Dra.

Milka Tello Villavicencio

Biotecnologa vegetal- Dra. Milka Tello V

Qu es un ADN polimrfico?
Los alelos heterocigticos son un claro ejemplo
de ADN polimrfico, pues poseen diferentes
secuencias de nucletidos.
El ADN polimrfico solo puede ser
conceptualizado al comparar el ADN de al menos
dos fuentes diferentes.
El trmino alelo en la gentica clsica se refiere
generalmente a un gen en particular, pero en este
caso, se aplica a cualquier segmento del genoma.
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Qu es un marcador?
Un marcador es un carcter o un gen que
debido al ligamiento puede usarse para
indicar la presencia de otro gen; es decir,
cualquier caracterstica A (sea un gen, una
protena, tipo de hoja, etc.) que est asociada
a la presencia o expresin de una
caracterstica B (como vigor, altura, resistencia
a enfermedades, etc.) puede considerarse
como un marcador, pues la presencia de A
necesariamente implica la de B.
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Qu es un marcador?
La importancia de los marcadores radica en que
ofrecen la posibilidad de estudiar poblaciones de
organismos y seleccionar aquellos que presentan
rasgos de inters para el hombre.
En ocasiones, el uso de marcadores permite
seleccionar los individuos aun antes de que expresen el
rasgo de inters. Gracias al empleo de marcadores ha
sido posible mejorar muchas especies que son la base
de la alimentacin del mundo.
Hay dos tipos principales de mar - cadores: los
marcadores morfolgicos y los marcadores
moleculares.
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Marcadores morfolgicos
Los marcadores morfolgicos fueron el primer
tipo de marcadores que el hombre utiliz.
Se consideran marcadores morfolgicos a los
caracteres de un individuo que se expresan en un
ambiente especfico y que el hombre identifica
con un objetivo determinado. Por ejemplo, en los
rboles de pino podemos usar como marcadores
morfolgicos el peso o tamao de la semillas,
pues se ha visto que dicha caracterstica se asocia
en la mayora de las poblaciones con la
supervivencia, el crecimiento y la reproduccin
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Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares corresponden a cualquier gen
cuya expresin permite un efecto cuantificable u
observable (caractersticas fenotpicas), que adems puede
detectarse fcilmente.
Este tipo de marcadores pueden evaluarse desde que los
individuos estn en sus primeros estadios de desarrollo, y
se pueden aplicar usando a todo el individuo o slo parte
de l.
Se habla de marcadores genticos cuando se transmiten
segn las leyes bsicas de la herencia mendeliana, por lo
que es importante destacar que no todos los marcadores
moleculares pueden considerarse como genticos.
Existen dos tipos de marcadores moleculares: los
marcadores bioqumicos y los marcadores de ADN.
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MARCADORES BIOQUMICOS
ISOENZIMAS
Las isoenzimas fueron descubiertas por
Hunter y Markert en 1957 y son diferentes
variantes moleculares de una misma enzima
presentes en una especie, las cuales
desempean la misma actividad pero pueden
tener diferentes propiedades.

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ISOENZIMAS
Las isoenzimas se identifican mediante el
proceso denominado electroforesis, que
consiste en colocar un extracto proteico del
material a analizar en los pocillos de un
soporte (papel de celulosa o un gel hecho de
agarosa o poliacrilamida) que se somete a un
campo elctrico durante varias horas para que
se separen las protenas de acuerdo con su
tamao o carga elctrica
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ISOENZIMAS
Una vez concluida la emigracin de las protenas por
medio del frente de corrida denominado Kohlrasusch,
el gel es colocado en una solucin que contiene los
compuestos qumicos necesarios (colorantes) para que
se lleve a cabo una reaccin y se puedan observar
posteriormente las isoenzimas en forma de bandas de
color en el soporte o gel.
Las diferencias en la movilidad electrofortica de las
isoenzimas son resultantes de las diferencias en las
secuencias del ADN que codifican tales enzimas.

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ISOENZIMAS
Estos marcadores tienen la ventaja de que la
tcnica es relativamente barata, accesible y no
destructiva debido a que utiliza pequeas
cantidades de material. Adems, el control
gentico de la mayora de las isoenzimas es
bien conocido, por lo que es posible realizar
inferencias genticas a partir de los patrones
de bandas observados en los geles.
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ISOENZIMAS
Por otro lado, las isoenzimas tienen base gentica
codominante (es decir, que en un individuo
diploide es posible visualizar la expresin de
ambos alelos); son selectivamente neutrales y
estn libres de efectos deletreos (cuando los
alelos tienen efectos negativos que imposibilitan
la reproduccin del genotipo que los posee),
efectos pleiotrpicos (cuando un gen controla la
expresin de ms de un carcter en un individuo)
y/o epistticos (dominancia de un gen sobre
otro).
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ISOENZIMAS
Desde su descubrimiento, las isoenzimas han jugado
un papel importante en muchas reas de la biologa;
sin embargo, su utilizacin ha sido muy limitada debido
a ciertas desventajas: 1) presentan problemas tcnicos;
2) no permiten cubrir todo el genoma, pues slo
representan una estrecha fraccin del contenido
gentico; 3 ) nicamente detectan la variacin de los
genes que codifican para la expresin de una
caracterstica del individuo; 4 ) se dificulta la precisin
de los datos obtenidos debido al polimorfismo en el
tejido de las isoenzimas (por ejemplo, el polimorfismo
detectado en una hoja no es el mismo que el que se
obtiene usando la semilla del mismo individuo).
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Marcadores de ADN
Los marcadores de ADN constituyen la nueva
generacin de marcadores moleculares y
solucionaron el problema de la carencia de
marcadores que tenan las isoenzimas, pues
son capaces de generar una cantidad
virtualmente infinita de marcadores.

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Marcadores de ADN
Existen varias tcnicas para identificar
marcadores de ADN, las que se pueden
agrupar en tres categoras: las de hibridacin
tipo Southern, las de reaccin de
polimerizacin en cadena (PCR) y las que
combinan PCR o sus productos de ADN con la
hibridacin tipo Southern.

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Marcadores de ADN
La hibridacin consiste en la formacin de una
molcula de doble cadena mediante el
apareamiento o unin de bases
complementarias de dos molculas de una
sola cadena. La hibridacin tipo Southern
explora las variaciones en la longitud o
tamao de los fragmentos de ADN
ocasionadas por la restriccin del genoma
mediada por una enzima particular
(endonucleasa).
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Marcadores de ADN
Esta tcnica comprende las siguientes etapas:
primero se extrae el ADN del material que
deseamos estudiar; luego se le adicionan enzimas
de restriccin (endonucleasas), las cuales cortan
el ADN en fragmentos de diferente longitud;
estos fragmentos son separados en geles de
agarosa, para despus realizar por capilaridad o al
vaco la transferencia de los fragmentos a una
membrana de papel de nitrocelulosa o de nylon
(transferencia tipo Southern).
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Marcadores de ADN
Finalmente, se hibridizan los fragmentos de la
membrana con sondas marcadas (radiactiva o no
radiactivamente) para visualizar y detectar las
bandas hibridadas.
Dentro de esta tcnica se encuentran los
marcadores RFLP (polimorfismo de la longitud de
los fragmentos de restriccin) y los VNTR
(secuencias adyacentes que se repiten en nmero
variable).

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Marcadores con PCR

La tcnica de PCR, o reaccin en cadena de la
polimerasa, es una tecnologa utilizada para
multiplicar (sintetizar) in vitro fragmentos
especficos de ADN con la finalidad de
detectar una secuencia gen de inters en el
genoma del individuo en estudio

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Marcadores con PCR

Se basa en la amplificacin de fragmentos de
ADN a partir de secuencias de nucletidos
denominadas cebador (primer), que son
capaces de reconocer una secuencia blanco
para la cual es complementaria.

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Marcadores con PCR

En forma general, los principales pasos del
PCR son los siguientes: se extrae el ADN del
material a analizar, se separa la molcula del
ADN en dos hebras (desnaturalizacin), se
induce el alineamiento o reconocimiento del
cebador con las secuencias blanco
complementarias o molde del ADN, y por
medio de la enzima Taq polimerasa se lleva a
cabo la extensin o alargamiento de la
molcula iniciadora (cebador).
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20

Marcadores con PCR

Este proceso se realiza en un termociclador,
que se encarga de realizar los cambios de
temperatura necesarios para que se
desarrollen las etapas o ciclos anteriormente
mencionados.
Los ciclos se repiten la cantidad de veces que
sea necesario, hasta obtener la cantidad de
copias de ADN que se requieran.

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21

Marcadores con PCR

Dentro de esta metodologa se encuentran los
marcadores llamados RAPD (ADN polimrfico
amplificado al azar), PCR iniciada con
microsatlites (MP-PCR), AFLP (polimorfismo
de longitud de fragmentos amplificados) y
DAF (amplificacin de huellas del ADN), entre
otros.

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22

Marcadores con PCR

Finalmente, dentro de las metodologas que
combinan la PCR o sus productos de ADN ms
la hibridacin tipo Southern, estn los RAHM y
RAMPO (amplificacin aleatoria del
polimorfismo de microsatlites).

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23

Ventajas y aplicaciones de los marcadores de

ADN
Son muy ventajosos los marcadores de ADN ya
que no son afectados por el ambiente, estn
presentes en cualquier estadio del individuo,
permiten una deteccin temprana, son
universales, muy abundantes, se requiere poca
cantidad de ADN para los anlisis y el ADN es muy
estable y especfico para cada individuo (huella
gnica). Sin embargo, son relativamente costosos,
necesitan personal entrenado, equipos
sofisticados y un estricto control de la
contaminacin.
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24

Ventajas y aplicaciones de los

marcadores de ADN
El uso de marcadores moleculares en los anlisis genticos y en el
mejoramiento de las plantas ha tenido una difusin
extremadamente rpida. Las principales aplicaciones incluyen la
obtencin de huellas genticas (fingerprinting) genmicas de
individuos, variedades y poblaciones; el anlisis de la estructura y
diversidad gentica en poblaciones naturales y de mejoramiento y
bancos de germoplasma; el establecimiento de relaciones
filogenticas entre diferentes individuos y especies; la construccin
de mapas genticos de alta cobertura genmica y la localizacin de
genes de inters econmico, mapeo de caractersticas de herencia
cuantitativa QTL (Quantitative Trait Loci ) y seleccin MAS auxiliada
por marcadores (Marker Asisted Selection).

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25

Usos de los marcadores

Cuantificacin de la diversidad existente en una poblacin

PROPORCIN DE LOCI POLIMRFICOS

NUMERO DE ALELOS POR LOCUS

HETEROCIGOSIDAD
Probabilidad de que los individuos en una poblacin tengan diferentes
alelos en el mismo locus

m
h=1- xi 2
i=1

xi es la frecuencia en la poblacin del

alelo i-simo en un locus y m es el
nmero de alelos

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26

Con qu herramientas medir lo anterior?

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27

Evidencia del Zea mays subsp. parviglumis como ancestro

del maz cultivado
Estudio con 21 loci de isoenzimas

Z. mays huehuetenangensis
Z. perennis
Z. diploperennis
Z. luxurians
Z. mays mexicana-Nobogame
Z. mays mexicana-Mesa Central

Z. mays mexicana-Chalco
Z. mays parviglumis-Sur de Guerrero
Z. mays parviglumis-Jalisco
Z. mays parviglumis-Cuenca Balsas

0.4

0.3

0.2

0.1

Z. mays mays

Distancia de Rogers
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Fuente: Doebley, 1990. Econ.

Bot. 44: 6-27.
28

Matsuoka, Y.; Y Vigouroux, M. M. Goodman; J.

Snchez G.; E. Buckler and J. Doebley. 2002. A
single domestication for maize shown by
multilocus microsatellite genotyping. PNAS
99(9):6080-6084.

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29

5. Seleccin asistida por marcadores

1.
2.
3.

1.

Genoma A, la subunidad 1 induce mayor tiempo de amasado

Genoma B las subunidades 17+18 y 7+8 tiene efecto positivo en las
propiedades viscoelsticas de la masa.
Genoma D, la subunidad 5+10 est asociada con un efecto positivo
sobre las propiedades viscoelsticas, mientras que la subunidad 2+12 se
asocia con un efecto negativo.

Las combinaciones 117+185+10, 2*7+85+10 y 17+85+10

presentan las mejores propiedades viscoelsticas de la harina.

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30

Qu es un QTL?
(Quantitative Trait Locus)

Es una regin del genoma que est asociada con un efecto a un

carcter cuantitativo........ (ej. RENDIMIENTO).

Conceptualmente, un QTL puede ser un gen individual, o puede ser un

grupo de genes ligados que afectan el carcter.

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31

Hoy en da...

Hoy en da, con las tcnicas de marcadores de ADN como RFLPs, RAPDs, SSRs
y AFLPs se tiene una cobertura amplia de marcadores en muchas
poblaciones de inters.

Hay un nmero prcticamente ilimitado de marcadores.

Ahora, para muchas especies cultivadas, estamos en posicin de

detectar QTLs y usar ligamientos identificados entre marcadores y QTLs
para aplicar seleccin asistida por marcadores.

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32

Inters en el estudio de los QTLs

1. Detectar las regiones del genoma que afectan un carcter -Dnde estn los QTLs?
2. Describir los efectos del QTL sobre el carcter
-Cunta de la variacin es causada por el QTL? --Cul
es la accin gnica asociada con el QTL?
(aditivo?, dominante?, nivel de dominancia a/d)

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Seleccin Asistida por Marcadores

Histricamente se han usado los registros de los fenotipos para

inferir el mrito gentico de las plantas.

Se ha demostrado que algunas variantes de genes especficos

estn asociadas de forma positiva con una caracterstica dada.

Entonces.... es posible determinar en etapas tempranas el genotipo de

una planta usando marcadores y seleccionar individuos que lleven la
variante gentica preferida.

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Seleccin Asistida por Marcadores

Es el proceso de usar los resultados de las pruebas de ADN para auxiliar en la

seleccin de individuos como progenitores de la siguiente generacin. La
palabra asistida implica que la seleccin tambin es influenciada por otras
fuentes de informacin como las caractersticas agronmicas observadas.
Marcador

Gen de inters (ej.

Resistencia a sequa,
rendimiento, etc.)

Los marcadores son referencias en el genoma que pueden ser utilizados por su
proximidad al QTL. No podemos observar la herencia del QTL, sino que
observamos la herencia del marcador, cercano al QTL.
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35

Es efectiva la seleccin asistida por marcadores?

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Isoenzimas
Mltiples formas de la misma enzima
Aloenzima: Una enzima, proveniente de un locus
Isoenzima: Una enzima, proveniente de ms de un locus
Metodologa

a) Macerar el tejido
b) Separar las enzimas por electroforesis
c) Localizar las enzimas por tincin histoqumica

d) Analizar los patrones de bandas

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40

Malato deshidrogenasa
A

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41

Catalasa

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42

Glutamato oxaloaceato transaminasa

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Isoenzimas

Ventajas
La tecnologa es robusta y sumamente reproducible
Los marcadores son codominantes, es decir, se pueden identificar
alelos dominantes y recesivos

Desventajas
Hay relativamente pocas tinciones disponibles para la deteccin de
enzimas
El anlisis est basado en el fenotipo

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Marcadores moleculares

Son secuencias detectables de ADN cuya herencia

puede ser monitoreada

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Principio de los marcadores

moleculares
Varios eventos (mutaciones puntuales, inserciones,
deleciones, duplicaciones, rearreglos) pueden dar
lugar a variantes mas o menos complejas en la
secuencia del ADN. A tales variantes se les
denomina polimorfismos
Los polimorfismos se traducen en diferencias en
el genotipo (como lo evidencan los diferentes
perfiles de bandas); y tal vez repercuta en el
fenotipo
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Propiedades deseables de los

marcadores moleculares
Que sean abundantes en el genoma
Alto nivel de polimorfismo

Especificidad de locus
Codominancia de alelos
Distribucin n todo el genoma

Demanda de habilidades tcnicas y mano de obra (automatizacin)

Reproducibilida dentro y entre laboratorios
Costos operativos

Cantidad de ADN requerida

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Marcadores moleculares

Tipos de marcadores ms comunes:

RFLPs
RAPDs
Repeticiones en serie (SSRs, Minisatlites)
AFLPs

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RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Se basa en la posibilidad de comparar patrones de bandas generados

mediante la digestin con enzimas de restriccin del ADN.

Etapas de la metodologa en laboratorio:

Aislamiento del ADN
Digestin y electroforesis
Transferencia del ADN por el mtodo Southern

Hibridacin del ADN

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Extraccin y digestin del ADN

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Transferencia del ADN a una membrana

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Hibridacin del ADN y revelado con rayos X

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Interpretacin de resultados

Sitio de unin de la sonda

Sitio de restriccin
Insercin de ADN

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Ventajas de los RFLPs

Metodologa transferible entre laboratorios

Se heredan en forma codominante

No se requiere informacin acerca de la secuencia del ADN
Poder discriminatorio: tanto a nivel de especie o de poblacin
como a nivel de individuo
Simplicidad: si se dispone de sondas adecuadas, la tcnica
puede aplicarse fcilmente a cualquier planta

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Desventajas de los RFLPs

Requieren cantidades grandes de ADN

No permiten la automatizacin
Bajos niveles de polimorfismo en algunas especies
Es necesario disponer de una genoteca de sondas apropiadas
Costosos
Requieren la distribucin de sondas entre laboratorios
Uso de sondas radiactivas

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Mtodos basados en PCR

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Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

30-40 ciclos de 3 etapas

Etapa 1: Desnaturalizacin (1 minuto, 94 C)

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Etapa 2: Hibridacin (45 segundos, 54 C)

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Etapa 3: Extensin (2 minutos, 72 C)

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Ciclo 4
Fragmento deseado

Amplificacin exponencial

Ciclo 3
Ciclo 2

Ciclo 1

Ciclo 35

ADN molde

4 copias

8 copias

16 copias

32 copias

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236= 68 mil millones

de copias

60

RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA)

Es una tcnica que usa iniciadores (primers) aleatorios cortos y

amplifica fragmentos annimos de ADN.

Etapas de la metodologa en laboratorio:

Aislamiento de ADN

Reaccin de PCR con los primers

Separacin de los fragmentos de ADN por electroforesis
Visualizacin de los fragmentos de ADN
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Gel de RAPD

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Ventajas de los RAPDs

Se genera alto nmero de fragmentos

Metodologa relativamente simple
Los primers arbitrarios se comercializan ampliamente
No hay necesidad de conocer la secuencia del ADN
Se requieren cantidades minsculas de ADN

Desventajas
Marcadores dominantes
Falta de informacin sobre los productos amplificados

Problemas con la repetibilidad

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SSRs (Simple Sequence Repeats)

(Microsatlites)

Es una tcnica que usa iniciadores (primers) para sitios especficos

(aquellos donde se encuentran las secuencias repetidas) y amplifica
fragmentos de ADN plenamente identificados.

Etapas de la metodologa en laboratorio:

Aislamiento de ADN
Reaccin de PCR con los primers
Separacin de los fragmentos de ADN por electroforesis

Visualizacin de los fragmentos de ADN usando bromuro de etidio,

nitrato de plata o mediante etiquetas fluorescentes
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Principio de los marcadores microsatlites

Repeticiones en serie de
una secuencia de ADN

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Ventajas de los SSRs

Gran nmero y amplia distribucin en todo el genoma
Marcadores codominantes
Marcadores estables y repetibles
Susceptibles de automatizacin

Se requieren cantidades minsculas de ADN

Desventajas
Requieren cierto entrenamiento para aplicarlos
Se requiere informacin sobre la secuencia del ADN
circundante a los fragmentos para el diseo de primers
Pueden presentar homoplasia en tamao de fragmento
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AFLPs (Amplified fragment length polymorphisms)

Es una combinacin entre las tcnicas de RFLPs y las tcnicas de PCR,

basado en la amplificacin selectiva de fragmentos de ADN digeridos
por enzimas de restriccin.

Etapas de la metodologa en laboratorio:

Digestin del ADN con dos diferentes enzimas de restriccin
Unin de adaptadores a los extremos del ADN cortado
Amplificacin selectiva usando combinaciones de iniciadores

Visualizacin de los fragmentos de ADN usando bromuro de etidio,

nitrato de plata o mediante etiquetas fluorescentes
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Esquema de la metodologa AFLP

Extremos
pegajosos

Corte del ADN con

EcoRI y MseI

DIGESTIN DEL
ADN

Adaptador EcoRI

Adaptador MseI

LIGACIN DE LOS
ADAPTADORES

PCR

Primers con un
nucletido selectivo

PREAMPLIFICACIN

Consisten de la secuencia del adaptador mas un

nucletido arbitrario usado para amplificar solo un
subset de fragmentos

PCR
Primers con tres
nucletidos selectivos

AMPLIFICACIN
SELECTIVA
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Geles de AFLP

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Ventajas de los AFLPs

Deteccin rpida de polimorfismos en el genoma
Altamente informativos debido al gran nmero de bandas

Altamente reproducibles
No se requiere informacin previa de la secuencia

Desventajas
Son marcadores dominantes
Con frecuencia no se distribuyen aleatoriamente (tienden a
concentrarse en los telmeros y centrmeros)
Son muy demandantes tcnicamente
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