar
los LD y LC se calcul el desvo estndar del
menor nivel de concentracin que cumpli con
los criterios de aceptacin establecidos para
precisin y exactitud. Los valores de LD y LC
se establecieron como mltiplos del desvo
estndar (Cuadro 1).
Los analitos presentaron LC entre 0,008
mg/kg (fenitrotin y malatin) y 0,084 mg/kg
(endosulfn sulfato). Los mayores LC

correspondieron a beta endosulfn, alfa
endosulfn y endosulfn sulfato; 0,041 mg/kg;
0,045 mg/kg y 0,084 mg/kg, respectivamente.
El elevado LC de estos 3 analitos pudo deberse
a que durante la ionizacin generan gran
cantidad de iones con mucha abundancia y solo
una fraccin de este analito inyectado origina el
in de cuantificacin, dando LC y variabilidad
elevados (tpn et al., 2004).
Los LC obtenidos en el presente trabajo
fueron menores que los Lmites Mximos de
Residuos (LMR) de la legislacin de Argentina
(SAGPyA, 2008) y los recomendados por el
Codex Alimentarius (FAO/OMS, 2013). Solo
los LC de diclorvs y endosulfn sulfato se
encontraron por encima de los LMR
establecidos por la Unin Europea (PE/CUE,
2005; DG SANCO, 2014). El mtodo aplicado
proporcion una adecuada sensibilidad para la
legislacin nacional, recomendaciones del
Codex y la Unin Europea (excepto para
diclorvs y endosulfn sulfato) (Cuadro 2).
Rojas, Dante et al.
011
Cuadro 1.- Lmite de Deteccin (LD), Lmite de Cuantificacin (LC) e Incertidumbre expandida (U)
del mtodo.
Compuesto
Diclorvs
Clorpirifs metil
Clorpirifs etil
Pirimifs metil
Fenitrotin
Malatin
Alfa endosulfn
Beta endosulfn
Endosulfn sulfato
Permetrina
Cipermetrina
LD (mg/kg)
LC (mg/kg)
U (%)
0,007
0,005
0,006
0,005
0,004
0,004
0,022
0,021
0,042
0,009
0,007
0,014
0,010
0,013
0,010
0,008
0,008
0,045
0,041
0,084
0,019
0,013
34
26
21
26
27
23
26
28
22
27
24
Cuadro 2.- Lmites Mximos de Residuos (LMR) establecidos en diversas normativas, relacionados
con maz (grano consumo) o cereales en grano.
Compuesto
LMR-Unin Europea*
(mg/kg)
LMR-Codex Alimentarius **
(mg/kg)
LMR-Argentina***
(mg/kg)
Diclorvs
0,01
5
5
Clorpirifs metil
3
5
Clorpirifs etil
0,05
Pirimifs metil
5
7
10
Fenitrotin
0,05
6
10
Malatin
8
0,05
8
Alfa endosulfn
0,05
0,2
Beta endosulfn
0,05
0,2
Endosulfn sulfato
0,05
0,2
Permetrina
0,05
2
2
Cipermetrina
0,3
0,3
0,1
Fenvalerato
0,02
2
0,1
Esfenvalerato
0,02
0,1
Deltametrina
2
2
1
* Reglamento (CE) N 396/2005 (PE/CUE, 2005; DG SANCO, 2014) .
** Base de Datos en lnea del Codex sobre los residuos de plaguicidas en los alimentos (FAO/OMS, 2013) .
*** Resolucin 507/2008 (SAGPyA, 2008).
012
Incertidumbre: Los valores estimados
para la incertidumbre expandida (U) del mtodo
estuvieron entre 21 % y 34 % (Cuadro 1) y el
valor ms alto correspondi a diclorvs.
Existen
numerosos trabajos que
presentan distintas formas de estimar la
incertidumbre expandida de un mtodo
obteniendo resultados que van desde < 10 %
hasta 50 % y luego asumen una incertidumbre
expandida para el mtodo de 50 % por
recomendacin del Documento No. SANCO
10684/2009 (tajnbaher y Zupani-Kralj,
2003; Kmellr et al., 2008; Banerjee et al.,
2009; Economou et al., 2009; Walorczyk y
Gnusowski, 2009; Chung y Chan, 2010).
Se comprob que todos los valores
estimados de incertidumbre de medicin fueron
aceptables para su empleo en el anlisis de
residuos de plaguicidas en alimentos segn las
recomendaciones del Documento No. SANCO
10684/2009 (Pihlstrm et al., 2009).
Deteccin y cuantificacin de pesticidas
En aproximadamente el 52 % de las
muestras procedentes de cintas de embarque se
encontraron residuos de plaguicidas mientras
que para las terminales portuarias cerca del 33

% de las muestras analizadas presentaron al
menos 1 residuo de pesticida.
En el Cuadro 3 se puede observar los
diferentes agentes fitosanitarios y su posible
relacin con las zonas. No se detectaron
residuos de plaguicidas en 98 muestras (n =
192) siendo 80 muestras en cintas de embarque
y 18 en terminales portuarias. En las muestras
en las cuales se detectaron (n = 94), 85
correspondieron a cintas de embarque y 9 a
terminales portuarias. Los residuos de
plaguicidas ms frecuentemente detectados
fueron fenitrotin (n = 40) seguido por
cipermetrina (n = 31). Tambin se destacaron la
escasa aparicin de fenvalerato (n = 3),
malatin (n = 2) y la ausencia de endosulfn (n
= 0, asumido como la suma de alfa endosulfn,
beta endosulfn y endosulfn sulfato). Para
todos los analitos el resultado ms frecuente
fue: no detectado. Los organofosforados
aparecieron en 122 determinaciones, los
piretroides en 73 y no se detectaron
organoclorados.
Analizando solo los casos detectados en
cintas de embarque, nuevamente fenitrotin (n
= 38) fue el ms frecuente, seguido por
Cuadro 3.- Distribucin de muestras detectadas y no detectadas (ND), segn nmero de residuos
de plaguicidas hallados.
N residuos detectados
Nmero
de muestras totales
Cintas de
embarque
Terminales
portuarias
ND
98
80
18
44
40
23
22
12
11
Total
192
165
27
Rojas, Dante et al.

pirimifs metil (n = 26), cipermetrina (n = 24) y
clorpirifs metil (n = 23).
Para muestras de cintas de embarque,
fenitrotin present el promedio ms alto (0,21
mg/kg) seguido por diclorvs (0,11 mg/kg) y
permetrina (0,11 mg/kg). El mayor valor
tambin lo present fenitrotin (1,4 mg/kg),
luego permetrina (0,46 mg/kg) y pirimifs metil
(0,37 mg/kg).
En el Cuadro 4 se observan los casos en
los cuales los LMR se excedieron. De acuerdo a
los LMR establecidos por la Unin Europea
(PE/CUE, 2005; DG SANCO, 2014) los
residuos de plaguicidas que presentaron valores
superiores fueron diclorvs (n = 14), fenitrotin
013
(n = 13), permetrina (n = 5), clorpirifs etil (n =

1), cipermetrina (n = 1) y fenvalerato (n = 1).
Por ende, el orden de frecuencia de
aparicin de los plaguicidas fue: fenitrotin (n
= 40) > cipermetrina (n = 31) > pirimifs metil
(n = 27) > deltametrina (n = 24) > clorpirifs
metil (n = 23) > diclorvs (n = 18) > permetrina
(n = 15) > clorpirifs etil (n = 12) > fenvalerato
(n = 3) > malatin (n = 2) > endosulfn (n = 0;
suma de alfa endosulfn, beta endosulfn y
endosulfn sulfato).
Los LMR recomendados por el Codex
Alimentarius no fueron superados en ningn
caso. Tomando la legislacin Argentina, solo
cipermetrina (n = 4) present valores mayores
al LMR.
Cuadro 4.- Nmero de determinaciones superiores a los Lmites Mximos de Residuos (LMR)
analizados.
> LMR-Unin Europea*
> LMR-Codex Alimentarius**
> LMR-Argentina***
Diclorvs
14
Fenitrotin
13
Clorpirifs etil
Permetrina
Cipermetrina
Fenvalerato
Compuesto
* Reglamento (CE) N 396/2005 (PE/CUE, 2005; DG SANCO, 2014).

** Base de Datos en lnea del Codex sobre los residuos de plaguicidas en los alimentos (FAO/OMS, 2013) .
*** Resolucin 507/2008 (SAGPyA, 2008).
CONCLUSIONES
El mtodo utilizado proporcion una
adecuada selectividad, linealidad, precisin,
exactitud y la estimacin de la incertidumbre
fue realizada para los residuos de pesticidas
estudiados. La metodologa es sencilla y de
bajo costo (pequeos volmenes de solvente y
rpida), adecuada para organismos de control y
evaluacin rutinaria del cumplimiento de

legislacin nacional y del Codex Alimentarius.
Sobre un total de 192 muestras de
granos maz, 94 presentaron residuos de
plaguicidas, siendo 85 muestras pertenecientes
a las cintas de embarque y el resto a terminales
portuarias. A su vez se observ que el orden de
frecuencia de aparicin de los plaguicidas fue:
fenitrotin (n = 40) > cipermetrina (n = 31) >
014
pirimifs metil (n = 27) > deltametrina (n = 24)
> clorpirifs metil (n = 23) > diclorvs (n = 18)
> permetrina (n = 15) > clorpirifs etil (n = 12)
> fenvalerato (n = 3) > malatin (n = 2) >
endosulfn (n = 0; suma de alfa endosulfn,
beta endosulfn y endosulfn sulfato).
Considerando
la
legislacin
de
Argentina, solo 4 muestras presentaron niveles
superiores al LMR, siendo cipermetrina el
plaguicida involucrado. Sin embargo, todas las
muestras presentaron niveles permitidos segn
los LMR del Codex Alimentarius.
RECOMENDACIN
Es de suma importancia que se controle
en las cintas de embarque y terminales
portuarias los niveles residuales de pesticidas,
dado que pueden ocasionar daos a la salud
humana.
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RVCTA

Nota Tcnica
Metodologa para disear un producto alimenticio por medio de la

identificacin de los factores que influyen en la decisin de compra
Food product methodology design using purchase decision factors identification
Pedro Vargas Aguilar*, Elba Cubero Castillo, Arie Lang Gutowski
Universidad de Costa Rica, Facultad de Ciencias Agroalimentarias, Escuela de Tecnologa de
Alimentos. San Pedro de Montes de Oca, San Jos, Costa Rica.
*Autor para correspondencia: pedro.vargas@ucr.ac.cr
Aceptado 01-Mayo-2014
Resumen
Se desarroll una metodologa para identificar los factores que influyen en la decisin de
compra de un producto alimenticio con la cual la informacin obtenida se utiliza para disear y
reproducir productos de alta gama de consumo. Inicialmente se definieron los parmetros que se
evaluarn para establecer la metodologa, y se estudi su efectividad en una salsa de tomate de corte
popular. Por medio de encuestas, en los restaurantes de comida rpida se determin la relacin
existente entre el volumen de consumo contra el tamao del establecimiento, as como el producto ms
consumido. Tambin, se determinaron los factores de decisin de compra y las caractersticas
sensoriales de mayor importancia para el consumidor en el producto en estudio. Se demostr que no
existe relacin directa entre el tamao del local donde se consume el producto, el nmero de
empleados, la cantidad de bocadillos consumidos y el consumo por semana de salsa de tomate. Para los
dueos de los establecimientos los atributos sensoriales de mayor importancia en una salsa fueron el
sabor dulce, la consistencia y el sabor cido; asimismo, definieron que los factores sabor, precio y
consistencia fueron los ms importantes para decidir la compra de un producto. De las salsas
comerciales se encontr una salsa que fue la que present las caractersticas de sabor y consistencia
ms cercanas al ideal. Esta salsa de tomate se utiliz como salsa patrn. Se evaluaron 3 prototipos y
cada uno fue sometido a una prueba de discriminacin con consumidores para encontrar el prototipo
ideal, ya que no difiri del patrn en ninguna de las caractersticas fisicoqumicas evaluadas ni se
Vargas-Aguilar, Pedro et al.
019
encontr diferencia significativa en la prueba discriminatoria. Con este anlisis, se logr reproducir la
salsa de mayor venta y consumo en restaurantes.
Palabras claves: aceptacin, comidas rpidas, decisin de compra, formulaciones, productos
alimenticios, prototipos.
Abstract
A methodology was developed to identify factors that influence a food product buying decision
and its related information to design and reproduce highly accepted consumer brands. Initially popular
ketchup brands parameters were evaluated for establishing this methodology and its effectiveness.
Through surveys, in fast food restaurants, the relationship between consumption volume against facility
size as well as the most consumed brands were determined. Purchase decision factors and most
important sensory characteristics to consumers were also determined. It was showed that there is no
direct relationship between facility size and employees number, amount of snacks consumed per week
and consumption of ketchup. From commercial sauces evaluated in this study, it was found the ketchup
brand that had flavor characteristics closer to the ideal one. This ketchup was used as a pattern. Three
prototypes were tested using discrimination tests with consumers and it was found a prototype as ideal
which does not differ from the pattern and it did not differ in any of the physical and chemical
characteristics evaluated. With this analysis, a ketchup can be reproduced.
Key words: acceptance, fast food, food products, formulations, prototypes, purchase decision.
INTRODUCCIN
El desarrollo de un nuevo producto se
lleva a cabo en el mbito de los negocios e
ingeniera y consiste en el proceso completo de
crearlo y llevarlo al mercado. Existen 2
aspectos paralelos que se involucran en este
proceso: uno implica la ingeniera del producto;
el otro, el anlisis del mercado. Los
responsables de la mercadotecnia consideran el
desarrollo del nuevo producto como el primer
paso en la gestin de su ciclo de vida (Czinkota
y Ronkainen, 2007).
El motor principal del desarrollo de
productos es la competencia. El objetivo
primordial del desarrollo es en consecuencia el
brindar una respuesta a las necesidades del
cliente, de modo tal que se ofrezca la mejor
opcin en calidad y precio para el segmento
abordado. Cuando se desarrolla un nuevo
producto pasa de la etapa de idea a las etapas de
produccin de mercadotecnia. En general el

proceso de desarrollo sigue los pasos sealados
en seguida:
1. Generacin de ideas de nuevos productos
2. Seleccin de ideas para determinar cules
ameritan ms estudio
3. Anlisis de negocios
4. Desarrollo del producto
5. Prueba de mercado
6. Comercializacin (Stanton et al., 1994)
Este tipo de metodologa se emplea para
identificar las necesidades, tanto conscientes
como inconscientes (latentes), para aprender
cmo los consumidores perciben productos,
marcas y tiendas; para conocer cules son sus
actitudes antes y despus de campaas
promocionales, y cmo y por qu toman sus
decisiones de consumo. Proporciona la base
para el desarrollo de conceptos nuevos de
productos y servicios diseados para satisfacer
020
aquellas necesidades del consumidor que se han
convertido en objetivos a llenar (Schiffman y
Kanuk, 1997). Por lo tanto, a medida que
nuevos productos son introducidos, los
productores necesitan saber si pueden capturar
una parte significante del fragmentado del
mercado del consumidor, con el fin de justificar
los gastos de introduccin del nuevo producto.
El concepto de mercadotecnia est
constituido sobre la premisa de que los
mercadlogos
primero
identifican
las
necesidades del consumidor, y luego
desarrollan productos y servicios que las
satisfagan. La investigacin con el consumidor
ofrece una serie de mtodos diversos para
comprender el comportamiento que presentan
los productos, as, los estudios de investigacin
con consumidores, se utilizan para identificar y
localizar mercados que sean apropiados como
objetivos, y para aprender sus hbitos
(Schiffman y Kanuk, 1997) .
Hay 3 formas bsicas para reunir los
datos primarios en una investigacin
cuantitativa: observacin del comportamiento,
experimentacin o por la aplicacin de
encuestas (entrevistas y programas). Dentro de
un estudio de este tipo, hay que considerar que
el tamao de la muestra depende tanto de las
disponibilidades presupuestales como del grado
de confianza que el mercadlogo tenga en las
conclusiones del estudio. Mientras mayor sea el
nmero de muestra, es ms probable que las
respuestas reflejen el universo total en estudio
(Schiffman y Kanuk, 1997).
La evaluacin sensorial de los alimentos
constituye hoy en da un pilar fundamental para
el diseo y desarrollo de nuevos productos
alimenticios. La prueba de comparacin
pareada es una prueba de 2 productos, en la
cual el panelista debe indicar cul de los
productos
contiene
ms
de
alguna
caracterstica, por ejemplo el dulzor o el brillo
(Stone et al., 2012), y la prueba afectiva o de
aceptacin se emplea para determinar el grado
de aceptacin de un producto por parte de los
consumidores (Earle et al., 2001). Se selecciona

una muestra aleatoria numerosa compuesta de
personas representativas de la poblacin de
posibles usuarios, con el fin de obtener
informacin sobre las actitudes de los
consumidores (Stone et al., 2012).
Tambin, la estadstica es una
herramienta para tomar decisiones, y dentro de
la gama de anlisis se encuentra el anlisis de
conglomerados (Cluster Analysis), que es una
tcnica desarrollada para clasificar los datos e
identificar similitudes y diferencias entre ellos,
y formar grupos dentro de estos. Por ello se ha
convertido en una prctica muy valiosa para
identificar segmentos de consumidores con
gustos y patrones similares. La formacin de
clusters con este mtodo est diseada para
minimizar la varianza entre los conglomerados
y se basa en la unin de aquellas observaciones
que den como resultado el menor incremento en
el error de la suma de cuadrados (Ns et al.,
2010).
Poco o nada se saba del gusto del
costarricense en relacin con la salsa de tomate,
las caractersticas que busca en ella y qu
factores hacen que se decida por una marca u
otra en el momento de la compra. Por lo tanto,
mediante la aplicacin de una metodologa
basada en encuestas y estudios de anlisis
sensorial, se realiz este trabajo con el fin de
identificar los atributos que el consumidor
busca en este producto. Con este estudio, se
busca desarrollar una salsa de tomate basada en
los factores que inciden en la decisin de
compra y en la percepcin de los atributos de
calidad deseada por los dueos de los servicios
de alimentacin de comidas rpidas, y de las
caractersticas sensoriales deseadas por los
consumidores en bocadillos que se aderezan
con la salsa de tomate como lo son los tacos,
hamburguesas o perros calientes.
MATERIALES Y MTODOS
La metodologa utilizada responde a una
matriz en la cual se va incorporando

informacin con el fin de tomar una decisin,
que ser estadsticamente analizada.
Implementacin de la metodologa
para reproducir una salsa de tomate de
mayor venta y consumo en los restaurantes
de comida rpida (RCR)
Caracterizacin de los servicios de
alimentacin e identificacin de las marcas
de salsa de tomate para el estudio
La poblacin de RCR se obtuvo a partir
de las listas dadas por el Instituto Nacional de
Estadstica y Censos (INEC, 2004) de Costa
Rica; de ah se escogieron los establecimientos
aleatoriamente.
Se aplicaron encuestas a los dueos de
100 restaurantes en el Gran rea Metropolitana
(GAM) de Costa Rica (San Jos, Heredia,
Alajuela y Cartago). Con este instrumento se
caracterizaron los RCR por tamao, la cantidad
de productos que venden y por el consumo de
salsa de tomate. Se realiz una correlacin entre
el tamao de los establecimientos (por nmero
de sillas, por nmero de empleados y cantidad
de bocadillos) y el consumo del producto por
semana, utilizando el programa Microsoft
Office Excel, versin 2007 (Microsoft
Corporation, Redmond, WA, USA).
A partir de los resultados obtenidos, se
identificaron las marcas de las salsas de tomate
de mayor consumo por semana como aderezo
en bocadillos populares y por nmero de
establecimientos donde se consumen. Esto se
llev a cabo por medio de anlisis de
distribuciones de frecuencias de la informacin
generada.
Determinacin de los factores de
decisin de compra y caractersticas
deseadas en la salsa de tomate por parte de
los compradores
En la misma encuesta se les pregunt a
los 100 compradores de salsa de tomate, los
021
factores por los cuales deciden comprar un

producto y los atributos del mismo, con el fin
de determinar cules fueron los de mayor
importancia y posteriormente evaluarlos
sensorialmente. Primeramente se les pidi que
ordenaran de mayor a menor importancia
(siendo el factor 1 el de mayor importancia y el
factor 5 el de menor) los atributos sabor a
tomate, sabor cido, sabor dulce, color y
consistencia. Luego ordenaron por orden de
importancia los factores precio, sabor,
consistencia, color, empaque y servicio, donde
el primer factor era el ms importante y el sexto
el menos importante.
Seleccin de la salsa de tomate de
mayor agrado
A las salsas de tomate de mayor
consumo se les realiz un estudio de aceptacin
con 100 consumidores. Las pruebas se llevaron
a cabo en los RCR del GAM bajo condiciones
controladas del lugar (aislado, suficiente luz,
libre de olores), especficamente, se colocaron
mesas individuales en zonas donde las personas
no fueron interrumpidas. Se escogieron 4
establecimientos y se evaluaron 25 personas por
establecimiento.
La eleccin de los consumidores se bas
nicamente en el hecho de que fueran personas
que frecuentan este tipo de establecimiento de
comidas y fuesen consumidores de salsa de
tomate. Las muestras se presentaron de forma
balanceada y aleatorizada, y codificadas con
nmeros de 3 dgitos. Las salsas de tomate se
sirvieron sobre tortillas tostadas de maz sin sal
y se les dio agua para enjugarse entre muestras.
Los consumidores evaluaron el agrado
por los siguientes atributos (escogidos por los
compradores de la salsa de tomate): el sabor
dulce, la consistencia y el sabor cido
utilizando una escala ideal (just right en
ingls) de 5 puntos, en donde el valor 3 de la
escala corresponde al valor ideal. Los valores 1
y 2 significan que no les gusta porque tiene
poco de la caracterstica y los valores 4 y 5 no
022
les gusta
porque tiene mucho de la
caracterstica evaluada.
Los resultados se analizaron por medio
del anlisis de cluster o grupos, con el fin de
buscar si existan segmentos de mercado. Cada
segmento se analiz mediante un anlisis de
varianza y una comparacin de medias de
Fisher LSD (Least Significant Difference) con
un nivel de significancia de 5 %. La salsa de
mayor agrado fue la que obtuvo el valor ms
cercano a 3 en la escala, para todos los atributos
medidos. Se utiliz el programa de estadstica
Statistical Analysis System, versin 9.2 (SAS
Institute Inc., Cary, NC, USA).
Elaboracin de los prototipos de las
salsas de tomate
A la salsa de tomate de mayor agrado se
le realiz una serie de anlisis fisicoqumicos
con el fin de caracterizarla y utilizarla como
patrn. Se determinaron los slidos solubles
como grados Brix (AOAC, 2002), pH (AOAC,
1999) y consistencia (con consistmetro de
Bostwick).
Se busc una formulacin de una salsa
de tomate (Echarrys y Ramrez-M., 2002) y se
ajust con base a las caractersticas
fisicoqumicas del patrn para hacer 3
prototipos. Se realizaron los ajustes necesarios
a la frmula en cuanto a cantidad de pasta de
tomate, cido actico, azcar y almidn de
manera que los anlisis fisicoqumicos fueran
similares a la salsa patrn.
Comparacin de los prototipos con el
producto comercial de mayor aceptacin
(salsa patrn)
Prueba
consumidores
de
discriminacin
con
Para evaluar si exista o no diferencia

entre cada uno de los prototipos de salsa de
tomate y la salsa patrn, se realiz una
comparacin pareada con 27 personas. El
nmero de personas se determin con una

potencia del 90 % ( = 0,10) y un d de 1
(Meilgaard et al., 2007), es decir que se pueda
captar una pequea diferencia entre los
productos.
La seleccin de los panelistas se bas
nicamente en el hecho de que fueran personas
que frecuentaran este tipo de restaurantes y que
consumieran salsa de tomate. Los panelistas
evaluaron los productos en un rea adecuada
para tal fin en un establecimiento de comida
rpida.
Se les presentaron 3 pares donde una de
las muestras era la salsa patrn y la otra
muestra uno de los 3 prototipos. Se les pregunt
cul de las 2 muestras era ms dulce. Luego se
volvi a presentar el mismo par (con cdigos
diferentes para evitar sesgos) y se les pregunt
cul era la ms cida y se les volvi a presentar
el mismo par (con cdigos diferentes) y se les
pregunt cul era la ms consistente. Este
procedimiento se repiti con los otros 2
prototipos.
Los datos se analizaron con las tablas
binomiales (Roessler et al., 1978) para
determinar si encontraron diferencias entre cada
prototipo y la salsa patrn para cada uno de los
3 atributos.
Caracterizacin de los restaurantes de
comida rpida (RCR) del Gran rea
Metropolitana (GAM)
En el Cuadro 1, se observa una muestra
de los RCR del GAM, que comercializan
bocadillos populares, y sus caractersticas por
tamao, cantidad de productos expendidos y
consumo de salsa de tomate.
En
la
caracterizacin
de
los
establecimientos que consumen salsa de tomate,
no se encontr una relacin entre nmero de
sillas que haba en el local y el consumo en
litros de salsa por semana (r2 = 0,64). Por
ejemplo, algunos establecimientos con mayor
023
Cuadro 1.- Caracterizacin de los RCR de la GAM por tamao, cantidad de venta y consumo de salsa
de tomate.
Establecimiento
Nmero*
Ubicacin
por Provincia
Sillas
por local
Empleados
por local
Cantidad de bocadillos
expendidos
(por semana)
San Jos
50
1500
189,0
Heredia
50
900
302,0
San Jos
43
350
19,0
San Jos
40
20
11,5
Alajuela
36
15
4,0
Cartago
35
150
11,5
San Jos
30
15
11,5
San Jos
30
400
30,0
Heredia
30
44
4,0
10
San Jos
28
24
7,5
11
Heredia
25
50
212,0
12
Cartago
25
20
12
n = 100 establecimientos.
RCR: restaurantes de comida rpida. GAM: Gran rea Metropolitana.
* Cada nmero es un local diferente.
378,0
nmero de sillas, como los establecimientos N

4 y N 6, consumen poca salsa de tomate (11,5
litros) y otros como el N 1 y el N 2 consumen
189 y 302 litros, respectivamente. Tampoco se
encontr una tendencia entre el nmero de
empleados y el consumo de salsa, y no existi
una relacin directa entre ellos (r2 = 0,0084).
Un resultado muy importante de este
estudio es que tampoco se evidenci una
relacin entre la cantidad de bocadillos
populares
que
se
expenden
en
el
establecimiento y el consumo de litros por
semana (r2 = 0,13). En algunos locales, se
expenden otras comidas que al consumidor le
gusta acompaar con salsa de tomate, tal es el
caso del arroz con pollo y emparedados entre
otros productos.
Por lo tanto, al no existir una relacin
entre el tamao del establecimiento y el
Consumo de salsa
de tomate
(litros/semana)
consumo semanal de salsa de tomate, se puede

deducir que la utilizacin de la salsa de tomate
en alimentos que no son bocadillos era muy
importante y se recomienda que se incluyan en
la encuesta. La pregunta debe identificar tanto
el uso que le da el cocinero, as como en los
alimentos en los que el cliente adiciona el
producto. Tambin que se identifiquen las
marcas del producto por volumen y la
presentacin en cada local.
Identificacin de las marcas de salsa de
tomate utilizadas en los RCR del GAM y de
las marcas de mayor consumo
Las salsas de tomate que se identificaron
en los RCR del GAM para acompaar o
aderezar bocadillos populares se muestran en la
Fig. 1; en litros por semana (Fig. 1A) y por
400
30
350
25
300
Nmero de establecimientos
Litros de salsa de tomate consumidos por semana
024
250
200
150
100
20
15
10
5
50
0
0
A H B G E C F K T L D I Q J N S M O P
A B C D E F G H I J K L M N O P Q S T
Marcas de salsa de tomate
Marcas de salsa de tomate
n = 100 establecimientos.
Las letras representan diferentes marcas de salsa de tomate.
Figura 1.- Distribucin de consumo en litros de las marcas de salsa de tomate por semana (A) y del
nmero de establecimientos que consumen las marcas de salsa de tomate (B).
nmero de establecimientos donde se consumen
(Fig. 1B). Se puede observar que en los 100
establecimientos encuestados se identificaron
20 marcas de salsas de tomate compitiendo por
el mismo mercado.
La metodologa propuesta no solo debe
considerar el volumen de ventas de cada marca
sino tambin el nmero de establecimientos
donde se consumen, ya que puede ser tan
importante que la marca tenga una buena
presencia en el mercado como un alto volumen

de ventas en un solo local.
Las marcas que se seleccionaron por
tener mayor presencia, es decir, se encontraron
en un mayor nmero de establecimientos de los
RCR, fueron las salsas denominadas como A,
B, C (Cuadro 2); y la salsa G se eligi porque
se consume en un solo establecimiento una gran
cantidad de litros por semana de esta salsa de
tomate.
Cuadro 2.- Marcas de salsa de tomate con mayor presencia y consumo en los RCR del GAM.
Salsa de tomate
Nmero de establecimientos
Consumo estimado de salsa de tomate

(litros/semana)*
27
364,8
20
311,6
13
125,4
G
1
212,8
RCR: restaurantes de comida rpida. GAM: Gran rea Metropolitana.
* Valor indicado por los dueos de los establecimientos.

Estas 4 salsas de tomate comerciales
fueron sometidas a un estudio de aceptacin
para identificar cul de estas marcas era
considerada la de mayor agrado. Para hacer este
estudio de aceptacin era necesario conocer las
caractersticas ms valoradas por los
compradores, o dueos de los establecimientos,
para evaluar estas caractersticas con los
consumidores.
Determinacin de los factores de decisin de
025
compra por parte de los compradores

El ordenamiento por parte de 100
dueos de locales de las caractersticas
sensoriales se aprecia en la Fig. 2. Se puede
observar la frecuencia de los compradores de
acuerdo al nivel de importancia de los
parmetros de calidad del producto (sabor a
tomate, sabor cido, sabor dulce, color y
consistencia).
Se encontr que el sabor dulce,
Cantidad de encuestados (Frecuencia)
60
50
40
1
30
2
3
20
4
5
10
0
Sabor a tomate Sabor cido
Sabor dulce
Color
Consistencia
Caractersticas de la salsa de tomate

(n = 100 establecimientos).
Figura 2.- Frecuencia de importancia para los compradores de salsa de tomate del sabor a
tomate, sabor cido, sabor dulce, color y consistencia de una salsa de tomate. El
factor de mayor importancia es el primero y el de menos importancia el ltimo o
nmero 5.
la consistencia y el sabor cido fueron los ms
importantes para los compradores de la salsa.
Los menos importantes fueron el sabor a tomate
y el color.
La Fig. 3 muestra los factores

sensoriales y no sensoriales que eran ms
importantes para los dueos de los RCR en el
momento de tomar la decisin de comprar una
026
80
Cantidad de encuestados (Frcuencia)
70
60
50
40
3
4
30
20
10
0
Precio
Sabor
Consistencia
Color
Empaque
Servicio
Factores de decisin de compra

(n = 100 establecimientos).
Figura 3.- Frecuencia de compra de salsa de tomate por precio, sabor, consistencia, color,
empaque y servicio. La escala utilizada fue de 6 puntos, donde 1 es el ms
importante y 6 el menos importante.
salsa de tomate. El sabor fue el que mostr la
mayor importancia seguido por el precio y por
ltimo la consistencia. Los factores que
tuvieron menos importancia fueron el empaque,
el servicio y el color.
Guercioni-Sterlecchini (1985) indica
que las caractersticas de mayor importancia en
una salsa de tomate son el sabor dulce, la
consistencia, el color y el sabor cido, lo cual
concuerda con los resultados encontrados en la
encuesta, que este tipo de consumidor est
acostumbrado a comer salsa de tomate y espera
un producto con tales caractersticas.
Estudio de aceptacin: seleccin de la salsa
de mayor agrado por parte del consumidor
Para identificar el agrado hacia las 4
salsas (A, B, C y G) los 3 atributos evaluados
fueron el sabor dulce, la consistencia y el sabor

cido. Los resultados se presentan en la Fig. 4.
La salsa de mayor agrado fue la que
obtuvo el valor ms cercano a 3 en la escala,
para todos los atributos medidos.
Por medio del anlisis de cluster, se
encontraron dos grupos o segmentos de
consumidores, uno con 67 consumidores y el
otro con 32.
Los dos grupos de consumidores
encontraron que el dulzor de la salsa C estuvo
cerca del valor ideal, y el grupo 2 tambin
encontr que la salsa de tomate B tena un
dulzor cercano al ideal. En los dos grupos, las 4
salsas de tomate presentaron una consistencia
cercana a la ideal. La acidez ideal tambin
correspondi a la salsa de tomate C para el
grupo 1 y para las salsas B, C y G para el grupo
2.
027
Letras minsculas iguales en el mismo bloque indican que no hay diferencias significativas (p > 0,05).
Figura 4.- Promedio de agrado para el sabor dulce, la consistencia y el sabor cido de 4 salsas de
tomate comerciales (A, B, C y G) utilizando una escala de 5 puntos donde el valor 3
representa el ideal y los valores por debajo o por encima representan desagrado, para dos
segmentos o grupos de consumidores.
La salsa C fue la que present
caractersticas de sabor y consistencia ms
cercanas al ideal. Esta salsa de tomate se utiliz
como salsa patrn, a ser imitada.
Elaboracin de 3 prototipos de salsas de
tomate
La formulacin de la salsa de tomate se
ajust con base en las caractersticas
fisicoqumicas de la salsa de tomate C y se
obtuvieron 3 prototipos a los cuales se les midi
los grados Brix, pH y la consistencia.

El Cuadro 3 muestra las mediciones
realizadas a la salsa C y a los prototipos. La
medicin de pH indic que todas las salsas
cumplieron con la especificacin de la norma
mexicana NMX-F-346-S-1980 (NM, 1980)
donde el pH mximo es de 4,3 y la consistencia
mxima en cm es de 12. La norma especifica
slidos totales mnimo 27, los cuales se pueden
comparar con los grados Brix que fueron
mayores a 30 para los 3 prototipos y el patrn.
Cuadro 3.- Caracterizacin fisicoqumica de la salsa de tomate C y los 3 prototipos.

Salsa de tomate
Caractersticas fsicas y qumicas de las salsas de tomate

Grados Brix
pH
Consistencia (cm/30 s)
Patrn (salsa C)
31,8
4,0
5,4
Prototipo 1
32,5
3,8
5,8
Prototipo 2
30,0
4,0
6,0
Prototipo 3
32,6
4,0
6,5
028
De los 3 prototipos desarrollados se
observ que el prototipo 1 obtuvo el valor ms
prximo a la salsa de tomate C en cuanto a los
grados Brix y la consistencia. Mientras que el
pH de los prototipos 2 y 3 fueron similares al
patrn.
El
prototipo
1
present
las
caractersticas fisicoqumicas ms cercanas al
patrn, sin embargo, los otros 2 prototipos no se
encontraron muy alejados de las caractersticas
del patrn, por lo tanto no se hizo ningn ajuste
a los prototipos para presentarlos en la siguiente
etapa de estudio (prueba de discriminacin).

Prueba de discriminacin para determinar
cules formulaciones presentaron diferencia
significativa con respecto a la salsa comercial
de mayor agrado
En el Cuadro 4 se muestra el nmero de
respuestas obtenidas en la prueba de
comparacin pareada con 27 consumidores para
los 3 prototipos y 3 caractersticas sensoriales.
Cuadro 4.- Nmero de personas que escogieron la muestra con mayor intensidad de sabor dulce, sabor
cido y consistencia en cada uno de los pares evaluados ( = 0,05; d = 1 y = 0,10;
n = 27).
Caracterstica
evaluada
2-AFC
2-AFC
2-AFC
Patrn*
Prototipo 1
Patrn*
Prototipo 2
Patrn*
Prototipo 3
Sabor dulce
12
15
18
21
Sabor cido
18
24
18
Consistencia
15
* Salsa de tomate C.
12
15
12
18
El nmero mnimo de respuestas

correctas es de 20 para que exista diferencias
significativas entre los 2 productos que se
comparan en una prueba 2-AFC (2-alternative
forced choice) con un = 0,05 (Ennis y
Jesionka, 2011), por lo tanto, se encontr que
entre el patrn y el prototipo 1 no se
presentaron diferencias significativas (p > 0,05)
para ninguna de las caractersticas evaluadas.
En cuanto a la comparacin entre el
patrn y el prototipo 2, se encontr que existan
diferencias significativas (p 0,05) en el sabor
cido y que se senta ms intenso en el
prototipo 2.
Cuando se compar el prototipo 3 y la
salsa de tomate C (patrn), los panelistas
encontraron ms dulce el patrn (p 0,05), lo
cual podra deberse a que, a pesar de que los
grados Brix del patrn y del prototipo fueron

similares, la consistencia instrumental del
prototipo fue mucho mayor. Se ha encontrado
que un aumento en la viscosidad aumenta los
umbrales de percepcin de sal y azcar, lo que
puede estar relacionado con una reduccin en la
velocidad de llegada de sabores a los receptores
de la lengua reduciendo la sensacin (Gady et
al., 2008).
A partir de este anlisis, se concluy que
la frmula del prototipo 1 era la ms cercana a
la salsa patrn en cuanto al dulzor, acidez y
consistencia, lo que significa que present las
caractersticas ideales deseadas por los
consumidores.
Las
pruebas
de
discriminacin
normalmente se utilizan en proyectos donde se
reducen costos de produccin y se usan poco en

proyectos de desarrollo de productos. Esto se
puede considerar un error especialmente en los
estadios finales del proceso cuando los cambios
a los prototipos son muy pequeos (Heyhoe,
2002).
Esta metodologa sensorial tendr xito
en la medida en que las caractersticas
fisicoqumicas de los prototipos se acerquen
suficientes a las del producto patrn, tal y como
se observa en el Cuadro 3, donde estando cerca
los prototipos 2 y 3, las pequeas diferencias
fueron detectadas por el consumidor. Por lo que
se recomienda trabajar con metodologas
sensoriales que maximicen la sensibilidad del
consumidor para que pueda encontrar pequeas
diferencias (Ennis y Jesionka, 2011), y as, el
producto desarrollado ser rplica del producto
patrn.
CONCLUSIONES
Por medio de las encuestas se
comprendi que no solamente era importante el
volumen de ventas si no el nmero de
establecimientos donde se consuma una marca
dada. De ah se encontraron los productos
(salsas de tomate) de mayor presencia, es decir,
que se encontraron en mayor nmero de
establecimientos, y los de mayor volumen de
venta.
En el caso especfico de las salsas de
tomate, de 20 marcas se encontraron 4 (A, B, C
y G) con mayores ventas. Tambin, de la
metodologa sugerida se concluye que se debe
incorporar en las encuestas el tipo de comida en
que se utiliza la salsa de tomate y de forma
general para cualquier otro producto se puede
preguntar los usos o aplicaciones del producto
que se reproducir.
Se pudieron establecer las caractersticas
sensoriales y no sensoriales ms importantes
para los dueos de los establecimientos, las
cuales ayudaron a formular los prototipos en
forma precisa. Se concluye que es importante
tomar en cuenta la opinin de los dueos de los
029
establecimientos donde se consume el producto

meta para lograrlo reproducir.
Los principales factores por los cuales
los dueos de los establecimientos compran la
salsa de tomate fueron el sabor, el precio y la
consistencia del producto. El empaque, el
servicio y el color no afectaron la decisin de
compra de este producto.
En cuanto a las caractersticas de calidad
del producto, el sabor dulce, la consistencia y el
sabor cido constituyeron las caractersticas
sensoriales que los dueos de los
establecimientos consideraron de mayor
importancia en la salsa de tomate.
Con la metodologa aplicada se logr
encontrar un prototipo que fue muy cercano a
una salsa comercial escogida como la de mayor
agrado. En el estudio del consumidor,
utilizando las caractersticas sensoriales de
mayor importancia, se encontr que la salsa de
tomate C fue la de mayor preferencia. Luego de
analizar los prototipos elaborados y evaluarlos
por los consumidores, se concluye que el
prototipo 1 no fue diferente al patrn en
ninguna de las caractersticas evaluadas.
La metodologa propuesta, con unos
pequeos cambios, cumpli el propsito de
reproducir un producto de alta venta y
presencia en un mercado especfico.
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RVCTA

Comunicacin
Efectos del gas ozono sobre cepas de Fusarium verticillioides y

F. proliferatum productoras de fumonisinas
Effects of ozone gas on Fusarium verticillioides and F. proliferatum strains
producers of fumonisin
Laura Frisn1 *, Priscila Bourilhon1, Horacio Ocampo2, Daro Ponisio2, Juan Baslico1
1
Ctedra de Microbiologa, Departamento de Ingeniera en Alimentos, Facultad de Ingeniera Qumica,

Universidad Nacional del Litoral. Santiago del Estero 2829 (3000), Santa Fe, Argentina.
2
Empresa Agua Ozonizada Santo Tom (3016), Santa Fe, Argentina.

*Autora para correspondencia: lfrison@fiq.unl.edu.ar
Resumen
Las fumonisinas son producidas por especies de Fusarium, esencialmente por Fusarium
verticillioides y F. proliferatum que se encuentran como contaminantes naturales en maz y
subproductos de maz. Su consumo, se asocia con ciertas enfermedades en animales y humanos. La
industria alimentaria apunta sus investigaciones al desarrollo de nuevas tecnologas y la aplicacin de
gas ozono, dado su elevado poder germicida y su descomposicin espontnea a oxgeno, se ha
convertido en un agente potencial para garantizar la seguridad microbiolgica y la calidad de los
alimentos. Debido a la importancia del consumo de maz en Argentina y a la contaminacin de este
grano por cepas productoras de fumonisinas, se estudi la posibilidad de detoxificar maz contaminado
con esta toxina con gas ozono. Se aislaron cepas de Fusarium verticillioides y F. proliferatum de
granos de maz y de silaje. Se estudi la capacidad de produccin de toxina de dichas cepas. La
cuantificacin de esta toxina se realiz mediante ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas
(ELISA) con el kit para fumonisinas RIDASCREENFAST Fumonisin siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se utiliz gas ozono a concentraciones de: 4500, 7500 y 25000 ppm v, por tiempos de
exposicin de 10 y 20 minutos. Todas las cepas de Fusarium estudiadas fueron buenas productoras de
032
fumonisinas. A las concentraciones y tiempos evaluados, no se observ la eliminacin o disminucin

de la concentracin de toxina. Prevenir la contaminacin con estos mohos es la mejor solucin para el
problema de las micotoxinas, debido a que una vez producida la toxina es difcil de erradicar.
Palabras claves: capacidad toxicognica, fumonisinas, Fusarium, gas ozono, micotoxinas en maz.
Abstract
Fumonisins are produced by Fusarium species, essentially Fusarium verticillioides and F.
proliferatum that occur as natural contaminant of corn and corn products. Consumption is associated
with certain diseases in animals and humans. The food industry aims its research to develop new
technologies and the application of ozone gas, given its high germicidal power and spontaneous
decomposition to oxygen, has become a potential agent to ensure microbiological safety and food
quality. Because of the importance of maize consumption in Argentina and contamination of the grain
by fumonisin-producing strains, the possibility to detoxify corn contaminated with this toxin with
ozone gas was studied. Strains of Fusarium verticillioides and F. proliferatum were isolated from
maize grain and silage. The toxin production capacity of these strains was studied. The quantification
of the toxin was performed by Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) kit for fumonisin
RIDASCREENFAST Fumonisin following manufacturers instructions. Ozone gas concentrations:
4500, 7500 and 25000 ppmv, for exposure times of 10 and 20 minutes was used. All strains of
Fusarium studied were good producers of fumonisin. At the concentrations and times studied,
eliminating or decreasing the concentration of toxin was not observed. Prevent contamination with
these molds is the best solution to the problem of mycotoxins, because once produced the toxin is
difficult to eradicate.
Keywords: fumonisin, Fusarium, mycotoxin in corn, ozone gas, toxicogenic capacity.
INTRODUCCIN
El gnero Fusarium est ampliamente
distribuido tanto en suelos como en sustratos
orgnicos. Presenta especies fitopatgenas que
causan graves enfermedades principalmente en
los cereales. Bajo condiciones ambientales
favorables, colonizan sintomticamente o
asintomticamente un sustrato como maz
pudiendo conducir esta interaccin a la
produccin de micotoxinas. Su importancia no
se debe solo a la prdida de las cosechas, sino
tambin a la biosntesis de micotoxinas que
pueden estar presentes en los cereales y sus
productos,
produciendo
sndromes
de
intoxicacin en animales y llegando a la cadena
alimentaria de los humanos (Cabaes et al.,
2007). Las micotoxinas asociadas a este gnero
son las fumonisinas (FB), zearalenona (ZEA) y

los tricotecenos, incluyendo es este grupo el
diacetoxiscirpenol (DAS), la toxina T-2,
deoxinivalenol (DON) y el nivalenol (NIV). Se
asocian a cuadros de toxicidad celular, efectos
sobre el crecimiento y el desarrollo de los
animales, e incluso al cncer en humanos y
animales, por lo que son de gran inters en el
sector agrcola y alimentario (Valle, 2011).
Fusarium verticillioides se encuentra
usualmente en zonas tropicales, y zonas
templadas y hmedas del mundo (Leslie y
Summerell, 2006). Esta especie es un patgeno
endmico de maz, que causa pudricin del tallo
durante todas las etapas de desarrollo de la
planta. Tambin se ha documentado como
contaminante de las semillas oleaginosas:
girasol, amaranto y soya, tambin especias,
Frisn, Laura et al.

como el cilantro, fenogreco, cardamomo y
pimienta (Pitt y Hocking, 2009).
La especie F. proliferatum, al igual que
F. verticillioides, es un problema significativo
en la contaminacin de plantas de maz en toda
Latinoamrica y el resto del mundo, siendo
cada vez ms importante en pases de Europa
(Bacon y Nelson, 1994; Desjardins, 2006;
Leslie y Summerell, 2006). F. proliferatum
tambin fue encontrado como contaminante de
sorgo, nueces de pino, arroz y frijoles (Marn et
al., 1999).
Las FB son neurotxicas, nefrotxicas y
hepatotxicas. Causan edema pulmonar y
cerebral, y lesiones cardacas. Los rganos
afectados son cerebro, pulmones, hgado,
riones y corazn. Los animales ms sensibles
son los equinos y los cerdos, aunque algunos
autores informan de sntomas en ovejas,
carneros y primates no humanos (Afsah-Hejri et
al., 2013).
El cultivo del maz ocupa un lugar
importante en la agricultura de Argentina. Los
principales
hongos
toxicognicos
contaminantes de este cereal y alimentos
formulados a base del mismo pertenecen a los
gneros Fusarium (F. verticillioides, F.
graminearum, F. proliferatum, F. oxysporum),
Penicillium (P. rubrum, P. purpurogenum),
Alternaria (A. alternata) y Aspergillus (A.
flavus) (FAO/WHO, 2001; WHO/FAO, 2002;
Aziz et al., 2006; Zhang et al., 2007; GarcaAguirre y Martnez-Flores, 2010).
La industria alimentaria apunta sus
investigaciones al desarrollo de nuevas
tecnologas y la aplicacin de gas ozono, dado
su
elevado
poder
germicida
y
su
descomposicin espontnea a oxgeno, se ha
convertido en un agente potencial para
garantizar la seguridad microbiolgica y la
calidad de los alimentos. Se considera que es un
sanitizante de buena eficiencia que requiere
tiempos de contacto bastante cortos. Inactiva
enzimas respiratorias y destruye la membrana
celular. Por su capacidad para dar reacciones de
adicin sobre los dobles enlaces y por su
033
tendencia a transformarse de nuevo en oxgeno

molecular, esta tecnologa es limpia, segura y
eficiente y no agrede al medio ambiente ya que
deja como residuo molculas de oxgeno. Estos
aspectos favorecen su empleo en la industria
alimentaria (Kadre et al., 2001). El potencial
del ozono en la industria de alimentos incluye
la reduccin de microorganismos, extensin de
la vida til de productos como pescado, carne,
frutas y reduccin de niveles de contaminacin
de ambientes de envasado de alimentos.
Varios autores coinciden en que el
ozono, tanto en fase acuosa como gaseosa, es
un potente germicida capaz de eliminar
bacterias, virus, hongos y quistes de parsitos,
sin provocar la formacin de compuestos
txicos ni dejar residuos, ya que se descompone
en oxgeno, aspecto ventajoso frente a otros
sanitizantes comnmente empleados para estos
fines (Kim et al., 1999; Rice, 1999; RicaurteGalindo, 2006).
Debido a que la contaminacin con
micotoxinas es un problema de grandes
repercusiones econmicas y de la salud, y que
el cultivo de maz ocupa un lugar importante en
la agricultura de Argentina, se propuso como
objetivo de este trabajo la posibilidad de
detoxificar con gas ozono maz contaminado
con fumonisinas, ya que es una tecnologa
limpia y que no agrede al medio ambiente.
MATERIALES Y MTODOS
Aislamiento e identificacin de cepas
de Fusarium verticillioides y F. proliferatum
Se aislaron cepas de Fusarium
verticillioides y F. proliferatum durante el
perodo de Marzo-Abril del ao 2012 a partir de
40 muestras de granos de maz y 40 de silajes.
Las muestras fueron provistas por el Instituto
Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA),
Estacin Experimental Agropecuaria Rafaela de
la Provincia de Santa Fe, Argentina. Las
mismas fueron conservadas en freezer (-20 C),
por su alto contenido de humedad, hasta el
034
momento de su anlisis. Se colocaron granos de
maz y trozos del ensilado sobre placas con
medio Agar Extracto de Malta (Malt Extract
Agar, MEA), al cual se le agreg cloranfenicol
(100 mg/L) para inhibir el crecimiento
bacteriano (Beuchat y Cousin, 2001). Estas
placas se incubaron a 28 C por 7 das. Luego
se realiz el aislamiento y purificacin de las
colonias que presentaron caractersticas propias
del gnero Fusarium y se procedi a su
identificacin a partir de caractersticas macro y
microscpicas, segn las claves de Nelson et al.
(1983).
Mediante una inspeccin microscpica
con un microscopio Leica, modelo CM E
(Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y un
aumento de 40 X, se determinaron cuales
aislados pertenecan al gnero Fusarium por la
presencia de macroconidios. Las colonias
coincidentes con este gnero (flocosas, color
rosa a morado, naranja plido o blanco) se
repicaron
a
medio
Agar
Spezieller
Nhrstoffarmer (SNA) y Agar Papa Dextrosa
(PDA). Se incubaron por 7 das a temperatura
ambiental bajo accin de luz para favorecer la
esporulacin del moho y as confirmar la
identidad del gnero. Luego se realiz la
identificacin de cada especie aislada. Todos
los cultivos utilizados fueron iniciados desde un
conidio simple (cultivo monosprico) (ZapataBaslico et al., 2010).
Para la identificacin se observaron las
caractersticas microscpicas propias de las
especies F. verticillioides y F. proliferatum
pertenecientes a la seccin 10, llamada seccin
Liseola (Nelson et al., 1983). Los caracteres
para determinar las secciones y las especies se
basan en las caractersticas del cultivo
(velocidad de crecimiento, color del micelio
areo, color del reverso, presencia de pigmentos
solubles, color de masas de conidios); en las
caractersticas de los macroconidios a partir de
los esporodoquios (tamaos, forma del conidio,
forma de las clulas pie y apical); en las
caractersticas de los microconidios a partir del
micelio areo (presencia, forma, agrupacin);
en los conidiforos (monofialides, polifialides)

y en los clamidoconidios (presencia, ausencia).
Todas las cepas de Fusarium aisladas se
conservaron a 4 C en crioviales conteniendo
agar-agua al 0,2 % (m/v) hasta su posterior
anlisis.
Capacidad toxicognica de las cepas
aisladas
Se sigui la metodologa de Liu et al.
(1996), sustituyendo el arroz por granos de
maz. Se colocaron 100 gramos de este sustrato
en matraz Erlenmeyer de 250 mL, uno para
cada cepa en estudio. Los granos se hidrataron
con 30 mL de agua destilada y se esterilizaron
en autoclave porttil de acero inoxidable
Labklass, YXQ-280MD a 121 C durante 30
minutos. Posteriormente se inocul el maz
esterilizado con 1 mL de la suspensin de la
cepa en estudio. Se incubaron 30 das a 28 C
agitando una vez al da para favorecer el
desarrollo uniforme. Cada anlisis se realiz
por duplicado.
La determinacin de FB se realiz
mediante ensayo por inmunoabsorcin ligado a
enzimas (Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay, ELISA) con el kit para fumonisinas
RIDASCREENFAST
Fumonisin
(RBiopharm AG, Darmstadt, Alemania). Este es
un inmunoensayo enzimtico competitivo para
el anlisis cuantitativo de FB en cereales y
piensos.
Preparacin de las muestras de maz
para la cuantificacin de las fumonisinas
Para la preparacin de las muestras se
siguieron las instrucciones del fabricante del kit
comercial. Para ello se pesaron 25 gramos de
muestra de maz (inoculado con las cepas en
estudio e incubado durante 30 das a 28 C) y se
trituraron en un molinillo a cuchillas elctrico
Dalvo, modelo MC/I (Tecno Dalvo, Santa Fe,
Argentina), luego se realiz la extraccin de la
Frisn, Laura et al.

toxina con 125 mL de metanol:agua (70:30) y
se agit vigorosamente durante 3 minutos en
mesa rotativa, marca BOECO, modelo OS-10
(Boeckel + Co (GmbH + Co), Alemania). Se
procedi al filtrado de la misma a travs de
papel de filtro WathmanTM N 1 (Whatman
International Limited, UK). Se diluy el filtrado
1:14 y se procedi a la cuantificacin de FB.
Equipo generador de gas ozono
El equipo que se utiliz en este trabajo
para la generacin del gas ozono fue
proporcionado y operado por personal de la
firma Agua Ozonizada Santo Tom (Santa Fe,
Argentina). El gas fue producido mediante la
tcnica de descarga elctrica tipo corona
(Frisn et al., 2013). Las cantidades de ozono
generadas dependen de las condiciones de
trabajo, cantidad de oxgeno que ingresa al
equipo, temperatura ambiental, caudal y
radiacin ultravioleta. Para la medicin de la
concentracin de ozono en fase gas se utiliz
Iodometra. Se hizo burbujear un volumen
conocido de un gas con ozono dentro de una
solucin de yoduro de potasio (KI). La
medicin de ozono residual en fase lquida, se
realiz mezclando una muestra del lquido a
medir con la solucin de KI. La reaccin
produce yodo (I2), el cual se titul
inmediatamente con tiosulfato de sodio
(Na2S2O3) hasta color amarillo plido,
utilizando almidn como indicador. La
concentracin de ozono (mg O3/min) que
produjo el equipo se calcul por el consumo de
Na2S2O3 (Beutelspacher-Santiago y CaldernAncona, 2005).
Con un caudal de 2 L/min, los mg de O 3
se convierten en microlitros (L) aplicando la
ecuacin de los gases: PV = nRT y dividiendo
por el caudal, para obtener las concentraciones
en partes por milln volumtricas (ppmv).
Las concentraciones de gas ozono
utilizadas en los ensayos fueron 4500 ppmv,
7500 ppmv y 25000 ppmv y los tiempos de
exposicin fueron 10 y 20 minutos. As, 4500
035
ppmv equivalen a una produccin de gas ozono

de 18 mg/min, 7500 ppmv a 30 mg/min y 25000
ppmv a 100 mg/min.
Cuantificacin de la concentracin de
la toxina luego de la detoxificacin con gas
ozono
Se trabaj de la misma manera que para
el estudio de la capacidad de produccin de FB
por parte de los aislados. Posteriormente se
expuso el maz al gas ozono a concentraciones
y tiempos determinados, en la cmara
hermtica del equipo. Luego se procesaron las
muestras y se procedi a la cuantificacin de las
FB.
Tratamiento estadstico de los datos
Para analizar el efecto de los diferentes
tratamientos se realiz Anlisis de la Varianza
(ANOVA) y Contraste de Rangos Mltiple, con
un nivel de confianza de 95,0 %, utilizando el
software Statgraphics Plus, versin 5.1
(Statistical
Graphics
Corporation,
Warrenton,VA, USA).
Aislamiento e identificacin de cepas de
Fusarium proliferatum y F. verticillioides
Se obtuvieron 15 aislados del gnero
Fusarium, 5 pertenecieron a la especie F.
proliferatum var. proliferatum (Nirenberg y
ODonnell, 1998) (A1, A2, A3, A8 y A9) y 10
a F. verticillioides (Seifert et al., 2003) (A4,
A5, A6, A7, A10, A11, A12, A13, A14, A15).
Capacidad toxicognica de las cepas aisladas
Al realizar el ELISA con el kit para FB
RIDASCREENFAST
Fumonisin
(RBiopharm AG), se observ que de los 15
aislados obtenidos, solo 7 resultaron ser
productores de FB; 3 pertenecientes a la especie
036
F. proliferatum (A1, A2 y A3) y 4 a la especie
F. verticillioides (A4, A5, A6 y A7), indicando
la gran incidencia de estos mohos en maz y
silajes en la zona del litoral argentino (ciudad
de Santa Fe).
En el Cuadro 1 se pueden observar los
resultados obtenidos de los promedios de las 2
repeticiones realizadas (cada una por
duplicado). Los aislados N 8 al 15 no
produjeron FB por lo que no figuran en el
cuadro.
Cuadro1.- Concentracin de fumonisinas (FB)
por el mtodo de ELISA.
Aislado
Concentracin FB (ppm)
A1
10,42
A2
12,68
A3
10,80
A4
20,00
A5
15,95
A6
12,06
A7
16,69
Las concentraciones de FB producidas

por estos aislados se encontraron entre 10,42 y
20,00 ppm (mg/kg). Estos resultados
concuerdan parcialmente con datos publicados
por Mallmann y Dilkin (2007) en su libro,
sobre diferentes pases como Argentina,
Uruguay, Estados Unidos, Brasil y del
continente africano. Ellos observaron que de 64
muestras de alimentos y 50 de hbridos de maz
analizadas en Uruguay y Argentina,
respectivamente, el 50 % de las muestras de
alimentos estaban contaminadas con FB en
concentraciones de 0,005 a 6,34 ppm, mientras
que el 100 % de las muestras de hbridos de
maz tenan entre 0,18 a 27,05 ppm. Adems,
en el maz de Argentina encontraron
contaminaciones con FB en el orden de 0,04 a
9,95 ppm. Tambin el maz proveniente del sur
de frica presentaba concentraciones de FB

entre 44 y 83 ppm e incluso hasta 117 ppm. En
Estados Unidos las concentraciones de FB
estaban entre 7,20 y 8,85 ppm, y la presencia de
esta micotoxina en alimentos para cerdos y
caballos
haba
sido
detectada
en
concentraciones de 0,2 a 330 ppm. En Brasil la
mayor incidencia de contaminacin con FB en
cereales y otros alimentos se encontr en los
estados del sur. El porcentaje de muestras
positivas oscilaron entre el 50 y 90 %, y las
contaminaciones variaron entre 0,005 y 15
ppm, sin embargo, el valor medio fue inferior a
1 ppm, a pesar de que tambin se puedan
encontrar valores de contaminacin superiores
a 50 ppm de fumonisina B1.
Cuantificacin de la concentracin de la
toxina luego de la detoxificacin con gas
ozono
En las Figs. 1, 2, 3, 4, 5 y 6 se muestran
los resultados obtenidos en la cuantificacin de
la toxina para los aislados de F. proliferatum y
F. verticillioides luego de la exposicin a las
diferentes condiciones de gas ozono estudiadas.
El ANOVA pudo establecer que no
existieron diferencias significativas (p =
0,1268) para las concentraciones de ozono y los
tiempos ensayados, con un nivel de confianza
del 95,0 %.
El Contraste de Rangos Mltiples
permiti identificar 2 grupos homogneos. Los
aislados correspondientes a F. proliferatum
(A1, A2 y A3) formaron un grupo con medias
homogneas y F. verticillioides (A4, A5, A6 y
A7) constituyeron el otro grupo.
Al aumentar la concentracin de gas
ozono de 4500 ppmv a 25000 ppmv, no se
produjo una disminucin o eliminacin de la
toxina.
Al analizar los valores obtenidos de
concentracin de FB se pudo observar que hubo
pequeas variaciones en la concentracin de FB
a medida que se increment la concentracin de
gas ozono y el tiempo de exposicin al mismo
Frisn, Laura et al.
037
24,00
21,00
18,00
15,00
Control
12,00
4500 ppmv 10 min.

4500 ppmv 20 min.
9,00
6,00
3,00
0,00
A1
A2
A3
Aislados
Figura 1.- Concentracin de fumonisinas (FB) en aislados de F. proliferatum luego de exposicin a
gas ozono 4500 ppmv (10 y 20 minutos) y comparacin con el control.
24,00
21,00
18,00
15,00
Control
4500 ppmv 10 min.
12,00
4500 ppmv 20 min.
9,00
6,00
3,00
0,00
A4
A5
A6
A7
Aislados
Figura 2.- Concentracin de fumonisinas (FB) en aislados de F. verticillioides luego de exposicin a
038
Concentracin de FB (ppm)
18,00
15,00
12,00
Control
9,00
7500 ppmv 10 min.

7500 ppmv 20 min.
6,00
3,00
0,00
A1
A2
A3
Aislados
24,00
21,00
18,00
15,00
Control
7500 ppmv 10 min.
12,00
7500 ppmv 20 min.

9,00
6,00
3,00
0,00
A4
A5
A6
A7
Aislados
Frisn, Laura et al.
039
21,00
18,00
15,00
Control
12,00
25000 ppmv 10 min.

25000 ppmv 20 min
9,00
6,00
3,00
0,00
A1
A2
A3
Aislados
24,00
21,00
18,00
15,00
Control
25000 ppmv 10 min.
12,00
25000 ppmv 20 min.
9,00
6,00
3,00
0,00
A4
A5
A6
A7
Aislados
040
(entre 10 y 20 min). Debido a que no existi
produccin espontnea de FB por parte de los
aislados, estos pequeos aumentos podran
deberse al hecho de que el gas ozono es un
potente oxidante, y podra haber producido
interferencias con el kit comercial utilizado
para cuantificar las FB.
Existen estudios realizados para
aflatoxinas (AFLA); como los de Prudente y
King (2001), quienes mostraron que maz
contaminado (10-12 % en peso) y tratado con
ozono gas, a un caudal de 2 L/min durante 96 h,
redujo los niveles de AFLA de 0,586 ppb a
0,047 ppb. Akbas y Ozdemir (2006) lograron
disminuir las concentraciones de AFLA en
granos de pistachos en un 23-24 % utilizando
concentraciones de gas ozono de 9 ppm a
tiempos de exposicin de 420 min (a 20 C y 70
% de humedad relativa). Una reduccin en las
concentraciones de AFLA aproximadamente de
un 25-30 %, en man contaminado, luego de la
exposicin a ozono gas a concentraciones de 21
ppm (mg/L) durante un tiempo de exposicin
de 96 h, fue alcanzada por de Alencar et al.
(2012). Inan et al. (2007) observaron una
reduccin del 80 y 93 % de AFLA en pimientos
rojos (Capsicum annuum), con concentraciones
de ozono gas de 33 y 66 ppm (mg/L),
respectivamente, durante 60 minutos de
exposicin.
McKenzie et. al. (1997) estudiaron la
degradacin y detoxificacin de soluciones
acuosas de micotoxinas (aflatoxinas B1, B2, G1
y G2, cido ciclopiaznico, fumonisina B1,
ocratoxina A, patulina, cido secalnico y
zearalenona)
en presencia de altas
concentraciones de O3 (2 , 10 y 20 % en peso)
durante un perodo de 5 minutos y observaron
mediante la cuantificacin por HPLC que
aflatoxina B1 y G1 fueron degradadas
rpidamente usando 2 % de O3; mientras que
aflatoxina B2 y G2 eran ms resistentes a la
oxidacin requiriendo niveles mayores de O3
(20 %). Para el estudio de fumonisina B1
(despus de la reaccin con O 3), observaron que
esta toxina se degradaba rpidamente (15 s) con
la formacin de nuevos productos y destacaron

que la degradacin de fumonisina B1 no se
correlacionaba con la detoxificacin, ya que las
soluciones de esta toxina tratadas con O 3
presentaron valores positivos para 2 bioensayos
diferentes realizados.
Prevenir la contaminacin con estos
mohos en granos de maz y ensilados es la
mejor solucin para el problema de las
micotoxinas, ya que una vez que se produjo la
toxina es difcil de erradicar (Marn et al.,
2008).
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIN
Se aislaron 15 cepas de las especies

Fusarium
proliferatum
y
F.
verticillioides a partir de 40 muestras de
maz y 40 de ensilados.
De los 15 aislados estudiados, 7
resultaron
ser
productores
de
fumonisinas; 3 pertenecientes a F.
proliferatum y 4 a F. verticillioides.
La concentracin de fumonisinas para
todos los aislados productores, luego de
30 das a 28 C, se encontraba entre
10,42 y 20,00 ppm.
A las concentraciones y tiempos
ensayados de gas ozono, no se observ
la disminucin o eliminacin de la
concentracin de fumonisinas.
Prevenir la contaminacin con estos
mohos en granos de maz y ensilados es
la mejor solucin para el problema de
las micotoxinas, ya que una vez que se
produjo la toxina es difcil erradicarla.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la financiacin de
este trabajo a la Universidad Nacional del
Litoral, Santa Fe, Argentina, a travs del
Programa PICT Bicentenario y a su Director
Dr. Juan Carlos Baslico.
Frisn, Laura et al.

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RVCTA

Comunicacin
Efectos del pH, NaCl, CaCl2 y la temperatura sobre la fuerza de cuajo de

tres coagulantes/cuajos
Effects of pH, NaCl, CaCl2 and temperature on the rennet strength of three types of
coagulant/rennet
Osmar Thomas Morillo Pia1*, Pablo Jos Garca Lugo2, Balmore Ruizdael Guerrero2,
Carmen Amelia Borregales Torres3, Jos Gonzalo Barrios3
1
Fundacin Centro de Investigaciones del Estado para la Produccin Experimental Agroindustrial
(Fundacin CIEPE). Av. Principal, Zona Industrial Agustn Rivero, Municipio Independencia, San
Felipe, Estado Yaracuy, Venezuela.
2
Universidad de Los Andes (ULA), Facultad de Ciencias, Departamento de Biologa, Laboratorio de

Biotecnologa de Microorganismos Sixto David Rojo. Sector La Hechicera, Estado Mrida,
Venezuela.
Productora de Alimentos Universitaria Lcteos Santa Rosa de la Universidad de Los Andes (ULA).
Mrida, Estado Mrida, Venezuela.
*Autor para correspondencia: omorillo@ciepe.gob.ve, osmthom@yahoo.com
Resumen
El cuajo y los coagulantes juegan un papel fundamental en el proceso de elaboracin de queso y
su actividad se ve afectada por diversos parmetros tecnolgicos. En este sentido se determin el efecto
del pH, concentracin de NaCl, CaCl2 y de la temperatura sobre la fuerza de cuajo de un coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13), una quimosina recombinante comercial (Maxiren) y un cuajo
comercial de origen animal (BIOVEN), preparados a concentraciones de 0,05 g/mL; 0,0004 g/mL y
044
0,0008 g/mL, respectivamente. El efecto del pH fue evaluado en un intervalo de 5,0 a 7,5 y la
concentracin de NaCl y CaCl2 en la leche entre 0,02 y 0,16 M. El efecto de los iones de Na y Ca en las
soluciones enzimticas fue evaluado entre 0,04 y 0,80 M y la temperatura de incubacin entre 20 y 70
C. Se determin que los cambios de pH tienen un efecto inversamente proporcional sobre la actividad
coagulante de la leche y la mxima actividad fue a pH 5 para los tres coagulantes evaluados. La
concentracin de NaCl en la leche tuvo un efecto adverso sobre la actividad coagulante, mientras que el
incremento de la [CaCl2] aument la actividad alcanzando valores mximos a 0,04 M. La presencia
iones de Na en las soluciones enzimticas tuvo el mismo efecto observado en las pruebas de
concentracin de NaCl en la leche y se observ un aumento de la actividad relativa conforme se
increment la concentracin de iones de Ca en la solucin. Los tres coagulantes/cuajos evaluados
exhibieron la mxima fuerza de cuajo a 45 C y tuvieron una accin cataltica muy especfica sobre la
leche con una marcada dependencia a los parmetros evaluados, presentando algunas diferencias entre
ellos debido posiblemente a la fuente y forma de obtencin.
Palabras claves: asprtico proteasas, actividad cataltica, actividad coagulante de la leche, fuerza de
cuajo, quimosina.
Abstract
Rennet and coagulants play a fundamental role in the process of cheese making and its activity
is affected by various technological parameters. In this sense, the effect of pH, NaCl and CaCl2
concentration and temperature on the rennet strength of an experimental microbial coagulant (BIOMI13), a commercial recombinant chymosin (Maxiren) and commercial animal rennet (BIOVEN) was
determined, prepared at concentrations of 0.05 g/mL; 0.0004 g/mL and 0.0008 g/mL, respectively. The
effect of the pH was tested in a range from 5.0 to 7.5 and concentration of NaCl and CaCl2 in milk was
evaluated between 0.02 and 0.16 M. The effect of the Na and Ca ions in the enzyme solutions was
evaluated between from 0.04 and 0.80 M and incubation temperature between 20 and 70 C. It was
determined that changes in pH have an inverse effect on milk-clotting activity and maximum rennet
strength at pH 5 for the three coagulants evaluated. The concentration of NaCl in milk had an adverse
effect on milk-clotting activity, while increasing [CaCl2] increased relative activity peaking at
concentration of 0.04 M. The Na ions present in the enzyme solutions had the same effect observed in
the tests of NaCl concentration in milk and also was observed that increasing the Ca ions resulted in an
increase in relative activity. The three tested coagulant/rennet exhibited high rennet strength at 45 C
and had a very specific catalytic action on milk with a strong dependence on the parameters evaluated,
showing some differences between them possibly due to the source and method of production.
Keywords: aspartic proteases, catalytic activity, chymosin, milk-clotting activity, rennet strength.
INTRODUCCIN
El cuajo juega un papel fundamental en
el proceso de elaboracin de queso,
tradicionalmente es extrado del cuarto
estmago de los terneros entre 10 y 30 das de
nacidos, como mezclas de quimosina (88 a 94

%) y pepsina (6 a 12 %) (Ruiz-Rojas, 2005).
Est compuesto principalmente por la enzima
quimosina (EC 3.4.23.4), organizada por el
Comit de Nomenclatura de la Unin
Internacional de Bioqumica y Biologa
Morillo-Pia, Osmar et al.
Molecular en la clase hidrolasa (EC 3.),

subclase que acta sobre enlaces peptdicos
(peptidasa) (EC 3.4), sub-subclase asprtico
endopeptidasa (EC 3.4.23); la cual cataliza la
hidrlisis especfica de la -casena de la leche
en el enlace Ser-Phe105Met-Ala (NC-IUBMB,
2013), tiene un peso molecular de 35,6 kDa y
un punto isoelctrico de 4,65 (Mohanty et al.,
2003; Kaewphuak, 2011). Su accin hidroltica
es responsable de la desestabilizacin de los
agregados solubles dentro de la leche, dando
inicio a la agregacin de las micelas
desestabilizadas que forman una red
tridimensional que va endurecindose hasta dar
lugar al gel definitivo denominada cuajada
(Castillo-Zambudio, 2001).
La limitada disponibilidad de estmagos
de terneros para la fabricacin del cuajo, los
problemas asociados con el sacrificio de
animales (Jacob et al., 2011) y los altos precios
de este producto en el mercado (Merheb-Dini et
al., 2012), son algunas de las razones que han
generado problemas para satisfacer esta
demanda; por lo que ha sido necesaria la
introduccin de otros coagulantes como
sustitutos del tradicional cuajo de ternero,
especficamente asprtico proteasas similares a
la quimosina de ternero. Un adecuado sustituto
debe garantizar altos rendimientos en quesera y
productos con caractersticas sensoriales
aceptables, es decir, debe tener alta capacidad
de atacar el enlace peptdico Phe105Met106 de
-casena y una baja actividad proteoltica a pH
y temperatura de fabricacin del queso, adems
de poseer una termoestabilidad suficientemente
baja para asegurar productos de suero de leche
sin restos de coagulante activo. Se ha hecho
mucho nfasis en introducir coagulantes
provenientes de otros rumiantes extradas de
tejido del estmago de cordero (Moschopoulou
et al., 2007; Jacob et al., 2011), cabra, bfalo
(Kumar et al., 2006; Jacob et al., 2011), cerdo
(Houen et al., 1996), entre otros. Pero estos son
poco comercializados debido a que su uso est
dirigido a la elaboracin de variedades de
045
quesos tpicos como el Provolone o Valpadana

(Jacob et al., 2011); tambin estn los
coagulantes de origen vegetal (Ruiz-Rojas,
2005; Jacob et al., 2011), estos son menos
comercializados que los de origen animal,
debido a que la relacin entre la actividad
coagulante y la actividad proteoltica no es lo
suficientemente alta para su comercializacin,
adems de exhibir alta especificidad hacia la
casena caprina y ovina, limitando su uso a solo
aquellos quesos de regiones especficas del
mundo (Raposo y Domingos, 2008) como el
Serra da Estrela (Portugal) y Manchego
(Espaa)
elaborados
con
coagulantes
provenientes de especies de Cynara (Prados et
al., 2007; Jacob et al., 2011). Otros tipos de
coagulantes de leche utilizados como sustitutos
del cuajo, son aquellos provenientes de
microorganismos. Esto ha generado la
evaluacin de especies de hongos como el
Aspergillus versicolor (Abdel-Fattah y Saleh,
1988), Penicillium oxalicum (Hashem, 1999),
Rhizophus oryzae (Kumar et al., 2005), Mucor
circinelloides (Sathya et al., 2009), Mucor
mucedo DSM 809 (Yegin et al., 2010),
Thermomucor
indicae-seudaticae
N31
(Merheb-Dini et al., 2012) y Rhizomucor
nainitalensis (Khademi et al., 2013), entre
otros. La especies de bacterias del gnero
Bacillus tambin han sido objeto de estudios
(El-Bendary et al., 2007; Shieh et al., 2009; Wu
et al., 2013), su aptitud para quesera, acorde a
Ruiz-Rojas (2005), es mejor que la de las
enzimas vegetales, pero sensiblemente menos
satisfactoria que la de las enzimas producidas
por los hongos. Este autor afirma que dentro de
todos los microorganismos evaluados destacan
el Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus y
Cryphonectria parasitica, de los que son
extradas proteasas comercializadas por
distintas firmas a nivel mundial. La proteasas
de R. miehei son las ms utilizadas, dando
resultados satisfactorios. Fox y McSweeney
(1997) y Mistry (2012) han sealado que los
coagulantes provenientes de organismos
046
modificados genticamente tambin son

utilizados, dado que su uso permite obtener
productos similares a la quimosina de ternero,
estos han sido comercializados bajo las marcas:
Maxiren, secretada
por
Kluyveromyces
marxianus var. lactis (Gist-Brocades, Pases
Bajos); Chymogen (Chr. Hansen, Dinamarca) y
Chymostar
(Rhne-Poulenc;
ahora
por
Danisco), secretadas por Aspergillus niger var.
awamori; y Chy-max, secretada por
Escherichia coli K-12 (Pfizer, USA; ahora por
Chr. Hansen). El producto registrado bajo la
marca Marzyme GM por Novo Nordisk A/S
(Dinamarca), fue el resultado de expresar el gen
de proteasas de Rhizomucor miehei en
Aspergillus oryzae.
Las enzimas coagulantes de la leche
tienen una accin cataltica que vara entre los
tipos de coagulantes, en gran medida por la
fuente de obtencin, por lo que se han
propuesto diversos mtodos donde varan
fundamentalmente las condiciones de pH de la
leche y temperatura en que se realizan los
ensayos, sin embargo, todos ellos se basan en
determinar el tiempo que tarda la fase de
desestabilizacin de las micelas de casena, es
decir, tiempo desde el contacto de los
coagulantes con la leche hasta la aparicin de
los primeros cogulos de leche (inicio de la fase
de agregacin y formacin del gel o cuajada),
esto es lo que se conoce como fuerza de cuajo
(FC), es la medida indirecta de la accin
hidroltica de las asprtico proteasas sobre las
molculas de -casena. Independientemente
del origen, la FC se ve afectada por diversos
factores, tales como, la composicin qumica de
la leche principalmente por el contenido de
protena, esta vara entre las especies de
animales de origen. La fraccin de las protenas
que intervienen en la elaboracin de los quesos
pertenece al grupo de protenas insolubles
llamadas casena entera, formadas por casena, -casena, -casena y -casena, esta
ltima es la responsable de la formacin de
agregados solubles dentro de la leche, tiene la
forma de una partcula coloidal conformada por
casena agregada envuelta en una molcula de
-casena soluble (Park et al., 2007). Otras

caractersticas de la leche que afectan la accin
cataltica son la concentracin de fosfato
clcico coloidal (CCP), relacin Ca/(fosfato +
citrato), relacin Ca/nitrgeno, concentracin
de casena, dimensin de las micelas,
presencia/ausencia
de
mastitis
y
presencia/ausencia de calostros (CastilloZambudio, 2001). Adems de las caractersticas
fsico-qumicas de la leche, existen otros
factores que afectan la actividad cataltica de las
enzimas coagulantes, denominadas factores
tecnolgicos asociados al proceso de
elaboracin
de
queso:
temperatura,
concentracin, tipo de enzima, adicin de
cloruro de calcio (CaCl2), pH de la leche y la
concentracin de NaCl (Castillo-Zambudio,
2001; Awad, 2007). Estos factores pueden
modificar la cintica de la hidrolisis de las
enzimas coagulantes de la leche provocando
cambios en la firmeza del gel (textura de la
cuajada),
bajos
rendimientos,
pueden
intensificar la actividad proteoltica y disminuir
la especificidad originando la aparicin de
sabores extraos y en general caractersticas
sensoriales no deseadas en los quesos
(Cavalcanti et al., 2004; Kumar et al., 2006;
Awad, 2007). En este sentido es imprescindible
conocer el efecto de estos parmetros sobre la
fuerza de los cuajos y coagulantes empleados
en la elaboracin de quesos. Bajo esta premisa,
se presenta la evaluacin del efecto del pH,
concentracin de iones de Na+ y Ca2+ y de la
temperatura, sobre la fuerza de cuajo de los
coagulantes:
BIOMI-13,
microbiano
experimental producido por una cepa de
Rhizomucor spp.; Maxiren, microbiano
comercial
proveniente
de
organismos
modificados; y BIOVEN, un cuajo comercial
de origen animal.
MATERIALES Y MTODOS
Se utilizaron tubos de ensayo de
capacidad 12 mL, marca PYREX (Corning
Incorporated, Corning, NY, USA) y las
incubaciones se realizaron en un bao
termostatizado con agitacin marca Grant,

modelo GLS400 (Grant Instruments Ltd,
Shepreth, Cambridgeshire, UK).
Cuajo y coagulantes
Se utiliz un coagulante de leche
microbiano liofilizado producido por cultivo
sumergido de una cepa de Rhizomucor spp.
(BIOMI-13) de la coleccin de cultivos del
Laboratorio
de
Biotecnologa
de
Microorganismos Sixto David Rojo de la
Universidad de Los Andes (Estado Mrida,
Venezuela). Una quimosina recombinante
(coagulante
de
organismo
modificado)
comercial marca Maxiren, producida por
Kluyveromyces lactis (DSM Food Specialties
B.V. - Gist-Brocades) y un cuajo de origen
animal marca BIOVEN provisto por la
Productora de Alimentos Universitaria Lcteos
Santa Rosa de la Universidad de Los Andes
(Estado Mrida, Venezuela).
Se utiliz como sustrato leche
descremada DifcoTM Skim Milk (Becton,
Dickinson and Company, New Jersey, USA DifcoTM Laboratories, Inc., Michigan, USA) y
para la incorporacin de iones, cloruro de sodio
(NaCl) y cloruro de calcio (CaCl2) grado
analtico.
Preparacin de las soluciones de
cuajo y coagulantes
Se prepararon 3 soluciones enzimticas,
una a partir del coagulante microbiano
experimental BIOMI-13 a concentracin de
0,05 g/mL, una con el coagulante microbiano
comercial Maxiren a 0,0004 g/mL y otra con
el cuajo comercial de origen animal BIOVEN a
0,0008 g/mL, preparadas con agua destilada.
Las 3 concentraciones fueron seleccionadas en
funcin al tiempo de coagulacin, comprendido
entre 60 y 120 segundos, esto permiti obtener
registros precisos del tiempo de aparicin de los
primeros cogulos durante la determinacin de
la FC.
047
Determinacin de la fuerza de cuajo

La actividad coagulante de la leche, se
midi por el mtodo comentado por Osorio et
al. (2008); consisti en tomar el tiempo que
tarda en coagular una muestra de 5,0 mL de leche descremada (al 10 % en CaCl2 0,01 M) al
adicionarle 0,5 mL de sobrenadante del cultivo
proveniente de la fermentacin. Esta
determinacin se logra haciendo rotar de
manera manual las muestras en un bao de
mara a temperatura de 37 C. La lectura del
tiempo de coagulacin se hace justo cuando el
aspecto de la pelcula de leche sobre la pared
interna del tubo de ensayo cambia de fluido
laminar a viscoso formndose pequeos
grumos. La actividad enzimtica se expres
como la fuerza de cuajo (FC) definida como la
cantidad de leche cuajada en mililitros por
gramo o mililitro de sobrenadante del cultivo en
40 minutos a 37 C y se calcul mediante la Ec.
1:
Ecuacin (1)
Donde:
FC : fuerza de cuajo
V : cantidad de leche, mL
2400: tiempo en que normalmente cuaja la
leche a 37 C con un cuajo estndar, s.
C : cantidad de sobrenadante del cultivo, mL
t : tiempo de coagulacin de la muestra, s
Determinacin del efecto del pH,
concentraciones de iones de Na, Ca y la
temperatura
A cada solucin enzimtica se le
determin la fuerza de cuajo (FC) bajo
condiciones estndar del mtodo comentado
por Osorio et al. (2008) y bajo diferentes
valores de pH, concentraciones de iones de Na,
Ca y de temperatura en la leche. A continuacin
se describen las pruebas realizadas:
048
El efecto del pH de la leche fue

evaluado en un intervalo de 5,0 a 7,5. La leche
descremada fue preparada al 10 % y CaCl2 0,01
M en buffer de fosfato de sodio a 20 mM para
el intervalo de pH 5,0 - 5,5 y en buffer TrisHCL a 20 mM para el intervalo de pH 6 - 7,5.
Para evaluar el efecto de la
concentracin de iones de Na y Ca en la leche,
se prepar leche descremada al 10 % y CaCl2
0,01 M en agua destilada y adicionalmente se
agreg NaCl para obtener concentraciones de
0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12; 0,16 M y una
muestra sin Na. El CaCl2 fue agregado en las
mismas proporciones descritas para las pruebas
con Na; adicionalmente se prepar una muestra
sin Ca y otra con 0,01 M de concentracin.
Para determinar el efecto de los iones de
Na y Ca en las soluciones enzimticas, a cada
una de ellas se agreg NaCl para obtener
concentraciones de 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,24;
0,40 y 0,80 M. Para el CaCl2, las soluciones
fueron preparadas en el mismo orden de
concentraciones descritas para el Na.
Posteriormente, a cada solucin enzimtica
preparada se le determin la fuerza de cuajo.
En el caso de la temperatura, el efecto
fue determinado preparando muestras de leche
descremada al 10 % en una solucin de CaCl2
0,01 M. Cada determinacin de fuerza de cuajo
se realiz a diferentes temperaturas de
incubacin de la reaccin: 20, 25, 30, 37, 40,
45, 50, 60 y 70 C.
Expresin de los resultados
Los resultados fueron expresados en
trminos de la actividad relativa (AR), la cual
se estima segn la Ec. 2, tomando como
referencia la fuerza de cuajo determinada a 37
C segn el mtodo comentado por Osorio et al.
(2008).
Ecuacin (2):
AR
par
etro
odificado
todo sorio
Donde:
AR : actividad relativa expresada en porcentaje
FCparmetro modificado : fuerza de cuajo determinada
a la condicin a evaluar
FCmtodo Osorio : fuerza de cuajo determinada
segn el mtodo estndar comentado por
Osorio et al. (2008)
Cada determinacin de AR fue estimada
por triplicado y promediada para graficarla por
separado en funcin a las variables pH,
concentraciones de NaCl, CaCl2 y temperatura,
segn fue el caso.
Fuerza de cuajo (FC) bajo condiciones
estndar
En el Cuadro 1 se muestran los valores
de la fuerza de cuajo de cada solucin
enzimtica preparada a las concentraciones
descritas
en
la
metodologa.
Fueron
determinadas bajo las condiciones estndar del
mtodo seleccionado y servirn de referencia
para el clculo de la actividad relativa (AR)
bajo las dems condiciones de estudio.
Cuadro 1.- Actividad coagulante de las
soluciones enzimticas evaluadas.
Solucin enzimtica
cuajo/coagulante
FC D. S.
BIOMI-13
260,87 0,23
Maxiren
213,34 0,91
BIOVEN
195,95 0,50
FC: fuerza de cuajo. D. S.: desviacin estndar.
La actividad registrada por cada
solucin enzimtica est asociada a las
concentraciones a las que fueron preparadas,
debido a que permite tiempos de lectura
promedio de 122, 112,5 y 92 segundos de
tiempo de coagulacin para BIOVEN,

Maxiren y BIOMI-13, respectivamente.
Tiempo suficiente para las determinaciones de
la FC en las evaluaciones que se discuten a
continuacin.
Factores que afectan la actividad coagulante
de la leche en los cuajos
Efectos del pH
Se determin que los cambios de pH
tienen un efecto inversamente proporcional
sobre la actividad coagulante de la leche del
cuajo y coagulantes evaluados, tal como se
observa en la Fig. 1. La mayor sensibilidad a
los cambios de pH fue para el cuajo comercial
de origen animal (BIOVEN), que registr una
AR de 225 % a pH 5 y de 36,1 % a pH 7,5.
049
Mientras que el menor efecto se observ sobre

el coagulante microbiano experimental BIOMI13, alcanzando 165,79 % a pH 5,0;
descendiendo proporcionalmente hasta registrar
54,99 % de la AR a pH 7,5. El coagulante
microbiano comercial Maxiren, registr
valores similares al microbiano experimental
(BIOMI-13).
Foda et al. (2012) observaron que a pH
mayores a 5, la actividad de coagulacin de la
leche expresada como actividad relativa (AR)
de enzimas producidas por Rhizomucor miehei
NRRL 2034 bajo fermentacin en estado
slido, disminuy hasta alcanzar 40 % a pH 7.
En la coagulacin de la leche, entre tipos de
cuajos y coagulantes, la dependencia del pH de
las enzimas empleadas es diferente (Harboe et
al., 2010).
Figura 1.- Efectos del pH sobre la fuerza de cuajo de los coagulantes Maxiren, BIOVEN y
BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al 10 % y [CaCl2] de 0,01 M, incubadas a
37 C.
Efectos de la concentracin de NaCl y
CaCl2 en la leche
La concentracin de iones de sodio en la
leche tuvo un efecto adverso sobre la actividad
coagulante de la leche (Fig. 2), fue

inversamente proporcional a la concentracin
de NaCl en la leche, disminuyendo hasta
valores de 60 % de AR para el coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13) y 40 %
050
Figura 2.- Efectos de la [NaCl] en la leche sobre la fuerza de cuajo de los coagulantes Maxiren,
BIOVEN y BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al 10 % y [CaCl2] de 0,01
M, incubadas a 37 C.
para los comerciales (Maxiren y BIOVEN) a

concentracin de 0,16 M.
Inhibicin progresiva de la AR por
incremento de la concentracin de NaCl, desde
% (a concentracin de 3 % de NaCl)
hasta
% (a concentraciones de 9 hasta 12
% de NaCl) fue estimada por Foda et al. (2012)
para enzimas producidas por R. miehei NRRL
2034. Harboe et al. (2010) sostienen que la
adicin de NaCl se limita a < 0,5 g/100 g; ya
que aumenta la formacin de cuajada, mientras
que a concentraciones mayores tiene un efecto
contrario. Por otra parte, la sensibilidad de las
enzimas de coagulacin de la leche de varias
fuentes al NaCl no es la misma (Foda et al.,
2012). Ramet (2001) describe que el efecto del
NaCl en leche de vaca no es el mismo en
presencia de diferentes tipos de enzimas de
coagulacin de la leche y agrega que, en leche
de Camelus dromedarius, la pepsina bovina
parece ser menos sensible al NaCl que el cuajo
de
ternera,
particularmente
a
altas
concentraciones de la sal.
En la Fig. 3 se observa el aumento en la
FC al incrementar el contenido CaCl2 en la

leche, alcanzando valores mximos de AR de
310 % para BIOVEN y 264 % para Maxiren a
concentracin de 0,04 M. El coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13) solo
alcanz una actividad relativa mxima de 140
%, a la misma concentracin, mostrando menor
sensibilidad
al
incremento
de
las
concentraciones de Ca en la leche. En las
muestras de leche sin adicin de calcio, se
observ una baja significativa en la FC de
ambos coagulantes comerciales (Maxiren y
BIOVEN), mientras que el coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13) no
mostr una dependencia tan marcada.
Similar comportamiento al de la Fig. 3
fue apreciado por Foda et al. (2012), quienes
mostraron que la AR fue mayor con la adicin
de CaCl2 a concentracin de 0,05 M; y que,
mayores concentraciones resultaron en una
marcada disminucin en la actividad de
coagulacin de la leche, la cual se redujo a 37,5
% a concentracin 0,2 M de CaCl2. Asimismo,
incrementos de las concentraciones de CaCl2 de
051
Figura 3.- Efectos de la [CaCl2] en la leche sobre la fuerza de cuajo de los coagulantes Maxiren,
BIOVEN y BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al 10 % e incubadas a 37 C.
10 a 50 mM produjeron incrementos de la
actividad de coagulacin de la leche, cuando
fue utilizada una proteasa extrada de flores de
Scolymus maculatus en leche descremada
(Benchiheub et al., 2014).
Es conocido que el Ca+2 combinado con
la -casena forma firmes cogulos durante la
segunda fase del proceso de coagulacin. La
adicin de CaCl2 durante la coagulacin de la
leche reduce el tiempo e incrementa la tasa de
coagulacin (El-Bendary et al., 2007;
Mohamed et al., 1988 y Balcones et al., 1996
cp Ahmed y Helmy, 2012).
Efectos de la concentracin de NaCl y
CaCl2 en las soluciones enzimticas
La presencia iones de sodio en las
soluciones enzimticas tuvo el mismo efecto
adverso sobre la actividad coagulante de la
leche (Fig. 4) describiendo la misma tendencia
que la observada en las pruebas de
concentracin de Na en la leche; sin embargo,
el coagulante microbiano comercial Maxiren
present menor sensibilidad a los niveles de Na
en las solucin enzimtica en comparacin con
el cuajo comercial de origen animal BIOVEN,

contrario a lo ocurrido en las pruebas de leche.
En la Fig. 5 se observa el aumento de la
actividad relativa conforme se increment la
concentracin de CaCl2 en las soluciones
enzimticas, sin embargo, los valores mximos
alcanzados por los coagulantes comerciales
(Maxiren y BIOVEN) estuvieron por debajo
de los obtenidos en las prueba de Ca en leche,
en especial para el Maxiren que solo alcanz
5 % de AR, ientras que a concentraciones
de 0,80 M, la AR del cuajo comercial BIOVEN
fue inhibida casi en totalidad.
En el caso del coagulante microbiano
experimental (BIOMI-13), mostr un aumento
de la actividad por encima de los comerciales y
mayor que el registrado en las pruebas de Ca en
leche, alcanzando aproximadamente una AR de
250 % a concentraciones en el intervalo 0,40 M
- 0,80 M.
Estos resultados podran sugerir que la
presencia de Ca en las soluciones enzimticas
induce algn tipo de modificaciones en las
enzimas coagulantes contenidas en el cuajo
microbiano que podra ser de tipo estructural o
de modificaciones en el sitio activo.
052
Figura 4.- Efectos de la [NaCl] en las soluciones enzimticas sobre la fuerza de cuajo de los
coagulantes Maxiren, BIOVEN y BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al
10 % y [CaCl2] de 0,01 M, incubadas a 37 C.
Figura 5.- Efectos de la [CaCl2] en las soluciones enzimticas sobre la fuerza de cuajo de los
coagulantes Maxiren, BIOVEN y BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al
10 % y [CaCl2] de 0,01 M, incubadas a 37 C.
Ahmed y Helmy (2012) evaluaron el

efecto de los iones Mn+2, Ca+2, Mg+2, Zn+2, Fe+2
y Cu+2, en las preparaciones enzimticas de
coagulantes
provenientes
de
Bacillus
licheniformis y Aloe variegata, demostrando
que el Mn+2, Ca+2, Zn+2 y el Fe+2 tuvieron un
efecto activador sobre ambos coagulantes. Un
estudio similar fue publicado por El-Tanboly et
al. (2013), donde demostraron que al aumentar
las concentraciones de iones de Ca durante la
coagulacin de la leche (mezcla de reaccin)
con una enzima de Mucor pusillus QM 436
increment la actividad coagulante, al igual que
el Mg+2 y el Fe+3, mientras los iones Mn+2 y
Zn+2 no tuvieron un efecto significativo sobre el
mencionado coagulante.
Efectos de la
incubacin (coagulacin)
temperatura
de
De acuerdo al grfico de la Fig. 6, los 3

coagulantes evaluados exhibieron la mxima
AR a 45 C (160 % para Maxiren y BIOVEN
y 200 % para BIOMI-13). El coagulante
053
microbiano experimental BIOMI-13 conserv

ms del 50 % de la actividad a temperatura de
70 C y los 2 comerciales fueron casi
totalmente inhibidos.
Foda et al. (2012) para un coagulante
producido por Rhizomucor miehei, observaron
incremento progresivo de la actividad
coagulante de la leche al aumentar la
temperatura de incubacin, alcanzando la
mxima AR a 60 C, resultado mayor a los
obtenidos para los coagulantes evaluados en
este trabajo. Entre tipos de coagulantes, algunos
no influyen significativamente en la protelisis
secundaria (Sheehan et al., 2004), coagulantes
en la produccin de quesos donde la
gelificacin tiene lugar a baja temperatura,
mientras que a temperaturas ms altas puede
ocurrir
protelisis
excesiva
afectando
negativamente la textura y el sabor de los
quesos
(Esteves
et
al.,
2003).
La
termoestabilidad del coagulante microbiano
experimental (BIOMI-13) implica posibles
problemas por efecto de protelisis secundarias
en quesos en etapa de maduracin.
Figura 6.- Efectos de la temperatura de incubacin sobre la fuerza de cuajo de los coagulantes
Maxiren, BIOVEN y BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al 10 % y
[CaCl2] de 0,01 M.
054
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIN
El cuajo y coagulantes evaluados

tuvieron una accin cataltica muy
especfica sobre la leche con una
marcada
dependencia
al
pH,
concentraciones de iones de Na, Ca y
temperaturas como era de esperarse,
presentando algunas diferencias entre
ellos debido posiblemente a la fuente y
forma de obtencin.
El cuajo comercial de origen animal
(BIOVEN) y el coagulante microbiano
comercial (Maxiren) mostraron mayor
sensibilidad a los cambios de los
parmetros evaluados y similitud entre
ellos, excepto en el pH, donde
Maxiren registr valores similares al
coagulante microbiano experimental
(BIOMI-13)
y
ambos
menor
sensibilidad.
El coagulante microbiano experimental
(BIOMI-13)
present
mayor
sensibilidad a la presencia de Ca en
solucin y mayor estabilidad trmica.
Es necesario evaluar con ensayos de
mayor amplitud para el coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13),
los efectos del Ca en la solucin
enzimtica y de estabilidad trmica
observados.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Fundacin
CIEPE (Estado Yaracuy, Venezuela), al
Laboratorio
de
Biotecnologa
de
Microorganismos Sixto David Rojo de la
Universidad de Los Andes (ULA) y a la
Productora de Alimentos Universitaria Lcteos
Santa Rosa de la ULA (Estado Mrida,
Venezuela) por el apoyo brindado durante la
ejecucin de este trabajo.
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RVCTA

Comunicacin
Efecto del sistema glucosa oxidasa/glucosa sobre el crecimiento de

Escherichia coli ATCC 25922 en leche
Effect of glucose oxidase/glucose system on the growth of
Escherichia coli ATCC 25922 in milk
Nirza Noguera1 *, Ana Hernndez2, Aldair Jimnez2 , Dayana Requena1 ,
Ninoska Ramrez1, Luis Ojeda1
1
Instituto de Investigaciones Biomdicas Dr. Francisco J. Triana Alonso, Universidad de Carabobo.

Avenida Las Delicias, Maracay, Estado Aragua, Venezuela.
2
Universidad de Carabobo, Facultad de Ciencias de la Salud, Sede Aragua, Escuela de Bioanlisis

Omaira Figueroa. Estado Aragua, Venezuela.
*Autora para correspondencia: nnoguera1@uc.edu.ve
Aceptado 13-Julio-2014
Resumen
La leche es uno de los alimentos de mayor importancia por ser rico en nutrientes y porque
constituye la materia prima para la elaboracin de una amplia gama de productos. Se ha demostrado
que en leches pasteurizadas de marcas comerciales, pueden ocurrir contaminaciones postproceso, lo
que representa un riesgo para la salud pblica. Es por ello que en las ltimas dcadas, ha ganado
importancia el uso de aditivos sintticos u orgnicos como tcnica complementaria durante el
procesamiento de alimentos. La enzima glucosa oxidasa (GOX) tiene amplio uso en la industria de
alimentos gracias a sus propiedades antioxidante y antimicrobiana. Adicionalmente, se ha demostrado
su capacidad de inhibir el crecimiento de diferentes enterobacterias. Por tal motivo, en el presente
trabajo se plante adicionar la enzima GOX en la leche y evaluar su efecto sobre el crecimiento de una
cepa de Escherichia coli ATCC 25922. Se estandariz la concentracin de GOX y glucosa que
ocasionaba la inhibicin del crecimiento bacteriano en medio Luria-Bertani y en funcin de los
058
resultados, se decidi utilizar la combinacin de 2 U de GOX y 2,0 % de glucosa para agregarlos como
aditivos en la leche y se establecieron dos sistemas: GOX/G sin pasteurizar y GOX/G pasteurizado. El
crecimiento fue monitoreado por la tcnica de contaje de colonias en placa-agar, a partir de 1 mL de
cultivo a las 4, 6 y 24 h de incubacin. Se encontr que los sistemas con GOX hasta las 6 horas
presentaron efectos similares, inhibiendo significativamente el crecimiento de la bacteria, mientras que
a las 24 h ya no se observ dicha inhibicin, pero s que el sistema con GOX pasteurizada exhibi una
poblacin menor que el sistema GOX sin pasteurizar. Estos hallazgos proyectan a la enzima GOX
como una alternativa para la conservacin de la leche, tanto cruda como pasteurizada.
Palabras claves: Escherichia coli, glucosa oxidasa, leche, pasteurizacin.
Abstract
Milk is one of the most important foods to be rich in nutrients and that is the raw material for
the manufacture of a wide range of products. It has been shown that pasteurized milks trademarks, may
have post-processing contamination, which poses a risk to public health. That is why in recent decades
has gained importance the use of synthetic or organic additives as a complementary technique during
food processing. Glucose oxidase (GOX) enzyme has wide application in the food industry due to its
antioxidant and antimicrobial properties. Additionally, it has demonstrated its ability to inhibit the
growth of different enterobacteria. Therefore, this work proposed adding the enzyme GOX in milk and
evaluates its effect on the growth of a strain of Escherichia coli ATCC 25922. The GOX and glucose
concentration that caused inhibition of bacterial growth in Luria-Bertani medium was standardized and
depending on the results, it was decided to use the combination of 2 U of GOX and 2.0 % glucose as
additives to add in the milk and two systems were developed: GOX/G unpasteurized and pasteurized
GOX/G. Growth was monitored by the technique of colony counting on agar plate, starting from 1 mL
of culture at 4, 6 and 24 h of incubation. It was found that systems with GOX to 6 hours had similar
effects, significantly inhibit the growth of bacteria, while at 24 hours, this inhibition was not observed,
but the system pasteurized GOX exhibited a smaller population than the GOX system unpasteurized.
These findings GOX enzyme projected as an alternative to the preservation of milk, both raw and
pasteurized.
Key words: Escherichia coli, glucose oxidase, milk, pasteurization.
INTRODUCCIN
Por su aporte nutricional, la leche es uno
de los alimentos de mayor importancia en
muchos pases del mundo (Celis y Jurez,
2009). Adems de ser un alimento rico en
nutrientes, constituye la materia prima para la
elaboracin de una amplia gama de productos
(Daz, 2000). No obstante, es un alimento
altamente perecedero, por lo que debe ser
manejado de manera adecuada. Las condiciones

de higiene y sanidad de las explotaciones
lecheras, as como a nivel de las industrias
procesadoras, deben ser ptimas para garantizar
la calidad microbiolgica de este alimento
(Valbuena et al., 2004; Celis y Jurez, 2009).
En Venezuela, la norma 798:1994 de la
Comisin Venezolana de Normas Industriales
(COVENIN), define la leche pasteurizada como
la leche cruda homogeneizada o no, que ha
Noguera, Nirza et al.

sido sometida a un proceso trmico aprobado
por la autoridad competente, en condiciones
tales que garanticen la destruccin de
microorganismos patgenos y la casi totalidad
de los microorganismos banales que pudiesen
estar presentes, sin que se alteren sensiblemente
las caractersticas organolpticas y fsicoqumicas de la misma. (COVENIN, 1994).
Esto implica que el proceso de pasteurizacin
debera mejorar la calidad microbiolgica de la
leche cruda, lo que contribuira a alargar su vida
de anaquel y minimizar riesgos de
enfermedades de transmisin alimentarias. Sin
embargo, hallazgos como los realizados por
Valbuena et al. (2004) y Luigi et al. (2013), en
leches pasteurizadas de marcas comerciales,
demostraron
que
pueden
ocurrir
contaminaciones postproceso, probablemente
por aplicacin deficiente de buenas prcticas de
procesamiento, limpieza y saneamiento de las
plantas procesadoras. En el estudio conducido
por Valbuena et al. (2004) en Maracaibo
(Estado Zulia, Venezuela), se encontr que el
50,93 % de las muestras analizadas de 5 marcas
de leche pasteurizada tenan niveles de
coliformes totales mayores al valor mximo de
1,0x102 UFC/mL, utilizado como referencia
para comparacin en el estudio. En la
investigacin realizada por Luigi et al. (2013)
en el Municipio Valencia del Estado Carabobo
(Venezuela), se obtuvo que el 45 % de las
muestras analizadas presentaron contajes de
coliformes totales elevados que superaron el
recuento de 1,0x10 2 UFC/mL. Adems,
realizaron la determinacin de coliformes
fecales y encontraron que el 72 % de las
muestras estaban por encima de lo permitido (3
UFC/mL). Dentro de las enterobacterias
aisladas en algunas muestras destacan:
Enterobacter cloacae (38 %), Escherichia coli
(45 %), Klebsiella pneumoniae (27 %),
Pseudomonas
aeruginosa
(10
%)
y
Pseudomonas putida (7 %).
Estos problemas de contaminacin a
nivel de la industria alimentaria representan no
059
solo un riesgo importante para la salud, sino

tambin un riesgo significativo desde el punto
de vista econmico. La produccin industrial de
alimentos es un proceso que se desarrolla a gran
escala, razn por la cual las consecuencias de
prdidas por contaminacin microbiana son
altamente costosas (Orber-Ratn, 2004). Es
por ello, que en las ltimas dcadas la
alternativa
de
combinar
tcnicas
de
conservacin durante el procesamiento de
muchos alimentos, ha ganado importancia. En
este sentido, los aditivos sintticos y orgnicos
con actividad antimicrobiana se estn
implementando como tcnica complementaria
para extender la vida til de los alimentos. En
especial, los aditivos orgnicos o de origen
natural, dadas las ventajas que tienen frente a
los sintticos, tal como lo destaca RodrguezSauceda (2011).
Dentro de este grupo de aditivos
orgnicos, las enzimas han tenido una gran
aceptacin. La enzima peroxidasa (EC
1.11.1.7), tambin llamada lactoperoxidasa
(NC-IUBMB, 2011), es empleada a nivel de la
leche cruda, como un conservante natural
recomendado por la Organizacin de las
Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentacin (FAO), considerado seguro
cuando se usa en correspondencia con las
directrices del Codex (FAO/WHO, 2006). La
enzima cataliza la oxidacin de los iones de
tiocianato en presencia del perxido de
hidrgeno. Esta reaccin convierte el tiocianato
en cido hipotiocianoso (HOSCN) que al pH de
la leche, se disocia en forma de iones de
hipotiocionato (OSCN-) los cuales reaccionan
con los grupos de sulfhidrilos libres,
inactivando as varias enzimas vitales para el
metabolismo de la clula bacteriana, lo que a su
vez imposibilita su reproduccin. Como las
protenas de la leche contienen muy pocos
grupos de sulfhidrilos y los que se hallan
presentes son relativamente inaccesibles al
OSCN- (enmascarado), la reaccin de este
compuesto en la leche es bastante especfica y
060
combate las bacterias presentes en la leche. El
efecto
antibacteriano
del
sistema
lactoperoxidasa/tiocianato/perxido
de
hidrgeno depende de la especie y la cepa.
Cuando la leche cruda tiene una flora mixta en
la que predominan las bacterias mesfilas, el
efecto
es
bacteriosttico,
(es
decir,
principalmente inhibidor). En presencia de
algunas bacterias Gram-negativas, por ejemplo,
Pseudomonas o Escherichia coli, el efecto es
bactericida (FAO/OMS, 1991). Este sistema es
recomendado cuando no existe posibilidad de
refrigerar la leche cruda previo a su
procesamiento, ya que puede mantener la
calidad microbiolgica inicial de la misma por
8 horas sin refrigeracin. La activacin de este
sistema previo al proceso de pasteurizacin es
beneficioso, puesto que incrementa la eficiencia
del tratamiento trmico, eliminando la
contaminacin por bacterias coliformes y
termorresistentes post-tratamiento (Ponce,
2010).
La glucosa oxidasa (GOX) (EC 1.1.3.4)
es una flavoprotena (NC-IUBMB, 1961) que
cataliza la oxidacin de la -D-glucosa hacia
cido glucnico y perxido de hidrgeno,
usando el oxgeno molecular como aceptor final
de electrones (Hatzinikolaou et al., 1996;
Pluschkell et al., 1996; Fiedurek y Gromada,
2000). Es producida comercialmente a partir de
los gneros Aspergillus y Penicillium, siendo A.
niger la especie usada con mayor frecuencia
para este fin (Hatzinikolaou y Macris, 1995;
Wong et al., 2008). La enzima GOX ha
demostrado su capacidad de suprimir o inhibir
el crecimiento de especies como Pseudomonas
fragi en caldo nutritivo y medio de extracto de
pescado (Yoo y Rand, 1995); Staphylococcus
aureus, Salmonella infantis, Clostridium
perfringens, Bacillus cereus, Campylobacter
jejuni, Listeria monocytogenes y Yersinia
enterocolitica en medio de carne cruda y
desnaturalizada con calor (Tiina y Sandholm,
1989); Escherichia coli y Salmonella derby en
caldo nutritivo (Massa et al., 2001). Este efecto
antimicrobiano, ha sido asociado a los

productos de la reaccin que la enzima cataliza.
Especficamente, el perxido de hidrgeno es
capaz de oxidar los grupos sulfhidrilos de las
enzimas bacterianas, formando puentes
disulfuro
lo
que
genera
cambios
conformacionales, prdida de funcionalidad y
muerte celular (Rojas-Valencia et al., 2008;
Tormo-Maicas y Julin-Rochina, 2009).
En consecuencia, como los principales
microorganismos
responsables
de
la
contaminacin de la leche son enterobacterias y
est demostrado el potencial que tiene la GOX
para inhibir su crecimiento, se plante en el
presente trabajo adicionar la enzima en la leche
y evaluar su efecto sobre el crecimiento de una
poblacin bacteriana definida de Escherichia
coli ATCC 25922.
MATERIALES Y MTODOS
Materiales biolgicos
Microorganismo y medio de cultivo
Se trabaj con la cepa Escherichia coli
ATCC 25922, certificada por el Instituto
Nacional de Higiene Rafael Rangel (Caracas,
Venezuela).
El medio Luria-Bertani (LB) se us
como medio estndar para el cultivo de la cepa,
compuesto por: triptona 10 g/L, extracto de
levadura 5 g/L y NaCl 10 g/L; para ajustar el
pH a 7,0 se utiliz NaOH 1,0 N. Los
componentes fueron mezclados en solucin y
sometidos a esterilizacin hmeda en un
autoclave Market Forge, Sterilmatic (Market
Forge Industries, Inc., Burlington, VT, USA) a
121 C, 15 psi, previo a su uso.
Enzima glucosa oxidasa (GOX)
Se utiliz GOX comercial Sigma
G6641, de 10.000 U, lote 070K38131 (SigmaAldrich Co. LLC., Saint Louis, MO, USA), a

partir de la cual se prepar una solucin madre
de 1000 U/mL, almacenada a -20 C en un
congelador horizontal marca FRIGIDAIRE.
Leche
Se trabaj con leche completa
pasteurizada de marca comercial, producida por
Lcteos Los Andes, C. A. (Venezuela).
Muestras de 250 mL de esta leche fueron
sometidas a esterilizacin hmeda a 121 C, 15
psi, en autoclave Market Forge, Sterilmatic
(Market Forge Industries, Inc., USA); para
garantizar una poblacin bacteriana definida
durante la ejecucin de los experimentos.
Procedimientos
Estandarizacin de la concentracin
de glucosa oxidasa (GOX) y glucosa que
afectan el crecimiento de la cepa E. coli
ATCC 25922 en medio Luria-Bertani (LB)
El primer experimento consisti en
estandarizar la concentracin de enzima GOX y
de glucosa, capaces de ejercer el mayor retraso
en el crecimiento de la cepa E. coli ATCC
25922. Para ello, se hizo crecer el mencionado
microorganismo en medio LB con adicin de
diferentes concentraciones de la enzima y de su
sustrato, siguiendo un procedimiento similar al
realizado por Tiina y Sandholm (1989), Yoo y
Rand (1995) y Massa et al. (2001). Se escogi
el medio LB como medio de referencia para el
crecimiento de la bacteria, puesto que estudios
previos han demostrado que es ptimo para el
crecimiento de muchas especies bacterianas,
entre ellas E. coli (Sezonov et al., 2007); por lo
que la incorporacin de algn aditivo que afecte
negativamente su crecimiento resultara
evidente. La enzima GOX se us en
concentraciones de 0,5; 1 y 2 U/mL similares a
las utilizadas por Yoo y Rand (1995) y Massa
et al. (2001). Las unidades de actividad
enzimtica del extracto se determinaron por el
061
mtodo colorimtrico descrito por Trinder

(1969), con la sustitucin de la o-dianisidina
por 3,3,5,5-tetrametilbenzidina (TMB), tal
como lo describi Ojeda et al. (2011). En el
caso de la glucosa a razn de 0,5; 1,0 y 2,0 %;
tomando como referencia los valores a los
cuales Yoo y Rand (1995) y Massa et al. (2001)
encontraron la mejor respuesta de inhibicin o
retardo del crecimiento, correspondientes a 8,0
y 16,0 mg/mL (equivalentes a 0,8 y 1,6 %) para
P. fragi y 4,0 mg/mL (equivalente a 0,4 %) para
E. coli, respectivamente. Sobre esta base, se
disearon 9 tratamientos (Cuadro 1) y fueron
comparados con un control (bacteria inoculada
en medio LB estndar sin aditivos).
Para el desarrollo del ensayo se usaron
10 fiolas de 125 mL de capacidad, con 25 mL
de medio correspondientes a los tratamientos y
control, las cuales fueron inoculados con 400
L de un pre-inculo equivalente a una carga
promedio de 4,5x104 UFC/mL 0,5x104
UFC/mL. Se incubaron a 37 C bajo agitacin
continua a 200 rpm durante 300 min, en un
incubador
New
Brunswick
Scientific,
Controlled Environment Incubator Shaker
(New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison,
New Jersey, USA). El crecimiento fue
monitoreado por el cambio de turbidez a 600
nm, en un espectrofotmetro BECKMAN,
modelo DU 650 (Beckman Instruments, Inc.
Fullerton, CA, USA), mediante la toma de
muestras de 1 mL a intervalos de tiempo de 60
min y transformados a UFC/mL. El ensayo se
repiti 3 veces, bajo un arreglo completamente
al azar.
Efecto
del
sistema
glucosa
oxidasa/glucosa
(GOX/G)
sobre
el
crecimiento de la cepa E. coli ATCC 25922
en leche
El segundo experimento se dise para
evaluar el efecto que el sistema GOX/G tuvo
sobre una poblacin definida de la cepa E. coli
ATCC 25922 crecida en leche, antes y despus
062
Cuadro 1.- Tratamientos formulados para la estandarizacin de las concentraciones de glucosa
oxidasa (GOX) y glucosa capaces de incidir sobre el crecimiento de la cepa E. coli
ATCC 25922 en medio Luria-Bertani (LB).
Tratamientos
Volumen de solucin enzimtica y cantidad

de glucosa adicionada a 25 mL de medio LB
1. GOX 0,5 U/glucosa 0,5 %
12,5 L de enzima y 0,125 g de glucosa
4. GOX 1 U/glucosa 0,5 %
25 L de enzima y 0,125 g de glucosa
de ser sometido a un proceso trmico tpico

usado en la industria lctea. Para establecer las
condiciones de pasteurizacin, se tomaron en
consideracin los hallazgos obtenidos por
Noguera et al. (2013), quienes encontraron que
la menor prdida de actividad ocurra en el
proceso con la menor temperatura y el mayor
tiempo, especficamente a 63 C por 30 min,
tambin conocida como pasteurizacin lenta
(LTLT, low temperatura long time).
El primer paso fue someter la leche
pasteurizada comercial a un proceso de
esterilizacin en autoclave Market Forge,
Sterilmatic (Market Forge Industries, Inc.,
USA) a 121 C, 15 psi, previo a su uso, a fin de
garantizar que los resultados correspondieran a
la poblacin y especie bacteriana en estudio. La
enzima fue pasteurizada en un incubador de
bloque seco (Dry-block Thermostat, Cat. #
SLTDB-120) de Seoulin Bioscience (Seoulin
Bioscience Co., Ltd., Corea del Sur) a 63 C por
30 min. Las unidades de muestra se
constituyeron en fiolas con 25 mL de leche
estril. Se establecieron 2 tratamientos: 1)
L/GOX/G, constituido de leche inoculada con

la bacteria, GOX y glucosa como aditivos; 2)
L/GOXp/G, constituido de leche inoculada con
la bacteria, GOX pasteurizada y glucosa como
aditivos. Los controles del ensayo fueron:
Control I, leche inoculada con la bacteria;
Control II, leche inoculada y glucosa como
aditivo.
Para la inoculacin, similar a lo
explicado en el ensayo anterior, se realiz un
pre-inculo de la bacteria en medio LB durante
24 h y a partir de este se tomaron volmenes de
400 50 L para incorporarlos en las unidades
de muestra. La incubacin se hizo a 37 C bajo
agitacin continua a 200 rpm durante 24 h, en
incubador
New
Brunswick
Scientific,
Controlled Environment Incubator Shaker
(New Brunswick Scientific Co., Inc., USA). El
crecimiento fue monitoreado por la tcnica de
contaje de colonia en placa-agar. Para ello, se
tomaron muestras de 1 mL a las 4, 6 y 24 h de
incubacin, las cuales fueron diluidas de
manera seriada e inoculadas en placas de agar
medio LB y colocadas en estufa Labnet, modelo

211DS (Labnet International, Inc., Edison, NJ,
USA) a 37 C durante 24 h, para luego realizar
el contaje de las colonias. Tambin se midi el
pH de las muestras en un pHmetro dual de IQ
Scientific Instruments, Inc. (Carlsbad, CA,
USA), con el fin de determinar la acidificacin
del alimento. Este ensayo se hizo bajo un
diseo completamente al azar con 4
repeticiones.
Los resultados se expresaron en funcin
de un ndice de crecimiento calculado como la
expresin matemtica que cuantifica el nmero
de veces que E. coli fue capaz de multiplicarse
en el tiempo, con respecto a su poblacin
inicial. Para determinarlo se dividi el nmero
de colonias cuantificadas para un tiempo
determinado (4, 6 y 24 h) entre el nmero de
colonias cuantificadas para el tiempo cero. Este
ndice se utiliz con la finalidad de
homogeneizar los resultados de las repeticiones
realizadas del ensayo y poder analizar con
mayor
objetividad
y
exactitud
el
comportamiento observado.
Anlisis estadstico
El anlisis estadstico de los datos se
hizo con el programa Microsoft Office Excel,
versin 2007 (Microsoft Corporation,
Redmond, WA, USA) para calcular medias,
desviaciones estndares, ndices de crecimiento,
construir curvas de crecimiento y realizar el
anlisis de varianza.
Concentraciones de glucosa oxidasa (GOX) y
glucosa capaces de retardar el crecimiento
de la cepa en estudio
Las clulas de E. coli ATCC 25922
inoculadas en medio LB con adicin del
sistema GOX/G, exhibieron crecimientos y
poblaciones finales distintas dependiendo de la
concentracin de enzima y glucosa incorporadas.
063
En la Fig. 1, se puede observar que la adicin

de 0,5 y 1 U de enzima por mL de medio, en la
mayora de los casos, no afect el crecimiento
de la bacteria, alcanzando un nmero de clulas
totales similares o superiores a las crecidas en
el medio control (LB sin aditivos), entre 1,5 y
1,7x106 UFC/mL. Solamente la combinacin de
1 U y 2,0 % de glucosa, ocasion un
crecimiento ligeramente inferior al control
(1,4x106 UFC/mL). Cuando se aument la
concentracin de la enzima a 2 U/mL, el
crecimiento result significativamente menor al
control (p < 0,05), disminuyendo el nmero
total de clulas a medida que se adicion mayor
cantidad de glucosa (1,2x10 6 a 9,2x105 y
7,4x105 UFC/mL, respectivamente).
Estos resultados tienen cierta similitud
con las curvas de crecimiento publicadas por
Massa et al. (2001), para la cepa E. coli
expuesta a combinaciones de 0,5 y 1 U/mL de
GOX con 1,0 y 2,0 mg/mL de glucosa, durante
las primeras 12 h de cultivo. En esas curvas no
se observaron diferencias entre el valor en log
UFC/mL alcanzado por el control y el de los
tratamientos; solo el incremento de la
concentracin de glucosa a 4,0 mg/mL, gener
un retardo sobre el crecimiento hasta lograr la
completa inhibicin a las 48 h.
Por otra parte, como la GOX cumple
con una cintica tipo Michaelis-Menten
(Bankar et al., 2009), existe una dependencia
entre la velocidad de reaccin y la
concentracin de sustrato cuando la enzima no
est saturada, comportndose como una
reaccin de primer orden. Esto explica los
resultados observados al combinar 2 U/mL de
GOX con diferentes cantidades de glucosa, a
medida que se increment la concentracin del
sustrato fue mayor el retardo en el crecimiento
de la cepa en estudio. La velocidad de
formacin de los productos generados por la
oxidacin de la glucosa con actividad
antimicrobiana, tales como el cido glucnico y
el perxido de hidrgeno (Fresl et al., 1984;
Field et al., 1986; Massa et al., 2001), aument
064
Nmero de clulas (UFC/mL) x10 6
2,0
GOX 0,5 U/glucosa 0,5 %
1,6

GOX 1 U/glucosa 0,5 %
1,2

0,8

0,4
Control
0,0
0
60
120
180
240
300
Tiempo (min)
n = 30.
Los puntos de coordenadas representan el valor promedio de 3 repeticiones.
Figura 1.- Curvas de crecimiento de la cepa de E. coli ATCC 25922 en medio Luria-Bertani, en
presencia de glucosa oxidasa (GOX) y glucosa en diferentes concentraciones.
a medida que se adicion mayor cantidad de
glucosa. Esto tambin demostr que, aun
cuando se establecieron concentraciones
superiores a las informadas por otros autores
(Tiina y Sandholm, 1989; Yoo y Rand, 1995;
Massa et al., 2001), ninguna alcanz la
saturacin de la enzima. Estudios como el
conducido por Zoghbi et al. (2008),
determinaron que la velocidad mxima de una
GOX producida a partir de una cepa de A.
niger, fue de 150 mM equivalente a una
concentracin de 27 mg/mL o 2,7 % de
glucosa.
A partir de estos resultados se decidi
utilizar la combinacin de 2 U de GOX y 2,0 %
de glucosa para agregarlos como aditivos en la
leche.
Efecto del sistema glucosa oxidasa/glucosa

(GOX/G) sobre el crecimiento de la cepa E.
coli ATCC 25922 en leche
Al comparar los ndices de crecimiento
de la bacteria en presencia de los sistemas
ensayados versus los controles, se evidenci el
efecto negativo que tiene el sistema GOX/G
para la proliferacin de la poblacin bacteriana,
durante las primeras 6 horas de cultivo,
independientemente del tratamiento trmico
(Fig. 2). A las 4 horas se observ una pequea
diferencia en el crecimiento de las muestras que
contenan los sistemas enzimticos con respecto
a los controles. Esta diferencia que se hizo
significativa a las 6 horas (p < 0,05), tiempo en
que el ndice de crecimiento de las muestras
con el sistema GOX/G sin pasteurizar y
065
35
ndice de crecimiento
30
25
Control I
20
Control II
L/GOX/G
15
L/GOXp/G
10
5
0
4
24
Tiempo (h)
n = 16.
Los valores son el promedio de 4 repeticiones.
Control I: leche inoculada con la bacteria .
Control II: leche inoculada y glucosa como aditivo.
L/GOX/G: leche inoculada con la bacteria, GOX y glucosa como aditivos.
L/GOXp/G: leche inoculada con la bacteria, GOX pasteurizada y glucosa como aditivos.
Figura 2.- ndices de crecimiento de E. coli ATCC 25922 en leche.

pasteurizado, alcanzaron valores promedios
alrededor de 2, mientras que los ndices de los
controles superaron las 5 unidades. Este efecto
no se prolong para las 24 h, los ndices
resultaron superiores a 15 unidades y no hubo
diferencias estadsticamente significativas (p >
0,05) entre los tratamientos. Sin embargo, se
observ que el ndice promedio de las clulas
crecidas en el sistema con la GOX pasteurizada
result menor que el de las crecidas con la
enzima sin pasteurizar, aunque esta diferencia
no fue significativa (p > 0,05), debido a la
variabilidad de los datos para este tiempo.
En lo que respecta al pH, se observ que
las muestras a las cuales se les incorpor el
sistema GOX/G mantuvieron valores por

encima de 6 durante las primeras 6 h, mientras
que en los controles se encontraron pH menores
a 6, ms bajos que el pH inicial. Para las 24 h,
todas las muestras exhibieron pH bajos
inferiores a 5, demostrando la acidificacin de
la leche (Cuadro 2). En general, la reduccin
del pH en todas las muestras se asoci con el
crecimiento celular, a medida que se
increment la actividad metablica de las
clulas bacterianas la leche se fue acidificando.
Por ello, en el caso de los controles, donde el
ndice de crecimiento fue mayor durante las
primeras 6 h, la reduccin del pH fue ms
evidente.
066
Cuadro 2.- Variacin del pH de las muestras de leche inoculadas con la bacteria E. coli ATCC 25922,
con y sin adicin del sistema GOX/G.
pH
Tratamiento
Tiempo
0h
4h
6h
24 h
Control I
6,53 0,12
5,87 0,13
5,16 0,11
4,27 0,15
Control II
6,55 0,13
5,63 0,15
5,13 0,09
4,22 0,18
L/GOX/G
6,48 0,16
6,40 0,12
6,19 0,15
4,78 0,17
L/GOXp/G
6,58 0,10
6,48 0,15
6,25 0,12
4,86 0,16
Control I: leche inoculada con la bacteria .

Control II: leche inoculada y glucosa como aditivo.
L/GOX/G: leche inoculada con la bacteria, GOX y glucosa como aditivos.
L/GOXp/G: leche inoculada con la bacteria, GOX pasteurizada y glucosa como aditivos.
En funcin de estos resultados, se

presume que el retardo en el crecimiento de la
cepa E. coli ATCC 25922 en leche con el
sistema GOX/G y GOXp/G, durante las
primeras horas, fue ocasionado por la accin
del perxido de hidrgeno producido por el
sistema y no por el cido glucnico, a
diferencia de lo descrito por Massa et al.
(2001). Las razones de esta discrepancia
radican en que, en primer lugar, el tiempo de
incubacin fue menor al descrito por los
autores, con mediciones a las 0, 4, 6 y 24 h. En
segundo lugar, el pH de las muestras de leche
se mantuvo entre 6,5 y 6,2 durante las
primeras 6 h, por lo que no hubo un descenso
importante que se pudiera asociar a una alta
produccin de cido capaz de afectar el
crecimiento celular.
En cuanto a la diferencia observada a las
24 h, entre los ndices promedios de
crecimiento de las bacterias en presencia de
GOX pasteurizada y GOX sin tratamiento
trmico, se consider pudo estar asociada a la
presencia de trazas de la enzima catalasa (CAT)
en el extracto de GOX, tal como lo indica el
fabricante. La catalasa (EC 1.11.1.6) es una
hemoprotena que cataliza la descomposicin
del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno
(NC-IUBMB, 2013). Cuando GOX acta en

presencia de CAT, el perxido de hidrgeno
producido es descompuesto, lo que disminuye
el efecto antimicrobiano tal como lo
demostraron (Massa et al., 2001). La enzima
GOX es termorresistente y mantiene buenos
niveles de actividad cataltica y antimicrobiana,
despus de una pasteurizacin a 63 C por 30
min (Noguera et al., 2013). A diferencia, se ha
documentado que la enzima CAT, pierde un
alto porcentaje de su poder cataltico al ser
expuesta a una temperatura de 60 C,
exhibiendo una actividad remanente de 20 % tal
como lo demostraron Castro-Rivero et al.
(2006), en un extracto enzimtico aislado de
una fuente vegetal (Acanthocereus pitajaya).
En consecuencia, se presume que el tratamiento
trmico pudo eliminar la actividad de las trazas
de CAT, lo que permiti prolongar el efecto del
perxido producido por el sistema GOX
pasteurizada/glucosa por mayor tiempo. Sin
embargo, no se puede precisar este lapso de
tiempo, ya que no se hicieron mediciones
intermedias entre los tiempos de 6 y las 24 h.
Adicionalmente, la alta variabilidad de
los datos tampoco permiti establecer de
manera concluyente si la enzima pasteurizada
fue capaz de retrasar por mayor tiempo el
crecimiento celular.
067
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
El sistema glucosa oxidasa/glucosa

(GOX/G) incorporado en leche a razn de 2
U/mL de la enzima y 2,0 % de glucosa,
ocasion un retraso en el crecimiento de la cepa
E. coli ATCC 25922 durante las primeras horas
de incubacin, ms no ocasion su total
inhibicin. Este resultado proyecta a la enzima
glucosa oxidasa (GOX) como un aditivo natural
que pudiese mantener la calidad microbiolgica
de la leche, durante las primeras horas
postproceso de pasteurizacin.
Tambin podra utilizarse como aditivo
natural en leche cruda y potenciar la accin del
sistema lactoperoxidasa. La incorporacin de
GOX y glucosa en la leche cruda favorecera la
produccin del perxido de hidrgeno, el cual
cumplira una doble funcin, primero como
agente antimicrobiano per se y en segundo
lugar, servira como sustrato para el sistema
lactoperoxidasa y formar as el cido
hipotiocianoso, el cual a su vez tambin tienen
efecto antimicrobiano. Esto le brindara una
mayor proteccin a la leche cruda durante
etapas como la de transporte desde las fincas
productoras y las fbricas, o en ocasiones
cuando las condiciones de refrigeracin no
estn garantizadas para el almacenamiento,
previo
al
procesamiento.
Futuras
investigaciones pueden enfocarse en evaluar
este potencial sobre bacterias nativas de la leche
y cepas asociadas a enfermedades de
transmisin alimentaria.
Bankar, Sandip B.; Bule, Mahesh V.; Singhal,

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AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue desarrollado gracias al
financiamiento del Consejo de Desarrollo
Cientfico y Humanstico de la Universidad de
Carabobo (CDCH-UC). Los hallazgos aqu
descritos son parte de los resultados del
proyecto 2011-003 aprobado y financiado por
este organismo.
068
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Revista Venezolana de Ciencia y Tecnologa de Alimentos. 5 (1): 001-017. Enero-Junio, 2014

Cuantificacin de plaguicidas residuales en granos de maz

Instituto de Tecnologa de Alimentos, Centro de Investigacin de Agroindustria, Instituto Nacional de

Centro de Investigaciones en Slidos (CINSO), Instituto de Investigaciones Cientficas y Tcnicas

(UNIDEF), Ministerio de Defensa (MINDEF) - Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y

Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET). Avenida Rivadavia 1917

El empleo de plaguicidas en la produccin agrcola ha tomado marcada importancia para

Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(1):001-017.

90. La produccin anual de maz fue alrededor

Rojas, Dante et al.

Figura 1.- Produccin de maz en Argentina. Perodo 1990-2012.

Rosario/General San Martn/San Lorenzo, Villa

Rojas, Dante et al.

La optimizacin de la tcnica analtica

Preparacin de patrones para evaluar

Disoluciones y diluciones se realizaron

s : es el promedio de s (Di Rienzo et al., 2008)

RSD % 2(1-0,5 logC)

Se utiliz un cromatgrafo de gases

Rojas, Dante et al.

criterios utilizados fueron: a) Recuperacin

< 90 % y solo 14 % para R % > 110.

Figura 2.- Recuperacin porcentual (R %) en funcin de la frecuencia

Figura 3.- Recuperacin porcentual (R %) promedio agrupadas por analito.

Rojas, Dante et al.

endosulfn sulfato (20,3 %), cipermetrina (17,6

(endosulfn sulfato). Los mayores LC

Rojas, Dante et al.

que para las terminales portuarias cerca del 33

Rojas, Dante et al.

(n = 13), permetrina (n = 5), clorpirifs etil (n =

> LMR-Codex Alimentarius**

* Reglamento (CE) N 396/2005 (PE/CUE, 2005; DG SANCO, 2014).

evaluacin rutinaria del cumplimiento de

mass spectrometry. Journal of Agricultural

Rojas, Dante et al.

Herrmann, Susan Strange and Poulsen, Mette

Rojas, Dante et al.

extraction and gas chromatography-mass

Revista Venezolana de Ciencia y Tecnologa de Alimentos. 5 (1): 018-030. Enero-Junio, 2014

Metodologa para disear un producto alimenticio por medio de la

Vargas-Aguilar, Pedro et al.

Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(1):018-030.

produccin de mercadotecnia. En general el

consumidores (Earle et al., 2001). Se selecciona

Vargas-Aguilar, Pedro et al.

factores por los cuales deciden comprar un

Para evaluar si exista o no diferencia

nmero de personas se determin con una

Vargas-Aguilar, Pedro et al.

nmero de sillas, como los establecimientos N

consumo semanal de salsa de tomate, se puede

Litros de salsa de tomate consumidos por semana

Marcas de salsa de tomate

Marcas de salsa de tomate

presencia en el mercado como un alto volumen

Consumo estimado de salsa de tomate

Vargas-Aguilar, Pedro et al.

compra por parte de los compradores

Cantidad de encuestados (Frecuencia)

Caractersticas de la salsa de tomate

La Fig. 3 muestra los factores