Prcticas de Bioqumica I

Prctica: Reacciones Generales de aminocidos y protenas

REACCIONES GENERALES DE
CARACTERIZACIN DE AMINOCIDOS Y
PROTENAS.
Objetivos
Al terminar esta prctica el estudiante estar en capacidad de:
-

Aplicar pruebas qumicas para la determinacin cualitativa de aminocidos.

Conocer la importancia de los grupos R en la determinacin cualitativa de los

aminocidos.

Emplear reacciones especficas para la caracterizacin de protenas.

Introduccin
Los aminocidos son las unidades estructurales ms simples (monmeros) que
componen la estructura de las protenas; estn constituidos por un grupo amino (NH2
o NH3+), un grupo carboxilo (COOH o COO-) unido al carbono 2 de la molcula, un
tomo de hidrgeno y una cadena radical conocida tambin como grupo R. Esta
ltima es especfica para cada aminocido y contribuyen a la identificacin de los
mismos.
La presencia de estos grupos qumicos en la estructura de los aminocidos es
lo que determina que estas molculas intervengan en un gran nmero de reacciones
qumicas.
Las reacciones pueden ir de lo general, como es el caso de la reaccin de la ninhidrina
o la de Biuret, hasta lo muy especfico como veremos en el desarrollo de este trabajo
prctico.

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Prctica: Reacciones Generales de aminocidos y protenas

MATERIALES Y REACTIVOS
-

Tubos de ensayo

Pipetas graduadas de 1, 2 y 5 mL

Baos de Mara

Goteros

Pinzas para tubo de ensayo

Cilindro graduado

Soluciones al 0,2% de los aminocidos disponibles en el laboratorio.

Solucin de albmina al 0,5 %

Reactivo de ninhidrina: preparada al 0,1 % en etanol

Acetato de plomo al 10 %

NaOCl al 10 %

NaOH al 30 %

HNO3 Concentrado

Reactivo de Millon: disolver 40 g de mercurio metlico en 57 mL de HNO3 y

aforar con cuidado a 100 mL con agua destilada

Reactivo de Biuret: puede presentarse como una mezcla, combinando

previamente sulfato de cobre e hidrxido de sodio. En dicho caso se usarn 0,5
mL de dicha mezcla

Reaccin de la Ninhidrina
Consiste en la reaccin del grupo amino y/o carboxilo libre de los aminocidos
y las protenas con la ninhidrina. Esta es una de las reacciones de uso frecuente en el
estudio qumico de los aminocidos, pptidos y protenas. Se fundamenta en la
reaccin de la ninhidrina frente a las molculas que poseen funciones amnicas y
carboxlicas libres, formndose un compuesto final de color violceo.
En esta reaccin, cada equivalente de aminocido reacciona con dos
equivalentes de ninhidrina. Aunque la reaccin de la ninhidrina con aminocidos y
protenas es de fcil ejecucin, esta lleva implcita varias etapas:

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Prctica: Reacciones Generales de aminocidos y protenas

1. Condensacin de la Ninhidrina con el aminocido:

O

O
OH

H2O

O
H3N+ CHC OR
O

NCHC OH

aminocido

OH
O

2. Formacin de la base de Schiff:

O

O-

N CHR

NCHC OH
O

+ CO2

3. Formacin del dicetohidrindeno:

O-

ON CHR

H2O

NH2

+ CHO R

4. Condensacin del amino-dicetohidrindeno con otra molcula de ninhidrina:

O

ONH2
O

ON

+ O
O

El ltimo compuesto en esta cadena de reacciones es de color azul violceo, e

indica la presencia de grupos carboxilo y/o amino libres en la muestra analizada.
Experimento 1
Prueba de la Ninhidrina.
En tres tubos de ensayo rotulados (1, 2 y 3) coloque 2 mL de aminocido (tubo 1), de
protena (tubo 2) y de compuesto desconocido (tubo 3). Agregue a cada tubo 10 gotas
de reactivo de ninhidrina y agite suavemente.
Coloque los tubos en bao de agua hirviente durante al menos 10 minutos.
En caso positivo la solucin se tornar violeta lo que indica la presencia de
aminocidos y/o protenas con grupos amino o carboxilo libres
3

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Reaccin de Biuret:
Es una reaccin general para la identificacin de pptidos y/o protenas. Se le
da ese nombre debido a que el color que se produce en esta reaccin, es similar al de
la condensacin de dos molculas de urea (H2N=C=NH2), conocido en alemn como:
Biuret. Se fundamenta en la formacin de un compuesto azul violeta por la reaccin
del in cpicro con el pptido o protena en medio alcalino. Este in forma un enlace
covalente coordinado con los enlaces peptdicos (ver reaccin).
La reaccin dar resultado positivo si el compuesto analizado posee al menos
dos enlaces peptdicos en su estructura. En el caso de los aminocidos y dipptidos la
reaccin es negativa. Si se observa la reaccin se ver claramente porqu hacen falta
dos enlaces:

N H

O
Cu

CH
C

R
OH

CH
Cu

N H

CH

++

C
H N

E nlaces Peptdicos

NH

H N

++

R
O

N H

Enlace covalente coordinado

Experimento 2
Prueba de Biuret
En tres tubos de ensayo debidamente rotulados (1, 2 y 3) agregue 2 mL de cualquier
aminocido disponible (tubo 1), de albmina (tubo 2) y de compuesto desconocido
(tubo 3).
Aada a todos los tubos 5 gotas de CuSOa 1 % y 5 gotas de NaOH 30%.
Agite suavemente y observe la aparicin de un color violeta que indica la presencia de
pptidos o protenas. El color celeste indica que el resultado es negativo.
4

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Reaccin de Sullivan
En esta reaccin se detecta la presencia de aminocidos azufrados (portadores
de grupos sulfhidrilos (-SH) y disulfuros (-S-S) como la cistena y la cistina
respectivamente.
Se basa en la alcalinizacin de la muestra que contiene el azufre producindose Na2S
el cual en presencia de acetato de plomo forma un precipitado negruzco de sulfuro de
plomo (PbS).
Las protenas que contengan estos grupos tambin darn positiva esta reaccin. La
misma se desarrolla de la siguiente manera:

1.
O

O
+

H3N

CH C

O-

+ 2NaOH

H3N

CH C

CH2

CH2

SH

OH

O-

+ Na2S + H2O

serina

Cisteina

2.
Na2S + (CH3COO) 2Pb

2CH3COONa

+ PbS

Experimento 3
Prueba de Sullivan
En tres tubos de ensayo rotulados 1, 2 y 3 agregue: 2 mL de cistena (tubo 1),
albmina (tubo 2) y compuesto desconocido (tubo 3). Adicione con cuidado 1 mL de
NaOH al 30% y 5 gotas de acetato de plomo al 10% a todos los tubos.
Mezclar y calentar a 100 C de 2 a 3 minutos.
En caso positivo se formar un precipitado negruzco de PbS.

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Prctica: Reacciones Generales de aminocidos y protenas

Reaccin de Sakaguchi
Est reaccin es especfica para la identificacin del grupo guanidino. Se
fundamenta en la condensacin del grupo guanidino con el -naftol en un medio
altamente oxidante, con la posterior produccin de un compuesto de color rojo
intenso.
Esta prueba da positiva frente a la arginina as como a las protenas que contienen este
aminocido.
O
H3N CH C OCH2
CH2
CH2

H3N CH C O

CH2
CH2
CH2

OH

NH

C NH2

alfa naftol

NH
C NH
NH2

Cromgeno rojo

Arginina

Experimento 4
Prueba de Sakagushi
En tres tubos de ensayo rotulados previamente (1, 2 y 3) agregue 2mL de arginina
(tubo 1), albmina (tubo 2) y compuesto desconocido (tubo 3).
Aada 3 gotas de NaOH al 30% a cada uno y agite suavemente.
Agregar 3 gotas de -naftol al 0,5 % en etanol a todos los tubos y mezcle bien.
Posteriormente agregue a los tubos 1 mL de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 14%.
La positividad de la reaccin se observar de inmediato en los tubos que contengan
arginina, bien sea libre o como parte de la estructura de una protena.

Reaccin

Xantoproteica:

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Permite identificar aminocidos que tienen anillo bencnico en su estructura,

tales como la fenilalanina o la tirosina. En esta reaccin el aminocido reacciona con
cido ntrico concentrado, ocurriendo la nitracin del anillo aromtico Como
productos finales de la reaccin se forman nitroderivados de color amarillo.
O
+

H32N

CH C
CH2

O
-

H32N

CH C

O-

CH2

HNO3

NO2
OH

OH

Tirosina

Tisosina nitrada
(amarillo)

Experimento 5
Prueba xantoproteica
En tres tubos de ensayo rotulados previamente (1, 2 y 3) coloque 2 mL de tirosina
(tubo 1), albmina (tubo 2) y compuesto desconocido (tubo 3).
Agregue 2 mL de HNO3 concentrado a cada tubo y caliente los tubos en un bao de
agua hirviendo de 1 a 3 minutos.

La aparicin de un color amarillo indica una

reaccin positiva para aminocidos aromticos.

Reaccin de Millon:
Tiene especificidad para detectar la presencia de tirosina o de protenas que la
contengan. Es una variante de la reaccin xantoproteca, identifica los compuestos que
contienen un grupo -OH ligado al anillo bencnico. En dicha reaccin adems de la
nitracin del anillo fenlico, se incorpora a su estructura el mercurio (Hg++)
producindose un derivado mercrico de nitrotirosina de color rojo.

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O
+H N
3

CH C

O
O-

+H

CH2

3N

CH C

O-

CH2

+ HgNO2

N O

OH

OHg

Tirosina

Compuesto mercrico
de Tirosina

Experimento 6
Prueba de Millon
Coloque en tres tubos de ensayo rotulados previamente (1, 2 y 3) 2 mL de tirosina
(tubo 1), de albmina (tubo 2) y de compuesto desconocido (tubo 3).
Aada a cada tubo 0,2 mL de reactivo de millon.
Calentar cuidadosamente sin llegar a ebullicin. En caso positivo se observar una
coloracin rojiza.

Auto evaluacin
1. Explique porque aminocidos como la cistina dan una reaccin positiva a la
reaccin de Sullivan.
2. Explique el fundamento de la reaccin de Biuret.
3. Diga las aplicaciones de la reaccin xantoproteica.
4. Cmo cree usted que resultara la reaccin de Biuret si la

aplicamos a un

dipptido?
5.- Porque un aminocido resulta negativo a la reaccin de Biuret?

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Bibliografa
Alemany, M; Font, S. Prctica de Bioqumica. Edit Alhambra. Espaa 1.983.
Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory
techniques. Saunders editores. 1976.
Plummer, David. Bioqumica prctica. Mc Graw Hill. 1981.
Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987.

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